BUKU PEDOMAN PRAKTIKUM

MATA KULIAH MIKROBIOLOGI DAN PARASITOLOGI

PROGRAM STUDI DIPLOMA III FARMASI
(FAR2203)

Disusun Oleh :

Kurnia Kusumawati, A.Md. Kes., S.Farm., M. Farm

POLITEKNIK KESEHATAN GENESIS MEDICARE

DEPOK
2022

1
 TATA TERTIB PRAKTIKUM

Dalam praktikum mikrobiologi dan parasitologi, kita akan bekerja dengan mikroorganisme,
oleh karena itu hendaknya berhati-hati karena mikroorganisme ini sangat kecil atau kasat mata
dan tidak berwarna sehingga sukar dilihat atau diketahui keberadaannya. Walaupun bahan
yang disediakan umumnya tidak berbahaya bagi kesehatan namun tetap harus berhati-hati
dengan mikroorganisme. Laksanakan dengan tertib dan seksama semua petunjuk yang telah
diberikan oleh pembimbing, serta patuhilah semua tata tertib laboratorium sebagai berikut:
1. Letakkan tas dan benda-benda lain milik saudara yang tidak diperlukan pada tempat yang
telah disediakan. Jangan sekali-kali meletakkan barangbarang lain diatas meja praktikum.
2. Dilarang melakukan aktivitas makan dan minum didalam laboratorium mikrobiologi.
3. Gunakanlah jas laboratorium selama praktikum berlangsung.
4. Gunakan masker dan sarung tangan (hands glove steril) bila perlu.
5. Sebelum mulai bekerja dipelajari betul apa yang akan dilakukan. Buatlah skema kerja
yang baik sehingga dapat bekerja dengan tepat, cepat dan teliti.
6. Kondisi steril penting dalam praktikum mikrobiologi, oleh karena itu ikutilah selalu cara
kerja secara tepat dan steril.
7. Jauhkan tangan dari mulut, hidung, telinga selama bekerja di laboratorium.
8. Kalau terjadi kesalahan atau kecelakaan segera lapor kepada asisten dan pembimbing.
9. Setelah praktikum selesai, bersihkan semua alat-alat yang telah digunakan menurut
ketentuan laboratorium. Meja dibersihkan dengan menggunakan desinfektan atau alkohol
setelah selesai mengerjakan praktikum.
10. Setiap kali selesai praktikum DIWAJIBKAN menyerahkan laporan sementara kepada
asisten pendamping masing-masing untuk mendapatkan persetujuan keabsahannya.
11. Sebelum meninggalkan laboratorium, matikan gas atau kompor pemanas, lampu, air dan
jangan lupa mencuci tangan dengan desinfektan.
12. Mahasiswa wajib mengikuti pretest atau posttest yang diadakan sebelum atau sesudah
praktikum.
13. Laporan resmi praktikum wajib dikumpulkan pada praktikum selanjutnya atau 1 minggu
setelah praktikum selesai.

2
 DAFTAR ISI

hal
PRAKTIKUM I ................................................................................................................................... 4

PRAKTIKUM II ............................................................................................................................... 17

PRAKTIKUM III .............................................................................................................................. 23

PRAKTIKUM IV .............................................................................................................................. 33

PRAKTIKUM V ............................................................................................................................... 37

PRAKTIKUM VI .............................................................................................................................. 45

PRAKTIKUM VII ............................................................................................................................ 50

3
 PRAKTIKUM I
PENGENALAN ALAT, STERILISASI DAN PEMBUATAN MEDIA(1,2)

TUJUAN PRAKTIKUM
Mahasiswa dapat mengenal alat-alat yang akan digunakan dalam praktikum mikrobiologi dan
dapat menggunakannya secara benar. Mahasiswa dapat menerapkan macam-macam teknik
sterilisasi. Mahasiswa dapat membuat media pertumbuhan bakteri dan teknik sterilisasi media.

DASAR TEORI

Laboratorium mikrobiologi adalah salah satu laboratorium yang wajib ada, karena
laboratorium ini sangat menunjang pembuatan peroduk-produk atau sediaan farmasi.
Berbagai sediaan obat dan makanan serta minuman yang akan dipasarkan untuk publik
memiliki syarat tertentu terhadap cemaran mikroba, bahkan obat steril bebas dari cemaran
mikroba dan bahan-bahan lain yang mengancam keselamatan penggunanya.

Alat – Alat Laboratorium

Alat-alat laboratorium yang umum digunakan dalam praktikum mikrobiologi antara lain
mikroskop, autoklaf, oven, inkubator, colony counter, lemari pendingin, hot platestirrer,
mikropipet, cawan petri, labu erlenmeyer, pipet tetes, pipet ukur, tabung reaksi, gelas ukur,
tabung durham, kawat ose, pinset.

a. Mikroskop:
Digunakan untuk mengamati mikroorganisme yang sangat kecil ukurannya. Bagian-bagian dari
mikroskop cahaya adalah:
1) lensa okuler untuk memperbesar bayangan yang terbentuk oleh lensa objektif,
2) lensa objektif untuk memperbesar specimen,
3) Pengatur focus kasar yaitu skrup untuk menaikkan dan menurunkan meja benda,
4) Pengatur focus halus yaitu skrup untuk menaikkan dan menurunkan meja benda secara
halus,
5) meja benda tempat meletakan specimen,
6) Sumber cahaya,

4
 7) Kondesor cahaya dan penjepit spesimen

b. Autoklaf
Autoklof adalah alat yang digunakan untuk sterilisasi alat, bahan, atau media tertentu
dengan menggunakan uap panas pertekanan. Dalam autoklaf uap berada dalam keadaan
jenuh, dan peningkatan tekanan mengakibatkan suhu yang tercapai menjadi lebih tinggi.
Sterilisasi cara ini menggunakan suhu 1210C bertekanan kira 2 atm(=15 Psi) selama 15-20
menit. Tekanan yang lebih besar akan dibutuhkan pada tempat-tempat yang lebih tinggi dari
10 permukaan laut. Udara yang berada dalam autoklaf harus dikeluarkan semuanya untuk
memperoleh suhu yang diinginkan (1210C). Alat dan bahan yang disterilkan dengan cara ini
akan dilewati oleh uap panas selama proses sterilisasi berlangsung. Sehingga bahan-bahan
yang disterilkan dengan cara ini harus yang bersifat permeabel terhadap uap panas dan tidak
rusak pada suhu 110-1210C. Panas lembab sangat efektif untuk mensterilkan bahan dan alat
meskipun pada suhu yang tidak terlalu tinggi, karena ketika uap air berkondensasi pada
bahan dan alat yang disterilkan, dilepaskan panas sebanyak 686 calori per gram uap air pada
suhu 1210

5
 c. Oven
Oven, bagian dari alat yang digunakan untuk
sterilisasi dengan metode panas kering. Suhu
sterilisasi dengan oven kira-kira 1600 C selama
60 menit Oven adalah alat yang digunakan untuk
sterilisasi alat dan bahan dengan menggunakan
udara kering. . Sterilisasi dengan oven digunakan
untuk alat, bahan atau media yang tahan terhadap
pemanasan tinggi Oven digunakan untuk
mensterilkan alat-alat gelas seperti Erlenmeyer,
cawan petri, tabung reaksi dan gelas lainnya.
Lamanya sterilisasi tergantung pada jumlah alat
disterilkan dan ketahanan alat terhadap panas.
d. Inkubator
Alat untuk menginkubasi/mengeram bakteri pada suhu
tertentu. Inkubator digunakan untuk menumbuhkan bakteri,
jamur, dan menyimpan biakan murni pada suhu rendah.
Inkubator memiliki sekat kaca antara bagian dalam inkubator
dan pintu yang fungsinya untuk melihat biakan bakteri tanpa
membuka sekat dalam, sehingga kondisi dalam inkubator
tetap terjaga.
e. Colony counter
Adalah alat yang digunakan untuk menghitung jumlah koloni
bakteri

6
 f. Lemari pendingin
Adalah alat yang digunakan untuk menyimpan
media atau bahan/spesimen agar isi dan mutu tidak
berubah.

g. Kawat ose/loop/sengkelit adalah alat yang

digunakan untuk menanam bakteri dengan cara
digores. Terdapat 2 jenis ose yang umum digunakan
yaitu ose jarum dan ose bulat.

h. Alat-alat lain yang digunakan dalam praktikum

mikrobiologi adalah alat gelas (erlenmeyer, beaker
glass, cawan petri), mikropipet, kaca obyek, lampu
bunsen, disc antibiotik, tabung durham,dan lain-
lain.

