VALIDASI METODE ANALISIS AMOKSISILIN DALAM KAPLET

DENGAN KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI UNTUK UJI

DISOLUSI TERBANDING

Cindy Melinda Sofyani, Taofik Rusdiana, Didi Jauhari Purwadiwarsa

Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran
Jl. Raya Bandung Sumedang km. 21, Jatinangor, 45363
Email: [email protected]
Abstrak

Amoksisilin merupakan suatu antibiotik semisintetik penicillin yang memiliki

cincin β-laktam dengan aktivitas sebagai antibakteri. Penentuan kadar uji disolusi
terbanding amoksisilin dapat dilakukan dengan teknik KCKT. Penelitian ini
bertujuan untuk mendapatkan suatu metode analisis yang tervalidasi untuk uji
disolusi terbanding. Metode penelitian yang dilakukan yaitu linieritas, akurasi,
presisi, spesifisitas dan ketangguhan dengan kondisi fase gerak buffer Natrium
dihirogen fosfat pH 5: asetonitril(96: 4), kolom C18, laju alir 1,5 ml/min dengan
menggunakan detektor UV 228 nm. Hasil yang didapat yaitu relatif simpangan
baku presisi <2 % untuk media pH 12 ; pH 4,5 dan juga pH 6,8. % perolehan
kembali akurasi dalam rentang 98 – 102 % untuk media pH 1,2 ; pH 4,5 dan juga
pH 6,8. Kemurnian peak untuk uji sensitivitas dan larutan uji terpisah tidak terdapat
interferensi dari plasebo. Uji ketangguhan tidak dapat digunakan karena hasilnya
presisi tetapi tidak akurasi. Dari hasil yang didapatkan dapat disimpulkan bawa
metode analisis dapat digunakan untuk analisis kadar uji disolusi terbanding.

Kata kunci : Amoksisilin, , KCKT , validasi metode.

Abtract
Amoxicillin is a penicillin semisynthetic antibiotic that has an β-lactam ring with
antibacterial activity. Determination of the level of comparable dissolution test of
amoxicillin can be done by HPLC technique. The research methods carried out
were linearity, accuracy, precision, specificity and toughness in system the mobile
phase use sodium dihidrogen phosphate pH 5: acetonitrile (96: 4), column C18,
flow rate of 1.5 ml / min using UV detector 228 nm. The result is is relative standard
deviation <2% precision for media pH 12; pH 4.5 and also pH 6.8. % recovery
accuracy in the range of 98 - 102% for media pH 12; pH 4.5 and also pH 6.8. Peak
purity for sensitivity test and separate test solution did not interfere with placebo.
From the results obtained it can be concluded that the analytical method can be
used for comparable dissolution test level analysis.
Keywords: Amoxicillin, HPLC, validated methode.
PENDAHULUAN sitrat pH 4,5 dan medium dapar fosfat

Amoksisilin merupakan suatu pH 6,8 atau simulasi cairan intestinal

antibiotik semisintetik penicillin yang tanpa enzim (FDA,2000). Uji disolusi

memiliki cincin β-laktam dengan terbanding dilakukan bertujuan untuk

aktivitas sebagai antibakteri yang membandingkan profil disolusi antara

disebabkan oleh mikroorganisme produk uji terhadap produk

yang rentan. Amoksisilin termasuk pembanding sehingga nantinya akan

antibiotik spektrum luas Antibiotik didapatkan nilai f2 (similaritas).

amoksisilin ini juga dapat digunakan Untuk mendapatkan nilai

pada terapi pneumonia dan penyakit %terdisolusi diperlukan penentuan

lain, termasuk infeksi bakteri pada kadar terhadap sampel hasil uji

telinga, tenggorokan, sinus, kulit, disolusi terlebih dahulu.

