TPC MPN Uji Bonterey
TPC MPN Uji Bonterey
TPC MPN Uji Bonterey
” TPC,
MPN,
UJI BONTEREY”
Disusun Oleh :
KELOMPOK
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Kata Pengantar
Puji serta syukur kami panjatkan atas rahmat dan karunia-Nya sehingga
kami dapat menyelesaikan makalah ini dengan penuh rasa tanggung jawab dan
tepat waktu dalam pengumpulannya.
Tujuan disusunnya makalah ini adalah untuk memenuhi salah satu tugas
mata pelajaran mikrobiologi, khususnya mengenai masalah pembelajaran
praktikum di semester 5 ini, mengenai TPC, MPN, dan Uji Bonterey dalam
metode analisa yang dilakukan, serta untuk menambah pengetahuan mengenai
Ilmu biologi/mikrobiologi.
Kami juga ingin mengucapkan terima kasih kepada semua pihak-pihak
yang telah membantu kami dalam penyusunan makalah ini.
Semoga makalah ini dapat bermanfaat bagi kami khususnya selaku
penyusun dan bagi siapa saja yang telah membacanya pada umumnya. Akhir kata
tiada gading yang tak retak, demikian pula dengan makalah ini yang masih jauh
dari sempurna. Tak lupa kritik dan saran sangat kami harapkan demi
penyempurnaan di masa yang akan datang.
Penyusun
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Daftar Isi
BAB I PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang ……………………………………………………. 1
1.2 Tujuan ……………………………………………………….……. 1
BAB II PEMBAHASAN
2.1. Perhitungan Mikroba dengan TPC ………………………………... 5
2.1.1 Pengenalan dasar Praktikum TPC……………………………. 9
2.1.2 Praktikum TPC (Angka Lempeng Total)…………………….. 11
2.2 Analisis Metode MPN ……………………………………………. 15
2.2.1 Analisis koliform metode MPN……………………………… 15
2.2.2 Praktikum MPN secara umum……………………………….. 18
2.2.3 Pengujian Escherichia coli…………………………………… 21
2.2.4 Analisis kualitas dan sanitasi air……………………………... 23
2.3 Uji Bonterey ……………………………………………………….. 26
2.3.1 Fermentasi karbohidrat………………………………………. 27
2.3.2 Uji IMVIC……………………………………………………. 33
2.3.3 Penggunaan citrat…………………………………………….. 44
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk
berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam cara untuk
menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara
yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan
secara langsung, antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan
(preparat sederhana diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung
(counting chamber). Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk
mengetahui jumlah mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja
(viabel count). Dalam pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada
cawan petri (total plate count / TPC), perhitungan melalui pengenceran,
perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN metode), dan kalorimeter (cara
kekeruhan atau turbidimetri).
Tujuan dari analisa ini adalah agar siswa/pratikan mampu melakukan uji
bakteriologis terhadap air minum dengan metode MPN (Most Probable Number).
Pengujian bakteri koliform yang berasal dari cemaran tinja (faecal koliform)
secara serentak dengan uji penegasan yang menggunakan media BGLB, maka
dilakukan juga hal yang sama yaitu 1 ose kultur yang positif dari LST Broth atau
LB, dipindahkan ke dalam tabung EC medium yang baru. Semua tabung MC
medium yang telah diinokulasikan oleh kultur dari LST-Broth, kemudian
diinkubasikan pada suhu 45,5°C selama 24 jam dan hasil pembentukan gas
dicatat. Kerapatan bakteri faecal koliform diperkirakan dengan tabel MPN.
Diferensiasi bakteri koliform dapat diarahkan ke dalam reaksi IMVIC.
Berbagai macam uji mokrobiologis dapat dilakukan terhadap bahan pangan,
meliputi uji kuantitatif mikroba untuk menentukan daya tahan suatu makanan, uji
kualitatif bakteri patogen untuk menentukan tingkat keamanan dan uji indikator
untuk menentukan tingkat sanitasi makanan tersebut. Pengujian yang dilakukan
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
terhadap tiap bahan pangan tidak sama tergantung berbagai faktor, seperti jenis
dan komposisi bahan pangan, cara pengepakan dan penyimpanan serta
komsumsinya, kelompok konsumen dan berbagai faktor lainnya
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
c) Uji Bonterey
Secara garis besar dan umum, uji bonterey dapat diartikan sebagai proses
uji ada tidaknya aktivitas yang ditimbulkan oleh suatu mikroba melalui
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
penguraian suatu zat oleh aktivitas mikroba/bakteri yang dikenal dengan nama
reaksi fermentasi dari suatu sampel.
