Pengukuran kadar Alfa Arbutin mengunakan metode UPLC dengan

persiapan seperti berikut:

1. penentuan Panjang gelombang maksimum
Ditimbang Alfa Arbutin standar dan hidrokuninon standar
sejumlah 3,0 mg kemudian dimasukan kedalam labu ukur 25ml
dan ditambahkan air suling sampai batas 25ml, dikocok sampai
homogen. Dipipet larutan sejumlah 5ml dan dimasukan kedalam
labu ukur 25ml, kemudian ditambahkan air suling sampai batas
dan masing-masing labu ukur diberi label tanda. Larutan dibaca
pada panjang gelombang (λ) 200-400nm. Hasil absorbansi yang
didapatkan digunakan untuk menentukan panjang gelombang
maksimum pada pengujian kadar Alfa arbutin.
2. Pembuatan larutan stok standar Alfa Arbutin (120ppm)
Ditimbang 3,0mg Alfa arbutin dan dimasukkan kedalam labu ukur
25ml. kemudian ditambahkan methanol sampai batas 25ml dan
dikocok sampai homogen. labu ukur diberi label larutan stok
standar alfa arbutin.
3. Pembuatan larutan stok standar hidrokuinon (106ppm)
Ditimbang 5,3mg hidrokuinon dan dimasukkan kedalam labu ukur
50ml. kemudian ditambahkan methanol sampai batas 50ml dan
dikocok sampai homogen. labu ukur diberi label larutan stok
standar hidrokuinon.
4. Pembuatan larutan kurva baku Alfa arbutin dan hidrokuinon
Disiapkan larutan kurva baku yang mengandung alfa arbutin 0,6;
1,2; 3,6; 6,0; 12,0 μg/ml dan 0,53; 1,0; 3,18; 5,3; 10,6 μg/ml
hidrokuinon. Caranya dipipet masing-masing larutan stok standar
alfa arbutin sejumlah 0,5; 1,0; 5,0; 10; 20 ml dan larutan stok
standr hidrokuinon sejumlah 0,5; 1,0; 5,0; 10,0; 20 ml dengan pipet
volume serta dimasukan masing-masing dalam labu ukur 100ml.
kemudian Ditambahkan air suling pada masing-masing labu ukur
sampai batas 100ml dan dikocok sampai homogen. masing-masing
 labu ukur diberi label. Bagan perhitungan kurva baku alfa abrbutin
ada di lampiran 1.
5. persiapan larutan sampel
Ditimbang sampel (krim atau serum) sejumlah 0,25gram dan
dimasukkan ke dalam centrifuge tube. Kemudian kedalam
centrifuge tube ditambahkan 3ml methanol dan di vortex selama 2
menit. Larutan tersebut kemudian di sonifikasi selama 30 menit.
Selanjutnya larutan tersebut di adjust dengan ditambahkan
deionized water sampai 25ml dan disonifikasi lagi selama 30
menit. Lalu Larutan tersebut disentrifuge pada 3500 rpm selama 20
menit, kemudian ditambahkan fase geraknya dan di filter dengan
mengunakan PTFE syringe filters.
6. pembuatan 0,1 M HCL
Dipipet HCL pekat (37%) sebanyak 8,3ml dan ditambahkan secara
perlahan dengan cara dialirkan pada dinding labu ukur 1000ml
yang berisi ± 250ml air suling dan dikocok secara perlahan.
Ditambahkan air suling sampai batas 1000ml dan dikocok sampai
homogen. labu ukur di beri label 0,1M HCL
7. pembuatan fase gerak
Pembuatan fase gerak sebanyak 1 liter, pertama-tama diukur air
suling 890ml dan dimasukkan dalam gelas beaker 2000ml.
Ditambahkan methanol 100ml dan HCL 0,1 M sebanyak 10ml
kedalam gelas piala serta diaduk sampai homogen. larutan tersebut
disaring dengan kertas saring nilon 0,2 μm dan filtratnya
ditampung dalam Erlenmeyer serta di beri label.
8. Persiapan UPLC
Dilakukan pengkondisian UPLC dengan fase gerak, caranya
dengan menaikkan kecepatan alir sedikit demi sedikit mulai dari
0,1 sampai 0,2 ml/menit. Kemudian dibiarkan selama 30 menit
untuk pengkondisian.
9. Optimasi kondisi analisis UPLC
 kondisi UPLC yang digunakan adalah kolom BEH C18, 1,7 μm,
2,1 x 50 mm (Acquity UPLC), volume injeksi 1,4 μl, dengan
kecepatan alir 0,2 ml/menit. Pembacaan kromatogram dengan
detector UV-Vis pada panjang gelombang (λ) 221nm. Optimasi
kondisi analisis UPLC dengan mengubah perbandingan fase gerak
dan laju alir sampai didapatkan kondisi optimal. Kondisi optimal
ditandai dengan hasil waktu retensi cepat dan kurva yang simetris
serta terpisah.
10. Uji kesesuaian sistem UPLC
Setelah didapatkan kondisi optimal, dilakukan uji kesesuaian
sistem UPLC. Uji kesesuaian bertujuan untuk memastikan sistem
UPLC tersebut telah siap untuk Analisa. Caranya dengan
menginjeksikan larutan standar alfa arbutin 5,0 μg/ml sebanyak 3
kali replikasi. Parameter yang dinilai adalah standar deviasi relatif
dari waktu retensi dan area kromatogram (RSD ≤ 2%), jumlah
lempeng teoritis (N > 2000), resolusi (Rs > 2 ) dan tailing factor
(TF ≤ 2)
11. Pengujian kadar sampel
Diinjeksikan larutan sampel yang telah disiapkan di poin no.5 pada
UPLC dengan dibandingkan larutan standar alfa arbutin 5,0 μg/ml.
Luas area yang didapatkan dicatat dan dihitung kadarnya.