Topik 2

Pemeriksaan metode Imunokromatografi

Test (ICT) untuk deteksi antigen

A. UJI KEHAMILAN (PREGNANCY TEST)

Beberapa merk kit reagen ICT dapat digunakan untuk mendeteksi hormon hCG (
human Chrorionic Gonadotropin) dalam urin secara kualitatif dengan metode
imunokromatografi yang cepat dan sensitif guna membantu diagnosa kehamilan lebih dini.
Hormon hCG merupakan suatu substansi protein pada wanita yang diproduksi segera setelah
terjadinya fertilisasi ( pembuahan). Hormon ini dibentuk oleh trofoblast dan akan
meningkat pada hari
9-12 sejak ovulasi. Pada kehamilan dini kadar hCG pada kadar 0.1 IU/mL dan meningkat
mencapai puncak pada hari 60-70 kehamilan. Penetapan kadar hCG dalm urin berfungsi
sebagai indikator kehamilan. Selain itu hCG berfungsi dalam mempertahankan korpus luteum
( merupakan jaringan di ovarium yang menghasilkan progesteron). Progesteron berfungsi
untuk memelihara dan mempertahankan proses kehamilan.

Hal-hal yang dapat mengganggu pemeriksaan :

1. Proteinuria yang menyebabkan inaktivasi anti-hCG.
2. Penyakit imunologi yang menyebabkan reaksi positif palsu akibat adanya interaksi antara
IgM dengan reagen.
3. Kadar LH tinggi ( rangsangan pada hipofise anterior atau penggunaan obat penenang)
menyebabkan reaksi positif palsu.
4. Pasca ooforectomi, menopause, hipotiroidisme atau gagal ginjal dapat menunjukkan hasil
positif palsu.

Substansi lain yang juga diproduksi oleh wanita hamil adalah:

1. Follicle Stimulating Hormone (FSH) yang berperan menjaga perkembangan ovum sebelum
ovulasi.
2. Luteinizing hormone (LH), bertanggung jawab dalam ovum dari ovarium untuk siap
dibuahi.

Prinsip
 Strip merupakan bantalan penyerap specimen, membran dan bantalan penyerap sisa
reaksi. Bantalan penyerap specimen mengandung antibodi monoclonal Mouse- anti hCG
yang dikonjugasi dengan zat warna Colloidal Gold. Zona test pada daerah membran diikat
dengan antibodi Goat anti hCG dan zona kontrol dengan Goat anti mouse IgG.
Selama proses berlangsung, specimen urin dihisap oleh bantalan penyerap specimen
dan dan mengalir melewati daerah membrane sampai mencapai bantalan penyerap sisa
rekasi dengan gaya kapiler. Di dalam bantalan penyerap specimen , hCG dalam specimen
urin akan diikat oleh gold conjugate, membentuk kompleks kemudian bergerak menuju
daerah membran. Antibodi Goat anti-hCG, yang terikat pada zona test akan menangkap
kompleks tersebut, membentuk sebuah garis berwarna merah muda yang menunjukkan
adanya hCG dalam specimen urin. Tidak terbentuknya garis pada zona tes tersebut
menunjukkan tidak terdeteksinya hCG dalam specimen urin. Sebuah garis berwarna
merahmuda yang tampak pada zona kontrol memastikan bahwa Pregna strip berfungsi baik.

Gambar 67. Komponen tes ICT dengan prinsip lateral flow

Keterangan :
1. Tempat untuk mencelupkan specimen
2. Bagian yang ditempeli dengan conjugate
3. Bagian untuk mendeteksi conjugate
4. Membran nitroselulosa
5. Garis tes dan garis kontrol
6. Bantalan penyerap
7. Plastik penyerap di bagian bawah strip.

Material yang disediakan dalam kit:

Strip yang terbungkus dalam kemasan aluminium foil yang dlengkapi dengan pengering silica
gel.
Lembar petunjuk pemakaian

Alat yang dibutuhkan namun tidak tersedia dalam kit yaitu wadah penampung urin.

Peringatan
1. Strip hanya digunakan untuk pemeriksaan invitro
2. Strip yang sudah kadaluarsa tidak boleh digunakan.
3. Strip disimpan pada suhu 4-280C , namun pada saat pemeriksaan suhunya harus sama
dengan suhu ruang (20-300C)
4. Jangan membuka pembungkus pregna strip sebelum tes siap untuk dilakukan.

Pengumpulan dan penyimpanan specimen

Gunakan wadah gelas atau plastik untuk menampung specimen urin. Spesimen urin
yang dikumpulkan sewaktu dapat dipakai untuk pengetesan, namun urin pagi menjadi lebih
baik digunakan karena mengandung konsentrasi hCG lebih tinggi. Apabila tes tidak dapat
dilakukan dengan segera, specimen urin dapat disimpan pada suhu 2-8 0C selama 72 jam.
Sebelum dites, specimen urin tersebut harus disesuaikan suhunya dengan suhu ruangan,
Apabila ada endapan yang jelas pada specimen urin maka specimen urin tersebut harus
disaring, disentrifugasi atau dibiarkan mengendap untuk mendapatkan bagian yang jernih
( supernatant) untuk pengetesan. Apabila akan dilakukan pengiriman maka specimen dibawa
diawetkan dengan trimersol atau sodium azide.

Prosedur pengujian
1. Buka pembungkus Strip
2. Celupkan strip ke dalam wadah yang berisi specimen urin sampai tanda batas garis
maksimum di bawah tanda panah.
3. Biarkan urin mengalir membasahi seluruh permukaan membran (30-60 detik) kemudian
letakkan strip pada permukaan yang datar dan tunggu selama 2 menit untuk membaca
hasil tes.

Pembacaan hasil
Jangan membaca hasil tes lebih dari 3 menit dari waktu pengetesan.
1. Positif : muncul warna merah muda pada garis tes dan garis kontrol. Hasil ini
menunjukkan positif hamil atau konsentrasi hCG dalam specimen urin yang diperiksa
sama atau lebih besar dari batas sensitivitas tes ( ≥ 25 mIU/mL)
2. Negatif : tidak muncul warna pada tes.
3. Invalid: tidak tampak garis merah pada zona tes atau zona kontrol atau hanya muncul
warna merah muda di garis tes. Kemungkinan petunjuk pemakaian tidak diikuti dengan
baik atau strip tidak berfungsi baik. Dalam hal ini specimen harus diulang pemeriksaan
menggunakan strip yang baru.