STERILISASI
Sterilisasi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat dalam
suatu benda (alat ataupun bahan). Tujuan sterilisasi dalam mikrobiologi adalah mematikan,
menghambat pertumbuhan dan menyingkirkan semua mikroorganisme yang ada pada alat dan
bahan yang akan digunakan dalam suatu pekerjaan guna menciptakan suasana aseptis. Secara
umum sterilisasi dapat dilakukan dengan 3 metode: mekanis, fisis dan ataupun secara kimia.
Sterilisasi mekanis diantaranya menggunakan microfillter, fisis terbagi menjadi 2 penyinaran
dan pemanasan, sedangkan kimia adalah dengan menggunakan bahan kimia (desinfektan).

7
a. Sterilisasi Mekanis
Sterilisasi dengan mekanis adalah sterilisasi dengan microfilter atau dengan penyaringan.
Mekanisme penyaringan berdasarkan
perbedaan ukuran partikel , penyaring dibuat
memiliki pori yang sangat kecil sehingga cukup
untuk menahan bakteri, saringan akan tercemar
bakteri sedangkan cairan yang melewatinya
bebas bakteri (steril). Bahan-bahan yang tidak
tahan pemanasan seperti serum, darah, toksin,
maupun sediaan farmasi yang tidak tahan
pemanasan disterilkan dengan menggunakan
penyaring bakteri seperti:

1) Berkefeld filter : penyaring bakteri dari tanah diatomae

2) Chamberlain Filter : penyaring bakteri dari porselein
3) Seitz filter : penyaring bakteri dari asbes
4) Fritted glass filter : penyaring bakteri dari gelas
b. Sterilisasi Fisis
Sterilisasi fisis terbagi menjadi 2 yaitu penyinaran dan pemanasan
1) Penyinaran
Penyinaran dapat dilakukan dengan sinar UV (ultra violet) dalam safety cabinet.
Biasanya safety cabinet akan dilengkapi dengan lampu UV guna mensterilkan
permukaan interior safety cabinet tersebut, atau untuk mencegah kontaminasi selama
proses penurunan suhu media atau alat-alat yang baru dikeluarkan dari oven atau
autoklave sebelum digunakan. Selain itu lampu UV juga bisa dipasang dalam sebuah
ruangan untuk mensterilkan ruangan.
2) Pemanasan
a) Sterilisasi Kering (Panas Kering)
i. Pemijaran

8
 Pemijaran merupakan suatu kegiatan membakar langsung alat-alat seperti ujung
ose, ujung pinset, ujung spatula yang berbahan logam. Pemijaran dilakukan sampai
alat-alat tersebut berwarna merah pijar.

ii. Flaming (Jilatan api)

Alat-alat seperti kaca objek, cawan petri yang telah berisi media, mulut
erlenmeyer yang berisi media dan jarum cukup dilakukan jilatan api atau
melewatkan alat tersebut pada nyala api bunsen. Artinya alat-alat tersebut hanya
mengalami jilatan api dan tidak sampai memijar.

9
iii. Udara panas
Alat yang digunakan adalah oven. Suhu yang biasa digunakan 160-1800C
selama 1-2 jam. Sterilisasi kering dengan oven ini baik dilakukan terhadap alat-
alat kering yang terbuat dari kaca, seperti: cawan petri, tabung reaksi, botol
sampel, pipet, alat suntik kaca, pinset, gunting, bahan-bahan yang tidak tembus
uap seperti gliserin, minyak, vaselin, bubuk, dan atau apa saja yang tidak menjadi
rusak, menyala, hangus atau menguap pada suhu tinggi. Penyusupan panas ke
dalam bahan pada metode ini berlangsung sangat lambat, oleh karena itu pada
saat sterilisasi harus dalam lapisan tipis dan jumlah yang sedikit, harus dilindungi
dalam wadah tertutup dengan cara membungkus atau menyumbat untuk
mencegah kontaminasi setelah dikeluarkan dari oven. Untuk 8 menjamin
efektivitas proses sterilisasi perlu diperhatikan muatan (jumlah alat yang

10
 dimasukkan kedalam oven) agar tersedia cukup ruangan untuk bergeraknya
aliran udara panas.
b) Sterilisasi Basah (Uap panas)
i. Uap Mengalir
Sterilisasi dengan menggunakan uap pada suhu 1000C yang dialirkan pada benda
yang disterilkan secara berulang-ulang (tiga sampai empat kali beberapa menit)
dengan selang waktu 24 jam. Atau sterilisasi dengan uap mengalir ini juga disebut
dengan sterilisasi bertingkat atau tyndalisasi. Cara ini dikenalkan oleh John
Tyndall (1820-1893). Keuntungan cara ini ialah tidak membutuhkan alat khusus.
Namun kerugiannya membutuhkan waktu yang lama, selain itu waktu selang
antara aliran uap mengalir tersebut memungkin spora yang resisten atau dorman
(non aktif) menjadi aktif kembali menjadi sel vegetatif. Cara ini digunakan untuk
media 9 gelatin, susu, dan karbohidrat, karena bahan-bahan tersebut akan
mengalami hidrolisis bila dipakai suhu yang lebih tinggi atau waktu yang lebih
lama.
ii. Penggodogan dalam Air
Penggodogan dilakukan untuk mematikan mikroorganisme yang tidak berspora.
Penggodogan dalam air mendidih
atau mencapai suhu 1000C, hanya
selama 5 menit biasanya sudah
cukup mensterilkan untuk peralatan
rumah tangga, asalkan air benar-
benar kontak secara langsung
dengan alat tersebut, tidak hanya
bagian luar atau permukaan saja tetapi sampai ke bagian dalam. Akan tetapi
sterilisasi dengan cara ini dapat dilakukan dengan waktu yang lebih lama,
tergantung tingkat kontaminasi alat yang disterilkan. Keadaan steril yang tidak
dapat dicapai dengan penggodogan dalam air panas selama 1 jam dapat
dilanjutkan dengan uap mengalir. Penggodogan dapat dilakukan dengan
waterbath.

11
 iii. Uap Bertekanan
Autoklaf merupakan alat yang digunakan dalam sterilisasi menggunakan uap
dalam tekanan. Sterilisasi cara ini efektif untuk semua mikroorganisme, baik
vegetatif maupun spora. Beberapa hal yang menjadi prinsip pada sterilisasi
dengan autoklaf adalah: 1). Sterilisasi bergantung pada uap, sehingga udara
harus benar-benar dikosongkan dari sterilisator. 2). Semua bagian bahan yang
disterilkan harus benar-benar dilalui oleh uap panas, sehingga labu kosong dan
tabung sebaiknya diletakkan dengan posisi tidur agar udara tidak terperangkap
di dasarnya. 3). Bahan-bahan yang berpori atau yang berbentuk cair harus
permeabel tehadap uap. 4). Suhu harus mencapai 1210C dan dipertahankan
selama 15-20 menit.
c. Sterilisasi Kimia
Digunakan senyawa desinfektan antara lain: 1). Peralatan besar dengan menggunakan HCl,
HgCl2, Formalin, Phenol, Chlorin dan alkohol. 2). Lingkungan dengan menggunakan
pestisida dan antiseptis. 3). Media dengan NaThiosulfat. Biasanya yang paling banyak
digunakan adalah alkohol, baik untuk menstrilkan alat, tangan pekerja ataupun meja kerja.

MEDIA

Media adalah bahan yang terdiri dari zat-zat makanan (nutrient) yang diperlukan
mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Dengan kata lain media adalah nutrisi dalam bentuk
padat atau cair untuk tempat pertumbuhan mikroba Media selain untuk menumbuhkan
mikroba juga dibutuhkan untuk isolasi & inokulasi mikroba serta untuk uji fisiologi dan
biokimia mikroba. Media yang baik untuk pertumbuhan mikroba adalah yang sesuai dengan
lingkungan pertumbuhan mikroba tersebut, yaitu : susunan makanannya dimana media harus
mengandung air untuk menjaga kelembaban dan untuk pertukaran zat atau metabolisme, juga
mengandung sumber karbon, mineral, vitamin dan gas, tekanan osmose yaitu harus isotonik,
derajat keasaman/pH umumnya netral tapi ada juga yang alkali, temperatur harus sesuai dan
steril.