Terdapat beberapa uji biokimiawi dan mikrobiologi yang diperlukan untuk
proses identifikasi suatu mikroorganisme, baik yang dikenal maupun yang tidak
dikenal, diantaranya adalah :
1.2 Tujuan
1. Mampu memenuhi salah satu tugas mata pelajaran mikrobiologi, yakni
pembuatan makalah tentang TPC (Total Plate Count), MPN (Most
Probable Number), dan Uji Bonterey (Uji Identifikasi Mikroba), tepat
waktu dalam pengumpulannya.
2. Pemahaman tentang pola pengajaran di dalam praktikum dengan referensi
yang tepat, dalam pelaksanaannya
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
BAB II
PEMBAHASAN
Metode Pengencerannya :
Dengan pengenceran, disiapkan beberapa buah tabung yang berisi aqua-des
steril sebanyak 9 mL. Kepada masing-masing tabung kemudian ditambahkan 1
mL sampel yang mau diperiksa secara bertahap, yaitu :
a) 1 mL sampel ke dalam tabung pertama, hingga konsentrasi larutan di
dalam tabung pertama menjadi 10-1.
b) 1 mL dari tabung pertama dimasukan ke dalam tabung kedua, hingga
konsentrasi larutan di dalam tabung kedua menjadi 10-2.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
jika sampel yang kita bawa dari bahan alami, yaitu jenis sampel terbuka, berbeda
dengan sampel tertutup, karena hal ini pasti dibedakan tergantung dari jenis
sampel yang sedang kita analisis.
Dari tiap-tiap tabung kemudian diambil 1 mL larutan dan ditanamkan ke
dalam cawan petri berisi media pdat. Pertumbuhan koloni yang timbul pada tiap-
tiap cawan, dihitung. Di dalam cawan petri ini harus diperhitungkan faktor
kerapatan pertumbuhan koloni. Karena kalau pertumbuhan terlalu rapat, biasanya
sulit untuk dipertanggung-jawabkan hasil yang telah di dapat. Juga untuk
pertumbuhan yang terlalu jarang, sehingga diperlukan adanya pemilihan cawan
yang ditumbuhi koloni yang paling tinggi kemungkinannya untuk dihitung. Dan
hal yang perlu dicatat pengenceran ini dilakukan untuk mempermudah proses
pengamatannya juga, karena semakin encer sampel suatu larutannya, maka
kemungkinan untuk tumbuhnya pun semakin besar, dan mikroba yang tampak
pun akan semakin sedikit.
Dari gambaran di bawah ini terlihat jelas bahwa cawan yang paling
memungkinkan untuk dihitung adalah cawan yang diisi pengenceran 10-3
(1/1.000) yang menghasilkan jumlah koloni 159 sel. Sehingga perhitungan
menjadi :
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Catatan penting :
Pada langkah pengerjaan praktikum TPC hal yang paling utama dilaksanakan
adalah melakukan semua pekerjaan secara aseptis dan menyelesaikan semua
metode pemipetan dari botol sampel ke tabung-tabung, dan ke dalam cawan petri
setelah itu daru menambahakan 15 mL PCA suhu 45ºC - 50ºC.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
1. Peralatan
a) Timbangan dengan ketelitian 0,0001 g;
b) Autoclave;
c) Inkubator 35 °C ± 1°C
d) Anaerobic jar;
e) Cawan petri 15 mm x 90 mm;
f) Botol pengencer 20ml;
g) Alat penghitung koloni;
h) Blender beserta Jar yang dapat disterilisasi atau stomacher;
i) Batang gelas bengkok diameter 3 mm–4 mm, dengan panjang tangkai 15
cm-20cm;
j) Pipet gelas atau pipetor : 0,1 ml, 1 ml, 5 ml dan 10 ml.
2. Bahan
a) Sampel susu murni
b) PCA (Plate Count Agar) dalam tabung sebanyak 20 mL.
c) Larutan pengencer
Prosedur
HARI PERTAMA :
Metoda cawan agar tuang/pour plate method
a) Pipet 1ml dari setiap pengenceran 10-1,10-2, dst dan masukkan ke dalam
cawan Petri steril. Lakukan secara duplo untuk setiap pengenceran.
b) Tambahkan 12 ml - 15 ml PCA yang sudah didinginkan dalam waterbath
hingga mencapai suhu 45°C ± 1°C ke dalam masing-masing cawan yang
sudah berisi contoh. Supaya contoh dan media PCA tercampur sempurna
lakukan pemutaran cawan ke depan ke belakang dan ke kiri-ke kanan.