Gambar 68. Contoh hasil pemeriksaan uji kehamilan

Karakteristik tes

Sensitivitas :
Pregna strip dapat mendeteksi hCG dalam urin pada konsentrasi ≥ 25 mIU/mL.
Pengujian sensitivitas hCG dilakukan pada konsentrasi lebih rendah dengan cara
menambahkan hCG hingga konsentarsi 0,20,25,50 dan 100 mIU/mL ke dalam masing-
masing specimen urin dari
60 wanita yang tidak hamil. Total specimen urin yang digunakan untuk pengujian sensitivitas
adalah 300 dan dari hasil tes tersebut didapat seperti tabel di bawah ini :
 hCG yang
ditambahkan ke Hasil dari 60 spesimen yang dites
dalam specimen urin Positif Meragukan Negatif
wanita yang tidak
hamil (mIU/ml)
0 0 0 60
20 0 3 57
25 60 0 0
50 60 0 0
100 60 0 0

Spesifisitas
Spesifisitas Pregna strip ditentukan dengan cara mempelajari reaksi silang terhadap hL
( Luteinizing hormone), hFSH ( Follicle Stimulating Hormone) dan hTSH ( Thyroid Stimulating
Hormon). Hasil tes negative pada konsentrasi hLH 200 mIU/mL, hFSH dan hTSH 1000
mIU/mL.

Pengujian terhadap zat pengganggu

Pengujian terhadap zat dengan konsentrasi tertentu di bawah ini bila ditambahkan ke
dalam specimen urin yang mengandung 0 dan 25 mIU/mL hCG ternyata tidak mengganggu
hasil tes dengan Pregna strip.

Asetaminofen 20 mg/dL Glukosa 2000 mg/dL

Asam asetilsalisilik 20 mg/dL Kafein 20 mg/dL
Asam askorbat 20 mg/dL Parasetamol 20 mg/dL
Atropin 20 mg/dL Protein 2000 mg/dL
Etanol 4000 mg/dL pH 5-9

B. PEMERIKSAN NS1 Antigen Dengue

Pendahuluan
Pemeriksaan NS1 Ag Dengue digunakan bila muncul gejala klinis berupa demam pada
hari ke 1-9. Tetapi pada hari ke 5 timbul pada umumnya mulai terbentuk IgM yang mungkin
dapat menghambat reaksi. Pemeriksaan ini dapat mendeteksi virus dengue paling baik pada
hari ke 1-4. Setelah hari ke 4 kadar NS1 antigen akan menurun dan akan hilang pada hari ke
9. Apabila pengambilan dilakukan setelah munculnya antibodi maka kadar virus dengue akan
menurun. Diperlukan ketepataan dalam pemilihan waktu dan jenis pemeriksaan.
Prinsip :
Pada SD Bioline Dengue NS1 Antigen test dilapisi oleh 2 garis yaitu garis Test dan garis
Kontrol. Garis tersebut belum dapat terlihat jika belum ditambahkan oleh sampel. Garis pada
kontrol harus selalu muncul, hal itu menunjukkan bahwa prosedur tes dilakukan dengan
benar (valid). Dengue NS1 antigen dapat mendeteksi antigen NS1 virus dengue dalam serum,
plasma atau whole blood dengan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi.

Bahan Pemeriksaan : Serum

Prosedur test ( sesuai dengan manual kit instruction yang digunakan)

1. Disiapkan alat dan bahan
2. Buka strip Dengue NS1 antigen
3. Diteteskan serum sebanyak 3 tetes (100 μl) dengan menggunakan pipet tetes
4. Baca hasil, hasil tidak boleh dilaporkan lebih dari 20 menit

Interpretasi hasil :
Negatif : tidak muncul warna merah muda pada garis pada tes dan dinyatakan valid
bila pada garis pada kontrol berwarna merah muda.
Positif : garis tes berwarna merah muda dan dinyatakan valid bila pada garis pada
kontrol berwarna merah muda.
Invalid : Bila tidak muncul warna merah muda pada garis pada kontrol

Contoh hasil positif : Adanya garis berwarna merah muda pada tes dan garis kontrol sebagai
validasi reagen.

Gambar 69. Contoh hasil positif

C. PEMERIKSAAN HBsAg
 Hepatitis B adalah penyakit infeksi yang disebabkan oleh virus hepatitis B (HBV), yang
mempengaruhi sekitar 5% populasi manusia di berbagai wilayah. Penyakit ini bisa terlihat
tidak ada gejala, akut (dengan kasus hepatitis fulminan dan kematian), atau hepatitis kronis
dengan kemungkinan degenerasi menjadi sirosis dan atau karsinoma hepatoselular dan
kematian.
Penyakit ini biasa menular melalui pertukaran cairan tubuh antara individu sehat dan
yang terinfeksi. Cara penularan bisa melalui jalur parenteral (serum yang terinfeksi, olahan
darah, transfuse darah, dll), atau non parenteral (saliva, air mata, keringat, urin, semen, luka
di kulit, dll).
Sejak ditemukannya antigen Australia oleh Blumberg tahun 1965, banyak penelitian
dilakukan mengenai antigen ini dan hubungannya dengan penyakit hati. Saat ini antigen
tersebut dikenal dengan Hepatitis B surface Antigen ( HBsAg), yaitu suatu partikel yang
merupakan lapisan permukaaan virus hepatitis B. Hoofnagle yang mengutip Dane
menggambarkan virus hepatitis B sebagai partikel Dane yang terdiri atas inti yang disebut
Hepatitis B core antigen ( HBcAg) dan suatu komponen yang melapisi permukaannya yang
disebut HBsAg. Di dalam darah terdapat lebih banyak HBsAg yang bebas daripada partikel
Dane sendiri. Beberapa antigen virus Hepatitis B adalah HBcAg, HBeAg, dan HBsAg. Sebagai
akibat adanya antigen ini, juga menimbulkan antibodi dalam darah yang ditujukan terhadap
masing-masing jenis antigen tersebut. Baik Antigen maupun antibodi merupakan seromarker
Hepatitis B dan penetapannya dapat digunakan dalam menyatakan infeksi VHB dan
perjalanan penyakitnya. Seromarker yang dapat ditetatpkan dalam darah yaitu HBsAg,
HBcAg, HBeAg, anti-HBs, anti-HBe, dan anti –HBc, sedangkan HBcAg hanya dapat ditemukan
dalam hepatosit.
Pada Hepatitis akut, HBsAg ditemukan dalam serum sejak akhir masa inkubasi,
kemudian kadarnya akan menurun pada saat penyembuhan. Menetapnya HBsAg dalam
darah melebihi jangka waktu 6 bulan merupakan petunjuk hepatitis menjadi kronik atau
penderita menjadi carrier. Anti HBs tidak muncul selama fase akut, tetapi mulai dapat
dideteksi pada waktu konvalescen. Munculnya anti-HBs dinilai sebagai parameter
penyembuhan atau imunitas. Sedangkan bila ditemukan HBsAg telah menghilang, sedangkan
anti HBs belum dapat dideteksi yang disebut dengan window period.
Anti –HBc timbul dalam darah pada permulaan penyakit dan biasanya dijumpai bersama
–sama HBsAg. Ditemukannya Anti-HBs dan anti-HBc dalam serum secara bersama-sama
tanpa ditemukannya HBsAg menunjukkan seseorang telah sembuh, demikian juga bila
ditemukan anti-HBs tanpa anti-HBc dapat berarti infeksi telah lama berlalu atau penderita
telah mendapat vaksinasi.

