SNI 7303:2009

” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
Standar Nasional Indonesia

Metode identifikasi bakteri Aeromonas hydrophila

secara biokimia

ICS 65.150 Badan Standardisasi Nasional

” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
 SNI 7303:2009

” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
Daftar isi

Daftar isi.....................................................................................................................................i
Prakata .....................................................................................................................................ii
1 Ruang lingkup.................................................................................................................... 1
2 Istilah dan definisi .............................................................................................................. 1
3 Prinsip................................................................................................................................ 2
4 Peralatan ........................................................................................................................... 2
5 Bahan ................................................................................................................................ 3
6 Prosedur ............................................................................................................................ 3
7 Pelaporan .......................................................................................................................... 5
Lampiran A (normatif) Pembuatan media................................................................................ 6
Lampiran B (normatif) Pembuatan pereaksi ............................................................................ 7
Bibliografi ................................................................................................................................. 9

Tabel 1 - Kriteria bakteri Aeromonas hydrophila ..................................................................... 5

i
SNI 7303:2009

” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
Prakata

Dalam rangka keberlanjutan usaha budidaya, meningkatkan produktivitas dan jaminan mutu
komoditas perikanan budidaya serta memberikan hasil uji yang akurat bagi setiap pengujian
laboratorium uji, maka perlu disusun suatu Standar Nasional Indonesia (SNI) tentang Metode
identifikasi bakteri Aeromonas hydrophila secara biokimia.

Standar ini disusun oleh Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya, melalui
konsensus pada tanggal 6 - 9 Nopember 2006 di Bogor, Jawa Barat yang dihadiri oleh
Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya serta instansi terkait sebagai upaya untuk
meningkatkan jaminan mutu dan keakuratan hasil uji dengan memperhatikan:

1 Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan RI. No.Kep.01/Men/2002 tentang Sistem

Manajemen Mutu Terpadu Hasil Perikanan.
2 Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan RI. No.Kep.06/Men/2002 tentang
Persyaratan dan Tata Cara Pemeriksaan Mutu Hasil Perikanan yang Masuk ke wilayah
Republik Indonesia.
3 Keputusan Menteri Kelautan dan Perikanan RI. No.Kep.21/Men/2004 tentang Sistem
Pengawasan dan pengendalian Mutu Hasil Perikanan untuk Pasar Uni Eropa.

Standar ini juga telah melalui tahap jajak pendapat pada tanggal 21 Juni 2007 sampai
dengan 21 September 2007 dan tahap pemungutan suara pada tanggal 12 Juni 2008
sampai dengan 12 Agustus 2008, namun untuk mencapai kuorum diperpanjang sampai
dengan tanggal 12 September 2008 dan langsung disetujui menjadi RASNI.

ii
 SNI 7303:2009

” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
Metode identifikasi bakteri Aeromonas hydrophila secara biokimia

1 Ruang lingkup

Standar ini menetapkan prosedur identifikasi bakteri Aeromonas hydrophila secara biokimia.

2 Istilah dan definisi

2.1
contoh ikan
sejumlah kecil dari suatu populasi ikan yang digunakan untuk pemeriksaan dan memenuhi
persyaratan secara statistika

2.2
Gram negative
hasil pewarnaan Gram yang ditandai dengan sel bakteri yang berwarna merah

2.3
ikan besar
ikan yang sudah dapat dibedakan organ dalamnya secara makroskopis

2.4
ikan kecil
ikan yang tidak dapat dibedakan organ dalamnya secara makroskopis

2.5
inkubasi
pengkondisian bakteri untuk tumbuh dan berkembangbiak sesuai dengan suhu dan waktu
yang diperlukan

2.6
inokulasi
menumbuhan bakteri dari satu media ke media lain

2.7
isolasi
pemisahan bakteri dari organ target dari ikan dengan menumbuhkan pada media agar

2.8
isolat murni
bakteri hasil pemurnian dari koloni yang terisolir

2.9
media O/F
media yang digunakan untuk uji Oksidatif - Fermentatif

2.10
media RS (Rimler Shott)
uji yang dilakukan untuk menumbuhkan bakteri spesifik Aeromonas hydrophila

1 dari 9
SNI 7303:2009

” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
2.11
media umum
media yang umum digunakan untuk penumbuhan bakteri

2.12
organ target
organ yang menjadi sasaran infeksi patogen dan digunakan sebagai objek pemeriksaan

2.13
pewarnaan Gram
uji untuk mengetahui morfologi bakteri dan membedakan sifat dinding sel bakteri dengan
menggunakan pewarna Gram

3 Prinsip

Mengisolasi dan memurnikan bakteri pada media umum kemudian diidentifikasi secara
morfologi dan uji biokimia.

4 Peralatan

a) laminarflow-hood (safety cabinet);

b) peralatan bedah;
c) meja bedah;
d) cawan petri;
e) labu erlenmeyer;
f) tabung reaksi;
g) jarum Őse;
h) bunsen;
i) pipet tetes;
j) pipet berskala;
k) tangkai kaca (hockey stick);
l) mortar;
m) autoclave;
n) vortex mixer;
o) timbangan analitik dengan ketelitian 0,01 g;
p) oven;
q) inkubator;
r) hot plate stirrer;
s) magnetic stirrer;
t) botol semprot;
u) rak tabung reaksi;
v) alat tulis;
w) mikroskop;
x) refrigerator;
y) pensil kaca.