saluran kemih, abdomen dan darah Beberapa metode analisis

(Kassaye & Genete, 2013; Kaur Sp, untuk penentuan kadar amoksisilin

Rao R& Nanda S, 2011; Sudjadi & yaitu dengan Kromatografi Cair

Rohman, 2012). Kinerja Tinggi (KCKT) (Depkes,

Uji ekivalensi secara in vitro 1995). Metode analisis baru bisa

dapat dilakukan menggunakan uji diterapkan apabila telah dilakukan

disolusi terbanding dengan validasi terlebih dahulu. Validasi

menggunakan 3 medium disolusi metode adalah proses di mana metode

yang berbeda; yaitu medium asam diuji oleh analis untuk keandalan,

klorida pH 1,2 atau simulasi cairan akurasi dan ketepatan tujuan yang

lambung tanpa enzim, medium dapar dimaksudkan (FDA, 1994). Hal ini
sangat penting untuk robustness. Setelah parameter ini

mengembangkan metode analisis terpenuhi, akan didapatkan metode

KCKT yang akurat, sensitif dan juga analisis yang tervalidasi dan metode

keakuratan dari hasil yang didapatkan dapat digunakan untuk penentuan

dapat dipertanggung jawabkan (Hsu kadar uji disolusi terbanding.

dan Hsu, 1992; Atici et al, 2017;

Sugihartini et al, 2014). METODE

Berdasarkan USP, metode

Alat
analitik diklasifikasikan menjadi 3
KCKT (Shimadzu) dengan detektor
kategori: kategori pertama yaitu
UV, kolom L1 C-18 15 cm x 4,6 mm,
kuantifikasi zat aktif dan eksipien,
Ultrasonik, beaker glass dan labu
kategori kedua yaitu penentuan
ukur. Analisis dan interpretasi data
ketidakmurnian suatu zat dan kategori
menggunakan perangkat lunak
ketiga yaitu pengidentifikasian suatu
Microsoft Excel 2013 dan
zat. Penelitian ini termasuk dalam
LCsolution. Membran filter RC 0,45
kategori pertama penentuan kadar
µl, 47 mm, Minisart syringe filter RC
suatu zat aktif, maka metode
0,45 µl, 15mm, vial dan tutup volume
penelitian parameter validasi
1,5 ml, labu takar 100 ml, labu takar
berdasarkan FDA yang harus diuji
50 ml, pipet volume 25 ml, pipet tetes,
untuk kategori pertama antara lain
botol media 1000 ml, gelas ukur 1 L
adalah kecermatan (akurasi),
dan pH meter.
keseksamaan (presisi), selektivitas,

linearitas dan rentang, dan Bahan

Bahan yang dibutuhkan pada pH meter agar pH tepat 1,2 (Depkes

penelitian ini adalah fase gerak dapar RI, 1995).

kalium dihidrogen fosfat pH 5 :

Pembuatan Buffer pH 4,5
asetonitril (96:4), standar amoksisilin
Dibuat dengan melarutkan 6,8 gram
99,66%, kaplet uji amoksisilin 500
kalium dihidrogen fosfat ke dalam
mg, larutan dapar HCl pH 1,2 ; larutan
1000 mL aquadest setengahnya,
dapar asetat/sitrat pH 4,5 dan larutan
dikocok homogen, lalu ditambahkan
dapar fosfat pH 6,8.
aquadest ad 1000 mL (Council of
Pembuatan Buffer Kalium
Pharmacopeia, 2005).
Dihidrogen Fossfat pH 5,0
Pembuatan Buffer pH 6,8
Dilarutkan 13,6 g kalium dihidrogen
Dibuat dengan cara menimbang 27,22
fosfat dalam 2 liter aquabidest, diatur
gram kalium fosfat monobasa dan
pH hingga 5,0 ± 0,1 dengan natrium
dilarutkan dalam 1000 ml aquades
hidroksida (Depkes RI, 1995)
(setara dengan kalium fosfat
Pembuatan Buffer pH 1,2
monobasa 0,2 M), kemudian diambil

Menimbang 14,91 gram kalium 50 ml ditambahkan natrium

klorida dan melarutkan dalam 1000 hidroksida 0,2 M sebanyak 22,4 ml

ml aquades (setara dngan kalium dan add aquades sampai 900 ml, cek

klorida 0,2 M) diambil 225 ml, dengan pH meter agar pH tepat 6,8

kemudian ditambahkan asam klorida (Depkes RI, 1995).

