METODE DILUSI (PENGENCERAN)

Paramita Koriston
(J111 14 517)
1. Pengertian dan fungsi media
Culture media atau media yang digunakan untuk pengkulturan yaitu formulasi
zat kimia yang kaya akan nutrisi yang dipersiapkan untuk menumbuhkan
mikroorganisme secara in vitro. Beberapa mikroorganisme dapat bertumbuh dengan
baik secara in vitro dengan nutrisi dari segala media umum; ada beberapa
mikroorganisme lain yang membutuhkan suatu media khusus, contohnya parasit yang
bersifat obligat tidak dapat bertumbuh pada media yang tidak hidup. 1
Suatu media harus mengandung nutrisi, memiliki kelembaban dan pH yang
sesuai, memiliki suplai oksigen yang memadai, dan memiliki temperatur yang sesuai
untuk menumbuhkan mikroorganisme dengan baik. Media diformulasi dan
dimodifikasi atau direvisi secara berkala dari makanan, air, tanah dan sampel klinis
untuk digunakan dalam proses isolasi, pengkulturan dan identifikasi mikroorganisme. 1
2. Unsur yang terkandung dalam media
Berikut adalah unsur dari culture media2:
a. Pepton, yaitu campuran dari protein yang tercerna sebagian, mengandung asam
amino, polipeptida, fosfat, dan mineral (seperti kalium dan magnesium).
b. Meat extract, mengandung produk degradasi protein, garam anorganik,
karbohidrat dan subtansi yang diperlukan untuk stimulasi pertumbuhan sel-sel
hidup (seperti vitamin dan hormon).
c. Elektrolit, berupa natrium klorida.
d. Air, sebagai sumber hidrogen dan oksigen.
e. Agar, yaitu produk alami yang berasal dari rumput laut. Agar mengandung
karbohidrat, sebagian kecil material yang menyerupai protein, dan beberapa
macam garam anorganik. Agar tidak mengandung nutrisi dan hanya digunakan
sebagai bahan pemadat, digunakan dengan konsentrasi 2-3%. Bahan ini
meleleh pada suhu 95C dan memadat pada suhu 40C.
3. Klasifikasi media
Media terbagi menjadi beberapa jenis menurut beberapa kategori:

a. Klasifikasi menurut karakteristik fisiknya:

1) Media padat, digunakan untuk mengisolasi suatu bentukan murni dari
mikroorganisme.
2) Media cair, digunakan untuk mengkulturkan bakteri dalam kuantitas yang
besar untuk menyiapkan antigen atau vaksin.2
b. Klasifikasi menurut unsur yang terkandung dan kegunaanya:
1) Media sederhana, yaitu media yang paling sederhana dan secara rutin
digunakan dalam laboratorium. Contohnya yaitu nutrient broth dan nutrient
agar.
2) Media diperkaya, yaitu media yang mengandung protein alami, seperti
darah, serum, telur dan glukosa. Contohnya yaitu glucose broth, blood
agar, chocolate agar, dan Loefflers serum agar.
3) Media selektif, yaitu media yang hanya membantu pertumbuhan
mikroorganisme tertentu saja dan mengandung zat inhibitor bagi
mikroorganisme lain. Contohnya yaitu alkaline peptone water, blood
tellurite medium, deoxycholate agar dan Aronsons medium.
4) Media diferensial, yaitu media yang mengandung suatu subtansi yang dapat
mendiferensiasikan dua tipe bakteri dengan karakter berbeda. Contohnya
yaitu MacConkey agar.
5) Media indikator, yaitu media yang mengandung subtansi tertentu yang
menghasilkan perubahan warna pada koloni sebagai hasil dari aktivitas
metabolisme dari beberapa organisme. Contohnya yaitu sugar media,
MacConkey agar, dan Wilson and Blair medium.2
c. Klasifikasi menurut kebutuhan oksigen
1) Anaerobic culture media, yaitu media yang disiapkan untuk isolasi
organisme anaerob. Contohnya Robertsons cooked meat medium dan
thioglycollate broth.
2) Mycobacterial culture media, yaitu media yang khusus digunakan untuk
mengisolasi mycobacteria. Mycobacteria membutuhkan media khusus
karena merupakan organisme yang pertumbuhannya lambat dan kulturnya
harus diinkubasikan sekitar 6 minggu dalam suhu 37C. Jadi, media khusus
untuk mycobacteria dikembangkan untuk bertahan selama masa inkubasi
yang panjang. Contohnya Lowenstein-Jensen medium dan Middlebrooks
medium.2
4. Persiapan media
Bahan medium biasanya dilarutkan, dan kemudian disterilkan. Ketika agar
digunakan sebagai bahan pemadat, medium harus dipanaskan perlahan, biasanya