Media harus mengandung semua kebutuhan untuk pertumbuhan mikroba, yaitu: sumber
energi misalnya gula, sumber nitrogen, juga ion inorganik essensial dan kebutuhan yang
khusus, seperti vitamin. Media pertumbuhan mengandung unsur makro yang dibutuhkan

12
mikroba seperti karbon (C), Hidrogen (H), oksigen (O), Nitrogen (N), dan Phospor (P). selain
itu media juga mengandung unsur mikro seperti besi (Fe), dan Magnesium (Mg). media juga
dapat mengandung bahan tambahan lain seperti indikator phenol red. Sifat media pembenihan
yang ideal adalah mampu memberikan pertumbuhan yang baik jika ditanami kuman,
mendorong pertumbuhan cepat, murah, mudah dibuat kembali, dan mampu memperlihatkan
sifat khas mikroba yang diinginkan.

Berdasarkan bentuknya media dibedakan menjadi:

1. Media Cair
Media cair digunakan untuk pembenihan diperkaya sebelum disebar ke media padat, tidak
cocok untuk isolasi mikroba dan tidak dapat dipakai untuk mempelajari koloni kuman.
Contoh media cair Nutrient broth (NB); Pepton dilution fluid (PDF); Lactose Broth (LB);
Mac Conkey Broth (MCB), dan lain-lain. Pepton merupakan protein yang diperoleh dari
peruraian enzim hidrolitik seperti pepsin, tripsin, papain. Pepton mengandung Nitrogen dan
bersifat sebagai larutan penyangga, beberapa kuman dapat tumbuh dalam larutan pepton
4%
2. Media semi padat
Adalah media yang mengandung agar sebesar 0.5 %
3. Media padat
Media padat mengandung komposisi agar sebesar 15 %.Media padat digunakan untuk
mempelajari koloni kuman, untuk isolasi dan untuk memperoleh biakan murni. Contoh
media padat Nutrient Agar (NA); Potato Detrose Agar (PDA); Plate Count Agar (PCA),
dan lain-lain
Berdasarkan tujuan penggunaannya media dibedakan menjadi:
a. Media isolasi
Media yang mengandung unsur esensial yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba.
b. Media diperkaya
Media diperkaya merupakan media yang mengandung bahan dasar untuk pertumbuhan
mikroba dan zat-zat tertentu yang ditambahkan seperti serum, kuning telur, dan lain-lain.

13
c. Media Selektif
Media selektif merupakan media cair yang ditambahkan zat tertentu untuk menumbuhkan
mikroorganisme tertentu dan diberikan penghambat untuk mikroba yang tidak
diinginkan.Contoh media yang ditambahkan ampisilin untuk menghambat mikroba
lainnya.
Jenis Media dan Fungsinya
Jenis Nama Fungsi
Cair Kaldu Nutrisi (Nutrient Broth) Media Pengayakan dan pembiakan
Air Pepton (Pepton Dilution Fluid/PDF) Media pengayaan
Kaldu empedu Media pembiakan bakteri enterik
Gula pepton (kaldu gula) dengan gula Media untuk melihat fermentasi gula
yang digunakan glukosa atau laktosa
Semi padat 0,5% agar Untuk melihat gerak bakteri
Padat Agar nutrisi (Nutrient Agar) Untuk mempelajari koloni bakteri
Agar Darah Untuk melihat koloni bakteri dan
sifat hemolysis
Agar endo Media pembiakan bakteri enterik,
dapat digunakan untuk membedakan
bakteri peragi laktosa dan bukan
peragi laktosa
EMBA-eosin Methylene Blue Agar Media pembiakan bakteri enterik,
dapat digunakan untuk membedakan
bakteri peragi laktosa dan bukan
peragi laktosa
SS Agar – Salmonella Shigella Media pembiakan Salmonella dan
Shigella
TCBS – Thiosulphate Citrate Bile Media Pembiakan Vibrio
Agar Darah Telurit Media pembiakan Corynebacterium
diphteria
Agar Miring Lowenstein-Jensen Media pembiakan Mycobacterium
tuberculosis
TSIA – Triple Sugar Iron Agar Media untuk melihat kemampuan
bakteri dalam meragi gula dan
membentuk H2S
Nutrient Agar Untuk peremajaan koloni murni

14
ALAT DAN BAHAN
1. Alat: Cawan petri, Erlenmeyer, Gelas ukur, Tabung reaksi, Pipet, Tip pipet, Batang
pengaduk, Penangas air/pemanas
2. Bahan: Nutrien agar (NA), Pepton, Muller Hinton Agar (MHA), Mc Conkey Broth
(MCB), Plate Count Agar (PCA), SIM, Aquadest

PROSEDUR KERJA
A. Pengenalan Alat dan Sterilisasi
1. Pengawas praktikum memperkenalkan alat dan mendemonstrasikan cara menggunaan
alat yang benar sambil menjelaskan fungsinya.
2. Praktikan mempraktekkan cara menggunaan alat dengan benar.
3. Praktikan mempraktekkan penggunaan autoklaf dan oven sebagai alat sterilisasi media
yang telah dibuat.
B. Pembuatan Media
1. Timbang media sesuai prosedur di kemasan. (Catatan : Buatlah media sesuai kebutuhan
masing-masing/sesuai instruksi dari Dosen/Penanggung jawab praktikum).
2. Serbuk media dimasukkan secara hati-hati ke dalam erlenmeyer.
3. Tambahkan aquades dan aduk sampai merata dengan batangpengaduk
4. Untuk media yang perlu dipanaskan, gunakan pemanas sampai media tercampur homogen
(kuning dan jernih), hati-hati jangan sampai media mendidih dan meluap, panaskan dengan
hati-hati menggunakan penangas/elemen
5. Untuk pembuatan media agar miring NA, sebelum di autoklaf, tuangkan media NA untuk
agar miring sejumlah kurang lebih 5 ml ke dalam tabung reaksi. Agar miring ini akan
digunakan untuk kultur atau pembiakan bakteri. Sisa media NA biarkan dalam erlenmeyer.
6. Untuk media cair (pepton) dimasukkan sejumlah 9 ml ke dalam tabung reaksi.
7. Untuk media semi padat (SIM), tuangkan sejumlah 3 ml ke dalam tabung reaksi
7. Tutup erlenmeyer dan tabung reaksi yang berisi media dengan kapas penutup tabung.
8. Sterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210 C, tekanan 1 atm, selama 15 menit.
9. Untuk media NA miring, keluarkan dari autoklaf dan bekukan dalam posisi miring
10. Untuk media NA dan MHA, tuangkan dalam cawan petri steril dan tunggu sampai beku.

15
LAPORAN SEMENTARA PRAKTIKUM I
1. Cara Kerja Sterilasasi menggunakan……………………..
a…………
b…………
c…………
2. Pembuatan Media
a. Media……………..
Jenis Media : Cair/Miring/Tegak/Plate
Yang Ditimbang :…………
ml Aquades sebagai pelarut :…………
Sterilisasi :…………

b. Media……………..
Jenis Media : Cair/Miring/Tegak/Plate
Yang Ditimbang :…………
ml Aquades sebagai pelarut :…………
Sterilisasi :…………

Nama Mahasiswa :
Tanggal Praktikum :
Paraf Dosen/Asisten Lab :

16
 PRAKTIKUM II
PEWARNAAN BAKTERI(1,3)

TUJUAN PRAKTIKUM
Mahasiswa dapat menjelaskan perbedaan berbagai bentuk bakteri dan contohnya, melakukan
pewarnaan bakteri dan menjelaskan perbedaan bakteri gram positif dan negatif

DASAR TEORI
Bakteri memiliki beraneka macam bentuk yaitu basil (tongkat/batang), coccus,
spirilum. Bakteri bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan
tripobasil.Bakteri bentuk kokus dibagi menjadi monokokus, diplokokus, dan
stafilokokus.Untuk bakteri bentuk spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan
melengkung.
Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri
itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka
dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling
utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.
Pewarnaan gram bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri dengan mudah.Pewarnaan
gram untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan
gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama
berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang
mengembangkan teknik ini pada tahun 1884. Prinsip dasar teknik pewarnaan bakteri adalah
adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan
yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen
seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan
pewarna asam dan pewarna basa. Pewarnaan Gram dapat membedakan bakteri menjadi dua
golongan utama Gram positif dan Gram negatif. Dasar dari teknik adalah bakteri diberi warna
dasarkristal violet dan diberikan larutan iodine kemudian dilunturkan oleh alkohol, sebagian
kuman berwarna ungu, karena sel mengikat senyawa kristal violet-iodine dan sebagian kuman
lain kehilangan warna dasar dan mengambil warna keduasafranin/fuchsin yang berwarna

17
merah. Kuman yang mempertahankan warna dasarungu disebut kuman Gram positif dan
kuman yang mengambil warna keduamerah disebut kuman Gram negatif.
Bakteri gram negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu
pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil
ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol. Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding
sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga
pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah.
Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal.
Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi
oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna ungu. Pewarna bereaksi secara
kimiawi dengan protoplas bakteri, apabila sel belum mati, proses pewarnaan akan
membunuhnya.
Untuk melakukan pewarnaan gram, bakteri dibuat pulasan lebih dahulu di atas kaca
objek.Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Pada pembuatan
pulasan perlu diperhatikan ketebalan dari bakteri yang dipulas, tidak terlalu padat atau tipis
agar tidak menganggu pengamatan dan diperoleh hasil yang baik. Kemudian pulasan bakteri
difiksasi. Fiksasi dilakukan dengan cara melewatkan preparat diatas api atau merendamnya
dengan metanol. Fiksasi bertujuan melekatkan bakteri pada glass objek dan mematikan
bakteri. Setelah fiksasi dilakukan maka teknik pewarnaan dapat segera dilanjutkan.

