KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

I. TUJUAN PERCOBAAN
 Setelah melakukan percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat:
Melakukan analisa sampel (zat warna) secara kromatografi lapis tipis

II. ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN

a. Alat yang Digunakan
· Pelat TLC
· Chamber Chromatography
b. Bahan yang Digunakan
· Pewarna Sintesis
· Pewarna Kue
· Tinta
· Ethanol

III. DASAR TEORI

KLT (kromatgrafi Lapis Tipis)/TLC (Thin Layer Chromatography) merupakan salah satu
cara untuk memisahkan dan menganalisa zat dalam jumlah yang kecil. Pada TLC, adsorben
tersebar secara merata dalam permukaan gelas dan membentuk suatu lapisan tipis, terbentuk
pita-pita yang tidak horizontal, maka sulit untuk mengumpulkan komponen-komponen. Ujung
dari pita kedua akan terbawa sebelum seluruh pita pertama keluar dari kolom. Ada dua factor
penyebab masalah ini yaitu permukaan atas dari adsorben tidak rata serta kolom tidak benar-
benar vertical.
Fenomena lain adalah terbentuknya lengkungan pada salah satu sisi pita. Hal ini dapat
terjadi bila ada ketidakteraturan pada permukaan adsorben atau terdapat gelembung udara pada
kolom.
Pada TLC, cuplikan yang akan dipisahkan atau dianalisa diteteskan pada pelat dengan
menggunakan kapiler. Pemisahan dapat terjadi dengan memasukkan pelat ke dalam chamber
(kamar) yang telah jenuh dengan pelarut. Pelarut akan naik secara perlahan-lahan sepanjang
pelat tersebut. Cuplikan akan terdistribusi antara fasa diam (adsorben) dan fasa gerak (pelarut).
Sebagai fase gerak umumnya zat yang kurang polar dibandingkan dengan fasa diam sehingga
komponen dalam cuplikan yang kurang polar akan bergerak lebih cepat dari komponen cuplikan
yang lebih polar. Bila larutan hamper mencapai ujung pelat maka pelat dikeluarkan dari chamber
dan dibiarkan hingga pelarut yang menempel pada pelat menguap. Akan terlihat noda-noda pada
pelat yang menunjukan jumlah komponen yang ada dalam cuplikan. Perbandingan antar jarak
perjalanan komponen dengan jarak perjalanan pelarut disebut Rf.

Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut:

Rf= Jarak yang ditempuh substansi/Jarak yang ditempuh oleh pelarut

 Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1,7 cm dari garis awal,
sementara pelarut berjarak 5,0 cm sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna merah menjadi:
1,7
Rf = 5,0
= 0,34