CATATAN : Untuk pengujian bakteri termofilik, penambahan media PCA kedalam cawan sebanyak 40 ml - 50 ml.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
HARI KEDUA :
1. Menghitung jumlah koloni pada lempengan agar. Gunakan lempengan
agar yang mempunyai 30 – 300 koloni. Bila tidak ada lempengan yang
mempunyai kisaran jumlah koloni tersebut, gunakan lempengan agar yang
mempunyai koloni sekitar 300. Dan apabila tidak terdapat jumlah koloni
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
(a) penghitungan jumlah hidup, lazimnya dilakukan dengan cara memasukkan volume suspensi tertentu
dalam cawan Petri. Lempengan agar diinkubasikan, kemudian dihitung jumlah koloni yang tumbuh setelah
masa inkubasi. Bila kandungan mikroorganisme dalam sampel terlampau banyak, artinya berkisar dalam
jumlah yang tinggi, maka sampel harus diencerkan.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas mikrobiologi air
dalam praktikum digunakan kelompok Koliform sebagai indikator. Kelompok
Koliform mencakup bakteri yang bersifat aerobik dan anaeorobik fakultatif,
batang gram negatif dan tidak membentuk spora. Koliform memfermentasikan
laktosa dengan pembentukkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35°C.
Dalam metode MPN digunakan medium cair, berbeda dengan metode cawan
yang menggunakan medium padat (Agar). Perhitungan dilakukan berdasarkan
jumlah tabung yang positif, yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi
pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung positif dapat dilihat dengan
timbulnya kekeruhan atau terbentuk gas dalam tabung durham.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Cara mengerjakan :
Hari pertama
1. Memipet 10 mL sampel air dalam 5 tabung lauryl tryptose broth
konsentrasi 2x.
2. Melakukan proses inokulasi lauryl tryptose broth dengan biakan E,coli.
Biakan ini merupakan control positif.
3. Menginkubasi deretan tabung ini pada suhu 35ºC selama 48 jam!
Hari kedua
1. Mengamati tabung lauryl tryptose broth 2x. media ini merupakan media
penyubur bagi kelompok koliform. Menyimpan tabung yang menunjukkan
hasil yang positif.
2. Menyediakan tabung kaldu BGBL dan tabung E.coli. kaldu BGBL
menyuburkan koliform, sedangkan kaldu E.coli serta suhu inkubasi
menyuburkan koliform asal-tinja.
3. Menginokulasi kaldu BGBL dan E.coli dengan 1 mata ose lauryl tryptose
broth yang menunjukkan hasil positif. Kemudian menyediakan kontrol
positif dengan menginokulasikan kedua media tersebut dengan E.coli.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Hari ketiga
1. Dari tabung BGBL yang menunjukkan hasil positif, gores lempengan agar
EMB. Inkubasi pada suhu 35ºC selama 24 jam.
2. Membandingkan angka indeks yang diperoleh dari tabung BGBL dengan
tabel MPN untuk koliform!
3. Kemudian lakukan hal yang sama untuk tabung E.coli untuk koliform
asal-tinja.
24 jam
Uji peneguhan
48 jam
(BGBL broth)
24 jam
Koliform asal-tinja
48 jam
E.coli broth
Uji Lengkap
Jumlah koloform : MPN/100mL
Asal-tinja : MPN/100mL
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
adanya pembentukan gas yang dapat diamati pada tabung durham. Sedangkan
Salmonella dan P. aeruginosa tidak dapat mengubah warna media karena tidak
memfermentasi laktosa, sedangkan mikroba lain yang mampu memfermetasi
laktosa dan mempunyai ekspresi pada media seperti E. coli adalah Enterobacter
aerogenes. Adapun cara memilah E. aerogenes antara lain dengan reaksi indole.
E. coli mempunyai reaksi positif, sedang E. aerogenes bereaksi negatif. Dengan
sifat tersebut media ini sangat baik untuk memilah E. coli dari mikroba lain pada
tahap awal terutama P. aeroginosa; S. aureus dan Salmonella.
Escherichia coli merupakan bakteri yang memiliki bentuk batang lurus, 1,1 –
1,5 µm x 2,0 – 6,0 µm, motil dengan flagelum peritrikus atau nonmotil.
Merupakan kelompok bakteri Gram negatif. Dapat tumbuh dengan mudah pada
medium nutrient sederhana. Dengan laktosa yang difermentasikan oleh sebagian
besar galur dengan produksi asam dan gas. Kandungan G+C DNA adalah 50
sampai dengan 51 mol %.