ALAT DAN BAHAN

1. Alat
Mikroskop, Kaca objek, Cover glass, Jarum ose, Bunsen, Beaker glass, Kertas saring, Pinset
2. Bahan a
Biakan kuman 1) Staphyllococus aureus 2) Escherichia coli 3) Streptococcus sp 4)
Pseudomonas pyogenes; aqua dest; karbol kristal ungu; fuchsin; lugol; alcohol 95 %;
immersion oil

PROSEDUR KERJA
1. Ambil satu sengkelit biakan kuman, letakkan pada kaca objek, suspensi dengan air
kemudian difiksasi

18
2. Tambahkan pewarna I kristal ungu biarkan selama lima menit, cuci dengan air
3. Tambahkan cairan lugol biarkan 45 – 60 detik cuci dengan air
4. Bilas dengan alcohol 95 % sampai warna ungu tidak mengalir, cuci dengan air
5. Tambahkan pewarna II fuchsin, diamkan 1-2 menit. Cuci dengan air, keringkan
6. Tambahkan minyak imersi, tutup dengan cover glass, periksa dibawah mikroskop dengan
perbesaran 40x dan 100 x objektif

19
INTERPRESTASI HASIL PEWARNAAN
Bakteri gram positif : berwarna ungu
Bakteri gram negative : berwarna merah

20
LAPORAN SEMENTARA PRAKTIKUM II
1. Staphylococcus aureus
Bentuk bakteri :
Formasi :
Warna :
Bakteri gram : positif/negative
Pengamatan Mikroskopik :

2. Escherichia coli
Bentuk bakteri :
Formasi :
Warna :
Bakteri gram : positif/negative
Pengamatan Mikroskopik :

Nama Mahasiswa :
Tanggal Praktikum :
Paraf Dosen/Asisten Lab :

21
3. Streptococcus sp
Bentuk bakteri :
Formasi :
Warna :
Bakteri gram : positif/negative
Pengamatan Mikroskopik :

4. Pseudomonas aerogenes
Bentuk bakteri :
Formasi :
Warna :
Bakteri gram : positif/negative
Pengamatan Mikroskopik :

Nama Mahasiswa :
Tanggal Praktikum :
Paraf Dosen/Asisten Lab :

22
 PRAKTIKUM III
PEMBIAKAN BAKTERI (1,2,4)

TUJUAN PRAKTIKUM
Mahasiswa dapat melakukan pemindahan biakan bakteri secara aseptik dan melakukan
berbagai cara pembiakan bakteri dengan metode gores pada media rata, miring dan tegak.

DASAR TEORI
Pada pembiakan/penanaman bakteri/mikroba perlu diperhatikan kebutuhan nutrisi untuk
bakteri tersebut sehingga dapat tumbuh dengan baik. Teknik untuk menanam bakteri adalah
sebagai berikut:

1. Spread plate method (cara tebar/sebar)

Teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur mikroba dengan cara dipulas atau
disebar padapermukaan media agar padat. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan
biakan kultur mikroba.
2. Streakplate method (cara gores)
Teknik isolasi koloni bakteri dengan cara ini dilakukan dengan cara menggoreskan
suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan media agar padat.
3. Pour plate method (cara tabur)
Teknik isolasi koloni bakteri dengan cara ini dilakukan dengan cara menggoreskan
suspensi bahan yang mengandung mikroba pada permukaan media agar padat.
4. Pembiakan lapangan
Teknik ini dilakukan dengan cara membasahi seluruh permukaan agar dengan suspensi
kuman merata. Biasanya digunakan untuk uji kepekaan antibiotika dan uji jenis kuman
dengan bakteriofaga
5. Pembiakan agar miring
Teknik inokulasi bakteri dengan caramenggoreskan pada permukaan agar miring
6. Pembiakan dengan tusukan
Teknik inokulasi bakteri dengan caramenusukkan ose pada permukaan agar tegak.

23
7. Biakan cair
Teknik ini dilakukan dengan cara mencelupkan kawat ose yang sudah dioleskan pada
biakan kuman kedalam wadah yang berisi media cair

ALAT DAN BAHAN

1. Alat
a. Kawat ose
b. Lampu bunsen
c. Beaker glass
2. Bahan
a. Agar miring nutrien agar
b. Agar Mac Conkey
c. Agar SIM
d. Blood Agar Plate
e. Biakan bakteri Escherichia coli
f. Biakan bakteri Staphylococcus aureus
g. Biakan bakteri Salmonella sp
h. Larutan pengencer (BPW atau NaCl fisiologis 0,9%)

PROSEDUR KERJA
1. Teknik Spread plate method (cara tebar/sebar)
a. Buatlah pengenceran 10-1 – 10-6 dari kultur murni bakteri dengan larutan pengencer.
b. Ambil tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri, buka dan bakar leher
tabung.
c. Pindahkan 0,1 ml kultur bakteri secara aseptis ke permukaan media NA dalam cawan
petri.
d. Bakar spreader yang sebelumnya telah dicelupkan dalam alkohol, biarkan dingin.
e. Tebarkan/sebarkan kultur bakteri dengan spreader secara merata dan biarkan sampai
permukaan agar mengering

24
 Gambar 1. Spread Plate Method

f. Setelah permukaan agar mengering, selanjutnya inkubasikan secara terbalik selama 24

jam pada suhu kamar dan amati pertumbuhannya.
g. Bandingkan pertumbuhan dari tiap-tiap pengenceran.

2. Teknik gores (Streak plate method)

a. Siapkan biakan bakteri yang akan ditanam kembali.

b. Bakar kawat ose sampai merah, biarkan dingin.
c. Sentuhkan ujung kawat ose pada koloni bakteri
d. Goreskan kawat ose pada permukaan lempeng nutrien dengan beberapa metode
berikut
1). Goresan sinambung
a) Disentuhkan inokulum loop pada koloni dan digoreskan secara kontinyu
sampai setengah permukaan agar
b) Diputar cawan 180ºC, pada jarum inokulum jangan dipijarkan dan dilanjutkan
dengan goresan sampai habis

Gambar 2. Streak Plate Metode Sinambung

25
2). Goresan T
a) Dibagi cawan menjadi tiga bagian menggukan spidol marker
b) Diinokulasi didaerah satu dengan streak zig-zag
c) Dipanaskan jarum inokulum dan ditunggu sampai dingain, kemudian
dilanjutkan streak zig-zag pada daerah kedua. Diputar cawan untuk
memperoleh goresan yang sempurna.
d) Dilakukan hal yang sama pada daerah ketiga

Gambar 3. Streak Plate Metode T

3). Goresan kuadran (streak quadrant)

a) Sama dengan goresan T, yang berbeda yaitu dibagi empat
b) Didaerah satu merupakan goresan awal yang banyak mengandung banyak sel
mikroorganisme
c) Dipotong atau disilangkan dari goresan pertama sehingga jumlah sedikit dan
akhirnya terpisah-pisah menjadi koloni tunggal.

26
 Gambar 4. Streak Plate Metode Kuadran

4). Goresan radian

a) Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan.
b) Pijarkan mata jarum ose dan dinginkan kembali
c) Putar lempengan agar 900 dan buat goresan terputus diatas goresan sebelumnya

Gambar 5. Streak Plate Metode Radian

e. Bakar kembali kawat ose

f. Inkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam dan amati pertumbuhannya.

