Prinsip Kerja HPLC
Prinsip Kerja HPLC
Prinsip Kerja HPLC
HPLC
1. Prinsip Kerja HPLC
Pada dasarnya prinsip kerja HPLC sama dengan kromatografi lapis tipis dan kromatografi
kolom, yang membedakan adalah fasa diam yang digunakan pada HPLC memiliki ukuran
yang lebih kecil sehingga luas permukaan besar sehingga keseimbangan antar fasa menjadi
lebih baik dan efisien.Pada HPLC tekanan yang tinggi menyebabkan fasa gerak dapat
bergerak lebih cepat sehingga difusi menjadi sekecil-kecilnya. Ukuran butir kecil pada fasa
diam dan tekanan yang tinggi pada fasa gerak pada kromatografi kolom cair secara teori akan
menghasilkan pemisahan yang sebaik-baiknya.
Fasa diam
HPLC
GC
Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5
Fasa gerak
Kolom
Ada 2 tipe:
- Kolom analitik dengan performance
tinggi, diameter dalam 1-6 mm
- Kolom preparative, diameter lebih besar
Tabung kolom dibuat dari kaca dan
baja tahan karat. Panjang kolom 0,3-6
meter atau lebih, rata-rata 0,9 m.
Kolom yang lebih panjang akan
menghasilkan resolusi bertambah
baik, tetapi perlu tekanan tinggi.
Tabung kolom dapat dikelilingi
selubung air (water jacket) untuk
pengaturan suhu. Jenis isi kolom
(kemasan kolom) tergantung cara
kromatografi yang dipakai (adsorpsi,
partisi, atau penukaran ion).
Detektor
Det
ektor yang paling banyak digunakan
adalah detektor fotometer sinar
tampak atau sinar ultraviolet, dan
detektor indeks bias.
Fungsi detektor untuk mendeteksi
adanya komponen cuplikan, dan
mengukur banyaknya komponen.
Syarat-syarat yang baik detektor
adalah mempunyai kepekaan tinggi,
gangguan noise sedikit, daerah respon
linear cukup luas, memberikan respon
terhadap semua tipe senyawa, dan
tidak peka terhadap perubahan
kecepatan aliran dan perubahan suhu.
Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5
Jumlah
sample
Prinsip
pemisahan /
Prinsip
kerja
Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5
masing-masing puncak mewakili satu
senyawa dalam campuran yang
melalui detektor dan menerap sinar
UV. Sepanjang anda mengontrol
kondisi
kolom,
anda
dapat
menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa
yang diperoleh, tentunya, anda (atau
orang lain) sudah mengukur senyawasenyawa murninya dari berbagai
senyawa pada kondisi yang sama.
Jika anda menginjeksi suatu larutan
yang mengandung senyawa murni X
yang telah diketahui jumlahnya pada
instrumen, anda tidak hanya dapat
merekam waktu retensi dari senyawa
tersebut, tetapi anda juga dapat
menghubungkan jumlah dari senyawa
X dengan puncak dari senyawa yang
dihasilkan.
Ini
berarti
dimungkinkan
mengkalibrasi instrumen sehingga
dapat digunakan untuk mengetahu
berapa
jumlah
substansi
yang
dihasilkan meskipun dalam jumlah
kecil.
Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5
4. Bagian HPLC
Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5
Terdiri dari ruang kecil, dimana solvent dipompa dengan piston yang bergerak maju
mundur. Tekanan yang dihasilkan dapat mencapai 10.000 psi.
b. Displacement Pump:
Terdiri dari semacam alat suntik (syring) yang besar dengan kapasitas biasanya 250
ml. Solvent dialirkan dengan menggerakkan piston.
c. Pneumatic Pump:
Terdiri dari container yang berisi solvent yang dapat ditekan dengan suatu gas.
Tekanan yang dihasilkan kurang dari 2000 psi. Sistim pemompaan ini dapat diatur secara
manual atau dengan menggunakan kontrol sistem komputer. Berkenaan dengan aliran fase
gerak, jika komposisi solvent dibuat tetap maka disebut isocratic elution. Hal ini dapat
dilakukan dengan mencampur lebih dulu dua atau lebih solvent. Kemudian langkah
selanjutnya adalah menaruhnya dalam satu reservoir atau dapat juga dengan menaruh
masing-masing solvent pada reservoir yang berbeda dengan pompa masing-masing. Jika
komposisi solvent dibuat berubah-ubah dari waktu ke waktu, maka cara ini disebut gradient
elution, yang pelaksanannya dapat diatur dengan control system.
.
