BAB I

PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari tentang mikroorganisme yang
tidak dapat dilihat dengan mata telanjang untuk meneliti apa saja yang terkandung
di dalam mikroorganisme. Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai
morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup
hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut
disuspensikan. Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri
dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan
metode pengecatan atau pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas
dan mudah diamati. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat
fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangkaian
pengecatan. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu
cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi (Jawetz 2008).
Struktur di dalam sel pada tempat-tempat yang dibentuk oleh spesies
ini,disebut endospora. Endospora dapat bertahan hidup dalam keadaan
kekurangan nutrien, tahan terhadap panas, kekeringan, radiasi UV serta bahan-
bahan kimia. Ketahanan tersebut disebabkan oleh adanya selubung spora yang
tebal dan keras. Sifat-sifat ini menyebabkan dibutuhkannya perlakuan yang keras
untuk mewarnainya. Hanya bila diperlukan panas yang cukup, pewarna yang
sesuai dapat menembus endospora. Tetapi sekali pewarna memasuki endospora,
sukar untuk dihilangkan. Ukuran dan letak endospora di dalam sel merupakan
ciri-ciri yang digunakan untuk membedakan spesies-spesies bakteri yang
membentuknya (Prescott 2008).
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum.
Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa
macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil,
dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri
berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip
buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan

1
tidak melengkung. Hal ini menyebabkan, mengamati bakteri dalam keadaan hidup
akan sulit. Karena hal tersbebutlah, dikembangkan teknik atau metode pewarnaan
sel gram bakteri . Teknik pewarnaan sel bakteri adalah suatu cara utama dalam
penelitian mikrobiologi. Hal tersebut dilakukan untuk mempermudah proses
identifikasi bakteri. Pewarnaan gram merupakan salah satu prosedur atau metode
yang sering sekali dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri. Pewarnaan gram
yang bertujuan untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar,
yaitu Gram positif dan gram negatif, yang didasarkan berdasarkan sifat kimia dan
fisika dinding sel mereka. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan
warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan
ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Jawetz, 2005).
Berdasarkan latar belakang di atas, maka perlu dilakukannya praktikum
“Pewarnaan Gram Bakteri” agar memberikan pemahaman kepada kita tentang
hal-hal yang berkaitan dengan pewarnaan atau pengecatan bakteri untuk
membantu identifikasinya.
1.2 Tujuan Praktikum
1. Mengetahui morfologi dari mikroorganisme yang berkelompok
2. Membedakan antara morfologi koloni mikroorganisme bakteri dan fungi
3. Mengidentifikasi bakteri Gram positif dan Gram negative
1.3 Manfaat praktikum
1. Agar mahasiswa dapat mengetahui morfologi dari mikroorganisme yang
berkelompok
2. Agar mahasiswa dapat membedakan antara morfologi koloni
mikrorganisme
yang berkelompok
3. Agar mahasiswa dapat mengidentifikasi bakteri gram positif dan gram
negatif

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Dasar Teori
2.1.1 Morfologi Mikroorganisme
Mikroorganisme merupakan jasad hidup yang mempunyai ukuran
sangat kecil (Kusnadi, dkk, 2003). Setiap sel tunggal mikroorganisme
memiliki kemampuan untuk melangsungkan aktivitas kehidupan antara
lain dapat mengalami pertumbuhan, menghasilkan energi dan
bereproduksi dengan sendirinya. Mikroorganisme memiliki fleksibilitas
metabolisme yang tinggi karena mikroorganisme ini harus mempunyai
kemampuan menyesuaikan diri yang besar sehingga apabila ada interaksi
yang tinggi dengan lingkungan menyebabkan terjadinya konversi zat yang
tinggi pula. Akan tetapi karena ukurannya yang kecil, maka tidak ada
tempat untuk menyimpan enzim-enzim yang telah dihasilkan. Dengan
demikian enzim yang tidak diperlukan tidak akan disimpan dalam bentuk
persediaan.enzim-enzim tertentu yang diperlukan untuk perngolahan bahan
makanan akan diproduksi bila bahan makanan tersebut sudah
ada.Mikroorganisme ini juga tidak memerlukan tempat yang besar, mudah
ditumbuhkan dalam media buatan, dan tingkat pembiakannya relative cepat
(Darkuni2001). Oleh karena aktivitasnya tersebut, maka setiap
mikroorganisme memiliki peranan dalam kehidupan, baik yang merugikan
maupun yang menguntungkan.
Bentuk umum mikroorganisme terdiri dari satu sel (uniseluler),
seperti yang umum didapatkan pada bakteri, ragi, dan mikroalga. Bentuk
mikroorganisme dapat juga berbentuk filamen atau serat, yakni rangkaian sel
yang terdiri dari 2 sel atau lebih yang berbentuk rantai, seperti yang umum
didapatkan pada fungi. Bentuk filamen paa kenyataannya dapat
berupa filamen semu bila hubungan antara sel satu dengan lainnya tidak