Escherichia coli merupakan penghuni normal saluran pencernaan manusia
dan hewan berdarah panas. Biasanya tidak patogenik. Anggota lain kelompok
koliform ialah Klebsiella pneumoniae, yang tersebar luas di alam; terdapat dalam
tanah, air dan padi-padian, dan juga dalam saluran pencernaan manusia dan
hewan. Dalam melakukan analisa untuk uji dari suatu cemaran yang dilakukan
dapat digunakan beberapa spesies atau kelompok bakteri telah dievaluasi untuk
menentukan sesuai tidaknya untuk organisme indikator. Di antara organisme-
organisme yang dipelajari, yang hampir memenuhi semua persyaratan suatu
organisme indikator yang ideal adalah Escherichia coli dan kelompok bakteri coli
lainnya yang dianggap sebagai indikator polusi tinja.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Jika dikaji lebih lanjut, suatu badan air, disini misalnya kolam ikan, dimasuki
buangan organik, misalnya yang berasal dari manusia dan kegiatan di dalam
rumahnya akan menyebabkan terjadinya gejolak kehidupan berbentuk siklus yang
dinamakan Siklus Biologis dinamis
Yaitu :
1) Manusia menghasilkan buangan berbebtuk urin, tinja, dan sampah ke
dalam perairan (kolam ikan misalnya).
2) Oleh bakteri buangan tersebut akan diuraikan menjadi ion-ion tertentu
yang sesuai dengan benda asalnya.
3) Hasil uraian akan digunakan oleh bakteri itu sendiri dan mikroalge untuk
pertumbuhan biomassa-sel, juga akan merupakan sumber nutrient untuk
tanaman air (misalnya kangkung, eceng, genjer, dsb).
4) Akibat dari adanya biomassa-mikroalge, proses fotosintesis akan terjadi
dengan menghasilkan oksigen yang dibutuhkan oleh bakteri menguraikan/
mengoksidasikan buangan.
5) Juga biomassa-mikroalge merupakan makanan utama dari Zooplankton,
zooplankton merupakan sumber utama makanan ikan/hewan kecil, serta
ikan/hewan air kecil merupakan sumber utama makanan ikan besar, serta
akhirnya ikan merupakan suber protein, lemak, dan karbohidrat bagi
manusia.
6) Juga tanaman air, akhirnya akan merupakan sumber karbohidrat, lemak,
vitamin dan protein bagi manusia.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
pembentukan asam ini ditandai oleh perubahan warna menjadi kuning. Pada pH >
7.0, merah fenol berwarna merah sedangkan bromocresol purple berwarna ungu.
Pada pengamatan di atas kita dapat mengetahui hal yang paling mendasar dari
reaksi fermentasi kabohidrat di dalam tabung Durham. Perbandingan yang
diperoleh antara salah satu tabung yang dicampur atau diisi dengan asam akan
menyebabkan berawarna kuning, sehingga akan terlihat reaksi fermentasi
karbohidrat secara jelas di pandangan dalam membedakan dari warna.
Proses selanjutnya :
Setelah diperoleh koloni-koloni dalam keadaan terpisah dalam lempeng
pembiakan, maka tindakan selanjutnya ialah mengadakan pemeriksaan sifat-sifat
biokimia yang penting untuk menunjang diagnosis yang ingin ditegakkan. Selain
itu isolasi dalam keadaan murni pada koloni itu digunakan untuk mengetahui
reaksi fermentasi terhadap jenis-jenis gula yang termasuk golongan
monosakarida, disakarida, dan polisakarida. Caranya adalah sebagai berikut.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Gambar 14.1
Struktur antigenik Salmonella typhi.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Cara mengerjakan :
Hari pertama
1. Menandai tabung kaldu karbohidrat dengan : Jenis karbohidrat, nama
pembuat, biakan yang diinokulasikan, biakan yang digunakan untuk deret
karbohidrat pertama adalah E.Coli, deret kedua aureus, ketiga M.Luteus.
deret ke kempat S.cerevisiae dan deret kelima sebagai kontrol
2. Menginokulasikan deret karbohidrat pertama dengan E,coli, deret kedua
dengan S.aureus, deret ketiga dengan M.luteus dan deret keempat dengan
S.cerevisiae dan deret kelima sebagai kontrol. Dan melakukan inkulasi
dengan proses yang hati-hati sehingga tidak menimbulkan gelembung-
gelembung gas dalam tabung Durham.
3. Menginkubasikan kelima deret tabung di dalam incubator 35ºC selam 24
jam.