Prinsip :
 Pada HBsAg tes, strip membrane nitroselulosa dilapisi oleh 2 garis yaitu garis Test dan
garis Kontrol. HBsAg dalam serum atau plasma bereaksi dengan colloidal gold- anti HBs
conjugate pada garis tes. Garis tersebut belum dapat terlihat jika belum ditambahkan oleh
sampel. Garis pada kontrol harus selalu muncul, hal itu menunjukkan bahwa prosedur tes
dilakukan dengan benar (valid).

Bahan Pemeriksaan : Serum/ plasma

Bila akan ditunda maka simpan pada suhu 2-80 C. Penyimpanan lebih dari 3 hari dapat
dilakukan pada suhu yang lebih rendah ( freezer).
Deteksi limit : 1 ng/mL

Prosedur test ( sesuai dengan manual kit instruction yang digunakan)

1. Disiapkan alat dan bahan
2. Buka strip HBs Ag
3. Diteteskan serum/ plasma sebanyak 3 tetes (100 μl) dengan menggunakan pipet tetes/
mikropipet.
4. Setelah 20 menit, dibaca hasil pemeriksaan dan hasil tidak boleh dilaporkan lebih dari
20 menit

Peringatan
1. Strip hanya digunakan untuk pemeriksaan invitro diagnostik
2. Strip yang sudah kadaluarsa tidak boleh digunakan.
3. Strip disimpan pada suhu 4-280C , namun pada saat pemeriksaan suhunya harus sama
dengan suhu ruang (20-300C)
4. Jangan membuka pembungkus strip sebelum tes siap untuk dilakukan.
5. Gunakan Alat pelindung diri dan lakukan cuci tangan sesudah menyelesaikan
pemeriksaan.
6. Hindari kontak dengan mata, kulit yang luka, dan membran mukosa.
7. Semua bahan tes dan material dibuang pada container biohazard.

Interpretasi hasil :

Gambar 70. Interpretasi hasil ICT

 Topik 1
Pemeriksaan ELISA untuk deteksi Antigen
Pemeriksaan HBsAg

• Antigen permukaan virus hepatitis B (hepatitis B surface antigen, HBsAg) merupakan

suatu antigen dari bagian luar / permukaan virus Hepatitis B.
• Bagian permukaan / envelope ini merupakan bagian yang melindungi virus Hepatitis B
dari serangan sistem imun manusia.Virus Hepatitis B (VHB) adalah suatu virus yang
termasuk keluarga Hepadnaviridae
• HBsAg merupakan petanda serologik infeksi virus hepatitis B pertama yang muncul di
dalam serum dan mulai terdeteksi antara 1 sampai 12 minggu pasca infeksi,
mendahului munculnya gejala klinik serta meningkatnya SGPT.
• Pada kasus yang akut, HBsAg akan hilang antara 3 sampai 6 bulan pasca infeksi
sedangkan pada kasus kronis, HBsAg akan tetap terdeteksi sampai lebih dari 6 bulan.
• HBsAg positif yang persisten lebih dari 6 bulan didefinisikan sebagai pembawa
(carrier).Sekitar 10% penderita yang memiliki HBsAg positif adalah carrier, dan hasil
uji dapat tetap positif selama bertahun-tahun
• HBsAg positif dengan IgM anti HBc dan HBeAg positif menunjukkan infeksi virus
hepatitis B akut.
• HBsAg positif dengan IgG anti HBc dan HBeAg positif menunjukkan infeksi virus
hepatitis B kronis dengan replikasi aktif.
HBsAg positif dengan IgG anti HBc dan anti-HBe positif menunjukkan infeksi
virus hepatitis B kronis dengan replikasi rendah

Manfaat pemeriksaan HbsAg adalah

1. Diagnosa infeksi virus hepatitis B
2. Skrining darah di unit-unit transfusi darah
3. Digunakan pada evaluasi terapi hepatitis B kronis
4. Skrining kehamilan
5. Sebagai pemeriksaan skrining pra-vaksinasi Hepatitis B

Tujuan : Untuk mengetahui adanya HBsAg pada darah manusia yang dapat dideteksi dengan
tehnik enzyme linked immunoassay (ELISA)
A.Prinsip : pencucian untuk menghilangkan pembungkus antigen terbentuk kompleks biotin
dan streptavidin menghubungkan alkalin fosfat mengkatalisis hidrolis dan
substrat menghasilkan fluoresensi, diukur pada panjang gelombang 450 nm.
Intensitas dari fluoresensi sebanding dengan kualitas HBsAg pada serum

B. Metode : Sandwich ELISA

C. Bahan : Serum pasen
D. Reagen : Microelisa strip, wash buffer, larutan substrate, larutan conjugate, asam sulfat
2N E. Alat : Mikropipet, tip kuning dan tip biru,tabung reaksi, tissue, seperangkat alat tes
lainnya F.Cara Kerja :
1. Siapkan microelisa strip sesuai dengan jumlah pemeriksaan

2. Pipet spesimen diluent 25 µl kedalam setiap sumur

3. Pipet sampel 100 µl masukan ke dalam sumur E1 dan seterusnya

4. Pipet kontrol negatif 100 µl, masukan ke dalam sumur A1, B1,C1

5. Pipet kontrol positif 100 µl masukkan ke sumur D1

6. Tutup dengan kertas seal, homogenkan plate secara perlahan

7. Inkubasi suhu 37oC selama 60 menit pada inkubator instrument

8. Tambahkan 50µl conjugated ke dalam setiap sumur yang berisi sampel atau kontrol

9. Inkubasi 37oC selama 60 menit pada inkubator instrument

10. Keluarkan dari inkubator, cuci 6x dengan washer instrument

11. Tambahkan 100 µl substrat ke dalam sumur yang berisi sampel/contoh

12. Inkubasi pada suhu kamar selama 30 menit

13. Tambahkan 100µl H2SO4 2N ke dalam setiap sumur yang berisi sampel/kontrol

14. Baca dengan reader instrument. Pembacaan dan interpretasi hasil meliputi
pembacaan hasil, kualifikasi kontrol dan interpretasi hasil

Pemantapan Mutu

• Pemantapan mutu dilakukan sesuai dengan GLP (Good Laboratory Practice) disertai
kurva kalibrasi untuk memverifikasi pemeriksaan yang dilakukan.
• Laboratorium harus melaksanakan prosedur pengendalian mutu yang sesuai untuk
menjamin kualitas dan ketepatan semua aspek pekerjaan yang dilakukan dan
dilaporkan . Bahan kontrol harus masuk ke dalam acceptable range.
• Validitas pemeriksaan harus dinilai terlebih dahulu sebelum hasil pemeriksaan dapat
dibaca.Hindari penggunaan ulang disposable tip dan tempat penampung bahan
pemeriksaan, karena penggunaan ulang tanpa pencucian yang sangat bersih
menimbulkan carry-over dan memberikan hasil yang salah.

