Fiksasi
Fiksasi
Fiksasi
inti (prokariota). Bakteri memiliki beragam variasi bentuk,seperti coccus, basil, dan
spiral, serta dapat hidup soliter maupun berkoloni.Habitat bakteri sangat bervariasi,
dari air, tanah, udara, hingga dalam tubuhhewan, (Betsy dan Keogh. 2005). Bakteri
umumnya tidak memiliki pigmensehingga tidak berwarna dan hampir tidak kelihatan
karena tidak kontrasdengan medium dimana mereka hidup.
Oleh karena itu, perlu dilakukanpewarnaan agar bakteri tampak jelas bila diamati
dengan mikroskop (Harleydan Presscot, 2002). Pewarnaan dikelompokkan menjadi
pewarnaan langsungdengan pewarnaan basa, pewarnaan tak langsung atau
pewarnaan negatif danpewarnaan gram (Dwidjoseputro, 2003). Pewarnaan basa
adalah pewarnaanyang langsung mewarnai bakteri. Pewarnaan negatif adalah
pewarnaan yangtidak langsung mewarnai bakteri, melainkan mewarnai latar
belakang preparatbakteri tersebut. Pewarnaan ini dilakukan dengan menggunakan
pewarna yangbersifat asam seperti nigrosin atau tinta cina (Harley dan Presscot,
2002).
Pewarnaan garam atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram positif dan gram
negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuan Denmark Hans Cristian Gram (1853-1938) yang
mengembangkan tehnik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara
pneumokokus dan bakteri klebsiella pneumoniae.
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil
ungu pada metode pewarnaan gram bakteri gram positif akan mempertahankan
warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif
tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarnaan penimbang (counterstain)
ditambahkan setelah metil ungu yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi
berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan
kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Banyak spesies bakteri gram negatif yang bersifat patogen,yang berarti mereka
berbahaya bagi organisme inang. Sifat potogen ini berkaitan dengan komponen
tertentu pada dinding sel gram negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal
juga dengan LPS atau Endotoksin).
1. Pewarnaan sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan teknik pewarnaan yang paling banyak digunakan.
Disebut sederhana karena hanya menggunakan satu jenis zat warna untuk
mewarnai organisme tersebut. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan
pewarnaan-pewarnaan sederhana karena sitoplasamanya bersifat basofilik (suka
dengan basa). Zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana
umumnya bersifat alkolin. Dengan pewarnaan sederhana dapat mengetahui bentuk
dan rangkaian sel-sel bakteri. Pewarna basa yang biasa digunakan untuk
pewarnaan sederhana ialah metilen biru, kristal violet, dan karbol fuehsin yang mana
pewarnaan sederhana ini dibagi lagi menjadi dua jenis pewarnaan.
1. Pewarnaan Asam
Merupakan pewarnaan yang menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel. Adapun zat warna yang dipakai dalam pewarnaan
positif adalah metilen biru dan air furksin.
1. Pewarnaan Basa
Pewarnaan basa atau negatif merupakan metode pewarnaan untuk mewarnai
bakteri tetapi mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini
mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang). Teknik ini berguna untuk
menentukan morfologi dan ukuran sel. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau
tinta cina.
Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu
lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai
dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding
sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-
pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel
tetap menahan warna biru (Fitria, 2009).
Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu
lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi
terlalu pendek (Fitria, 2009).
Komposisi dinding sel Kandungan lipid rendah (1-4%) Kandungan lipid tinggi
Ketahanaa terhadap
perlakuan fisik
Lebih tahan Kurang tahan
(Manurung, 2010).
Pewarnaan tahan asam yang umum digunakan adalah pewarnaan Zieh Neelson
dengan pewarna utama karbol fuksin dengan pemanasan dan pewarna tandingan
metilen blue Loeffler. Perlakuan panas tersebut diganti dengan penggunaan
pembasah yaitu suatu deterjen untuk mengurangi tegangan permukaan lemak,
untuk menjamin penetrasi. Pewarna yang mengandung pembasah ini disebut
pewarna Kinyoun (Purwoko, 2010).
1. Bacillus Safranin
Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen selular
dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Terjadi
ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada
pewarna .
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling
banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan
penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau
tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak
pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi
menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding
sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai
dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel.
1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis.
2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti
sabun, formalin, fenol.
3. Aplikasi zat warna tunggal, atau lebih dari 1 zat warna. Pewarnaan gram pada
praktikum ini dilakukan dalam 4 tahap yaitu:
4. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
5. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
6. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
7. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin.
Keempat tahap tersebut dijelaskan langsung dalam langkah percobaan di bawah ini.
Langkah selanjutnya, 1 tetes kristal violet diteteskan di atas gelas benda tersebut
kemudian didiamkan selama 30 detik. Setelah itu, gelas benda dibilas dengan
aquades hingga warnanya hilang. Kristal violet merupakan reagen yang berwarna
ungu. Kristal violet ini merupakan pewarna primer (utama) yang akan memberi
warna pada mikroorganisme target. Kristal violet bersifat basa sehingga mampu
berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam. Dengan perlakuan seperti
itu, sel mikroorganisme yang transparan akan terlihat berwarna (ungu). Pemberian
kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan warna ungu muda.
Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan gram pada bakteri adalah
didasarkan pada struktur dan komposisi dinding sel bakteri. Bakteri gram positif
mengandung protein dan gram negatif mengandung lemak dalam persentasi lebih
tinggi dan dinding selnya tipis. Kristal violet yang diteteskan didiamkan selama 30
detik bertujuan agar cat atau pewarna ini dapat melekat sempurna pada dinding sel
bakteri.
Langkah percobaan yang dilakukan oleh praktikan dimulai dengan 1 tetes sampel
yang berupa bakteri sampel A dan bakteri sampel B diteteskan di atas gelas benda
yang berbeda. Kedua gelas benda berisi sampel tersebut dipanaskan (fiksasi) di
atas bunsen burner. Hal ini bertujuan untuk menguapkan air sehingga hanya akan
didapat bakteri saja. Proses fiksasi juga bertujuan supaya bakteri benar-benar
melekat pada gelas benda sehingga olesan bakteri berupa tetesan sampel tidak
akan terhapus apabila dilakukan pencucian. Yang perlu diperhatikan dalam proses
fiksasi adalah bidang yang mengandung bakteri dijaga agar tidak terkena nyala api.
Pemberian reagen atau pewarna yang berganti dari satu pewarna ke pewarna lain
dengan waktu yang telah ditentukan disebabkan karena zat-zat warna tersebut
dapat berikatan dengan komponen dinding sel bakteri dalam waktu singkat. Karena
itulah rentang waktu pemberian zat warna yang satu ke yang lainnya tidak lama
sehingga proses identifikasi bakteri berlangsung cepat (efisiensi waktu).
Setiap akhir pemberian reagen atau pewarna, selalu dilakukan pembilasan terhadap
gelas benda dengan menggunakan aquades. pembilasan ini bertujuan untuk
mengurangi kelebihan setiap zat warna yang sedang diberikan. Setiap akhir
pembilasan pada masing-masing reagen, perlu dilakukan penyerapan air bilasan
dari aquades dengan menggunakan kertas tissu agar aquades tidak tercampur
dengan reagen atau pewarna baru yang akan diberikan. Setelah pembilasan
terakhir, gelas benda dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop. Jika terbentuk
warna ungu maka termasuk golongan bakteri gram positif , dan jika terbentuk warna
merah atau merah muda maka termasuk golongan bakteri gram negatif.
Kebanyakan sel-sel bakteri tidak berwarna, sehingga jika di lihat di bawah mikroskop
tidak memperlihatkan warna kontras. Demikian pula bagian-bagian tertentu misalnya
spora, flagella, kapsul atau dinding sel hanya dapat diamati jika dilakukan
pengecatan atau pewarnaan khusus. Dengan pewarnaan ini, bakteri mula-mula
dilapisi dengan larutan zat warna karbol gentinviolet (karbol kristal violet, karbolmetil
violet) dan didiamkan beberapa lama, kemudian disiram dengan larutan yodium dan
dibiarkan terendam dalam waktu yang sama. Sampai tingkat pewarnaan ini selesai,
semua bakteri akan berwarna ungu.
Membunuh mikroba, karena sel dalam keadaan mati lebih mudah diwarnai
daripada sel dalam keadaan hidup.
Pelunturan warna
Pelunturan warna bermaksud untuk menghilangkan warna sel yang telah diwarnai.
Senyawa ini digunakan untuk menghasilkan keadaan yang kontras pada sel mikroba
sehingga dengan jelas dapat dilihat dibawah mikroskop misalnya.
Pada umumnya sel mikroba yang mudah diwarnai akan lebih cepat pula dilunturkan,
sedangkan sebaliknya sel mikroba yang sukar diwarnai akan sulit pula untuk
dilunturkan. Sifat cepat dan lambatnya cara pelunturan inilah yang diperbedakan
untuk membedakan kelompok mikroba setelah diberi pewarnaan.
Dari segi ketahanan sel terhadap senyawa kimia, dibidang mikrobiologi dikeSnal ada
tahan asam, tahan alkohol, tahan air dan sebagainya. Ketahanan terhadap suatu zat
kimia inipun dipergunakan untuk membedakan kelompok mikroba.
VIII. Kesimpulan
5.1 Kesimpulan
Dari percobaan pewarnaan yang dilakukan dapat ditarik kesimpulan :
Pewarnaan bakteri dipengaruhi faktor-faktor antara lain fiksasi, pelunturan warna, substrat,
intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup
Perbedaan pada garam negatif dan gram positif terletak pada warnanya pada gram positif
berwarna ungu kareana dapat mempertahankan zat pewarna kristal violet serta perbadaan
terjadi pada dinding selnya
Macam-macam pewarnaan anatara lain : pewarnaan sederhana,pewarnaan
differensial,pewarnaan spora dan perwarnaan kapsul
Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain : alkohol, carbol
fuchsin, crystal violet, nigrosin, malachite green, lugols iodida, dan safranin.
5.2 Saran
Sebaiknya pada praktikum dilakukan percobaab yang lain seperti pewarnaan kapsul,
basil tahan asam, dan perwarnaan fulton, diharapkan dengan mempelajari berbagai macam
metode pewarnaan lebih banyak mengenai tentang proses dan metode pewarnaan.
DAFTAR PUSTAKA