3. Teknik Pour plate (cara sebar)

a. Dinginkan media NA dalam tabung reaksi sampai suhu ± 45 - 500C (cirinya : terasa
hangat di kulit/tidak ‘kemranyas’).
b. Buka tutup tabung yang mengandung kultur murni bakteri, dan bakar leher botol.
c. Pindahkan 1 ml kultur murni bakteri ke dalam tabung reaksi yang mengandung NA
secara aseptis.

27
 d. Bakar leher tabung di atas bunsen, dan tuangkan media NA yang telah mengandung
kultur murni bakteri ke dalam cawan petri.
e. Goyangkan perlahan-lahan untuk mencampur kultur bakteri dengan NA sampai
homogen. Penggoyangan petri jangan terlalu kuat. Pada saat penuangan media, petri
bisa diletakkan dalam radius maksimal 20 cm dari sumber api (zona steril)

Gambar 6. Pour Plate Metod

f. Setelah agar memadat diinkubasi terbalik pada suhu kamar selama 24 jam. Inkubasi
terbalik dilakukan setelah agar memadat. Amati pertumbuhannya.

4. Isolasi pada media agar miring

a. Dibakar ose sampai steril dan didinginkan

b. Diambil biakan bakteri pada media agar
c. Ditutup tabung media agar dan dibuka dengan menjepit menggunakan
jari kelingking
d. Dibakar mulut tabung reaksi dengan api bunsen
e. Digores zig-zag permukaan media yang sudah berisi koloni bakteri
dengan ose
f. Dibakar mulut tabung dan segera ditutup dengan tutupnya
g. Dibakar ose sampai steril
h. Diinkubasi mikroba yang telah diisolasi selama 2x24 jam didalam
inkubator
i. Diamati karakteristik koloni mikroba yang tumbuh

28
5. Isolasi dengan tusukan (agar tegak)
a. Dibakar needle sampai steril dan didinginkan
b. Diambil biakan bakteri pada media agar
c. Ditutup tabung media agar dan dibuka dengan
menjepit menggunakan jari kelingking
d. Dibakar mulut tabung dengan api bunsen
e. Dibakar needle yang sudah berisi kolonibakteri
dan ditusukkan ke agar tegak
f. Dibakar mulut tabung smapai steril
g. Diinkubasi mikroba yang telah diisolasi selama
2x24 jam didalam inkubator
h. Diamati karakteristik koloni mikroba yang
tumbuh

6. Isolasi pada agar cair

a. Dibakar ose sampai steril dan didinginkan

b. Diambil biakan bakteri pada media agar
c. Ditutup tabung media agar dan dibuka dengan menjepit menggunakan jari kelingking
d. Dicelupkan jarum ose yang sudah berisi koloni bakteri ke agar cair
e. Dibakar mulut tabung dan segera ditutup dengan tutupnya
f. Dibakar ose sampai steril
g. Diinkubasi mikroba yang telah diisolasi selama 24 jam didalam inkubator
h. Diamati kekeruhan pada agar cair

29
GAMBARAN HASIL PENGAMATAN COLONI BAKTERI PADA AGAR PLATE

30
LAPORAN SEMENTARA PRAKTIKUM III
1. Biakan bakteri Staphylococcus aureus
Media Agar Blood Plate
Bentuk Koloni :
Warna koloni :
Ukuran koloni :
Permukaan :
Tepi koloni :
Tinggi koloni :
Sifat koloni pada blood agar plate :
Gambar

2. Biakan bakteri Escherichia coli

a. Media Mac Conkey
Bentuk Koloni :
Warna koloni :
Ukuran koloni :
Permukaan :
Tepi koloni :
Tinggi koloni :
Sifat koloni pada Mac Conkey plate :
Gambar :

b. Media NA miring : tumbuh/tidak tumbuh (+/-)

Gambar :

31
 c. Media SIM
Gerak : +/-
Indol : +/-
H2S : +/-
Gambar :

3. Biakan bakteri Salmonellasp

a. Media Mac Conkey
Bentuk Koloni :
Warna koloni :
Ukuran koloni :
Permukaan :
Tepi koloni :
Tinggi koloni :
Sifat koloni pada Mac Conkey plate :
Gambar :

b. Media NA miring : tumbuh/tidak tumbuh (+/-)

Gambar :

c. Media SIM
Gerak : +/-
Indol : +/-
H2S : +/-
Gambar :

Nama Mahasiswa :
Tanggal Praktikum :
Paraf Dosen/Asisten Lab :

32
 PRAKTIKUM IV
PENGARUH LINGKUNGAN TERHADAP PERTUMBUHAN
MIKROORGANISME (1)

TUJUAN PRAKTIKUM
Mahasiswa dapat melakukan pembuktikan pengaruh lingkungan (suhu dan desinfektan)
terhadap pertumbuhan bakteri

DASAR TEORI
Pertumbuhan bakteri sangat dipengaruhi oleh lingkungan seperti suhu, kelembaban, dan
pengaruh lain. Selain dipengaruhi oleh faktor lingkungan, pertumbuhan juga dipengaruhi
faktor dari dalam bakteri itu sendiri. Untuk pertumbuhannya mikroorganisme membutuhkan
kondisi yang ideal sehingga mikroba dapat tubuh secara optimal. Perubahan lingkungan akan
dapat mempengaruhi pertumbuhan bakteri, bahkan dapat mengubah morfologi dan fisiologi
dari mikroba tersebut. Mikroorganisme dapat beradaptasi dengan baik di lingkungan yang
berbeda.mikroorganisme dapat berkembang dengan sangat pesat, bahkan pertumbuhan
mikroorganisme yang sangat besar dapat menjadi suatu wabah penyakit atau meyebabkan
kerusakan pada bahan makanan. Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan
mikroorganisme diantaranya adalah:
1. Suhu
Pada umumnya mikroorganisme dapat tumbuh optimal pada suhu tubuh manusia, tetapi
ada sebagian bakteri yang dapat tumbuh pada kondisi cukup ekstrim, misalnya pada suhu
panas atau dingin.
2. pH
pH optimal untuk pertumbuhan bakteri adalah sekita pH netral yaitu 6,5 – 7,4. Pada
umumnya bakteri tidak akan tumbuh pada pH terlalu asam atau basa. Sehingga ketahanan
terhadap pH ini yang dapat dimanfaatkan untuk mengawetkan bahan makanan, misalnya
dengan teknik fermentasi, dimana makanan dibuat fermentasi.
3. Oksigen
Oksigen merupakan unsur yang sangat penting untuk pertumbuhan mikroba aerob.

33
4. Tekanan osmotik
Tekanan osmotik yang tinggi dapat menyebabkan air keluar dari dalam sel bakteri,
akibatnya bakteri dapat mati atau terhambat pertumbuhannya. Teknik ini dapat digunakan
untuk mengawetkan makanan dengan cara penambahan garam sehingga tekanan osmotik
cairan akan naik.
5. Unsur kimia
Untuk pertumbuhannya bakteri membutuhkan unsur-unsur kimia seperti C, H, N, S, dan P.
selain itu juga membutuhkan unsur mikro seperti, Zn, Fe, dan Cu.

ALAT DAN BAHAN

1. biakan kuman
2. lempeng NA
3. kapas usap steril
4. kaldu NB
5. desinfektan
6. uang logam

PROSEDUR KERJA
A. Melihat pengaruh suhu terhadap pertumbuhan kuman
1. ambil satu sengkelit biakan kuman masukkan dalam nutrient broth
2. Celupkan kapas usap ke dalam suspensi kuman dan oleskan pada permukaan agar
secara merata
3. sisa suspensi kuman dididihkan. setelah mendidih ulangi langkah 2 pada lempeng agar
yanglain
4. inkubasi pada suhu 37o C selama 24 jam
5. bandingkan yang terjadi pada dua cawan petri tersebut
B. Melihat pengaruh suhu terhadap pertumbuhan kuman pada uang logam
1. ambil satu buah uang logam tempelkan pada permukaan lempeng agar
2. ambil satu buah uang logam yang lain, bakar hingga memijar dan tempelkan pada
permukaan lempeng agar lain
3. inkubasi selama 24 jam pada suhu 37o C

34
 4. amati yang terjadi
C. Melihat pengaruh desinfektan terhadap pertumbuhan kuman
1. kapas usap steril dibasahi oleh NB dan diusapkan pada telapak tangan, kemudian
diusapkan pada lempeng agar
2. cuci tangan dengan sabun, ulangi langkah 1 pada lempeng agar lain
3. cuci tangan dengan desinfektan, ulangi langkah 1 pada lempeng agar lain
4. inkubasi selama 24 jam pada suhu 37o C
5. amati yang terjadi