Hari kedua
1. Memeriksakan adanya fermentasi karbohidrat dengan melihat
pembentukan asam dan pembentukan gas. Pembentukan asam terlihat
sebagai perubahan warna kaldu karbohidrat menjadi kuning. Pembentukan
gas terlihat di dalam tabung Durham. Memperhatikan bahwa di dalam
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Dalam kaitannya dengan karbohidrat, ada beberapa cara uji yang dapat
dilakukan secara kualitatif untuk mengetahui karbohidrat untuk difermentasikan.
1) Uji Fehling, Barfoed, Benedict (ada tidaknya monosakarida).
2) Uji Antron (penentuan adanya gula dalam darah).
3) Uji Mollisch (karbohidrat secara umum).
4) Uji Selliwanof (penentuan fruktosa dalam sampel).
5) Uji Tauber (ada tidaknya pentosa dalam sampel).
6) Uji Iodin (ada tidaknya glikogen atau Eritrodekstrin).
7) Fenil-Hidrazin (untuk menentukan gugus karbonil lepas).
2.3.2 Uji IMVIC
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
pembentukan indol dapat diketahui dengan reagens Ehrlich atau Kovacs, yang
mengakibatkan medium berwarna merah. Cara pengerjaannya adalah sebagai
berikut.
1. Medium pembiakan cair yang telah ditanam dieramkan selama 24 sampai
48 jam.
2. Reagens Ehrlich yang disediakan terdiri dari:
a. Para-dimetil-amino-benzaldehida = 9 g
b. Etil-alkohol = 190 ml
c. Asam klorida (pekat) = 40 ml
3. Ke dalam biakan ditambahkan 1 ml eter atau silol, dikocok, sehingga
tersebar rata di seluruh cairan, kemudian didiamkan sampai semua eter
atau silol berkumpul di permukaan.
4. Reagens diteteskan perlahan-lahan melalui dinding tabung sebanyak
kirakira 0,5 ml. Bila indol positif maka tampak cincin merah terbentuk di
batas cairan medium dan eter atau silol.
Indol dibentuk dari asam triptofan sebagai hasil aktivitas hidrolisis beberapa
spesies bakteri. Dalam hal ini yang perlu diperhatikan dalam medium pembiakan
hanya digunakan pepton yang mengandung asam amino. Indol adalah zat yang
dapat menguapkan dan dapat diperiksa adanya dengan penambahan
pdimetilaminobenzaldehida, atau dengan sepotong kertas yang diimpregnasi
dengan asam oksalat, kemudian diselipkan antara mulut tabung dan tutup kapas.
Penggunaan eter atau silol dimaksudkan untuk mengekstraksi indol dari medium,
karena indol dapat larut dalam eter atau silol, sehingga bila jumlah indol sedikit
dapat dikumpulkan ke permukaan medium dan bereaksi dengan reagens di
permukaan medium berupa cincin merah.
Uji indol ini dilakukan pada dasarnya adalah dengan menginokulasikan
biakan yang akan diujikan untuk melakukan teknik analisis mengidentifikasikan
suatu mikroba.
2. UJI METHYL RED
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Pada kaldu gula yang berisi tabung Durham, dapat diketahui kemampuan
mikroorganisme untuk memfermentasikan karbohidrat, tetapi hasil produksi
fermentasi tidak diketahui. Dalam praktikum digunakan media MR – VP untuk
mengetahui fermentasi asam campuran atau fermentasi butana-diol.
Uji Methyl red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam
campuran. Beberapa bakteri memfermentasikan glukosa dan menghasilkan
berbagai produk yang bersifat asam sehingga akan menurunkan pH media
pertumbuhannya menjadi 5.0 atau lebih rendah. Penambahan indikator pH
“Methyl red” dapat menunjukkan adanya perubahan pH menjadi asam. Methyl
red berwarna merah pada lingkungan dengan pH 4.4 dan berwarna kuning dalam
lingkungan dengan pH 6.2.
GAMBAR. Keterikatan antara pembentukan asam dan waktu inkubasi sewaktu proses fermentasi
campuran mikroorgansime menghasilkan berbagai asam, sehingga menurunkan pH medium menjasi 5.0
atau menjadi lebih rendah.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Gambar
Bakteri Escherichia coli.
