Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5

HPLC
1. Prinsip Kerja HPLC
Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi
kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran
yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi
lebih baik dan efisien.Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat
bergerak lebih cepat sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa
diam dan tekanan yang tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan
menghasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya.

2. Keuntungan penggunaan HPLC

Kelebihan dari teknik HPLC dibandingkan dengan GC ( Gas Chromatography) :

a. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak
stabil.
b.HPLC memiliki detector dengan kepekaan yang tinggi
c. Teknik ini memiliki daya memisah yang tinggi
d. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya
e. Dalam HPLC dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya dalam
beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat kecil (sedikit fase
gerak yang dikonsumsi)
f. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar.
Kelebihan High Performance Liquid Chromatografi:
Isolasi zat yang tidak mudah menguap (non volatile)
Isolasi zat yang secara termal tidak stabil
Dapat diopersikan pada suhu kamar
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
Sudah digital sehingga penggunaannya cepat, mudah dan lebih praktis
Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
Resolusi yang baik
Dapat digunakan bermacam-macam detektor
Kolom dapat digunakan kembali
Mudah melakukan "sample recovery

3. Perbedaan HPLC dan GC

Fasa diam

HPLC

GC

Fisa diam berupa adsorben yang tidak

boleh larut dalam fasa gerak.
Ukuran yang lebih kecil (5 s/d 10 m)
dan tekanan sampai 6000 psi. Ukuran
yang kecil dari fasa diam menyebakan
fasa
diam
mempunyai
luas
permukaan yang besar, keseimbangan
antar fasa menjadi lebih baik dan
efisien pemisahan dipertinggi.

Fasa diam berupa suatu cairan bertitik

didih tinggi dan proses serapannya
lebih banyak berupa partisi yang
berupa
padatan
dan
adsopsi
memainkan peranan utama.

Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5
Fasa gerak

Fasa gerak merupakan suatu cairan.

fase gerak adalah gas seperti helium,

hidrogen, atau nitrogen.

Kolom

Ada 2 tipe:
- Kolom analitik dengan performance
tinggi, diameter dalam 1-6 mm
- Kolom preparative, diameter lebih besar
Tabung kolom dibuat dari kaca dan
baja tahan karat. Panjang kolom 0,3-6
meter atau lebih, rata-rata 0,9 m.
Kolom yang lebih panjang akan
menghasilkan resolusi bertambah
baik, tetapi perlu tekanan tinggi.
Tabung kolom dapat dikelilingi
selubung air (water jacket) untuk
pengaturan suhu. Jenis isi kolom
(kemasan kolom) tergantung cara
kromatografi yang dipakai (adsorpsi,
partisi, atau penukaran ion).

Ada dua tipe utama kolom dalam

kromatografi gas-cair. Tipe pertama,
tube panjang dan tipis berisi material
padatan; Tipe kedua, lebih tipis dan
memiliki fase diam yang berikatan
dengan
pada
bagian
terdalam
permukaannya.
Kolom biasanya dibuat dari baja tak
berkarat dengan panjang antara 1
sampai 4 meter, dengan diameter
internal sampai 4 mm. Kolom digulung
sehingga dapat disesuakan dengan
oven
yang
terkontrol
secara
termostatis.
Kolom dipadatkan dengan tanah
diatomae, yang merupakan batu yang
sangat berpori. Tanah ini dilapisis
dengan cairan bertitik didih tinggi,
biasanya polimer lilin.

Ada beberapa cara untuk mendeteksi

substansi yang telah melewati kolom.
Metode umum yang mudah dipakai
untuk menjelaskan yaitu penggunaan
serapan ultra-violet.

Ada beberapa tipe detektor yang biasa

digunakan. Detektor ionisasi nyala
merupakan detektor yang umum dan
lebih mudah untuk dijelaskan daripada
detektor
alternatif
lainnya.
Dalam mekanisme reaksi detektor
ionisasi nyala, pembakaran senyawa
organik merupakan hal yang sangat
kompleks. Selama proses, sejumlah
ion-ion
dan
elektron-elektron
dihasilkan dalam nyala. Kehadiran ion
dan
elektron
dapat
dideteksi.

Detektor

Det
ektor yang paling banyak digunakan
adalah detektor fotometer sinar
tampak atau sinar ultraviolet, dan
detektor indeks bias.
Fungsi detektor untuk mendeteksi
adanya komponen cuplikan, dan
mengukur banyaknya komponen.
Syarat-syarat yang baik detektor
adalah mempunyai kepekaan tinggi,
gangguan noise sedikit, daerah respon
linear cukup luas, memberikan respon
terhadap semua tipe senyawa, dan
tidak peka terhadap perubahan
kecepatan aliran dan perubahan suhu.