Bila kondisi pengerjaan sama, maka niali Rf untuk kompoen tertentu adalah sama. Nilai
Rf dapat digunakan untuk mengidentifikasi komponen.
Istilah kromatografi berasal dari bahasa Latin chroma berarti warna dan graphien berarti
menulis.Kromatografi pertama kali diperkenalkan oleh Michael Tswest (1903) seorang ahli
botani dari Rusia. Michael Tswest dalam percobaannya ia berhasil memisahkan klorofil dan
pigmen-pigmen warna lain dalam ekstrak tumbuhan dengan menggunakan serbuk kalsium
karbonat (CaCO3) yang diisikan ke dalam kaca dan petroleum eter sebagai pelarut. Proses
pemisahan itu diawali dengan menempatkan larutan cuplikan pada permukaan atas kalsium
karbonat (CaCO3), kemudian dialirkan pelarut petroleum eter. Hasilnya berupa pita-pita
berwarna yang terlihat sepanjang kolom sebagai hasil pemisahan komponen-komponen dalam
ekstrak tumbuhan. Dalam teknik kromatografi, sampel yang merupakan campuran dari berbagai
macam komponen ditempatkan dalam situasi dinamis dalam sistem yang terdiri dari fase diam
dan fase gerak. Semua pemisahan pada kromatografi tergantung pada gerakan relatif dari
masing-masing komponen diantara kedua fase tersebut. Senyawa atau komponen yang tertahan
lebih lemah oleh fase diam akan bergerak lebih cepat daripada komponen yang satu dengan
lainnya disebabakan oleh perbedaan dalam adsorbsi, partisi, kelarputan atau penguapan diantara
kedua fase.
Kromatografi lapis tipis mirip dengan kromatogafi lapis tipis (KLT). Bedanya lapis tipis
(KLT) digantikan lembaran kaca atau plastik yang dilapisi dengan lapisan tipis adsorben seperti
alumina, silika gel, selulosa atau materi lainnya. Kromatografi lapis tipis bersifat boleh ulang
(reprodusibel) dari pada kromatografi lapis tipis (KLT).
Adsorben yang digunakan pada kromatogrfai lapis tipis biasanya terdiri dari silika gel
atau alumina dapat langsung atau dicampur dengan bahan perekat misalnya kalsium sulfat untuk
disalutkan pada pelat. Pada pemisahannya, fase bergerak akan membawa komponen campuran
sepanjang fase diam pada pelat sehingga terbentuk kromatogram. Pemisahan yang terjadi
berdasarkan adsorbsi dan partisi. Teknik kerja KLT prinsipnya hampir sama dengan komatografi
lapis tipis (KLT).
Penentuan harga Rf pada KLT sama dengan pada kromatografi lapis tipis (KLT). Harga
Rf dapatdigunakan untuk identifikasi kualitatif. Untuk tujuan penentuan kadar, bercak komponen
dapat dikerok lalu dilarutkan dalam pelarut yang sesuai untuk dianalisa dengan metode lain yang
tepat. Aplikasi KLT sangat luas, termasuk dalam bidang organik dan anorganik. Kebanyakan
senyawa yang dapat dipisahkan bersifat hidrofob seperti lipida dan hidrokarbon dimana sukar
bila dikerjakan dengan kromatografi lapis tipis (KLT). KLT juga penting untuk pemeriksaan
identitas dan kemurnian senyawa obat, kosmetika, tinta, formulasi pewarna dan bahan makanan.
Kromatografi dapat digolongkan berdasarkan pada jenis fase-fase yang
digunakan.Kromatografi juga dapat digolongkan atas prinsipnya, misalnya kromatografi partisi
(Partition chromatography) dan kromatografi serapan (Adsorption chromatography).Sedangkan
menurut teknik kerja yang digunakan, misalnya kromatografi kolom, kromatografi lapis tipis
(KLT), kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi gas.
Dalam proses kromatografi selalu terdapat kecenderungan yaitu:
a. Kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melarut dalam cairan
b. Kecenderungan molekul-molekul komponen untuk melekat pada permukaan padatan
halus (adsorpsi penyerapan)
c. Kecenderungan komponen-komponen untuk bereaksi secara kimia (penukar ion)
d. Kecenderungan molekul-molekul terekslusi pada pori-pori fase diam.
Faktor reterdasi (Rf ), merupakan parameter kharakteristik kromatografi lapis tipis (KLT) dan
kromatografi lapis tipis. Harga Rf merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu komponen pada
kromatogram dan pada kondisi tetap merupakan besaran kharakteristik dan reproduksibel. Rf
didefenisiskan sebagai perbandingan jarak yang ditempuh komponen terhadap jarak yang
ditempuh pelarut (fase bergerak).
Hubungan ini berlaku jika Kd dan penampang lintang tidak tetap sepanjang lintasan zat terlarut.
Pemilihan pelarut tergantung dari campuran sampel yang diteliti. Pelarut yang cocok untuk