2 dari 9
 SNI 7303:2009

” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
5 Bahan

a) media umum (TSA, BHI, NA);

b) akuades;
c) alkohol 70 %;
d) alkohol aseton;
e) larutan crystal violet;
f) larutan iodine-lugol;
g) larutan safranin;
h) larutan tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride 1 % dalam akuades (reagen
oksidase);
i) O/F basal medium;
j) larutan glukosa 10 % disterilkan secara filterisasi;
k) 0/129 disc;
l) paraffin oil steril;
m) RS medium;
n) SIM agar;
o) kertas label;
p) paraffin;
q) alumunium foil;
r) filter paper.

CATATAN Pembuatan media diuraikan dalam Lampiran A dan pembuatan pereaksi diuraikan
dalam Lampiran B.

6 Prosedur

6.1 Preparasi contoh

6.1.1 Ikan besar

a) Bersihkan permukaan tubuh ikan dengan kapas yang telah dibasahi alkohol 70 %.
b) Bedah ikan menggunakan peralatan bedah steril, ambil organ target (hati, ginjal, limpa),
dan sterilkan permukaannya kemudian siap dilakukan isolasi. Isolasi dapat juga
dilakukan dari permukaan tubuh yang luka, atau sediaan darah.

6.1.2 Ikan kecil dan telur

Ambil contoh, dibilas dengan menggunakan akuades steril minimal 3 kali, kemudian ikan
digerus, contoh siap untuk diisolasi.

6.2 Isolasi bakteri

a) Bersihkan permukaan meja kerja/clean bench dengan alkohol 70 %.

b) Tusuk organ target dengan jarum Őse steril secara aseptis kemudian goreskan ke media agar.
c) Gerus benih dan telur secara aseptis, kemudian ambil hasil gerusan dengan jarum Őse
steril dan goreskan ke media agar.
d) Inkubasikan pada suhu 25 °C selama 18 jam - 24 jam.

3 dari 9
SNI 7303:2009

” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
6.3 Pemurnian koloni

a) Ambil koloni yang tumbuh terpisah di dalam goresan yang diduga Aeromonas hydrophila
untuk selanjutnya dimurnikan.
b) Apabila hasil pemurniannya diperoleh koloni yang seragam maka diteruskan dengan uji
lanjutan.

6.4 Tahap analisa

6.4.1 Pewarnaan Gram

a) Siapkan gelas objek yang telah dibersihkan dari lemak dengan alkohol 70 % dan diberi label.
b) Teteskan 1 tetes akuades steril pada permukaan gelas objek.
c) Ambil isolat dengan jarum Őse steril, campur dengan akuades dan diulas merata pada
permukaan gelas objek.
d) Fiksasikan dengan melewatkan preparat di atas api (jarak 15 cm) beberapa kali sampai
terlihat kering.
e) Teteskan larutan crystal violet pada preparat sampai merata dan diamkan selama 1 menit.
f) Cuci dengan air mengalir.
g) Teteskan larutan iodine lugol pada preparat sampai merata, dan diamkan selama 1 menit.
h) Cuci preparat dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
i) Teteskan larutan alkohol aseton pada preparat sampai merata dan diamkan maksimal 30
detik.
j) Cuci preparat dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
k) Teteskan larutan safranin pada preparat sampai merata dan diamkan selama 2 menit.
l) Cuci preparat dengan air mengalir dan dikeringanginkan.
m) Amati preparat menggunakan mikroskop.
n) Sifat bakteri Gram negatif ditandai dengan sel bakteri berwarna merah/pink, bentuk
batang pendek.

6.4.2 Uji motilitas

a) Ambil isolat dengan jarum Őse lurus, dan inokulasikan dengan menusukkan pada media
semi solid (SIM agar, MIO agar).
b) Inkubasikan pada suhu 25 °C - 28 °C selama 18 jam - 24 jam.
c) Reaksi positif ditandai oleh adanya pertumbuhan bakteri yang menyebar dan tidak
terlihat bekas tusukan.

6.4.3 Uji oksidase

a) Basahi kertas saring dengan pereaksi oksidasi.

b) Ambil 1 loop isolat bakteri, goreskan pada kertas saring yang sudah diberi reagen oksidasi.
c) Reaksi oksidasi positif ditandai munculnya warna biru keunguan pada goresan.

6.4.4 Uji oksidatif-fermentatif

a) Siapkan 2 tabung berisi media O/F.

b) Ambil isolat bakteri dengan jarum Őse steril.
c) Inokulasikan isolat bakteri ke dalam tabung yang berisi media O/F dengan cara
ditusukkan.
d) Satu tabung diisi dengan parafin cair steril hingga ketinggian 1 cm di atas permukaan
media O/F, sedangkan tabung lainnya tanpa parafin cair.
e) Reaksi fermentatif ditandai perubahan warna media pada tabung yang diisi parafin cair
dari hijau menjadi kuning.