3
nyata atau tidak ada. Sedangkan bentuk filament benar, kalau hubungan
antara satu sel dengan lainnya terdapat hubungan yang jelas, baik hubungan
secara morfologis (bentuk) maupun secara fisiologi (fungsi sel).
1. Morfologi Jamur
Jamur adalah mikroorganisme yang masuk golongan eukariotik dan tidak
termasuk golongan tumbuhan. Jamur berbentuk sel atau benang bercabang dan
mempuyai dinding sel yang sebagian besar terdiri atas kitin dan glukan, dan
sebagian kecil dari selulosa atau kitosan. Gambaran tersebut yang membedakan
jamur dengan sel hewan dan sel tumbuhan. Sel hewan tidak mempunyai dinding
sel, sedangkan sel tumbuhan sebagian besar adalah selulosa. Jamur mempunyai
protoplasma yang mengandung satu atau lebih inti, tidak mempunyai klorofil dan
berkembang biak secara aseksual, seksual, dan keduanya (Sutanto, 2008).
Morfologi jamur mencakup khamir dan kapang.
a. Khamir adalah sel-sel yang berbentuk bulat (uniseluler) dan dapat bersifat
dimorfistik, lonjong atau memanjang yang berkembang biak dengan
membentuk tunas dan membentuk koloni yang basah atau berlendir.
Sedangkan kapang terdiri atas sel-sel memanjang dan bercabang yang disebut
hifa, anyaman hifa yang disebut miselium (Sutanto, 2008).
b. Kapang adalah jamur yang tersusun dari hifa-hifa. Hifa tersebut dapat
bersekat sehingga terbagi menjadi banyak sel, atau tidak bersekat disebut hifa
senositik (coenocytic). Anyaman hifa baik yang multiseluler atau senositik
disebut miselium. Kapang membentuk koloni yang menyerupai kapas
(cottony, woolly) atau padat (velvety, powdery, granular) (Sutanto, 2008).
2. Morfologi Bakteri
Bakteri adalah organisme prokariotik yang umumnya tidak mempunyai
klorofil, dan produksi aseksualnya terjadi melalui pembelahan sel. Bakteri pada
umumnya merupakan makhluk hidup yang juga memiliki DNA, akan tetapi DNA
bakteri tidak berada pada nukleus yang juga tidak mempunyai membran sel. DNA
ekstrakromosomal dari bakteri tergabung menjadi satu plasmid yang berbentuk
kecil dan sirkuler ( Jawetz, 2004) . Menurut Dwidjoseputro (1985) Ukuran sel