Elisa Reader
Yang perlu dikalibrasi :
• Linearitas alat
• Stabilitas pembacaan
• Ketepatan pembacaan
• Kalibrasi harus dilakukan:
• Pertama kali alat tersebut dipakai
• Setelah penggantian lampu
• Secara berkala untuk ketepatan pembacaan

Hal – hal yang harus diperhatikan

• Pengumpulan spesimen
• Penyimpanan dan penanganan spesimen
• Perlindungan diri
• Kondisi penyimpanan dan stabilitas reagen
 Topik2
Pemeriksaan ELISA untuk deteksi Antibodi
A. Pemeriksaan Anti HIV

HIV (Human Immunodeficiency Virus) adalah virus yang menyerang sistem kekebalan
tubuh manusia dan melemahkan kemampuan tubuh untuk melawan penyakit. Kumpulan
gejala penyakit akibat melemahnya sistem kekebalan tubuh inilah yang disebut Acquired
Immuno Deficiency Syndrome (AIDS). Penyakit ini ditandai dengan adanya kelainan yang
kompleks dari sistem pertahananan seluler tubuh dan menyebabkan korban menjadi sangat
peka terhadap mikroorganisme oportunistik. Gangguan pada sistem kekebalan seluler
akibat penyakit AIDS merupakan predisposisi bagi seorang individu untuk terjadinya
neoplasia seperti Sarkoma Kaposi dan limfoma.
Pemberian anti retroviral (ARV) telah menyebabkan kondisi kesehatan para penderita
menjadi jauh lebih baik. Infeksi penyakit oportunistik lain yang berat dapat disembuhkan.
Namun obat-obat ini hanya berperan dalam menghambat replikasi virus tetapi tidak bisa
menghilangkan virus yang telah berkembang.
Pemeriksaan antibodi menggunakan metode ELISA digunakan untuk mendeteksi
antibodi yang dibuat tubuh terhadap virus HIV. Antibodi tersebut biasanya diproduksi mulai
minggu ke 2, atau bahkan setelah minggu ke 12 setelah terpapar virus HIV.
Para ahli menganjurkan pemeriksaan ELISA dilakukan setelah minggu ke 12 sesudah
melakukan aktivitas seksual berisiko tinggi atau tertusuk jarum suntik yang terkontaminasi.
Tes antibodi HIV ini terbagi dua tahap, yaitu tes Penyaring dan tes Konfirmasi. Tes
penyaringan dilakukan dengan metode ELISA dan tes konfirmasi dengan cara Westren Blot.
Hasil positif pada ELISA belum memastikan bahwa orang yang diperiksa telah terinfeksi HIV.
Masih diperlukan pemeriksaan lain, yaitu Western Blot atau IFA, untuk mengkonfirmasi hasil
pemeriksaan ELISA ini.
ELISA Direct
Digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antigen.
. Pada ELISA direct, pertama microtiter diisi dengan sampel yang mengandung antigen yang
diinginkan, kemudian microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel
pada dinding lubang microtiter.
. Antibodi yang telah ditautkan dengan enzim signal dimasukkan ke dalam lubang-lubang
mikrotiter.
. Ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal
. Dihitung dengan menggunakan kolorimetri, chemiluminescent, atau fluorescent end-point.

ELISA Indirect
Digunakan untuk mendeteksi dan mengukur konsentrasi antibodi
 • Pada ELISA indirect, pertama mocrotiter diisi dengan larutan yang mengandung
antigen spesifik,
• microtiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak menempel pada dinding
lubang microtiter.
• Kemudian larutan sampel yang mengandung antibodi yang diinginkan dimasukkan ke
dalam lubang-lubang microtiter
• Mikrotiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi dengan
antigen spesifik
• Lalu ke dalam lubang microtiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi sekunder
spesifik tertaut enzim signal,
• Mikrotiter dibilas lagi untuk membuang antibodi sekunder tertaut enzim signal yang
tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik
• Ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal

ELISA Sandwich
Teknik ELISA jenis ini menggunakan antibodi primer spesifik untuk menangkap antigen yang
diinginkan dan antibodi sekunder tertaut enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antigen
yang diinginkan.
• Pertama mikrotiter diisi dengan larutan yang mengandung antibodi penangkap
• Mikrotiter dibilas untuk membuang antibodi penangkap
• Larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke dalam
lubang-lubang mikrotiter
• Mikrotiter kembali dibilas untuk membuang antigen yang tidak bereaksi dengan
antigen penangkap
• Dimasukkan larutan yang berisi antibodi detector
• Mikrotiter dibilas lagi untuk membuang antibodi detector yang tidak berinteraksi
dengan antibodi spesifik
• Ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim signal,
ELISA sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan akibat
keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi.

Pemeriksaan HIV dengan SD HIV 1/ 2 ELISA 3.0

Prinsip : SD HIV 1/ 2 ELISA 3.0 mengandung mikroplet yang dilapisi antigen rekombinan HIV
1/2 (gp41, p24, gp36) pada well. Selama inkubasi awal, anti-HIV pada serum pasien
diikat oleh antigen HIV 1/ 2. Setelah inkubasi ini, semua materi yang tidak terikat
 dibuang dengan aspirasi dan pencucian.

Cara Kerja :
1. Siapkan strip well sebanyak 3 well. Well 3 untuk kontrol negatif, well 2 untu kontrol
positif dan well 1 untuk sampel.
2. Pippet 100 ul pengenceran sampel pada masing-masing well.
3. Tambahkan 50 ul control negatif pada well 3, control positif pada well 2, dan sampel
pada masing-masing well.
4. Tutup mikroplate dengan parafilm dan kocok dengan baik pada vibrator mixer,
pengocokan sangat penting untuk mendapatkan hasil yang baik.
5. Inkubasi selama 30 menit dalam suhu 370C
6. Cuci well sebanyak 5 kali dengan 350 ul cairan pencuci, biarkan kurang lebih 10 detik
waktu merendam pada masing” pencucian dan buang semua cairan dari well.
7. Pippet 100 ul enzim konjugat pada masing-masing well.
8. Tutup mikroplate dengan parafilm.
9. Inkubasi selama 30 menit dalam suhu 370C
10. Cuci well sebanyak 5 kali dengan 350 ul cairan pencuci, biarkan kurang lebih 10 detik
waktu merendam pada masing” pencucian dan buang semua cairan dari well.
11. Kocok secara perlahan TMB substrat A dan B dengan perbandingan 1:1 dan pippet
100 ul campuran substrat tersebut kedalam masing-masing well.
12. Kocok secara perlahan TMB substrat A dan B dengan perbandingan 1:1 dan pippet
100 ul campuran substrat tersebut kedalam masing-masing well.
13. Inkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan
14. Pipet 100 ul larutan stopping pada masing-masing well.
15. Baca absorban dari well dengan bikromatik spektrofotometer pada 450 nm dengan
panjang gelombang yang direkomendasikan pada 620 nm. Pembacaan harus selesai
dalam 1 jam dari akhir pemeriksaan.