Pada dasarnya pengerjaan praktikum Uji Methyl Red ini digunakan untuk
mengetahui perbedaan dan menggolongkan, serta memisahkan dua bakteri yang
tergolong mikroba yang patogen, yakni antara Escherichia coli dan bakteri
patogen Enterobacter aerogenes. Dengan menggunakan reagens methyl red yang
dapat mengidentifikasikan kedua bakteri tersebut untuk dapat digunakan dalam
tahapan proses pengerjaan analisa selanjutnya, terutama dalam hal identifikasi
mikroba patogen dari suatu bahan atau sampel.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Cara mengerjakan :
Hari pertama
1. Menandai tabung kaldu MR – VP dengan biakan bakteri yang digunakan.
2. Menginokulasi kaldu MR – VP dengan biakan bakteri.
3. Menginkubasikan dalam suhu 35ºC selam 5 x 24 jam.
Hari kedua
1. Menambahkan 5 tetes reagens methyl red ke dalam tabung MR – VP.
2. Melaporkan hasilnya.
Uji bersifat positif apabila kaldu berwarna merah setelah penambahan
reagens methyl red.
Uji bersifat negatif apabila kaldu MR – VP berubah menjadi kuning atau
jingga setelah penambahan reagens.
Esherichia coli
Enterobacter aerogenes
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
3. Uji Voges-Proskauer
Uji ini digunakan dan dilakukan untuk mengidentifikasi mikroorganisme yang
melaksanakan fermentasi 2.3-butanadiol. Bila bakteri memfermentasikan
karbohidrat menjadi 2.3 butanadiol sebagai produk utama, akan terjadi
penumpukan bahan tersebut dalam media pertumbuhan. Penambahan 40% KOH
dan 5% larutan alpha-naphtol dalam ethanol dapat menentukan adanya asetoin
(asetilmetilkarbinol), suatu senyawa pemuka dalam sintesis 2.3-butanadiol. Pada
penambahan KOH, adanya asetoin ditunjukkan oleh perubahan warna kaldu
menjadi merah muda. Perubahan warna ini diperjelas dengan penambahan larutan
alpha-naphtol. Perubahan warna biakan lebih jelas terlihat pada bagian yang
berhubungan dengan udara, karena sebagian 2.3-butanadiol dioksidasikan kembali
menjadi asetoin sehingga memperjelas hasil reaksi. Berdasarkan hal ini tabung
yang berisi tabung dikocok sehingga berbuih, kemudian dibuka tutup tabungnya
dan dimiringkan di atas meja kerja.
Uji Vorges-Proskauer ini sebenarnya merupakan uji tidak langsung untuk
mngetahui adanya 2.3-butanadiol dan selalu didapatkan secara serentak, sehingga
uji VP absah untuk menentukan adanya 2.3-butanadiol.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Hari kedua
1. Menambahkan 10 tetes larutan 40% KOH dan 15 tetes larutan alpha-
naphtol dalam kaldu MR – VP. Kemudian mengocok tabung sehingga
dengan baik meningkatkan aerasi sehingga terjadi peningkatan oksidasi
2.3-butanadiol menjadi asetoin dan memperjelas hasil reaksi uji ini. Hasil
reaksi dapat terlihat paling lambat setelah 30 menit.
2. Melaporkan hasil pengujian yang telah dilakukan. Uji ini bersifat positif
apabila kaldu berwarna merah dalam waktu 30 menit setelah penambahan
reagens. Uji yang bersifat negatif ini apabila kaldu MR – VP tidak
memperlihatkan perubahan warna setelah penambahan reagens.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Pengujian ini dikorelasikan dengan adanya sitokrom dalam kadar yang tinggi,
yang dapat dipakai untuk mengenal bakteri tertentu yang termasuk dalam genus
Pseudomonas dan Neisseria. Oksidasi dari p-aminodimetilanilina menjadi warna
merah tua sampai hitam, dapat dipakai sebagai ukuran aktivitas sitokrom.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Uji Katalase
Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian H 2O2 (Hidrogen
Peroksida) menjadi air dan O2 (Oksigen). Hidrogen Peroksida bersifat toksik
terhadap sel karena bahan ini menginaktivasikan enzim dalam sel. Hidrogen
peroksida terbentuk sewaktu metabolisme aerob, sehingga mikroorganisme yang
tumbuh dalam lingkungan aerob harus menguraikan bahan toksik tersebut.
Katalase adalah salah satu enzim yang digunakan mikroorganisme untuk
menguraikan Hidrogen peroksida, enzim lainya yang dapat menguraikan
Hidrogen peroksida adalah peroksidase. Pada penguraian hidrogen peroskidase
oleh peroksidase tidak dihasilkan oksigen.
Uji katalse berguna dalam identifikasi kelompok bakteri/mikroba tertentu.