4
bakteri pada umumnya adalah 0,5-1,0 µm, dan mempunyai tiga bentuk dasar yaitu
bulat atau kokus, batang atau Bacillus, dan bentuk spiral.
Koes (2006) menyebutkan ada beberapa faktor yang dapat mempengaruhi
pertumbuhan bakteri antara lain adalah :
a. Sumber energi.
b. Sumber karbon.
c. Sumber nitrogen.
d. Sumber garam-garam anorganik.
e. Bakteri-bakteri tertentu membutuhkan faktor-faktor tumbuh tambahan.
Menurut (Fardiaz, 1989) Pertumbuhan bakteri memiliki beberapa fase,
beberapa fase pertumbuhan bakteri yaitu :
a. Fase adaptasi.
b. Fase pertumbuhan.
c. Fase logaritmik.
d. Fase pertumbuhan lambat.
e. Fase pertumbuhan tetap (statis).
f. Fase menuju kematin dan fase kematian.
Menurut Subandi (2014:69) bakteri merupakan organisme dengan ciri-ciri
sebagai berikut:
1. Prokariot, yaitu mikroorganisme yang tidak memiliki membran inti;
Sel tunggal, mikroorganisme mikroskopik (kekecualian ada dua yang
ditemukan dengan ukuran yang hampir dapat dilihat dengan mata telanjang,
yaitu Epulopiscium fishelsomi suatu bakteri berbentuk batang dengan
diameter 80 µm dan panjang 200-600 µm dan Thionargarita namibiensis suatu
bakteri berbentuk sperik (lensa) dengan diameter 100-750 µm;
2. Umumnya berukuran lebih kecil daripada sel eukariot;
3. Sangat kompleks meskipun ukurannya kecil.
Menurut Mahata, dkk (2008:11) Bentuk morfologi bakteri dapat dibagi
menjadi 3 bagian, yaitu:
1. Bentuk basil (bacillus) Basil berbentuk seperti tongkat pendek, agak
silindris, bentuk basil meliputi sebagian besar bentuk bakteri.

5
 2. Bentuk coccus (bulat) Bentuk coccus adalah bentuk bakteri seperti bola-
bola kecil, golongan bakteri ini tidak sebanyak basil. Baik dalam bentuk basil
maupun coccus, secara kelompok dapat berupa:
a. Seperti rantai bergandengan panjang= streptobasil atau streptococcus
b. Berdua-dua bergandengan= diplococcus
c. Mengelompok berempat= Tetracoccus
d. Bergerombol seperti anggur= Staphylococcus
e. Berkelompok seperti kubus= sarcina
3. Bentuk Spiral
Bentuk spiral adalah bakteri yang berbentuk spiral atau panjang bengkok-
bengkok. Golongan ini tidak banyak dibandingkan dengan basil dan coccus.
4. Bentuk Vibrio (Koma) Bentuk vibrio adalah bentuk seperti batang bengkok
dan seperti tanda koma.
5. Bentuk Spirocheta (Spirochet) Bentuk spirocheta adalah bentuk seperti
batang berbelit-belit, panjang dan banyak belitannya.
Menurut Harti (2015:14), struktur sel bakteri terdiri dari:
a. Dinding Sel Merupakan struktur kompleks, semi kaku, dengan tebal 10-23
nanomikron dan mengelilingi membran sitoplasma; berfungsi memberi bentuk sel
dan melindungi isi del dari pengaruhy luar sel. Tersusun makromolekul
peptidoglikan (murein) yang terdiri dari disakarida dan polipeptida. Disakarida
terdiri dari monosakarida yang merupakan N-acetylglucosamine (NAG) dan N-
acetylmuramic acid (NAM).
b. Membran plasma Membran Plasma merupakan struktur tipis di bawah
dinding sel dan membungkus sitoplasma sel, tersusun fospolipid dan protein
membentuk struktur fospolipid bilayer yang terdiri dari bagian “kepala dan ekor”.
Bagian kepala tersusun dari fosfat dan gliserol, sehingga bersifat hidrofil (polar
dan larut air), bagian ekor tersusun dari asam lemak sehingga bersifat hidrofob
(nonpolar dan tidak larut air). Gugus polar kedua permukaan dan gugus nonpolar
pada bagian dalam bilayer. Tidak mengandung sterol, sehingga kurang rigid dari
membrane eukariotik; berfungsi sebagai membran selektif permiabel

6
(semipermiabel) yaitu barier selektif terhadap bahan atau materi yang masuk dan
keluar sel.