Tes Validasi
0.010 ≤A(neg) ≤0.200
A (pos) ≥1.000
Jika salah satu nilai absorban pada kontrol negatif keluar dari spesifikasi, nilai ini dapat
diabaikan.
Kedua nilai absorban pada kontrol positif harus sesuai dengan spesifikasi.
Jika spasifikasi tidak terpenuhi, tes harus diulangi.
 Evaluasi
Hitung rata-rata absorban pada kontrol negatif, lalu hitung batas nilai dengan ditambah 0.300
A (neg) + 0.300 = batas nilai
Berdasarkan kriteria pada tes, sampel dikategorikan sebagai berikut :
A (sampel) < batas_anti HIV ½ Negatif
A (sampell) ≥ batas_anti HIV ½ Positif

Limitasi dan Interferensi

i Prosedur pemeriksaan, pencegahan, dan interpretasi hasil kit ini harus diikuti saat
pemeriksaan
ii. Sampel
iii. Kit ini mendeteksi antibodi HIV pada serum manusia atau plasma dan ini dapat digunakan
sebagai tes skrining
iv. Kesalahan dalam penambahan spesimen dalam prosedur dapat mengakibatkan hasil
negatif palsu. Pengulangan pemeriksaan harus dipertimbangkan jika terdapat kecurigaan
klinis tentang adanya infeksi.

Performance characteristic
SD HIV 1/2 ELISA 3.0 telah diperiksa dengan sampel klinis positif dan negatif diperiksa dengan anti-
HIV ½ ELISA test.
Referensi SD HIV 1 /2 ELISA 3.0

Metode Hasil Positif Negatif Total Hasil

Elisa Positif 345 0 345

Komersial

Negatif 2 990 992

Total Hasil 347 990 1337

 Sensivitas relatif: 100%, spesifitas relatif: 99,8%

• Presisi
Presisi Within-run dan between run telah ditentukan dengan 10 kali pengulangan
pemeriksaan dari 3 spesimen : negatif, positif lemah, dan positif kuat. Nilai CV(%) dari
negatif, positif lemah, dan positif kuat berada dalam 10%.

Kelebihan
1. Teknik pengerjaan relatif sederhana
2. Relatif ekonomis (karena jenis a antibodi yang digunakan hanya satu saja, sehingga
menghemat biaya untuk membeli banyak jenis antibodi)
3. Hasil memiliki tingkat sensitivitas yang cukup tinggi.
4. Dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan antigen walaupun kadar antigen
tersebut sangat rendah (hal ini disebabkan sifat interaksi antara antibodi atau antigen
yang bersifat sangat spesifik)
Dapat digunakan dalam banyak macam pengujian

Kelemahan Metode ELISA

1. Pemeriksaan ELISA hanya mendeteksi antibodi, bukan antigen (akhir-akhir ini
sudah ditemukan test ELISA untuk antigen).
2. Pemeriksaan ELISA hanya terhadap antigen jenis IgG. Penderita AIDS pada taraf
permulaan hanya mengandung IgM, sehingga tidak akan terdeteksi. Perubahan dari
IgM ke IgG membutuhkan waktu sampai 41 minggu.
3. Pada umumnya pemeriksaan ELISA ditujukan untuk HIV1. Bila test ini digunakan pada
penderita HIV2, nilai positifnya hanya 24%. Tetapi HIV2 paling banyak ditemukan
hanya di Afrika.
4. Masalah false positive pada test ELISA. Hasil ini sering ditemukan pada keadaan positif
lemah, jarang ditemukan pada positif kuat. . Hal ini disebabkan karena morfologi HIV
hasil biakan jaringan yang digunakan dalam test kemurniannya berbeda dengan HIV
di alam.

Pemeriksaan HIV ½ dari imunocomb

Tujuan : Uji kualitatif untuk mengetahui ada tidaknya antibodi HIV1 dan HIV2 dalam serum
atau plasma pasen.
A. Prinsip : Immunocomb II HIV 1 dan 2 bispot merupakan suatu pemeriksaan fase cair
secara tidak langsung metoda Enzyme Imuno Assay (EIA). Fase solid adalah Comb
dengan 12 gigi, setiap 3 gigi sensitif pada 3 titik: titik bagian atas adalah antibodi dari
Human Imunoglobulin tersangka (kontrol internal), Titik bagian tengah terdiri dari
peptida-peptida buatan HIV 2, Titik bagian bawah terdiri dari peptida-peptida buatan
HIV-1. Piring/ plate memiliki 6 baris (A-F) dengan 12 sumur setiap baris, berisi larutan
reagen siap pakai yang berbeda pada setiap langkah pemeriksaan. Pemeriksaan
tersebut menunjukkan langkah dan perpindahan comb dari baris ke baris dengan
proses inkubasi pada setiap langkahnya.
Antigen dalam spot direaksikan dengan antibodi dalam serum akan terbentuk
kompleks antigen antibodi kemudian direaksikan dengan konyugat anti human IgG
yang berlabel enzim akan terbentuk ikatan konyugat anti human IgG dan terakhir
direaksikan dengan substrat kromogenik akan menghasilkan spot yang berwarna.

B. Metode : Immunocomb II HIV 1 dan 2 Bispot (ELISA).

C. Bahan : Serum pasen
D. Reagen : Immunocomb II HIV 1 dan 2 Bispot, terdiri dari:

1. Comb:

Comb dibungkus dengan kantung aluminium. Pada kit tersebut berisi 3 comb. Setiap comb
memiliki 12 gigi, 1 gigi dapat digunakan untuk setiap pemeriksaan. Gigi tersebut sensitif
dengan 3 areal reaktif . Titik titik bagian atas adalah antibodi dari Human Imunoglobulin
tersangka (kontrol internal), Titik bagian tengah terdiri dari peptida-peptida buatan HIV 2
(Envelope Glikoprotein), Titik bagian bawah terdiri dari peptida-peptida buatan HIV-1. Untuk
memulai pemeriksaan, sampel (serum) ditambahkan ke dalam lubang dari baris A plate
tersebut. Comb dimasukkan ke dalam lubang dari baris A. Apabila terdapat antibodi HIV
dalam sampel, maka secara khusus akan berikatan dengan peptida-peptida buatan dari titik
bawah dan atau titik tengah dari gigi-gigi comb. (Gambar 1). Secara serentak imunoglobulin
yang terdapat dalam sampel akan menangkap anti human imunoglobulin di titik bagian atas
(kontrol internal), komponen yang tidak terlapisi dicuci dalam baris B. Di dalam baris C yang
tertangkap dalam gigi-gigi tersebut akan bereaksi dengan anti human antibodi berlabel
enzim alkali fosfatase. Di dalam 2 baris selanjutnya komponen yang tidak terlapisi terlepas
melalui baris pencucian.Baris F: Lapisan alkali fosfatase akan bereaksi dengan komponen
kromogenik yang memberikan warna. Hasil yang tampak adalah spot (titik) yang berwarna
abu-abu kebiruan di atas permukaan gigi-gigi dari comb tersebut.
2. Plate

Kit berisi 3 plate yang dilapisi oleh aluminium foil. Setiap plate (gambar 3) berisi seluruh
reagen yang dibutuhkan untuk pemeriksaan. Plate tersebut terdiri dari 6 bagian (A-F) dengan
12 lubang setiap barisnya. Isi dari setiap baris adalah sebagai berikut:

- Baris A: cairan specimen/kontrol positip/kontrol negatip

- Baris B: Larutan Pencuci

- Baris C: Antibodi Anti Human Goat (tersangka) dilapisi Alkali fosfatase

- Baris D: Antibodi Anti Human Goat (tersangka) dilapisi Alkali Fosfatase

- Baris E: Larutan Pencuci

- Baris F : Larutan Substrat Kromogenik berisi 5 Bromo 4 Chloro 3 Indolyl Fosfat (BCIP) dan

Nitro Blue Tetrazolium (NBT).