35
LAPORAN SEMENTARA PRAKTIKUM IV
A. Hasil Pengamatan Pengaruh Suhu Terhadap Pertumbuhan Kuman
Suspensi Kuman Suspensi Kuman yang dididihkan
Pengamatan

Gambar

B. Hasil Pengamatan Pengaruh Suhu Terhadap Pertumbuhan Kuman

Uang Logam Yang Tidak Dipijar Uang Logam Yang Dipijar
Pengamatan

Gambar

C. Hasil Pengamatan Pengaruh Desinfektan Terhadap Pertumbuhan Kuman

Tangan yang tidak dicuci Tangan yang dicucu
sabun/desinfektan
Pengamatan

Gambar

Nama Mahasiswa :
Tanggal Praktikum :
Paraf Dosen/Asisten Lab :

36
 PRAKTIKUM V
UJI KEPEKAAN ANTIBIOTIKA (1–3)

TUJUAN PRAKTIKUM
Mahasiswa mampu melakukan uji kepekaan kuman terhadap berbagai antibiotika dengan metode
difusi dan dilusi, mahasiswa mampu menginterpretasi hasil tes uji kepekaan antibiotika

DASAR TEORI
Uji kepekaan Antibiotik
Penyakit infeksi bakteri dapat diobati dengan antibiotika baik yang bersifat bakterisida
maupun bakteriostatika. Untuk mengatasi penyakit dengan tepat diperlukan data kepekaan kuman
penyebab infeksi tersebut terhadap antibiotika yang tersedia. Pengujian kepekaan antibiotik dapat
dilakukan dengan metode difusi atau dilusi.
Pada metode difusi prinsipnya adalah terdifusinya senyawa antimikroba ke dalam media
padatyang telah diinokulasi dengan bakteri. Metode difusi dapat dilakukan dengan cara cakram
atau sumuran. Pada metode difusi cakram, kertas cakram yang mengandung antibiotik diletakkan
di atas media yang telah mengandung mikroba, kemudian diinkubasi dan dibaca hasilnya
berdasarkan kemampuan penghambatan mikroba di sekitar kertas cakram. Metode difusi sumuran
dilakukan dengan membuat sumuran dengan diameter tertentu pada media agar yang sudah
ditanami bakteri.Antibiotik diinokulasikan ke dalam sumuran tersebut dan diinkubasikan.Zona
jernih yang terbentuk di sekitar cakram atau sumuran merupakan indikator penghambatan
antibiotik terhadap pertumbuhan mikroba.
Metode pengujian berikutnya adalah dengan metode dilusi.Pada metode ini dibedakan
menjadi metode dilusi cair dan metode dilusi padat. Pada metode dilusi cair, dapat menentukan
minimum inhibitoryconcentration(MIC) atau kadar hambat minimum (KHM) dan minimum
bacterial concentration (MBC)atau kadar bunuh minimum (KBM). Cara yang dilakukan adalah
dengan membuat seri pengenceran agen antimikroba pada agen medium cair yang ditambahkan
dengan agen mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih
tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai
KHM tersebut dilanjutkan dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun

37
agen antimikroba, dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah
diinkubasi ditetapkan sebagai KBM. Metode Dilusi Padat serupa dengan metode dilusi cair namun
menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen
antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.
Prinsip metode difusi adalah terdifusinya senyawa antimikroba ke dalam media padatyang
telah diinokulasi dengan bakteri dan dapat dilakukan dengan cara cakram atau sumuran. Prinsip
metode dilusi adalah penentuan kadar hambat minimum (KHM) atau minimum concentration
inhibitory (MIC) dari suatu seri pengenceran agen antimikroba pada medium yang
digunakandengan penambahan mikroba uji pada medium tersebut. Larutan uji agen antimikroba
pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai
KHM, yang kemudian dapat ditetapkan sebagai Kadar Bunuh Minimal (KBM)

PROSEDUR KERJA
A. Uji Potensi Senyawa Antibiotik Secara Difusi Paper Disk

Alat dan Bahan :

a. Alat-alat : petridish , pinset, pipet volume steril

b. Kultur murni bakteri uji dalam media NB umur 24 jam
c. Disk antibiotik
d. Disk blank
e. Media nutrien agar (NA)
f. Standar Mac Farland II
g. Buffered Pepton Water (BPW) untuk pembuatan suspensi bakteri uji
h. Aquadest steril sebagai pelarut senyawa uji
i. Alkohol 70 %

Cara kerja :

a. Preparasi Mikroba Uji

1) Siapkan kultur murni bakteri uji.

2) Siapkan larutan standard Mac Farland II (BaCl2 1,1% 0,5 ml dalam 9,95 ml H2SO4 1%)

38
 3) Buat 10 ml suspensi bakteri uji menggunakan media BPW dan setarakan kekeruhannya
dengan larutan standar Mac Farland II

b. Pengujian potensi antibiotik secara difusi paper disk

1) Pembuatan kontrol kontaminasi media

Siapkan 20 ml media NA dan tuang secara aseptis ke dalam petri steril, biarkan memadat

2) Pembuatan kontrol pertumbuhan bakteri uji

Ambil 0,2 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke dalam petri berisi media NA secara
spread plate (harus merata di seluruh permukaan media) dan biarkan permukaan agar
mengering.

3) Pengujian potensi antibiotik secara difusi paper disk

a) Siapkan petri berisi 20 ml media nutrien agar (NA)

b) Ambil 0,2 ml suspensi bakteri uji, inokulasikan ke media NA secara merata dengan
cara spread plate dan biarkan permukaan agar mengering.
c) Secara aseptik, letakkan disk antibiotik, serta 1 disk blank kontrol negatif pada
permukaan media NA.
d) Setiap paper disk diinokulasikan dengan jarak tertentu secara teratur, agar supaya
tidak terjadi overlapping zona hambat yang terbentuk.
e) Beri label pada dasar petri secara benar
f) Inkubasikan selama 24 jam. Amati zona keruh dan jernih di setiap petri
g) Amati, gambar pertumbuhannya dan ukur diameter zona jernih yang terbentuk di
sekitar paper disk dengan jangka sorong/penggaris.

B. Uji Potensi Senyawa Antibiotik Secara Dilusi

Alat dan Bahan

1. Alat : autoklaf, botol pengencer, incubator, lampu spiritus, ose bulat, rak tabung, spoit 1 ml,
spoit 5 ml, dan tabung reaksi.
2. Bahan : aquadest steril, biakan bakteri, kapas medium nutrien broth, larutan antibiotik

39
Prosedur Kerja

a. Disediakan 10 buah tabung steril, dan diberi label 1 – 10.

b. Masukkan pengencer ke dalam tabung III-IX masing masing 1 ml
c. Ditambahkan ke dalam tabung I sebanyak 3 ml antibiotic 200 ppm. Tabung reaksi II
dimasukkan 1 ml antibiotic konsentrasi 200 ppm, lalu diambil 1 ml antibiotic dari tabung
I kemudian dipindahkan ke dalam tabung III, lalu diambil 1 ml tabung III dipindah ke IV
tabung IV dan begitu selanjutnya sampai ke tabung IX
d. Setelah sampai tabung IX dihomogenkan lalu dibuang 1 ml lalu dibuang. Sehingga tabung
II – IX berisi 1 ml larutan.
e. Dimasukkan ke dalam tabung II – IX 1 ml suspensi biakan bakteri. Sedangkan tabung 10
berisi 2 ml biakan bakteri sebagai control positif.
f. Diinkubasikan semua tabung pada suhu 37oC dan diamati pertumbuhan bakteri setelah 1
x 24 jam.
g. KHM ditunjukkan oleh tabung yang memiliki konsentrasi terendah yang dapat
menghambat bakteri.