Pertukaran zat melalui membran sel melalui:

1. Proses pasif (passive procces) yang meliputi:
a. Simple diffusion, merupakan proses perpindahan zat yang terjadi karena
adanya perbedaan tekanan osmotik isi sel dengan lingkungannya.
b. Facilitated diffusion, merupakan proses difusi pasif dengan perantara
protein pembawa (carrier protein), molekul yang di transport seperti glukosa dan
asam amino.
c. Osmosis, merupakan proses pertukaran zat pelarut dari tempat yang
berkonsentrasi rendah menuju tempat dengan konsentrasi tinggi melalui membran
semi permeabel.
2. Proses aktif (active procces) meliputi:
a. Transport aktif, merupakan pertukaran zat yang membutuhkan energi dan
transport protein tanpa terjadi perubahan senyawa.
b. Translokasi gugus, merupakan pertukaran zat yang membutuhkan energi
dan transport protein tanpa terjadi perubahan senyawa.
c. Sitoplasma, sebagai substansi sel dalam membran plasma, bagian ini
tersusun dari air (805%), proteinj, karbohidrat, lipid, ion anorganik, senyawa
dengan berat molekul rendah; bersifat tebal, semi transparan dan elastis.
Menurut Fifendy (2017:124-126) terdapat beberapa faktor yang dapat
mempengaruhi pertumbuhan bakteri , yaitu:
1. Tingkat Keasaman (pH) Kebanyakan mikroba tumbuh baik pada pH sekitar
netral dan pH 4,6-7,0 merupakan kondisi optimum untuk pertumbuhan bakteri,
sedangkan kapang dan khamir tumbuh pada pH yang lebih rendah.
2. Suhu (Temperatur) Suhu merupakan salah satu faktor lingkungan yang
berpengaruh terhadap pertumbuhan mikroba. Setiap mikroba mempunyai kisaran

7
suhu dan suhu optimum tertentu untuk pertumbuhannya. Berdasarkan kisaran
suhu pertumbuhan, mikroba dibedakan atas tiga kelompok sebagai berikut:
a. Psikrofil, yaitu mikroba yang mempunyai kisaran suhu pertumbuhan pada
suhu 0-20˚C.
b. Mesofil, yaitu mikroba yang mempunyai kisaran suhu pertumbuhan 20-
45˚C c. Termofil, yaitu mikroba yang suhu pertumbuhannya diatas 45˚C
3. Nutrien Mikroba sama dengan makhluk hidup lainnya, memerlukan suplai
nutrisi sebagai sumber energi dan pertumbuhan selnya. Unsur-unsur dasar tersebut
adalah: karbon, nitrogen, hidrogen, oksigen, sulfur, fosfor, zat besi dan sejumlah
kecil logam lainnya. Ketiadaan atau kekurangan sumber-sumber nutrisi ini dapat
mempengaruhi pertumbuhan mikroba hingga pada akhirnya dapat menyebabkan
kematian.
4. Oksigen Mikroba mempunyai kebutuhan oksigen yang berbeda-beda untuk
pertumbuhannya.
Menurut Ramadhan (2015:89) Mikroorganisme mampu bersimbiosis dengan
organisme lain dan mempengaruhi kondisi lingkungannya karena sifatnya yang
berkembang cepat pada kondisi substansi yang mendukung hidup dan
perkembangannya. Interaksi dengan organisme lain dapat juga bersifat parasitik
atau merugikan dan menjadi patogen.
a. Bakteri yang menguntungkan Bakteri yang hidup di sekitar akar tumbuhan
atau rhizosfir dapat berperan sebagai pengikat nitrogen bebas dari udara. Gas
nitrogen yang bebas di udara menjadi senyawa yang terikat pada suatu media
leghaemoglobin bintil akar tumbuhan famili leguminosae. Tumbuhan tidak dapat
mengikat atau memfiksasi gas nitrogen bebas dari udara secara mandiri.
Kolaborasi ini merupakan simbiosis mutualistis, tumbuhan dapat memanfaatkan
senyawa nitrogen yang dihasilkan oleh metabolisme bakteri dalam bintil akar, dan
bakteri mendapat energi dari cairan akar. Selain itu, Bakteri menguntungkan
memproses bahan organik menjadi senyawa yang dibutuhkan tanaman , hewan
atau manusia. Jenis-jenis mikroba atau bakteri yang meguntungkan karena
menghasilkan zat-zat hara yang diperlukan tumbuhan diantaranya rhizobium,
azolla dan mikoriza.