3. Kontrol Positip : Satu mL cairan plasma positip penderita sebagai antibodi HIV 1 dan 2,
tidak aktif oleh Beta propiolakton, perlakuan panas.
4. Kontrol negatip : Satu mL cairan plasma negatip antibodi HIV

E. Alat : Perforator, dropper, sarung tangan, clinipet 50 uL dan tip kuning, stopwatch

kertas saring, label,plate Immunocomb II HIV ½ Bispot, comb.

F.Cara Kerja :

1. Semua komponen disiapkan

2. Sampel sebanyak 50 uL dipipet dengan mikropipet, lubangi satu sumur yang berlapis
aluminium foil di baris A dari plate tersebut menggunakan tip pipet atau perforator dan
sampel dimasukkan ke dalam sumur tersebut. Kemudian campur/ kocok beberapa kali.
3. Langkah yang sama dilakukan pada sampel lainnya. Kontrol positip dan kontrol
negatipp menggunakan sumur yang lain di baris A dengan tip yang berbeda.
a. Slipkan comb ke dalam sumur dari baris A tersebut yang sudah berisi spesimen dan
kontrol, campur, tarik dan celupkan kembali comb ke dalam sumur beberapa waktu.
b. Biarkan selama 10 menit menggunakan stop watch, campur, lalu campurkan kembali
sebanyak 2 kali selama proses inkubasi. Sebelum 10 menit lubangi aluminium foil baris
B menggunakan perforator, jangan membuka dulu lubang-lubang yang lain.
 c. Setelah 10 menit, comb diambil dari baris A. Cairan menempel dan menyerap ke
ujung sisir-sisir diletakkan di atas kertas serap bersih. Tidak boleh menyentuh
permukaan atas dan gigi-gigi.
4. Pencucian pertama dilakukan pada baris B.

5. Slipkan comb tersebut di atas ke dalam sumur-sumur pada baris B. Campur/ Aduk, tarik
dan celupkan kembali comb secara berulang ke dalam lubang selama 10 detik.
Pengadukkan diulangi beberapa waktu selama 2 menit, sementara itu sumur C
dilubangi, setelah 2 menit comb ditarik dan cairan dibiarkan menempel dan menyerap
seperti pada langkah 4 C.
6. Pengikatan dengan konyugat (Baris C)

7. Comb dislipkan ke dalam lubang baris C, campur comb beberapa waktu (10 detik),
lakukan seperti langkah 4b. Baris D dilubangi, setelah 10 menit, comb ditarik, cairan
menempel dan menyerap.
8. Pencucian ke dua (Baris D)

9. Comb dislipkan ke dalam sumur dari baris D, ulangi pengadukan selama 2 menit, selain
itu lubangi baris E. Setelah 2 menit, comb ditarik dan cairan menempel dan menyerap.
10. Pencucian ke 3 (Baris E)

11. Comb dislipkan ke dalam sumur dari baris E, pengadukan dilakukan secara berulang
selama 2 menit. Sementara itu lubangi baris F. Setelah 2 menit, comb ditarik dan cairan
menempel dan menyerap.
12. Reaksi Warna (Baris F)

13. Comb dislipkan ke dalam sumur dari baris F. Campur seperti pada langkah 4a. Waktu
diset selama 10 menit. Campur seperti langkah 4b. Setelah 10 menit comb ditarik.
14. Penghentian reaksi (Baris E)

15. Comb dislipkan ke dlam sumur baris E. Setelah 1 menit, comb ditarik dan dibiarkan
mengering di udara.
Rangkuman Langkah Kerja:

Langkah Baris Proses

Reaksi Antigen Antibodi A Campur, Inkubasi selama 10 menit. Absorpsi

Pencucian B Campur/ Aduk, inkubasi selama 2 menit.

Absorpsi
 Ikatan dari konjugat C Campur, inkubasi selama 10 menit. Absorpsi

Ikatan dari monjugat D Aduk, inkubasi selama 2 menit. Absorpsi

Pencucian E Aduk, inkubasi selama 2 menit, Absorpsi

Reaksi Warna F Campur, inkubasi selama 10 menit

Penghentian Reaksi E Inkubasi 1 menit, keringkan di udara.

Hasil Pengamatan :

- Kontrol positip harus menghasilkan 3 titik di gigi-gigi comb.

- Kontrol negatip harus menghasilkan titik bagian atas (kontrol internal) dan tidak ada titik
lain.
- Sampel harus menghasilkan titik bagian atas (kontrol internal). Hal tersebut menunjukkan
bahwa sampel telah ditambahkan.Jika terdapat kondisi lain, selain ke 3 kondisi tersebut,
maka hasil invalid dan sampel juga kontrol harus diganti.

H. Interpretasi Hasil

- Menunjukkan titik bagian atas (kontrol internal) mengidentifikasikan bahwa sampel tidak
memiliki antibodi dari HIV 1 dan HIV 2.
- Titik bagian tengah terwarnai mengindikasikan terdapat antibodi dari HIV 2.

- Titik bagian bawah terwarnai, mengindikasikan terdapat antibodi dari HIV 1.

Dalam kasus HIV I dan 2, dua titik akan ditemukan (titik atas sebagai kontrol internal).
Kadang-kadang konsentrasi tinggi dari antibodi anti HIV 1 atau antibodi anti HIV 2 akan
dihasilkan 2 titik.
 Topik3
Pemeriksaan antibodi Ig G / Ig M Rubella

T
(HSV).
ORCH merupakan singkatan untuk beberapa penyakit infeksi yang terkait dengan
meningkatnya risiko terjadinya kecacatan pada janin jika menginfeksi wanita hamil
yaitu Toxoplasma gondii, Rubella, Cytomegalovirus (CMV) & Herpes simpleks virus

Pemeriksaan laboratorium yang diperlukan untuk membantu mengetahui infeksi TORCH

adalah menggunakan metode ELISA.

Cara Penularan TORCH bisa secara aktif maupun pasif.