Pada bakteri berbentuk kokus, uji katalase digunakan untuk membedakan
Staphylococcus dan Streptococcus. Kelompok Streptococcus ini bersifat katalase-
negatif sedangkan Staphylococcus ini bersifat katalase-positif. Penentuan adanya
katalase diuji dengan larutan 3% H2O2 pada koloni terpisah. Pada bakteri yang
bersifat katalase-positif terlihat pembentukan gelembung udara sekitar koloni.
4. UJI CITRAT
Uji sitrat digunakan untuk melihat kemampuan mikroorganisme menggunakan
sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon dan energi. Untuk uji ini dapat
digunakan medium sitrat – koser berupa medium cair atau medium sitrat –
Simmon berupa medium padat. Simmon’s sitrate agar merupakan medium sintetik
dengan Na sitrat sebagai satu-satunya umber karbon, NH4+ sebagai sumber N dan
brom thymol blue sebagai indikator pH, sedangkan medium sitrat – Koser tidak
mengandung indikator. Apabila mikroorganisme mampu menggunakan sitrat,
maka asam akan dihilangkan dari medium biakan, sehingga menyebabkan
peningkatan pH dan mengubah warna medium dari hijau menjadi biru. Perubahan
dari warna hijau menjadi biru ini menunjukkan bahwa mikroorganisme mampu
menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon. Sedangkan pada
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Cara mengerjakan :
Hari pertama
1. Menandai tabung Simmon’s citrate agar dengan nama, tanggal, dan nama
mikroorganisme yang akan diujikan.
2. Menginokulasi tabung agar dengan inokulum yang tiptis. Inokulum yang
tebal kadangkala menyebabkan mikroorganisme seakan-akan dapat
tumbuh dalam simmon’s citrate agar, sehingga hasil yang tidak benar.
3. Menginkubasi di suhu 35ºC selam 48 jam.
Hari kedua
1. Memperhatikan atau mengamati perubahan warna dengan melihat
pertubuhan dan perubahan warna dari warna hijau ke warna biru.
2. Melaporkan hail pengujian yang telah dilakukan
Format Laporan Uji Citrat
Warna setelah Kesimpulan hasil
Mikroorganisme
masa inkubasi pengujian
E.coli
E.aerogenes
P.vulgaris
P.aeroginusa
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Uji untuk melihat penggunaan sitrat, hidrolisis urea dan likuifikasi gelatin
sangat berguna dalam pencirian mikroorganisme. Penggunaan sitrat merupakan
salah satu uji dari deretan Uji IMVIC yang digunakan dalam pencirian bakteri
koliform. Hidrolisis urea sering kali digunakan untuk membedakan Salmonella
dari Proteus yang merupakan kuman patogen pada saluran urinaria, namun dapat
pula ditemukan dalam spesimen sebagai kuman non-patogen. Hidrolisis gelatin
sering digunakan dalam membedakan spesies tertentu Pseudomonas dan
mikroorganisme dalam saluran pencernaan.
Hidrolisis Gelatin
Gelatin adalah protein yang diperoleh pada waktu merebus tulang, tulang
rawan atau tenunan ikat hewani lainnya. Protein ini bila didinginkan membentuk
“gel”. Beberapa mikroorganisme tertenu mampu menguraikan molekul sehingga
asam amino yang dihasilkan dapat digunakan sebagai zat hara. Hidrolisis gelatin
oleh mikroorganisme tersebut dikatalisasikan oleh eksoenzim yang disebut
gelatinase. Gelatin yang telah dicerna tidak mampu membentuk gel dan cenderung
bersifat cair. Kemampuan untuk mencernakan gelatin dapat digunakan dalam
pencirian mikroorganisme. Sebagai contoh, serratia marcescens dapat dibedakan
dari Klebsiella pneumonia atau Escherichia coli bedasarkan kemampuan
mencernakan gelatin. Hidrolisis gelatin dapat pula digunakan untuk mengetahui
sifat patogen galur mikroorganisme karena sering kali dikaitkan dengan produksi
enzim untuk menguraikan bahan pengikat tenunan untuk memudahkan
penyebaran mikroorganisme.
Dalam Laboratorium, pencairan gelatin diuji dengan cara menusukkan
mikroorganisme yang akan diuji ke dalam media semi-padat yang mengandung
nutrient broth dan gelatin. Media ini diinkubasikan dan diamati kemampuan
mikroorganisme mencairkan gelatin. Pada suhu 35ºC, gelatin dapat mencair
apabila diinokulasikan dengan mikroorganisme yang mampu mapun tidak mampu
mencairkan gelatin. Berdasarkan hal tersebut, gelatin harus dimasukkan ke dalam
lemari es selam 30 menit untuk mengetahui kemampuan mikroorganisme
mencairkan gelatin. Apabila mikroorganisme mampu mencerna gelatin, maka
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
media semi-padat gelatin tetap bersifat cair setelah dikeluarkan dari lemari es.