Seluruh detektor ditutup dalam oven

yang lebih panas dibanding dengan
temperatur
kolom.
Hal
itu
menghentikan
kondensasi
dalam
detektor.

Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5

Jumlah
sample

Prinsip
pemisahan /
Prinsip
kerja

Sampel cuplikan harus dimasukkan

ke dalam kolom sebagai lapisan
setipis mungkin. Ukuran sampel
sekitar 1-20 L. Dua cara untuk
melakukan injeksi: cara injeksi dan
katup pemasukan cuplikan mikro
(micro-sampling valve)

Sample harus mudah menguap dan

memiliki kstabilan termal pada suhu
pengoperasian. Sampel dimasukkan ke
dalam aliran gas melalui lubang injeksi
yang terletak pada bagian atas kolom.
Suatu aliran gas yang sinambung
mengelusi komponen-komponen dari
kolom dan kemudian mencapai
detektor yang dihububngkan dengan
suatu
sistem
pencatat.
Berikut
diagramnya

Mula-mula solven diambil melalui

pompa Solven ini kemudian masuk ke
dalam katup injeksi berputar, yang
dipasang tepat pada sample loop.
Dengan pertolongan mikrosiring,sample dimasukkan ke dalam sample
loop yang kemudian bersama-samadengan solven masuk ke dalam
kolom. Hasil pemisahan dideteksioleh detektor yang ditampilkan oleh
perekam/recorder. Tekanan solven
diatur dengan pengatur dan pengukur
tekanan. Pompa memasok solven
pada
tekanan
konstan
hingga
tekanan 4500 psi dengan laju alir
rendah, yakni beberapa milliliter per
menit.
Output
akan
direkam
sebagai
rangkaian puncak-puncak, dimana

Ada tiga hal yang dapat berlangsung

pada
molekul
tertentu
dalam
campuran yang diinjeksikan pada
kolom:
Molekul dapat berkondensasi pada
fase diam.
Molekul dapat larut dalam cairan pada
permukaan fase diam
Molekul dapat tetap pada fase gas
Dari ketiga kemungkinan itu, tak
satupun yang bersifat permanen.
Hasil akan direkam sebagai urutan
puncak-puncak;
setiap
puncak
mewakili
satu
senyawa
dalam
campuran yang melalui detektor.
Sepanjang anda mengontrol secara
hati-hati kondisi dalam kolom, anda
dapat menggunakan waktu retensi
untuk membantu mengidentifikasi

Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5
masing-masing puncak mewakili satu
senyawa dalam campuran yang
melalui detektor dan menerap sinar
UV. Sepanjang anda mengontrol
kondisi
kolom,
anda
dapat
menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa
yang diperoleh, tentunya, anda (atau
orang lain) sudah mengukur senyawasenyawa murninya dari berbagai
senyawa pada kondisi yang sama.
Jika anda menginjeksi suatu larutan
yang mengandung senyawa murni X
yang telah diketahui jumlahnya pada
instrumen, anda tidak hanya dapat
merekam waktu retensi dari senyawa
tersebut, tetapi anda juga dapat
menghubungkan jumlah dari senyawa
X dengan puncak dari senyawa yang
dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak

sebanding dengan jumlah X yang
melalui detektor, dan area ini dapat
dihitung secara otomatis melalui layar
komputer. Area dihitung sebagai
bagian yang berwarna hijau dalam
gambar
(sangat
sederhana).
Jika larutan X kurang pekat, area
dibawah puncak akan berkurang
meskipun waktu retensi akan sama.
Misalnya,

Ini
berarti
dimungkinkan
mengkalibrasi instrumen sehingga
dapat digunakan untuk mengetahu
berapa
jumlah
substansi
yang
dihasilkan meskipun dalam jumlah
kecil.

senyawa yang tampak-tentu saja anda

atau seseorang lain telah menganalisa
senyawa murni dari berbagai senyawa
pada kondisi yang sama.