0,2 M sebanyak 382,5 ml dan add

Pembuatan Fase Gerak
aquades sampai 900 ml, cek dengan
Membuat campuran buffer fosfat pH Menyuntikkan larutan standar,larutan

5,0 dan asetonitril (96:4), kemudian sampel dan larutan plasebo ke sistem

disaring dan dihilangkan udara dalam KCKT, amati respon pada panjang

fase gerak dengan pengaduk gelombang 228 nm.

ultrasonik.
(FDA, 1994)

Kondisi KCKT
Uji Keterulangan (presisi)

Spesifikasi kolom : Kolom L1 ,

Dilakukan dengan penyuntikan
15 cm x 4,6 mm
keberulangan (Ripitabilitas) yang

Detektor : panjang dimana dilakukan pada tiga level dan

gelombang 20 nm tiga kali pengulangan dan presisi

Antara (Intermediate precision) yaitu

Fase gerak : Buffer
pengujian yang sama dilakukan di
Natrium dihidrogen fosfat pH 5,0
hari yang berbeda.
dan asetonitril (96:4)

Uji Linieritas dan rentang

Panjang gelombang : 228 nm

Pada setiap media buffer disolusi

Laju alir : 1,5 ml/menit
dibuat persamaan garis dengan
Volume injeksi : 20 µl
rentang 100 ppm, 200 ppm, 300 ppm,

(United States of Pharmacopeia, 400 ppm, 500 ppm dan 600 ppm.

2005)
Uji Akurasi

Validasi Metode Analisis

Menyuntikkan konsentrasi larutan

Uji Selektifitas standar dengan memipet dari larutan

induk, sehingga menghasilkan kadar sistem ini elusi yang digunakan yaitu

dengan kadar 20%, 60%, 120% dan elusi isokratik. Pada sistem elusi

dilakukan triplo pada setiap level isokratik, komposisi fase gerak dibuat

konsentrasi. Konsentrasi dibuat di tetap dari awal sampai akhir waktu

sekitar kurva kalibrasi. (FDA, 1994) analisis. Sistem isokratik dipilih

karena analit yang dipisahkan

Robustness
tidaklah begitu kompleks dan hanya
Uji ketangguhan dilakukan dengan
terdapat satu analit yaitu amoksisilin.
menguji variasi pH fase gerak + 2
Kecepatan alir merupakan variabel
yaitu pH 4,8 dan pH 5,2 dan juga
penting dalam KCKT. Kecepatan alir
variasi laju alir + 2 dari laju alir yang
akan mempengaruhi pemisahan suatu
digunakan yaitu 1,3 dan 1,7.
senyawa dari komponen lainnya,
Kemudian diperhatikan % relative
semakin kecil kecepatan alir yang
standar deviation dan % Recovery
digunakan maka akan menghasilkan
(ICH, 1997).
puncak yang lebih lebar dan

pemisahan lebih baik (Harmita,

2006). Kecepatan alir yang akan

HASIL DAN PEMBAHASAN digunakan dalam analisis adalah 1,5

ml/min.
Kondisi KCKT
Untuk melihat apakah suatu sistem
Metode elusi dalam kromatografi
KCKT yang dipilih dapat memenuhi
dibedakan menjadi dua yaitu elusi
sistem yang digunakan dan
isokratik dan elusi gradien. Pada
memenuhi pesryaratan untuk analisis
perlu dilakukan uji kesesuaian sitem Tailing
< 2,5 1,25
factor (Tf)
Faktor
(sistem suitability test). Parameter
kapasitas 1,1 < k' < 2,8 1,345
(k')
yang dinilai diantaranya yaitu presisi Tabel 2. Uji Kesesuaian sistem media
pelarut pH 4,5
dari waktu retensi analit, faktor