4 dari 9
 SNI 7303:2009

” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
6.4.5 Uji Rimmler-Shotts (RS)

a) Ambil isolat bakteri dengan jarum Őse steril dan goreskan pada media RS.
b) Inkubasikan pada suhu 37 °C selama 18 jam - 24 jam.
c) Amati koloni yang tumbuh, apabila berwarna kuning tanpa warna hitam di tengah koloni
berarti positif Aeromonas hydrophila.

7 Pelaporan

Bakteri dinyatakan sebagai Aeromonas hydrophila apabila memenuhi kriteria seperti pada
Tabel 1.

Tabel 1 - Kriteria bakteri Aeromonas hydrophila

No. Test Hasil reaksi

1. Pewarnaan Gram Gram negatif, bentuk batang pendek
2. Uji motilitas Motil
3. Uji oksidasi Positif oksidatif
4. Uji oksidatif-fermentatif Positif O/F
5. Uji RS Positif RS

5 dari 9
 ” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
Lampiran A
(normatif)
Pembuatan media

A.1 Typticase (tryptic) soy agar

TSA komersial

Cara membuat:

a) Larutkan 40 g TSA dalam 1 l (1 x 10-3 m3) akuades, panaskan sampai mendidih.

b) Sterilisasi pada suhu 121 °C, selama 15 menit, tekanan 1 atm.

A.2 Media O/F

Media O/F komersial

Cara membuat:

a) Campurkan 9,4 g O/F basal medium dengan 1 l air, panaskan hingga mendidih
tambahkan 1 % glukosa.
b) Pipet 3 ml ke dalam tabung reaksi, sterilisasi.

A.3 Media RS

L-lysine hydrochloride 5.0 g

L-ornithine hydrochloride 6.5 g
L-cysteine hydrochloride 0.3 g
Maltose 3.5 g
Sodium thiosulphate 6.8 g
Ferric ammonium citrate 0.8 g
Sodium deoxycholate 1.0 g
Sodium chloride 5.0 g
Yeast extract 3.0 g
Novobiocin 0.005 g
Bromothymol blue 0.03 g
Agar 13.5 g

Cara membuat:

a) Campurkan bahan di atas dan larutkan dalam 1 l akuades dengan stirring;

b) Atur keasaman pH 7 dan didihkan selama 1 menit.

6 dari 9
 SNI 7303:2009

” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
Lampiran B
(normatif)
Pembuatan pereaksi

B.1 Pereaksi pewarnaan Gram

B.1.1 Larutan cristal violet

Bahan:
Cristal violet 2g
Etanol 20 ml
Ammonium oxalat 0.8 g
Akuades 80 g

Cara membuat:

a) Larutkan Crystal violet ke dalam etanol.

b) Larutkan ammonium oxalat ke dalam akuades.
c) Campurkan kedua larutan, biarkan selama 24 jam sebelum penyaringan.

B.1.2 Larutan iodine

Bahan:

Iodine 1g
Potassium iodide 2g
Akuades 300 ml

Cara membuat:

a) Larutkan Potassium iodide ke dalam 20 ml akuades.

b) Tambahkan Iodine dan biarkan selama semalam.
c) Tambahkan sisa akuades.

B.1.3 Larutan penjernih

Bahan:

Ethanol 95 ml
Acetone 5 ml

B.1.4 Larutan safranin

Bahan:

Safranin 0.25 g
Ethanol (95%) 10 ml
Akuades 90 ml

Cara membuat:
Larutkan safranin ke dalam ethanol dan akuades.

7 dari 9
 ” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
B.2 Pereaksi uji oksidasi

Larutan oksidasi

Bahan:

Tetramethy-p-phenylenediamine dihydrochloride 1 ml
Akuades 99 ml

Cara membuat:

Larutkan tetramethy-p-phenylenediamine dihydrochloride ke dalam akuades.

8 dari 9
 SNI 7303:2009

” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
Bibliografi

Jean F. Mac Faddin, MS, MT(ASCP), SM (AAM), SFC, USA Retired. Biochemical Tests for
Identifiction of Medical Bacteria. 2nd. 1983.

John G. Holt, Noel R.Krieg, Peter H.A. Sneath, James T.Stanley, Stanley T. Williams.
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. 9th. 1983.

Nicolas Frerichs G, BVMS, PhD, MRCVS, Dip.Bact dam Stuart D. Millar, Cbiol, MLBiol.
Manual for The Isolation and Identification of Fish Bacterial Pathogens. Institute of
Aquaculture, University of Stirling, Schotland. 1993.

9 dari 9
” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”
 ” Copy SNI ini dibuat oleh BSN untuk Panitia Teknis Perumusan SNI 65-05 Produk Perikanan Subpanitia Teknis 65-05-S2 Perikanan Budidaya ”

BADAN STANDARDISASI NASIONAL - BSN

Gedung Manggala Wanabakti Blok IV Lt. 3-4
Jl. Jend. Gatot Subroto, Senayan Jakarta 10270
Telp: 021- 574 7043; Faks: 021- 5747045; e-mail : [email protected]