3. Katup Injector:
Bagian ini merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk selanjutnya dibawa oleh fase
gerak ke dalam kolom. Ada beberapa sistem injeksi:
a. Syringe Injection;
Injeksi menggunakan syringe yang dapat memompakan sampel dengan tekanan sampai
1500
psi.
b. Stop Flow Injection:
Termasuk jenis syringe injection, hanya injeksinya dengan cara memasukkan sampel ke
dalam ruang injeksi (atau disebut mixing chamber, sementara itu aliran fase gerak dihentikan.
Setelah sampel masuk lalu fase gerak dialirkan kembali dan sampel akan terbawa.
c. Auto sampler (disebut juga Auto Injector)
Terdiri dari suatu sistem yang dikendalikan oleh control system. Sampel ditaruh dalam wadah
seperti tabung kecil bertutup. Tutup dapat ditembus oleh jarum pengisap. Sampel disedot secara
otomatis dengan sistem pompa yang untuk selanjutnya dimasukkan ke dalam aliran fase gerak.
Pada auto sampler ini dapat dipasang 100 sampel sekaligus. Dengan sistem HPLC akan bekerja
sendiri melakukan analisis, termasuk mencuci sendiri sistem injeksinya setelah melakukan
injeksi.
4.Kolom (Column):
a. Bahan kolom, ukuran kolom dan ukuran partikel isi kolom.
b. Jenis Column Packing (Isi Kolom)
5. Detektor
Setelah sampel melewati kolom maka komponen-komponennya akan terpisah-pisah dan
keluar dari kolom dengan waktu yang berbeda-beda. Komponen yang sudah terpisah ini
secara berturut-turut akan melewati suatu detektor dan akan dibaca kadarnya. Detektor yang
digunakan harus sesuai dengan jenis zat yang dianalisis.
a. Detektor UV
Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi. Sampel yang dianalisis
harus menyerap sinar UV. Setelah sampel melewati kolom lalu dilewatkan Flow-cell.
Intensitas sinar keluar akan lebih kecil daripada sinar masuk karena ada yang diabsorbsi
oleh sampel. Besarnya absorbsi yang dinyatakan dengan ukuran absorban sebanding
dengan kadar zat yang dianalisis. Detektor ini sifatnya spesifik, artinya hanya dapat
digunakan untuk zat-zat yang menyerap sinar UV. Panjang gelombang sinar UV yang
biasa digunakan adalah 254 nm.
b. Detektor Fluoresensi
Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri. Sampel dikenai sinar UV yang sesuai,
maka zat ini akan berfluoresensi. Sinar yang dipancarkannya ditangkap dengan
phototube. Intensitas sinar Fluoresensi ini akan sebanding dengan kadar sampel yang
diamati.
Detektor
ini
lebih
sensitif
daripada
detektor
UV.
Pemakaian sumber sinar laser akan memberikan sensitivitas yang sangat tinggi. Untuk
zat yang tidak berfluoresensi dapat dilakukan derivitisasi yang menghasilkan zat yang
dapat berfluoresensi. Derivatisasi sering dilakukan terhadap asam amino.
c. Detektor Indeks Refraksi (Refraksi Index Detector = RID)
Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5
d. Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan indeks refraksi sampel dengan solvent. Semua
larutan suatu zat mempunyai indeks bias yang spesifik, oleh karena itu detektor ini dapat
digunakan untuk hampir semua zat.
6. Recorder
Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor kemudian dikirim ke
recorder. Recorder akan membuat suatu tampilan. Dalam kromatografi tampilan ini disebut
chromathogram. Untuk HPLC dilengkapi seperangkat software yang dapat menghitung luas
kromatogram dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya.
Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati
melalui berkas pada waktu itu
Interpretasi output dari detektor
Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak
mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV.
Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom,dapat menggunakan waktu retensi untuk
membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh.
Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan
area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer.Area dihitung sebagai bagian
yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
Detektor
Absorbansi Uv-vis
Fotometer filter
Spektrofotometer
spektrometer photo
-diode array
Fluoresensi
Sensitifitas
(g/ml)
Kisaran
linier
Karakteristik
5 x 10-10
5 x 10-10
> 2 x 10-10
104
105
105
10-12
104
Amita Rusdianingrum/M0311005/KELOMPOK 5
Indeks bias
5 x 10-7
104
Elektrokimia
Konduktimetri
Amperometri
10-8
10-12
104
105
sumber:
http://lansida.blogspot.com/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerja-tinggi.html
http://indonesiakimia.blogspot.com/2011/05/high-performance-liquid-chromatography.html
http://kuliahitukeren.blogspot.com/2011/01/alat-hplc-high-performance-liquid.html
http://mel-rizky.blogspot.com/2012/02/perbedaan-hplc-dan-gc.html