Tabel Konsentrasi

Tabung Antibiotik Pengencer Konsentrasi akhir antibiotic (ppm)

I 2 ml 200 ppm - Kontrol negatif

II 1 ml 200 ppm - 200

III 1 ml 200 ppm 1 ml 100

IV 1 ml tabung III 1 ml 50

V 1 ml tabung IV 1 ml 25

VI 1 ml tabung V 1 ml 12,5

VII 1 ml tabung VI 1 ml 6,25

VIII 1 ml tabung VII 1 ml 3,125

IX 1 ml tabung VIII 1 ml 1,5625

X - Bakteri 2 ml Kontrol positif

40
INTERPRESTASI HASIL
a. Kepekaan antibiotic metode difusi :

41
42
b.. Uji kepekaan bakteri metode dilusi : Konsentrasi terendah yang dapat menghambat bakteri

43
LAPORAN SEMENTARA PRAKTIKUM V
1. Uji Kepekaan Bakteri Metode Difusi Paper Disc
Diameter Hambatan : mm
Bakteri :
Antibiotik :
Hasil : Resisten/Sensitif/Intermediate
Gambar :

2. Uji Kepekaan Bakteri Metode dilusi

Bakteri :
Antibiotik :
KHM :
Hasil Pengamatan :

Nama Mahasiswa :
Tanggal Praktikum :
Paraf Dosen/Asisten Lab :

44
 PRAKTIKUM VI
ANGKA LEMPENG TOTAL (1)

TUJUAN
1. mampu melakukan pengujian angka lempeng total bakteri (ALT) pada jamu, makanan
ringan dan minuman ringan
2. mampu menginterpretasi hasil pengujian ALT

DASAR TEORI

Angka Lempeng Total bakteri adalah jumlah koloni bakteri aerob mesofil yang terdapat
dalam tiap gram ataupun ml sample uji. Bakteri mesofil merupakan bakteri yang tumbuh pada
temperatur minimal 10-20°C, optimal pada suhu 20-40°C dan maksimal pada suhu 40- 45°C.
Uji ALT mengandung prinsip yaitu pertumbuhan koloni bakteri aerob mesofil setelah
cuplikan diinokulasikan pada lempeng agar dengan cara tuang dan diinkubasi pada suhu yang
sesuai. Pengujian dilakukan secara duplo.Untuk mendapatkan ALT representatif dilakukan
terhadap beberapa pengenceran sample seperti 10-1 ; 10-2 ; 10-3 dst.

Sample bentuk padat diperlakukan sebagai berikut; sample padat dihancurkan dalam
kemasan sebelum dibuka, timbang sebanyak 25 g, larutkan dengan larutan fisiologis hingga
250 ml. Sample bentuk serbuk seperti jamu, timbang sebanyak 10 g, larutkan dengan larutan
fisiologis hingga 100 ml. Sample cair seperti minuman ringan tidak perlu diencerkan lebih
dahulu. Sampel yang akan diuji terlebih dahulu dihomogenkan dalam larutan fisiologis
sehingga didapat pengenceran 10-1. Dari hasil pengenceran tersebut, dipipet sebanyak 1 ml ke
dalam tabung pertama yang berisi 9 ml larutan pengencer sehingga diperoleh pengenceran 10-
2
. Campuran dikocok homogen. Pengenceran dilakukan demikian seterusnya sehingga
diperoleh pengenceran bertingkat 10- 3, 10-4, 10-5 dan seterusnya.

Dari setiap hasil pengenceran, dipipet 1 ml ke dalam cawan petri dan dibuat duplo.
Selanjutnya, ke dalam setiap cawan petri, dituang sebanyak 15-20 ml media Plate Count Agar
(PCA). Cawan petri segera digoyangkan perlahan supaya sampel tercampur rata dengan media

45
pembenihan. Setelah media membeku, cawan petri diinkubasi pada suhu 35-37°C selama 24-
48 jam dengan posisi terbalik.

ALAT DAN BAHAN

1. Alat
a. petri dish
b. tabung reaksi
c. pipet ukur
d. erlemeyer
2. Bahan
a. Pepton Dilution Fluid (PDF) / NaCl Fisiologis
b. Plate Count Agar (PCA)
c. sample

46
PROSEDUR KERJA

a. Pipet 1 mL dari setiap pengenceran diatas dan masukkan ke dalam cawan petri steril.
Lakukan secara duplo untuk setiap pengenceran.
b. Tambahkan 12 mL - 15 mL PCA (yang sudah steril dan suhu ruang) ke dalam masing-
masing cawan yang sudah berisi contoh. Supaya contoh dan media PCA tercampur
sempurna, lakukan pemutaran cawan ke depan-ke belakang dan ke kiri-ke kanan.
c. Inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisi terbalik. Masukkan ke dalam inkubator
pada suhu 35 °C ± 1 °C untuk bakteri mesofilik atau pada suhu 45 °C ± 1 °C untuk
bakteri termofilik selama 48 jam ± 2 jam
d. Hitung angka lempeng total dengan menghitung jumlah koloni pada cawan dengan
bantuan coloni counter
e. Pertumbuhan koloni pada setiap cawan yang mengandung 30-300 koloni dicatat. Pada
setiap pemeriksaan, selalu disertakan media control uji (blanko). Angka lempeng total
untuk 1 gram atau 1 mL sampel dihitung dengan mengalikan jumlah rata-rata koloni
pada cawan dengan faktor pengenceran.ALT dihitung dari petri dengan jumlah koloni
representatifjika tidak terdapat jumlah koloni representatif, ALT merupakan prakiraan
dari pengenceran tertinggi.

47
LAPORAN SEMENTARA PRAKTIKUM VI

48
Nama Mahasiswa :
Tanggal Praktikum :
Paraf Dosen/Asisten Lab

49
 PRAKTIKUM VII
MPN (MOST PROBABLE NUMBER) COLIFORM(1,3)

TUJUAN PRAKTIKUM
Mampu melakukan uji Most Probable Number (MPN) Coliform pada sampel makanan, minuman
ataupun jamu

PRINSIP KERJA
Pertumbuhan bakteri coliform yang ditandai dengan terbentuknya gas dalam tabung durham.
Setelah contoh diinkubasikan dalam perbenihan yang cocok pada suhu 36 ±10 C selama 24 – 48
jam.

DASAR TEORI
MPN Coliform adalah suatu metode penentuan angka mikroorganisme dengan metode Angka
Paling Mungkin yang digunakan luas di lingkungan sanitasi untuk menentukan jumlah koloni
Coliform di dalam air, susu dan makanan lainnya. Metode MPN dapat digunakan untuk
menghitung menghitung jumlah bakteri yang dapat memfermentasi laktosa membentuk gas,
misalnya bakteri Coliform. Metode MPN menggunakan medium cair di dalam tabung reaksi,
dimana prinsipnya adalah menghitung jumlah tabung yang positif yang ditumbuhi oleh mikroba
setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.Tabung pada pengujian MPN dinyatakan positif
apabila timbul kekeruhan dan atau terbentuknya gas di dalam tabung Durham.

Pengujian menggunakan metode MPN terdiri atas dua cara, yaitu menggunakan deretan 3 tabung
dan deretan 5 tabung reaksi. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian dan
kepekaan yang lebih tinggi, tetapi alat gelas yang digunakan juga lebih banyak. Namun pada
prinsipnya cara penentuan menggunakan deretan 5 tabung sama dengan metode MPN
menggunakan deretan 3 tabung. Pengujian MPN dilakukan dengan menggunakan sampel
berbentuk cair, apabila sampel yang akan digunakan berbentuk padatan maka sampel tersebut
harus dibuat cair (suspensi) lebih dahulu dengan perbandingan 1 :10.

Tahapan uji kualitatif koliform secara lengkap terdiri dari tiga tahap, yaitu:

50
1. Uji Penduga

Uji ini menggunakan Lactose Broth atauMac Conkey Broth (MCB), apabila sampel yang
digunakan mengandung bakteri asam laktat, misalnya susu, dapat digunakan Brilliant Green
Lactose Bile Broth (BGLBB). Bakteri asam laktat dapat memfermentasi laktosa dan
membentuk gas, hingga dapat mengakibatkan pembacaan uji positif yang salah. Inkubasi
dilakukan pada suhu 35°C selama 24 jam, dan tabung dinyatakan positif jika terbentuk gas
sebanyak 10% atau lebih dari volume di dalam tabung durham. Tabung yang tidak
menunjukkan gas diperpanjang lagi inkubasinya sampai 48 jam. Jika tetap tidak terbentuk gas,
dihitung sebagai tabung negatif.