Sebaliknya bila mikroorganisme tidak mampu mencerna gelatin, maka media
semi-padat gelatin membeku kembali, setelah dikeluarkan dari lemari es.
Cara mengerjakan :
Hari pertama
1. Menandai tabung gelatin dengan nama, tanggal pembuatan,
mikroorganisme yang akan diujikan.
2. Media diinokulasikan dengan cara menusukkan mikroorganisme yang
akan diujikan sedalam ¾ bagian dari lapisan permukaan.
3. Menginkubasikan pada suhu 35ºC selam 24 jam.
Hari kedua
1. Mengamati pertumbuhan dalam media gelatin, kemudian masukkan
tabung ke dalam lemari es selama 30 menit.
2. Mengamati pencairan gelatin setelah dikelauarkan dari lemari es.
Pencairan gelatin dapat dilihat dengan memiringkan tabung. Apabila
gelatin tetap dalam keadaan cair, maka mikroorganisme mampu
mencernakan atau menghidrolisiskan gelatin. Beberapa mikroorganisme
mampu mencernakan gelatin namun memerlukan waktu yang relatif lama.
Ini berarti bahwa medium gelatin harus diinkubasikan kembali selama 1
minggu sebelum dapat dinyatakan pengujian bersifat negatif. Laporkan.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
Hidrolisis Urea
Beberapa mikroorganisme mampu menghasilkan enzim urease yang
menguraikan urea menjadi ammonium dan CO2. aktivitas enzim urease ini dapat
diamati dengan menumbuhkan mikroorganisme dalam media biakan yang
mengandung urea dan indikator pH (biasanya phenol-red). Apabila
dihidrolisiskan, NH4+ terakumulasi dlam media menjadi basa. Perubahan warna
dari merah-jingga menjadi merah-ungu merupakan petunjuk terjadinya hidrolisis
urea. Urea bersifat stabil, sehingga media urea tidak dapat disterilkan dengan
autoclave. Sterilisasi dilakukan dengan cara filtrasi (penyaringan).
Genus Proteus dapat dibedakan dari beberapa bakteri Gram negatif lain
karena kesanggupannya menghasilkan banyak enzim urease. Bila dalam biakan
terdapat urease, urea dihidrolisis, sehingga terbentuk amonia yang mengubah
warna indikator dari kuning menjadi merah.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
BAB III
PENUTUP
3.1 Kesimpulan
Dalam kehidupan yang kita jalani ini alangkah baiknya kita dapat melakukan
suatu kegiatan yang bermanfaat dan berguna bagi orang lain kelak. Pastinya
dengan menggunakan metode yang tepat dan benar. Dengan pembelajaran
mikrobiologi ini kami dapat memahami tentang arti pentingnya sebuah usaha
yang baik dan terarah. Dengan metode TPC, MPN, dan Uji Bonterey yang telah
difahami dan dipelajari, maka kita akan dapat membantu khalayak luas dan ramai,
khususnya masyarakat disekitar kita ataupun keluarga kita, dan umumnya adalah
seluruh umat manusia ini, tentunya dalam perihal kaitannya dengan masalah
mikroorganisme. Dengan usaha dan niat yang baik serta ilmu pengetahuan yang
telah diperoleh maka dapat meningkatkan kefahaman dan wawasan tentang
kegiatan praktikum yang akan dilakukan di semester 5 ini.
3.2 Saran
Memberikan pengetahuan serta wawasan kepada masyarakat atau siswa
tentang pembelajaran yang terdapat di semester 5 ini, dalam suatu pokok
pembahasan yang dapat digunakan atau dimanfaatkan sebagai pegangan dalam
pengerjaan praktikum mikrobiologi. Serta menyampaikan bahwa TPC, MPN, dan
Uji Bonterey ini merupakan jenis praktikum terapan yang dapat diaplikasikan di
dalam kehidupan nyata dan merealisasikannya dalam dunia ini.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
DAFTAR PUSTAKA
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI
TPC, MPN, Uji Bonterey
LAMPIRAN
Lampiran pekerjaan :
• Dimas Seto Prasetyo :
Mencari bahan, mengetik, editing, konsep makalah, print.
• Hanifa Handayani :
Mencari bahan, mengetik, print, dan jilid.
…..
MAKALAH MIKROBIOLOGI