Area dibawah puncak sebanding

dengan jumlah setiap senyawa yang
telah melewati detektor, dan area ini
dapat dihitung secara otomatis melalui
komputer yang dihubungkan dengan
monitor. Area yang akan diukur
tampak sebagai bagian yang berwarna
hijau
dalam
gambar
yang
disederhanakan.
Perlu dicatat bahwa tinggi puncak
tidak merupakan masalah, tetapi total
area dibawah puncak. Dalam beberapa
contoh tertentu, bagian kiri gambar
adalah puncak tertinggi dan memiliki
area yang paling luas. Hal ini tidak
selalu merupakan hal seharusnya.
Mungkin saja sejumlah besar satu
senyawa dapat tampak, tetapi dapat
terbukti dari kolom dalam jumlah
relatif sedikit melalui jumlah yang
lama. Pengukuran area selain tinggi
puncak dapat dipergunakan dalam hal
ini.

Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5

Meskipun demikian, harus berhatihati. Jika anda mempunyai dua

substansi yang berbeda dalam sebuah
campuran (X dan Y), dapatkah anda
mengatakan jumlah relatifnya? Anda
tidak dapat mengatakannya jika anda
menggunakan serapan UV sebagai
metode pendeteksinya.

4. Bagian HPLC

Bagian-Bagian Alat HPLC

Pada dasarnya instrumen HPLC terdiri dari tandon (reservoir) cairan fase gerak, pompa,
injector, kolom, detektor dan rekorder.
1. Tandon (Reservoir)
Reservoir terbuat dari gelas atau stainless steel. Jumlahnya bisa satu, dua atau lebih.
Reservoir yang baik disertai degessing system yang berfungsi untuk mengusir gas-gas terlarut dalam
solvent. Gas terlarut tersebut antara lain oksigen. Degassing dilakukan dengan mengalirkan gas inert
dengan kelarutan yang sangat kecil, misalnya helium. Sistem yang lebih lengkap disertai penyaring
debu. Debu dan partikulat yang terbawa oleh solvent dapat menyumbat kolom. Degassing dapat juga
dibuat sendiri dengan erlermeyer yang dilengkapi dengan pengaduk magnet, pemanas dan pompa
vacum. Untuk memperoleh pemisahan yang optimum dianjurkan menggunakan solvent yang masih
baru.
2. Pompa
Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak (solvent) ke dalam kolom dengan aliran yang
konstan dan reproducible. Pompa harus memenuhi persyaratan:
a) Dapat memberi tekanan sampai 6000 psi (360 atm)
b) Tekanan yang dihasilkan bebas pulsa.
c) Dapat mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 0,1 sampai 10 ml/ menit.
d) Dapat mengalirkan fase gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi.
e) Tahan terhadap korosi (biasanya terbuat dari baja atau teflon).
f) Ada beberapa jenis pompa, antara lain :
a. Reciprocating pump:

Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5
Terdiri dari ruang kecil, dimana solvent dipompa dengan piston yang bergerak maju
mundur. Tekanan yang dihasilkan dapat mencapai 10.000 psi.
b. Displacement Pump:
Terdiri dari semacam alat suntik (syring) yang besar dengan kapasitas biasanya 250
ml. Solvent dialirkan dengan menggerakkan piston.
c. Pneumatic Pump:
Terdiri dari container yang berisi solvent yang dapat ditekan dengan suatu gas.
Tekanan yang dihasilkan kurang dari 2000 psi. Sistim pemompaan ini dapat diatur secara
manual atau dengan menggunakan kontrol sistem komputer. Berkenaan dengan aliran fase
gerak, jika komposisi solvent dibuat tetap maka disebut isocratic elution. Hal ini dapat
dilakukan dengan mencampur lebih dulu dua atau lebih solvent. Kemudian langkah
selanjutnya adalah menaruhnya dalam satu reservoir atau dapat juga dengan menaruh
masing-masing solvent pada reservoir yang berbeda dengan pompa masing-masing. Jika
komposisi solvent dibuat berubah-ubah dari waktu ke waktu, maka cara ini disebut gradient
elution, yang pelaksanannya dapat diatur dengan control system.
.
3. Katup Injector:
Bagian ini merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk selanjutnya dibawa oleh fase
gerak ke dalam kolom. Ada beberapa sistem injeksi:
a. Syringe Injection;
Injeksi menggunakan syringe yang dapat memompakan sampel dengan tekanan sampai
1500
psi.
b. Stop Flow Injection:
Termasuk jenis syringe injection, hanya injeksinya dengan cara memasukkan sampel ke
dalam ruang injeksi (atau disebut mixing chamber, sementara itu aliran fase gerak dihentikan.
Setelah sampel masuk lalu fase gerak dialirkan kembali dan sampel akan terbawa.
c. Auto sampler (disebut juga Auto Injector)
Terdiri dari suatu sistem yang dikendalikan oleh control system. Sampel ditaruh dalam wadah
seperti tabung kecil bertutup. Tutup dapat ditembus oleh jarum pengisap. Sampel disedot secara
otomatis dengan sistem pompa yang untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam aliran fase gerak.
Pada auto sampler ini dapat dipasang 100 sampel sekaligus. Dengan sistem HPLC akan bekerja
sendiri melakukan analisis, termasuk mencuci sendiri sistem injeksinya setelah melakukan
injeksi.
4.Kolom (Column):
a. Bahan kolom, ukuran kolom dan ukuran partikel isi kolom.
b. Jenis Column Packing (Isi Kolom)
5. Detektor
Setelah sampel melewati kolom maka komponen-komponennya akan terpisah-pisah dan
keluar dari kolom dengan waktu yang berbeda-beda. Komponen yang sudah terpisah ini
secara berturut-turut akan melewati suatu detektor dan akan dibaca kadarnya. Detektor yang
digunakan harus sesuai dengan jenis zat yang dianalisis.
a. Detektor UV
Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi. Sampel yang dianalisis
harus menyerap sinar UV. Setelah sampel melewati kolom lalu dilewatkan Flow-cell.
Intensitas sinar keluar akan lebih kecil daripada sinar masuk karena ada yang diabsorbsi
oleh sampel. Besarnya absorbsi yang dinyatakan dengan ukuran absorban sebanding
dengan kadar zat yang dianalisis. Detektor ini sifatnya spesifik, artinya hanya dapat
digunakan untuk zat-zat yang menyerap sinar UV. Panjang gelombang sinar UV yang
biasa digunakan adalah 254 nm.
b. Detektor Fluoresensi
Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri. Sampel dikenai sinar UV yang sesuai,
maka zat ini akan berfluoresensi. Sinar yang dipancarkannya ditangkap dengan
phototube. Intensitas sinar Fluoresensi ini akan sebanding dengan kadar sampel yang
diamati.
Detektor
ini
lebih
sensitif
daripada
detektor
UV.
Pemakaian sumber sinar laser akan memberikan sensitivitas yang sangat tinggi. Untuk
zat yang tidak berfluoresensi dapat dilakukan derivitisasi yang menghasilkan zat yang
dapat berfluoresensi. Derivatisasi sering dilakukan terhadap asam amino.
c. Detektor Indeks Refraksi (Refraksi Index Detector = RID)

Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5
d. Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan indeks refraksi sampel dengan solvent. Semua
larutan suatu zat mempunyai indeks bias yang spesifik, oleh karena itu detektor ini dapat
digunakan untuk hampir semua zat.
6. Recorder
Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor kemudian dikirim ke
recorder. Recorder akan membuat suatu tampilan. Dalam kromatografi tampilan ini disebut
chromathogram. Untuk HPLC dilengkapi seperangkat software yang dapat menghitung luas
kromatogram dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya.

5. Detektor digunakan pada HPLC :

Detektor
Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum
yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.Banyak
senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu
Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak
mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.
Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan
area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian
yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
Detektor
Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter
Spektrofotometer
spektrometer photo
-diode array
Fluoresensi

Sensitifitas
(g/ml)

Kisaran
linier

Karakteristik

5 x 10-10
5 x 10-10
> 2 x 10-10

104
105
105

10-12

104

Sensitivitas bagus, paling sering

digunakan, selektif terhadap gugusgugus dan struktur-struktur yang
tidak jenuh.
Sensitifitas sangat bagus, selektif,

Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5

Indeks bias

5 x 10-7

104

Elektrokimia
Konduktimetri
Amperometri

10-8
10-12

104
105

Tidak peka terhadap perubahan suhu

dan kecepatan alir fase gerak.
Hampir bersifat universal akan tetapi
sensitivitasnya
sedang.
Sangat
sensitif terhadap suhu, dan tidak
dapat
digunakan
pada
elusi
bergradien
Peka terhadap perubahan suhu dan
kecepatan alir fase gerak, tidak dapat
digunakan pada elusi bergradien.
Hanya mendeteksi solut-solut ionik.
Sensitifitas sangat bagus, selektif
tetapi timbul masalah dengan adanya
kontaminasi elektroda.

sumber:
http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html
http://indonesiakimia.blogspot.com/2011/05/high-performance-liquid-chromatography.html
http://kuliahitukeren.blogspot.com/2011/01/alat-hplc-high-performance-liquid.html
http://mel-rizky.blogspot.com/2012/02/perbedaan-hplc-dan-gc.html