pemisahan merupakan campuran dua pelarut, sehingga nilai Rf senyawa-senyawa dalam
campuran sampel tersebar di sepanjang lapis tipis (KLT). Nilai pH pelarut juga harus
diperhatikan, karena banyak pelarut yang mengandung asam asetat atau ammonia yang
menghasilkan lingkungan yang sangat asam atau sangat basa.
Keuntungan pemisahan dengan metode kromatografi dibandingkan pemisahan metode lainnya
yaitu:
a. Dapat digunakan pada sampel atau konstituen yang sangat kecil (semi mikro dan
mikro)
b. Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organic multi komponen
c. Proses pemisahan dalat dilakukan dalam waktu yang relative singkat
d. Seringkali murah dan sederhana, karena umumnya tidak memerlukan alat yang mahal
dan rumit.
Untuk tujuan identifikasi, noda-noda sering dikarakterisasikan berdasarkan nilai Rfnya.
Nilai Rf adalah rasio jarak yang dipindahkan oleh suatu zat terlarut terhadap jarak yang
dipindahkan oleh garis depan pelarut selama waktu yang sama. Nilai Rf yang identik untuk suatu
senyawa yang diketahui dan yang tidak diketahui dengan menggunakan beberapa system pelarut
berbeda memberikan bukti yang kuat bah bahwa nilai untuk kedua senyawa tersebut adalah
identic, terutama jika senyawa tersebut dijalankan secara berdampingan di sepanjang pita lapis
tipis (KLT) yang sama.
Beberapa kelebihan dari KLT yaitu sebagai berikut :
1. Waktu pemisahan lebih cepat
2. Sensitif, artinya meskipun jumlah cuplikan sedikit masih dapat dideteksi.
3. Daya resolusinya tinggi, sehingga pemisahan lebih sempurna.
Pemilihan sistem pelarut dan komposisi lapisan tipis ditentukan oleh prinsip kromatografi yang
akan digunakan. Untuk meneteskan sampel yang akan dipisahkan digunakan suatu penyuntik
berukuran mikro. Sampel harus nonpolar dan mudah menguap. Kolom-kolom dalam pelat dapat
diciptakan dengan mengorek lapisan vertikal searah gerakan pelarut. Resolusi KLT jauh lebih
tinggi daripada kromatografi lapis tipis (KLT) karena laju difusi yang luar biasa kecilnya pada
lapisan pengadsorbsi. Semua teknik yang dipakai krometografi lapis tipis (KLT) juga dapat
digunakan untuk kromatografi lapis tipis.
Nilai Rf dipengaruhi oleh ketebalan lapisan, sebagian besar prosedur pemisahan untuk
analisis kualitatif menggunkan ketebalan lapisan 250 µm dan untuk anlisis preparatif digunakan
ketebalan sampai 5 mm. Kadang-kadang digunakan kalsium sulfat sebagai adsorben untuk
 mengikat lapisan pada lempeng. Silika gel adalah bahan yang paling banayak digunakan untuk
pemisahan sejumlah besar senyawa. Hal yang harus diperhatikan adalah atmosfer ruang
pemisahan harus jenuh dengan pelarut, karena menentukan besar kecilnya nilai Rf. Hal ini dapat
dilakukan dengan menggunakan wadah sekecil mungkin dan menghubungkan dinding dengan
lapis tipis (KLT) yang terendam dalam pelarut.
Teknik pemisahan dalam kromatografi ada dua macam, yaitu :
1. Descending-chromatografy adalah yang berdasarkan cairan pengelusi yang dibiarkan bergerak
menuruni lapis tipis (KLT) akibat gaya gravitasi.
2. Ascending-chromatografy yaitu pemisahan yang berdasarkan cairan pengelusi bergerak ke atas
dengan gaya kapiler.

Kromatografi juga bisa digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi

komponen-komponennya .Dalam kromatografi lapis tipis, fase diam adalah lapisan tipis jel silika
atau alumina pada sebuah lempengan gelas, logam atau plastik

Gambar alat TLC

Bagian-bagian TLC
¨ Pelat : berupa kaca yang dilapisi fase diam seperti CaCO3
¨ Chamber : tempat memasukkan pelarut( fase gerak) dan pelat (fase diam)
¨ Fase diam : zat padat inert yang melapisi pelat
¨ Fase gerak : zat cair (pelarut organik) seperti etanol yg membawa cuplikan

Prinsip Kerja TLC

Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel
dengan pelarut yang digunakan.] Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat
 silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan.Larutan atau
campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel
dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.

Faktor-faktor yang mempengaruhi harga Rf pada TLC

¨ Struktur kimia darei senyawa yang dipisahkan
¨ Sifat dari penyerap dan derajat aktifasinya
¨ Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap
¨ Kemurnian pelarut (fase gerak)
¨ Jumlah cuplikan yang digunakan
¨ Suhu
¨ kesetimbangan