kapasitas (k’), faktor selektivitas (α), Parameter Syarat Hasil

Presisi
efisiensi kolom (N) dan faktor ikutan waktu % RSD < 2 % 0,05969%
retensi
Plate
(tailing factor). number ( >1700 2854
N)
Tailing
Parameter Syarat Hasil < 2,5 1,24
factor (Tf)
Presisi Faktor
waktu % RSD < 2 % 0,5928% kapasitas 1,1 < k' < 2,8 1,39
retensi (k')
Plate Tabel 3. Uji Kesesuaian sistem media
number ( >1700 3071 pelarut pH 6,8
N)
Tailing Dari parameter tabel di atas dapat
< 2,5 1,25
factor (Tf)
Faktor dilihat bahwa kondisi KCKT telah
kapasitas 1,1 < k' < 2,8 1,442
(k')
optimum dan dapat digunakan dalam
Tabel 1. Uji Kesesuaian sistem media
pelarut pH 1,2
analisis.

Hasil Validasi
Parameter Syarat Hasil
Presisi Uji Linieritas
waktu % RSD < 2 % 0,05969%
retensi
Plate Didapat kurva linier seperti berikut:
number ( >1700 2493
N)
 Media pelarut pH 1,2
1.5
AUC ( x 107 )

y = 0.1688x + 0.0143
1 R² = 0.9988
0.5 Series1
Linear (Series1)
0
0 2 4 6 8
Konsentrasi ( x 102)

Media Pelarut pH 4,5

y = 0.1898x - 0.0089
1.5 R² = 0.9901
1
AUC ( x 107 )

0.5 Series1
Linear (Series1)
0
0 2 4 6 8
-0.5
Konsentrasi ( x 102)

Media pelarut pH 6,8

1.5 y = 0.1932x + 0.0026
AUC ( x 107 )

1 R² = 0.9998
0.5 Series1
0 Linear (Series1)
0 2 4 6 8
Konsentrasi ( x 102)

Kriteria penerimaan bagi uji linearitas pH 6,8 adalah lebih dari atau sama

adalah dengan melihat koefisien dengan 0,99 .

kolerasi ( r2 ) ≥ 0,99. Berdasarkan

Akurasi
tabel di atas, nilai R2 pH 1,2 ; 4,5 dan
Nilai % perolehan kembali yang

ditemukan yaitu pada 98,119 –

101,987 % dan memenuhi dimana nilai % RSD kurang dari 2 %

persyaratan FDA (1991) yaitu 98- (ICH, 1997).

102%. Sehingga dapat dinyatakan Spesifitas

metode analisis memenuhi Pengujian spesifisitas dilakukan

persyaratan akurasi untuk analisis. dengan tujuan apakah suatu metode

Konsentrasi Konsentrasi
analisis yang digunakan dapat
Medium Teoritis terukur %Recovery
membedakan antara zat atau senyawa
pelarut (ppm) (ppm)
100 100,257 100,257 yang dianalisis dengan senyawa
pH 1,2 400 407,950 101,987
600 588,714 98,119 lainnya yang terdapat dalam matriks
100 100,827 100,82
sampel. Pengujian spesifisitas juga
pH 4,5 400 399,984 99,95
600 598,430 99,73
dimaksudkan untuk apakah suatu
100 98,935 98,935
pH 6,8 400 405,538 101,385 metode dapat membedakan analit dan
600 596,041 99,340
produk pengisiny. (ICH, 1997). Dari
Tabel 4. Hasil uji akurasi.
hasil pengujian dapat dilihat
Presisi
bahwasanya tidak terdapat peak lain
Pada presisi intraday dan
yang bersamaan dengan amoksisilin
repeatability pada media pH 1,2
sehingga blanko dan plasebo tidak
didapat %RSD sebesar 0,275% dan
mengganggu hasil penelitian zat
0,194% , pada media pH 4,5 didapat
tunggal amoksisilin.
%RSD sebesar 0,104% dan 0,096%
Robustness
sedangkan pada media pH 6,8 didapat
Untuk menvalidasi kekuatan suatu
%RSD sebesar 0,109% dan 0,096.
metode perlu dibuat perubahan
Nilai presisi memenuhi persyaratan
metodologi yang kecil dan terus
menerus dan mengevaluasi respon Didapatkan metode analisis