8
 b. Bakteri yang Merugikan Bakteri yang merugikan melakukan aktivitas
dekomposisi menjadi bahan yang baeracun bagi tanaman , hewan atau manusia.
Kurang lebih 200 jenis bakteri dapat menyebabkan penyakit tanaman. Jenis-jenis
bakteri ini terutama berbentuk batang dan hanya terdiri dari enam genus (marga)
yaitu: Agrobacterium, Corynebacterium, Corynebacteriaceae, Erwinia,
Streptomyces dan Xanthomonas (Hasruddin dan Husna, 2014:82).

2.1.2 Metode Pewarnaan Gram

Pewarnaan bakteri diperlukan beberapa faktor, yaitu :
1. Fiksasi
Sebelum bakteri di warna harus dilakukan fiksasi lebih dahulu. Yaitu
dengan cara fisik (pemanasan atau freeze drying), atau dapat juga dilakukan
fiksasi dengan menggunakan agensia kimia.
Fungsi fisaksi ialah :
(1) Mencegah mengkerutnya globula-globula protein sel
(2) Mempertinggi sifat reaktif gugusan-gugusan karboksilat, amino
primer, sulfihidril
(3) Merubah anfinitas pewarnaan bakteri
(4) Mencegah terjadinya otolisis sel
(5) Dapat membunuh bakteri secara cepat dengan tidak menyebabkan
perubahan-perubahan bentuk atau strukturnya
(6) Melekatkan bakteri diatas gelas benda
(7) Membuat sel-sel lebih kuat (keras)

Cara fiksasi yang paling banyak digunakan dalam pewarnaan bakteri ialah
dengan membuat lapisan suspense bakteri di atas gelas benda, kemudian dikering-
anginkan dan dilakukan beberapa kali diatas api lampu spritus. Pada pewarnaan
biologi lainnya dapat digunakan agensia-agensia fiksasi kimia (campuran asam
cuka dengan asam pikrat, alkohol dengan aseton, dll).

2. Substrat

9
 Tiap pewarna bakteri basa atau pewarna bakteri asam dapat bereaksi
dengan konstituen tertentu. Oleh sebab itu substrat organic (lipids-lipids, protein-
protein, asam-asam nukleat dan karbohidrat) juga akan mempengaruhi pewarnaan
biologi. Sehingga dapat dibedakan sel-sel yang :
(1) Basofil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna bakteri basa
(2) Asidofil atau oksifil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna bakteri
asam
(3) Sudanolfil, yaitu sel-sel yang dapat mengikat pewarna bakteri yang
dapat larut dalam minyak.
3. Intensifikasi Pewarnaan
Dapat dilakukan beberapa cara, antara lain dengan mempertinggi kadar
pewarna bakteri atau menambah suatu mordan.
4. Pelunturan pewarna bakteri (Decolorizer)
Decolorizer digunakan terutama untuk mendapatkan kontras yang baik
pada bayangan mikroskop. Pada umumnya sel-sel yang sukar untuk dipewarna
bakteri akan lebih sukar untuk didekolorisasu (misalnya pada pewarnaan acid fast
pada Mucobacterium). Sebaliknya sel-sel yang mudah di warna akan lebih mudah
pula didekolorisasi.

2.2 Uraian Bahan

2.2.1 Alkohol 70% (Dirjen POM, 1979 ; Rowe,)
Nama Resmi : AETHANOLUM
Nama Lain : Etanol, alkohol
Rumus Molekul : C2H5OH
Berat Molekul : 46.07 gr/mol
Rumus Struktur :

Pemerian : Cairan tidak berwarna,mudah menguap, bau khas,

rasa panas. Mudah terbakar dengan memberkan
nyala biru yang tidak berasap.