hingga mendidih, untuk melarutkan agar. Pada beberapa kasus dimana interaksi dengan
komponen, misalnya metal, dapat mengakibatkan penggumpalan medium, larutan
harus disiapkan dan disterilkan terpisah sebelum mencampurkan larutan dan
mempersiapkan medium.3 Berikut adalah beberapa metode sterilisasi yang berbeda:
a. Tyndallization
Panas uap air 100C selama 30 menit dapat membunuh sel bakteri vegetatif,
tetapi tidak dengan endosporanya. Metode ini dapat dilakukan dengan
menggunakan Arnold Sterilizer. Dengan mendinginkan medium dalam
inkubator setelah dipanaskan, maka endospora yang tersisa nantinya akan
berkecambah. Setelah itu, bakteri yang telah berkecambah dari endospore
tersebut dimatikan lagi dengan mengulang proses pemanasan tadi. Apabila
proses ini diulangi selama tiga hari, medium akan menjadi steril karena semua
endospore telah berkecambah dan kemudian dibunuh dengan pemanasan uap
air. Proses ini disebut Tyndallization, sesuai dengan nama penemunya, John
Tyndall.3
b. Inpissation
Inpissation adalah metode dimana medium dipaparkan dengan panas; ini
dilakukan pada material dengan protein tinggi, seperti media yang mengandung
telur, yang tidak dapat menahan panas pada proses autoclaving. Proses ini
menyebabkan pembekuan protein tanpa mengubah susunan kimianya. Metode
ini dapat dilakukan dengan beberapa prosedur berbeda: dengan Arnold
sterilizer atau dengan specialized inpissator. Medium dipanaskan dalam suhu
75-80C selama 2 jam secara berulang setiap harinya dalam 3 hari. Inpissation
dengan menggunakan autoclave dilakukan pada suhu 85-90C selama 10
menit, lalu temperatur dinaikkan menjadi 121C dengan hanya menggunakan
uap bertekanan, dan lalu perlahan suhu diturunkan hingga kurang dari 60C. 3
c. Autoclaving
Autoclaving menggunakan uap air bertekanan, untuk membunuh
mikroorganisme. Pemanasan 15 menit pada tekanan 15 psi dan suhu 121C
adalah metode yang paling umum digunakan. Metode ini dpat membunuh sel
bakteri sekaligus endosporanya. Bagaimana pun, beberapa subtansi media tidak
dapat menoleransi panas tersebut, sehingga terkadang metode ini dilakukan
dengan suhu yang lebih rendah. Media yang mengandung karbohidrat biasanya
disterilisasi pada suhu 116-118C untuk mencegah dekomposisi karbohidrat
dan pembentukan zat toksik yang dapat menghambat perkembangan bakteri.3
d. Metode Filtrasi
Filtrasi adalah metode yang umum digunakan untuk mensterilkan komponen
yang tidak tahan panas (mengalami perubahan susunan kimia apabila terekspos
panas berlebih). Media cair dialirkan melalui kaca sinter atau membran yang

terbuat dari selulosa asetat atau nitroselulosa, dengan ukuran pori yang kecil.
Membran dengan ukuran pori 0.2 mm akan menjebak sel bakteri, sehingga
sering disebut sebagai filter bakteriologis. Dengan mencegah lewatnya bakteri,
filtrasi membuat cairan bebas dari bakteri dan mikroorganisme eukariotik, atau
bebas dari organisme, sehingga disebut steril. Banyak larutan karbohidrat,
larutan antibiotik dan larutan vitamin disterilkan dengan filter dan ditambahkan
ke media yang sudah didinginkan pada temperatur di bawah 50C.3
5. Metode isolasi dengan pengenceran bersambung
Beberapa metode diketahui dapat mengisolasi dan memperbanyak jumlah
mikroorganisme (bakteri, fungi, protozoa, alga, mycoplasma dan virus) dengan
menggunakan tanah, makanan, susu, air, dan lain-lain. Metode pengenceran
bersambung adalah salah satu prosedur yang paling umum digunakan untuk
mengisolasi jamur, bakteri dan actinomycetes. Prinsip dasar dari metode ini yaitu
ketika sampel cair yang mengandung mikroorganisme dikulturkan, masing-masing
mikroorganisme yang bertahan hidup akan berkembang menjadi suatu koloni, sehingga
jumlah dari koloni yang muncul di atas wadah (atau cawan petri) mewakili jumlah dari
organisme yang ada di dalam sampel.1
Dalam metode ini, sejumlah material yang diketahui banyaknya (10 ml atau 10
gram) dicampurkan dengan sejumlah air suling steril (90 ml untuk mendapatkan larutan
100 ml) untuk mendapatkan suspensi mikroba. Pengenceran bersambung 10-2, 10-3, 107
, dan seterusnya dibuat dengan memindahkan (dengan pipet) sejumlah volume terukur
(umumnya 1 atau 10 ml) ke dalam air suling steril (9 atau 90 ml). Terakhir, 1 ml dari
tiap-tiap larutan yang telah diencerkan ditambahkan ke dalam cawan petri dimana
kemudian dituangkan 25 ml agar steril yang masih cair (45C). Media yang digunakan
yaitu NA (nutrient agar) untuk bakteri, Saborauds agar atau Czapeks Dox agar untuk
fungi, Glycerol yeast agar untuk actinomycetes dan Wort agar untuk ragi. Umumnya,
pengenceran 10-2 hingga 10-5 dipilih untuk memperbanyak jumlah fungi, 10-3 hingga
10-6 untuk actinomycetes dan 10-4 hingga 10-7 untuk bakteria tergantung proporsinya.
Setelah agar mengeras, cawan petri kemudian diinkubasikan dalam posisi terbalik
selama 3-7 hari pada suhu yang diinginkan (28-37C). Jumlah koloni yang muncul
pada cawan petri dihitung, dirata-ratakan dan dikalikan dengan faktor pengenceran
untuk mendapatkan jumlah sel/spora atau cfu (colony per unit) per gram atau mililiter
dari sampel.1

Daftar Pustaka
1. Kango N. Textbook of microbiology. New Delhi: I.K. International Publishing
House; 2010. P.154,160.
2. Vasanthakumari R. Textbook of microbiology. New Delhi: BI Publications; 2007.
P.32-35.
3. Atlas RM. Handbook of microbiological media. 4th Ed. Boca Raton: Taylor and
Francis Group; 2010. P.8-9.