intrumen (Harmita, 2004). Suatu modifikasi kondisi USP yang

metode dikatakan memiliki robutness memenuhi persyaratan untuk uji

yang baik jika diberikan perubahan disolusi terbanding dengan

kecil terhadap sistem KCKT tetap Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

memiliki respon intrumen yang sama (KCKT). Metode KCKT detektor UV

aatau tidak mengalami perubahan untuk analisis senyawa amoksisilin

yang signifikan. Untuk menyatakan yang dilakukan dengan fase diam

nilai robutness bisa dihitung dari % kolom C18, fase gerak buffer Natrium

Recovery dan % RSD dari data dan Dihidrogen fosfat pH 5 : asetonitril

didapat bahwa perubahan + 0,2 pH (96 : 4) pada panjang gelombang 228

dan + 0,2 laju alir mempengaruhi nm dan laju alir 1,5 ml/min memenuhi

waktu retensi serta AUC dari persyaratan validasi dengan

perhitungan dan diapat bahwa hasil parameter linieritas, akurasi,presisi,

memiliki presisi yang baik teteapi spesifisitas dan robustness.

memiliki akurasi yang buruk

sehingga untuk pengujian

pengukuran pH dan laju alir haruslah

tepat.

DAFTAR PUSTAKA
SIMPULAN
Atici Esen Bellur, Yucel Yazar, C¸ Analysis. Northern Ireland:
Agtas¸ agan , Nurten Mourne Training Service.
Ridvanoglu, Bekir Karlıga.
2017. Development and Sudjadi & Rohman, 2012. Analisis
validation of stability indicating Farmasi. Yogyakarta: Pustaka
HPLC methods forrelated Pelajar.
substances and assay analyses Sugihartini et al. 2014. VALIDASI
of amoxicillin and potassium METODE ANALISA
clavulanate mixtures: Journal PENETAPAN KADAR
of Pharmaceutical and EPIGALOKATEKIN GALAT
Biomedical Analysis Vol 136. DENGAN KROMATOGRAFI
Depkes, R.I, 1995. Farmakope CAIR KINERJA TINGGI:
Indonesia Ed IV. Jakarta: Pharmaciana Vol 4 No.2
Departemen Kesehatan
Republik Indonesia.
FDA. 1994. Validation of
Chromatographic Methods.
Rockville: U.S Department of
Health Services, Center for
Drug Evaluation and Research
(CDER).
Hsu dan Hsu. 1992. High-
Performance Liquid
Chromatographic Method for
Potencial Determination of
Amoxicillin in Commercial
Preparations and for Stability
Studies: Antimicroial Agents
and Chemotherapy Vol 36 No.
6
Kassaye, L. & Genete, G., 2013.
Evaluation and comparison of
in-vitro dissolution profiles for
different brands of Amoksisilin
capsules. African Health
Sciences, XIII(2).
Kaur SP, Rao R, & Nanda S, 2011.
Amoksisilin: A broad spectrum
antibiotic. International
Journal of Pharmacy and
Pharmaceutical Sciences.
McPolin, 2009. An Introduction to
HPLC for Pharmaceutical