2. Uji Penguat

Terbentuknya gas di dalam Mac Conkey Broth (MCB) atau di dalam Brilliant Green Lactose
Bile Broth (BGLBB) tidak selalu menunjukkan jumlah bakteri koli karena mikroba lainnya
mungkin juga ada yang dapat memfermentasi laktosa dengan membentuk gas, misalnya bakteri
asam laktat dan beberapa khamir tertentu. Uji penguat dilakukan dengan memindahkan
sebanyak 1 ose biakan dari tabung yang membentuk gas pada media Mac Conkey Broth (MCB)
/ Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB) ke dalam tabung yang berisi 10 ml Brilliant
Green Lactose Bile 2% (BGLB 2%). Semua tabung diinkubasi pada suhu 37°C selama 24-48
jam. Gas yang terbentuk pada tabung durham dalam media Brilliant Green Lactose Bile
(BGLB) 2% memperkuat bukti adanya bakteri Kliform.14

3. Uji Pelengkap

Uji pelengkap dilakukan untuk mengidentifikasi jenis bakteri Coliform dalam sampel yang
menunjukkan tabung positif pada uji penguat. Tabung yang menunjukkan hasil positif diambil
1 ose biakan dan digoreskan di atas media endo agar dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu
37°C. Jika hasil uji pelengkap menunjukkan terbentuknya koloni hijau metalik pada media endo
agar, hasil tersebut menyatakan bahwa terdapat bakteri Escherichia coli pada sampel. Jika hasil
uji pelengkap menujukkan terbentuknya koloni berwarna merah tanpa kilap hijau metalik, hasil
tersebut menyatakan bahwa bakteri Coliform yang terkandung dalam sampel bukan Escherichia
coli tetapi kemungkinan jenis lain dari bakteri Coliform seperti Enterobacter aerogenesis.

51
ALAT DAN BAHAN

1. Alat

a. Tabung reaksi
b. Tabung durham
c. Kawat ose
d. Pipet ukur
e. Erlenmeyer
f. Lampu bunsen

2. Bahan

a. Lactose broth
b. Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB)
c. Endo/Mac Conkey Agar
d. Sampel uji

PROSEDUR KERJA

A. Pembuatan Media

1. Media Lactose Broth (LB)

Larutkan 13 gram media LB kedalam 1 liter aguades, sterilisasi dalam autoclave 1210C
selama 15 menit. Untuk lactose broth triple strength (TSL)sama dengan di atas, hanya
penimbangannya 3 kali lipat/triple.
2. Media Briliant Green Lactase BileBroth (BGLBB)
Larutkan 40 gram media BGLBB kedalam 1 liter aguades, sterilisasi dalam autoclave
1210C selama 15 menit.
B. Pengambilan Sampel

Pengambilan sampel air dan minuman cair dapat langsung diperiksa tanpa perlu persiapan
sampel terlebih dahulu. Untuk sample minuman yang pekat/kental dan makanan padat perlu
dilakukan persiapan sampel terlebih dahulu.

52
1. Pengambilan sampel air
a) Pengambilan sampel air bergantung keadaaan air itu sendiri.
b) Jika berasal dari air sungai yang mengalir maka botol dicelupkan miring dengan bibir
botol melawan arus air.
c) Jika pengambilan sampel dilakukan pada air yang tenang, maka botol dapat dicelupkan
dengan tali.
d) Jika pengambilan sampel pada air kran, maka kran dibakar terlebih dahulu kemudian
dialirkan dulu beberapa saat kemudian air ditampung
2. Pengambilan sampel minuman pekat/makanan padat
Sampel Minuman pekat/kental : (v/v)
a) Memipet 10 ml sampel ml minuman pekat masukkan dalam botol yang telah berisi
aquades steril 90 ml,
b) Mengocok, dengan cara dibolak-balik beberapa kali,
c) Dilakukan secara aseptis.
Sampel Makanan padat :
a) Menimbang 10 gr makanan padat masukkan dalam botol yang telah berisi 100 ml
aquades steril,
b) Mengocok, dengan cara dibolak-balik beberapa kali,
c) Melakukannya secara aseptis,
d) Mendiamkan beberapa saat agar makanan mengendap
3. Pengujian Sampel
1). Uji Penduga
a) Siapkan 9 tabung reaksi berisi 10 ml LB steril yang sudah dilengkapi dengan tabung
durham. Atur letak pada rak tabung dan masing masing beri kode (A1,A2,A3;
B1,B2,B3; C1,C2,C3) dimana pada kode A1, A2 dan A3 berisi media LB triple
strength sedangkan pada kode B dan C berisi LB single strength
b) Tuangkan air sampel dengan pipet steril sebanyak 10 ml dan dimasukkan kedalam 3
tabung kultur yang berkode A1,A2,A3.
c) Tuangkan air sampel dengan pipet steril sebanyak 1 ml dan dimasukkan kedalam 3
tabung kultur yang berkode B1,B2,B3.

53
 d) Tuangkan air sampel dengan pipet steril sebanyak 0,1 ml dan dimasukkan kedalam 3
tabung kultur yang berkode C1,C2,C3.
e) Inkubasi selama 24-48 jam pada suhu 37oC
f) Amati dan catat tabung yang menunjukkan reaksi positif dengan adanya gelembung
udara pada tabung durham dan atau mengalami perubahan warna dari ungu menjadi
keruh pada larutan uji.
2). Uji Penguat
a) Siapkan tabung kultur yang masing masing berisi 10 ml media cair BGLBB steril yang
sudah dilengkapi dengan tabung durham. Atur letaknya pada rak tabung dan masing
masing beri kode (A1,A2,A3; B1,B2,B3; C1,C2,C3), sehingga jumlahnya sama dengan
jumlah tabung LB yang positif saja.
b) Pindahkan 1 ml dari tabung yang menunjukkan hasil positif dari uji penduga kedalam
tabung yang berisi BGLB steril.
c) Inkubasi selama 24 jam pada suhu 44oC (untuk bakteri coliform fecal) atau 370C (untuk
bakteri coliform non fecal)
d) Amati gelembung udara di dalam tabung durham. Catat kode tabung yang positif
mengeluarkan gas. Mikroba penghasil gas yang tumbuh pada tabung adalah kelompok
mikroba yang mampu memfermentasikan laktosa dan tahan terhadap suhu tinggi 440C
mikroba ini disebut kelompok bakteri coliform fekal
3). Uji Pelengkap/ Complicated
a) Uji penguat dapat dilakukan dengan mendeteksi adanya bakeri E.Coli caranya ialah :
b) Inokulasi sampel dari tabung BGLBB yang positif pada uji penegasan sebanyak satu ose
ke permukaan media EMB secara zigzag. Inkubasi pada suhu 370C selama 1 x 24 jam.
c) Amati pertumbuhan koloni pada media EMB. Koloni yang menampakkan adanya hijau
mengkilap metalik adalah koloni bakteri E.coli
d) Dipastikan lagi dengan mengamati inoculum dari koloni tersebut secara langsung dengan
menggunakan mikroskop dengan pengecatan gram, dimana bakteri E coli berbentuk
batang dan berwarna merah karena gram negative, dan dilakukan uji biokimia terhadap
bakteri tersebut.

54
e) Setelah semua pengujian selesai, tentukan nilai MPN COLIFORM berdasarkan tabel
MPN . Nilai MPN ditentukan berdasarkan jumlah tabungn yang positif dari perlakuan
dan dihitung = MPN tabel x 1/penegenceran tengah

55
INTERPRESTASI HASIL

56
57
LAPORAN SEMENTARA PRAKTIKUM VI
Sampel :
Diproduksi :
No Batch :
No Regis :
Tabung Gas Positif
10-1 10-1 10-1 MPN COLIFORM

Syarat :
Kesimpulan :

Gambar Hasil pengujian :

Nama Mahasiswa :
Tanggal Praktikum :
Paraf Dosen/Asisten Lab

58
REFERENSI
1. Yusmaniar, Wardiyah, Nida K. BAHAN AJAR FARMASI. MIKROBIOLOGI DAN
PARASITOLOGI. Cetakan Pertama. Jakarta: Pusat Pendidikan Sumber Daya Manusia
Kesehatan Badan Pengembangan dan Pemberdayaan Sumber Daya Manusia Kesehatan
Kementerian Kesehatan Republik Indonesia; 2017. 77 p.

2. Meganada Hiaranya P, Sukini, Yodong. Bahan Ajar Keperawatan Gigi. Mikrobiologi.

Cetakan pertama. Jakarta: Pusat Pendidikan Sumber Daya Manusia Kesehatan Badan
Pengembangan dan Pemberdayaan Sumber Daya Manusia Kesehatan Kementerian
Kesehatan Republik Indonesia; 2017. 401 p.

3. Kurniawan Fajar Bakti, Indra Taufik S. Bakteriologi Praktikum Teknologi Laboratorium

medik. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC; 2016. (Analis Kesehatan).

4. Ulfah U, Liliek H, Nur K, Prilya Dewi F. Panduan Praktikum Mikrobiologi Umum.

Malang: Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri (UIN) Maulana Malik
Ibrahim; 2018.

59