Penularan secara aktif (didapat) disebabkan antara lain makan daging setengah matang yang
berasal dari hewan yang terinfeksi, makan makanan yang tercemar oosista dari feses
(kotoran) kucing yang menderita TORCH, transfusi darah (tropozoid), transplantasi organ
atau cangkok jaringan (tropozoid, sista), kecelakaan di laboratorium yang menyebabkan
TORCH masuk ke dalam tubuh atau tanpa sengaja masuk melalui luka hubungan seksual
antara pria dan wanita juga bisa menyebabkan menularnya TORCH. Ibu hamil yang kebetulan
terkena salah satu penyakit TORCH ketika mengandung, Air Susu Ibu (ASI) juga bisa sebagai
penyebab menularnya penyakit TORCH. Sedangkan penularan secara pasif (bawaan) terjadi
pada bayi melalui ibu yang terinfeksi TORCH pada masa kehamilan.
TOxoplasmosis disebabkan oleh parasit yang disebut Toxoplasma gondii. Infeksi
Toxoplasma berbahaya bila terjadi saat ibu sedang hamil atau pada orang dengan sistem
kekebalan tubuh terganggu (misalnya penderita AIDS). Diagnosis Toxoplasmosis secara klinis
sukar ditentukan karena gejala-gejalanya tidak spesifik atau bahkan tidak menunjukkan
gejala (sub klinik). Oleh karena itu, pemeriksaan laboratorium mutlak diperlukan untuk
mendapatkan diagnosis yang tepat.
Rubella disebabkan oleh virus Rubella, dapat menyerang anak-anak dan dewasa muda.
Infeksi Rubella berbahaya bila tejadi pada wanita hamil muda, karena dapat menyebabkan
kelainan pada bayinya. Tanda-tanda dan gejala infeksi Rubella sangat bervariasi untuk tiap
individu, oleh karena itu, diagnosis infeksi Rubella yang tepat perlu ditegakkan dengan
bantuan pemeriksaan laboratorium.
Cytomegalovirus (CMV) disebabkan oleh virus Cytomegalo, dan virus ini temasuk
golongan virus keluarga Herpes, CMV dapat tinggal secara laten dalam tubuh dan CMV
merupakan salah satu penyebab infeksi yang berbahaya bagi janin bila infeksi terjadi saat ibu
sedang hamil. Jika ibu hamil terinfeksi, maka janin yang dikandung mempunyai risiko tertular.
Pemeriksaan laboratorium sangat bermanfaat untuk mengetahui infeksi akut atau infeski
berulang
Herpes simpleks virus (HSV) disebabkan oleh Virus Herpes Simpleks tipe II (HSV II).
Bayi yang dilahirkan dari ibu yang terinfeksi HSV II biasanya memperlihatkan lepuh pada kulit,
tetapi hal ini tidak selalu muncul sehingga mungkin tidak diketahui. Pemeriksaan
laboratorium yang dapat dilakukan, yaitu dengan memeriksa adanyaAnti-HSV II IgG dan IgM
sangat penting untuk mendeteksi secara dini terhadap kemungkinan terjadinya infeksi oleh
HSV II dan mencegah bahaya lebih lanjut pada bayi bila infeksi terjadi pada saat kehamilan.
Enzyme Link Immuno Sorbent Assay (ELISA) merupakan alat untuk uji serologis yang cepat
dan sensitif juga spesifik terhadap hasil pemeriksaan maka, ELISA cocok digunakan untuk
pemeriksaan TORCH.

Prinsip kerja dari ELISA adalah adanya ikatan antigen dengan antibodi spesifik. Ikatan antigen
antibodi yang dilabel dengan enzim akan mengubah substrat yang akan memberikan warna,
dan dibaca pada ELISA reader.

A. Tujuan : Untuk mengetahui adanya antibodi Rubella pada serum manusia.

B. Prinsip : Pemeriksaan Rubella dengan ELISA
Antigen Rubella dilapiskan pada permukaan microwells. Serum pasien yang
diencerkan ditambahkan pada wells, dan antibodi spesifik Rubella IgG/IgM
jika terdapat pada serum pasen maka akan berikatan dengan antigen. Semua
material yang tidak berikatan akan dicuci. Setelah menambahkan enzim
konjugat akan berikatan dengan kompleks antibodi antigen. Kelebihan enzim
konjugat akan dicuci dan tambahkan substrat TMB Chromogenic. Reaksi
katalitik enzim konjugat akan terhenti pada waktu yang spesifik. Intensitas
warna yang terbentuk sebanding dengan antibodi IgG/IgM dalam sampel.
C. Metode : Indirect ELISA
D. Bahan : Serum pasen
E. Reagen : Kit Rubella dari reagen
F. CaraKerja :
1. Masukkan ke dalam sumur kontrol dan kalibrator 200 µl
2. Masukkan ke dalam sumur sampel, 200 µl diluen + 20 µl serum
3. Inkubasi 45 menit pada suhu 37 o C
4. Cuci sebanyak 6 kali
5. Tambahkan antigen / antibodi komplek sebanyak 100 µl
6. Inkubasi 45 menit pada suhu 37 o C
7. Cuci sebanyak 6 kali
8. Tambahkan TMB/H2O2 sebanyak 100 µl
9. Inkubasi 15 menit pada suhu 37 o C
10. Tambahkan asam sulfat sebanyak 100 µl
G. Interpretasi Hasil

Bila IgG (-) dan IgM (+)

Kasus ini jarang terjadi, kemungkinan merupakan awal infeksi. Harus diperiksa kembali 3
minggu kemudian untuk melihat apakah IgG berubah menjadi (+). Bila tidak berubah, maka
IgM tidak spesifik, yang bersangkutan tidak terinfeksi Toxoplasma.

Bila IgG (-) dan IgM (-)

Belum pernah terinfeksi dan beresiko untuk terinfeksi.
Bila IgG (+) dan IgM (+)
Kemungkinan mengalami infeksi primer baru atau mungkin juga infeksi lampau tapi IgM nya
masih terdeteksi (persisten=lambat hilang). Oleh sebab itu perlu dilakukan tes IgG affinity
langsung pada serum yang sama untuk memperkirakan kapan infeksinya terjadi, apakah
sebelum atau sesudah hamil. Keadaan ini perlu dilanjutkan dengan pemeriksaan Aviditas IgG.
Bila aviditas IgG tinggi, menunjukkan infeksi didapat lebih dari empat bulan yang lalu
Bila IgG (+) dan IgM (-)

Pernah terinfeksi sebelumnya. Bila pemeriksaan dilakukan pada awal kehamilan, berarti
infeksinya terjadi sebelum kehamilan dan saat ini telah memiliki kekebalan. Bagi penderita
yang sudah pernah terpapar, nilai IgG tidak akan kembali ke angka negatif atau nol
Quality Control

Sebuah cek validasi dilakukan pada kontrol setiap saat kit digunakan untuk memverifikasi
apakah kinerja dari assay memenuhi syarat.
Hasil pemeriksaan dibandingkan dengan data kontrol berikut :

Kalibrator Persyaratan

Rubella IgM S/Co > 1.1

CMV IgM S/Co > 1.1

Toxo IgM S/Co > 1.5

HSV 1 & 2 IgM S/Co > 1.1

Ketika Calibrator digunakan memverifikasi cocok maka pemeriksaan dilanjutkan.