10
 Kelarutan :  Sangat mudah larut dalam air, dalam klorofom P
dan dalam eter P.
Khasiat : Zat tambahan
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, terlindungi dari
cahaya ; di tempat sejuk, jauh dari nyala api
2.2.2 Aquadest (Dirjen POM, 1979)
Nama resmi : AQUA DESTILATA
Nama lain : Air suling
Rumus molekul : H2O
Berat molekul : 18,02 g/mol
Rumus struktur :

Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, tidak mempunyai

rasa, tidak berbau.
Kelarutan : Tercampur dengan pelarut yang paling polar
Khasiat : Dapat melarutkan berbagai zat
Kegunaan : Pelarut
Penyimpanan : Simpan didalam wadah tertutup rapat.
2.2.3 Kristal Violet (Dirjen POM, 1979)
Nama Resmi : TRIS (4-dimethylamino) PHENYL
METHYLIUM
CHLORIDE
Nama Lain : Ungu anilin
Rumus Molekul : C25N3H30Cl
Berat Molekul : 407,979 g/mol
Rumus Struktur :

11
 Kelarutan :  Sukar larut dalam air, agak suka larut dalam
etanol (95%) dan dalam asam asetat glasial.
Larutannya berwarna lembayung tua
Khasiat : Sebagai cat utama atau garam A dalam
pengecetan gram
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
2.2.4 Iodin (Dirjen POM, 1979)
Nama resmi : IODUM
Nama lain : Iodium
Rumus molekul : I
Berat molekul : 126,91 g/mol
Rumus struktur :

Pemerian : Keping atau butir, berat, mengkilat, seperti

logam ;
hitam kelabu; bau khas
Kelarutan : Larut dalam lebih kurang 3500 bagian air, dalam
13 bagian etanol (95%) dalam lebih kurang 4
bagian karbondisulfida P, larut dalam kloroform
P dan dalam karbontetraklorida P
Kegunaan : Sebagai komposisi cat B
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat
2.2.5 Metilen Blue (Dirjen POM, 1979)
Nama resmi : METHYLTHIONINI CHLORIDUM
Nama lain : Metilen Blue
Rumus molekul : C16H18CIN3S3H2O
Berat molekul : 373,90 g/mol
Rumus struktur :

12
 Pemerian : Larutan dalam air dan dalam etanol berwarna
biru
tua
Kelarutan : Larut dalam air dan dalam kloroform, agak sukar
larut dalam etanol
Kegunaan : Sebagai cat utama dalam pengecatan sederhana
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik
2.2.6 Safranin (Dirjen POM, 1979)
Nama resmi : SAFRANIN
Nama lain : Safranin
Rumus molekul : C20H19N4·Cl-
Berat molekul : 350,85 g/mol
Rumus struktur :

Kelarutan : Tidak larut dalam air, mudah larut dalam etanol

Kegunaan : Sebagai pewarna dalam beberapa pewarnaan
preparat dan memberikan warna merah pada
preparat.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat

13
 BAB III
MEKANISME KERJA
3.1 Alat Yang Digunakan
Adapun alat yang digunakan adalah, Autoklaf, Bunsen, Cawan Petri,
Cover Glass, Disposible, Inkubator, Labu Erlenmeyer, Mikroskop, Objek Glass,
Ose Bulat, Oven, Pipet Tetes, Rak Tabung, Tabung Reaksi.
3.2 Bahan Yang Digunakan
Adapun bahan yang digunakan adalah, Alkohol 96%, Aqua Pro Injeksi,
Inokulum Bakteri, Kapas, Larutan Kristal Violet, Larutan Lugol/ Iodin, Larutan
Safranin, Nutrient Agar, Nutrient Broth, Potato Dextrose Agar, Spiritus, Tisu.
3.3 Cara Kerja
3.3.1 Pewarnaan Sederhana
1. Disediakan kaca objek, bersihkan dengan alkohol, lalu lewatkan diatas
nyala api bunsen untuk mensterilkan kaca objek
2. Diambil satu tetes inokulum bakteri yang akan diperiksa, lalu diletakkan
diatas kaca objek
3. Dilewatkan diatas nyala api Bunsen
4. Dicuci dengan alkohol
4. Ditutupi dengan kaca penutup dan biarkan sampai kering
5. Diamati di bawah mikroskop morfologi jamur
3.3.2 Pewarnaan Gram Bakteri

14
1. Disediakan kaca objek, bersihkan dengan alkohol, lalu lewatkan diatas
nyala api bunsen untuk mensterilkan kaca objek
2. Diteteskan setetes aqua pro injeksi (aquadest steril) diatas kaca objek
tersebut
3. Diambil inokulum bakteri yang akan diidentifikasi, lalu letakkan diatas
tetesan aqua pro injeksi itu, kemudian dihomogenkan
4. Dilewatkan apusan/ pulasan tersebut diatas nyala api dengan cepat
5. Dteteskan kristal violet pada apusan dan biarkan 60 detik
6. Dicuci kristal violet dengan aquadest dan keringkan
7. Diteteskan larutan iodin pada apusan, di diamkan selama 60 detik
8. Dicuci dengan alkohol 95%
9. Diteteskan larutan safranin dan biarkan 60 detik
10. Dicuci dengan aquadest, lalu keringkan
11. Diamati warna bakteri dengan mikroskop, apakah bakteri tersebut
merupakan gram positif atau negatif

15
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Praktikum
Tabel 1. Hasil Pengamatan
No Jenis Gambar Perbandingan Keterangan
. mikroorganisme Sampel Literatur
Bentuk bakteri : Basil
1. Bakteri Warna bakteri : Merah
(Vibrio Gram : Negatif
Cholerae)
Bentuk bakteri :
2. Jamur Warna bakteri :
(Candida Gram :
Albicans)

4.2 Pembahasan
Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan
paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan
tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada
tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya
lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan
gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif

16
memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram
negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel
(Manurung, 2010).
Praktikum yang dilakukan kali ini adalah pewarnaan gram. Bakteri biakan
murni yang digunakan adalah bakteri vibrio cholerae yang telah diinokulasi pada
praktikum sebelumnya. Pada pewarnaan bakteri digunakan berbagai macam
reagen atau pewarna seperti kristal violet, lugol dan safranin.
Adapun alat yang digunakan untuk proses pewarnaan gram antara lain yaitu
Autoklaf, Bunsen, Cawan Petri, Cover Glass, Disposible, Inkubator, Kawat
penyangga, Labu Erlenmeyer, Mikroskop, Objek Glass, Ose Bulat, Ose Lurus,
Oven, Pipet Tetes, Rak Tabung, Tabung Reaksi. Kemudian untuk bahan yang
digunakan untuk proses pewarmaam gram yaitu Alkohol 96%, Aqua Pro Injeksi,
Inokulum bakteri, Kapas, Larutan Kristal violet, Larutan Safranin, Larutan
lugol/iodin, Larutan metilen blue, Medium NA, Medium NB, Medium PDA,
Spritus, Tissue.
Hal pertama yang dilakukan yaitu membersihkan seluruh area dan alat yang
akan dipakai untuk melakukan percobaan ini dengan alkohol 70%, penggunaan
alkohol 70% untuk mensterilkan. Menurut, Noviansari (2013), alkohol
menunjukan aktivitas sebagai bakterisid yang membunuh bakteri dalam bentuk
vegetatifnya. Hal ini menunjukan bahwa alkohol mampu menghambat
pertumbuhan bakteri.
Langkah selanjutnya yang dilakukan yaitu menyediakan kaca objek kemudian
dibersihkan dengan alkohol lalu dilewatkan diatas nyala api bunsen untuk
mensterilkan Langkah ini biasa juga disebut dengan fiksasi. Fiksasi adalah suatu
metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan
menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk
mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak
struktur selnya (Lay,1994). Kemudian yaitu mengambil 1 ose inokulum bakteri
yang akan diidentifikasi, lalu diletakkan di atas kaca objek selanjutnya
ditambahkan aquadest