Persyaratan Kalibrator
Permasalahan Pemeriksaan
Sumur Blanko > 0.050  Larutan substrat kromogen belum
OD 450 nm terkontaminasi selama pemeriksaan
Kontrol Rendah > 0.200  Proseder pencucian dan pengaturan
OD 450 nm setelah variasi pencucian telah divalidasi pada uji pra
koefisien blanko > 30% qualifikasi
  bahwa larutan pencuci yang tepat telah
digunakan dan alat telah dicuci sebelum
digunakan
 Bahwa tidak ada kesalahan yang telah
dilakukan dalam prosedur pengujian
(Pengisapan kontrol tinggi bukan kontrol
rendah)
 Bahwa tidak ada kontaminasi dari kontrol
rendah atau sumur dimana telah terjadi
penghisapan karena penghisapan sample
yang tinggi, terhadap tumpahan atau
konjugat enzim.
 Bahwa mikropipet tidak terkontaminasi
dengan sampel yang tinggi atau dengan
konjugat enzim
 Bahw jarum pencuci tidak terhalang atau
tersumbat
Kalibrator RCH S/CO < 1.1  Bahwa prosedur harus dilakukan dengan
Kalibrator Terhadap S/CO < 1.5 benar
 Bahwa tidak ada kesalahan terjadi ketika
pengambilan kalibrator (contoh: tertukar
dengan kontrol rendah)
 Bahwa prosedur pencucian dan
pengaturan pencucian telah divalidasi
pada persiapan pemeriksaan
 Bahwa tidak terjadi kontaminasi
eksternal pada kalibrator
 Bahwa EIA telah dilarutkan dengan
volume dan pelarut yang benar sesuai
dengan petunjuk yang tertera
Kontrol Tinggi < 0.750  Bahwa prosedur harus dilakukan dengan
OD 450 nm benar
 Bahwa tidak ada kesalahan terjadi ketika
pengambilan kontrol (contoh: tertukar
dengan kontrol rendah dengan kontrol
tinggi)
 Bahwa tidak terjadi kontaminasi
eksternal pada kalibrator
 Bahwa EIA telah dilarutkan dengan
volume dan pelarut yang benar sesuai
dengan petunjuk yang tertera
 Topik 4
Pemeriksaan ECLIA untuk deteksi antibodi
Pemeriksaan Ig E

I
gE merupkan Imunoglobulin E yang kadarnya meningkat pada infeksi cacing (berperan
dalam imunitas parasit), selain itu IgE juga berhbungan terutama dengan reaksi alergi.
Karena bila terdapat alergen maka akan diikat silang (cross linking) oleh 2 molekul IgE
pada
permukaan sel mast sehingga menimbulkan influk ion kalsium ke dalam sel, hal itu
menurunkan kadar adenosin monofosfat siklik (CAMP)  Degranulasi sel mast.
Chemiluminescence adalah emisi atau pancaran cahaya oleh produk yang distimulus oleh
sutau reaksi kimia atau kompleks cahaya. ECLIA menggunakan teknologi tinggi yang memberi
banyak keuntungan dibandingkan dengan metode lain. Pada metode ini menggunakan
prinsip sandwich, kompetitif, dan bridging.
Metode ECLIA ini menggunakan ruthenium(II) tris(bipyridyl) [Ru(bpy)32+ ] sebagai labelnya dan
bereaksi dengan tripropilamine (TPA) pada permukaan elektroda pada panjang gelombang
620 nm.

Tujuan : Untuk mengetahui adanya Ig E pada serum manusia.

A.Prinsip : . IgE dalam bahan pemeriksaan akan berikatan dengan anti-IgE spesifik
antibodi Biotin dan anti-IgE antibodi Ruthenium membentuk kompleks.
. Penambahan Streptavidin coated mikropartikel akan menempel pada

kompleks tsb.
. Kompleks yang terikat akan ditangkap oleh permukaan elektroda. Zat-zat
yang tidak berikatan akan dicuci oleh procell.
. Emisi chemiluminescent akan diukur oleh photomultiplier dan hasil
ditentukan menggunakan kurva kalibrasi.
 Gambar 71. Prinsip Pemeriksaan Ig E
B. Metode : Sandwich ECLIA
C. Bahan : Serum pasen

D. Reagen : 1. Elecsys Ig E II Kit reagen tdd : - Streptavidin coated mikropartikel

- Anti IgE antibodi Biotin

- Anti IgE antibodi Ruthenium

2. IgE set

3. Elecsys PreciControl IgE

4. Procell, clean cell, sys wash, assay cup, assay tip

E. Alat : 1. Elecsys 2010 instrument

2. APD

F. Cara Kerja

1. Sampel yang beku, reagensia, kalibrator, dan juga kontrol didiamkan di suhu ruangan
(20 - 25 ̊C), dan disiapkan menjadi larutan kerja sesuai petunjuk pada leafleat.

2. Reagensia diletakkan pada disk reagensia, kalibrator pada disk sampel. Lakukan
kalibrasi reagen.
3. Letakkan kontrol dan sampel pada disk sampel. Lakukan pemeriksaan sampel.

299 Imunoserologi 
 1 2 3

1. Suspensi Paramagnetic
Microbeads (M)
2. Reagen 1
3. Reagen 2
Sampel 50 μl dimasukkan ke dalam Disk
 1. Inkubasi pertama: antigen dari sampel (50 µL), antibodi biotinilasi poliklonal spesifik
β- CrossLaps dan antibodi monoklonal spesifik β-CrossLap yang telah dilabel dengan
kompleks ruthenium membentuk kompleks.
2. Inkubasi kedua: setelah pembahan mikropartikel yang dilapisi oleh streptavadin
terjadi kompleks antigen antibodi melalui interaksi biotin dan streptavadin.
3. Gabungan reaksi ini diaspirasikan kedalam sel pengukur elektrokimia dimana
substansi yang tidak terikat dicuci dan kemudian dipindahkan oleh buffer procell,
sedangkan kompleks imun yang terbentuk ditangkap secara magnetis. Aplikasi dari
voltase ke elektroda kemudia menginduksi emisi cahaya chemiluminesence yang
diukur dengan photomultiper.
Hasil akan tertera pada komputer yang tersambung dengan alat.
F.Cara Kerja (sesuai petunjuk leaflet) :

1. Serum dimasukkan dalam cuvet sebanyak 15 µL

2. Cuvet dimasukkan pada disk Elecsys 2010

3. Masukkan sampel ID di sampel ID, lalu tekan Enter

4. Masukkan nomor posisi sampel di disk position, lalu tekan Enter. Bila diperlukan, ganti
no Sequence dan tentukan faktor pengenceran set dilution faktor. Posisi dan nomor
sequence akan bertambah secara otomatis.
5. Tandai tes yang dipilih dengan menekan nama tes

6. Tekan new sampel untuk sampel selanjutnya

7. Tekan start.

G.Sensitivitas
Sensitivitas pemeriksaan : 0,25 ng/mL

H.Interpretasi Hasil
- Dewasa : < 100 IU/mL
- Neonatus : < 1.5 IU/mL
- < 1 tahun : <15 IU/mL
- 1-5 tahun : <60 IU/mL
- > 5-9 tahun : <90 IU/mL
- >9-15 tahun : <200 IU/mL