17
 Selanjutnya percobaan pewarnaan gram bakteri, Langkah pertama yang
dilakukan yaitu menyediakan kaca objek kemudian dibersihkan dengan alkohol
70% lalu dilewatkan diatas nyala api bunsen untuk mensterilkan kaca objek,
Langkah kedua yaitu meneteskan setetes aqua pro injeksi (aquadest steril) diatas
kaca objek tersebut. Selanjutnya diambil inokulum bakteri yang akan
diidentifikasi, lalu diletakkan diatas tetesan aqua pro injeksi itu, setelah itu
dihomogenkan. Kemudian dilakukan fiksasi, Fiksasi bertujuan untuk mematikan
bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya
(Lay,1994). selanjutnya diteteskan kristal violet pada apusan dan biarkan selama
60 detik. Penggunaan kristal violet karena larutan kristal violet dapat mewarnai
seluruh sel, maka pewarna ini disebut pewarna primer (Salam Suriwiria, 1999)
Kemudian kristal violet dicuci dengan aquadest dan dikeringkan lalu dicuci
dengan alkohol penggunaan aquadest untuk 95%, Menurut Purwoko (2010)
alkohol berfungsi untuk membilas atau melunturkan kelebihan zat warna pada sel
bakteri (mikroorganisme). Alkohol memberikan dampak pada saat pewarnaan
gram, jika saat bakteri dibilas dengan alkohol , alkohol akan melarutkan lapisan
lipid pada dinding sel. Bakteri gram negatif yang dinding selnya tersusun dari
lapisan lipid yang tebal maka akan larut dalam alkohol.
Selanjutnya diteteskan larutan iodin pada apusan dibiarkan 60 detik. Larutan
yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan untuk desinfikasi
darurat air minum, dan sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam laboratorium,
pewarnaan dan tes medis (Dwidjoseputro.1998). selanjutnya dicuci larutan iodin
dengan aquadest dan keringkan lalu ditetesi dengan alkohol 95% dan dikeringkan,
selanjutnya dicuci dengan aquades, kemudian diteteskan larutan safranin dan
dibiarkan selama 60 detik. Safranin digunakan sebagai conterstain dalam beberapa
protokol pewarnaan, (Sutedjo,1991). Setelah itu dicuci dengan aquadest, lalu
dikeringkan terakhir diamati warna bakteri dengan mikroskop, apakah bakteri
tersebut merupakan gram positif atau negative. Menurut (Faradiaz, 1992) dengan
mikroskop diperoleh pembesaran sehingga memungkinkan untuk mengamati
objek yang halus yang tidak nampak jika dilihat dengan mata telanjang.

18
 Kemungkinan kesalahan pada praktikum ini antara lain pemberian zat warna
yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam
proses fiksasi, kemudian faktor lainnya adalah pada proses pencucian terlalu deras
dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut
terbawa air dan factor lain pada saat pengamatan miroskop yang digunakan
kurang dalam identifikasi sehingga membutuhkan waktu yang cukup lama serta
hasil gambar yang tidak terlalu jelas

BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk
mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan
mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di
bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna crystal
violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin
atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan
oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.
Dari hasil pengamatan yang kami peroleh pada saat pengamatan dibawah
mikroskop, pada pewarnaan sederhana untuk jamur tidak terlihat bentuknya

5.2 Saran
5.2.1 Saran Untuk Jurusan
Saran kami untuk jurusan agar sekiranya lebih melengkapi lagi sarana dan
prasarana yang ada di dalam laboratorium agar dapat memberikan kenyamanan
pada dosen, asisten dosen, maupun praktikan dalam melakukan praktikum di
Universitas Negeri Gorontalo.

19
5.2.2 Saran Untuk Laboratorium
Saran kami untuk laboratorium agar sekiranya dapat melengkapi dan
memperbaiki fasilitas yang tersedia didalam laboratorium untuk mempermudah
dan memperlancar proses praktikum tanpa adanya hambatan.
5.2.3 Saran Untuk Asisten
Saran kami agar asisten dan praktikan tidak ada missed communication
selama praktikum agar hubungan asisten dan praktikan terjalin dengan baik untuk
terciptanya suatu keberhasilan dalam mengikuti praktikum mikrobiologi
5.2.4 Saran Untuk Praktikan
Saran kami kepada rekan rekan praktikan agar sekiranya bisa konsisten dan
lebih tepat waktu lagi untuk berkumpul dan bersiap-siap dalam melakukan
praktikum. Dan agar kiranya para praktikan lebih rajin membaca materi dan
belajar agar bisa mendapatkan nilai yang bagus saat melakukan praktikum.

20