Generla Probiotics Techniques

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Metodi microbiologici tradizionali e metodi molecolari per l'analisi degli

integratori alimentari a base di o con probiotici per uso umano
Article · January 2008
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Paolo Aureli Concetta Scalfaro

Istituto Superiore di Sanità Istituto Superiore di Sanità
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Giovanna Franciosa
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ISTITUTO SUPERIORE DI SANITÀ
Metodi microbiologici tradizionali

e metodi molecolari per l’analisi
degli integratori alimentari
a base di o con probiotici per uso umano
Paolo Aureli, Alfonsina Fiore, Concetta Scalfaro, Giovanna Franciosa

Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare
ISSN 1123-3117
Rapporti ISTISAN
08/36
Metodi microbiologici tradizionali e metodi molecolari per l’analisi degli integratori alimentari a base di o con
probiotici per uso umano.
2008, ii, 63 p. Rapporti ISTISAN 08/36
Il presente rapporto, indirizzato in particolare ai laboratori preposti al controllo ufficiale degli alimenti, descrive i
metodi di analisi microbiologici e di biologia molecolare e i criteri per valutare la conformità degli integratori a base
di o con probiotici, per uso umano. L’effetto benefico dovuto all’assunzione, in adeguate quantità, di microrganismi
vivi denominati probiotici, ha portato al crescente aumento del consumo di preparazioni a base di o con probiotici;
per questo motivo sta diventando sempre più importante garantirne la qualità numerando e tipizzando i microrganismi
probiotici presenti in tali preparazioni. Fino ad oggi, la mancanza di metodi analitici per la numerazione differenziale
dei probiotici negli integratori alimentari per uso umano ha solo raramente permesso ai laboratori del controllo
ufficiale di verificarne la conformità alle Linee Guida 2005 del Ministero della Salute (Dipartimento di Sanità
Pubblica Veterinaria, Nutrizione e Sicurezza Alimentare).
Parole chiave: Probiotici, Integratori a base di o con probiotici, Metodi di analisi

Microbiological and molecular methods for analysis of probiotic based food supplements for human
consumption.
2008, ii, 63 p. Rapporti ISTISAN 08/36
The present report, specifically directed to the official control laboratories, shows traditional and molecular
methods and criteria for assessment of the compliance of probiotic food supplements intended for human
consumption. The perceived health benefits associated to the conscious ingestion in adequate amounts of certain live
microorganisms (named probiotics) have led to an increased consumption of products containing or consisting of
mono- or mixed microbial cultures, therefore it is important to guarantee their quality to the consumers by counting
and typing the probiotic microorganisms. At present, the official control of the probiotic food supplements to verify
the compliance of the probiotic food supplements to the Guidelines 2005 for probiotic and prebiotic issued by
Ministry of Health (Department of Veterinary Public Health, Nutrition and Food Safety) is rarely performed because
of absence of analytical methods for the differential enumeration of probiotics in mixed culture preparations.
Key words: Probiotics, Probiotic based food supplements, Analytical methods
Per informazioni su questo documento scrivere a: [email protected].
Il rapporto è accessibile online dal sito di questo Istituto: www.iss.it.
Citare questo documento come segue:

Aureli P, Fiore A, Scalfaro C, Franciosa G. Metodi microbiologici tradizionali e metodi molecolari per l’analisi degli integratori
alimentari a base di o con probiotici per uso umano. Roma: Istituto Superiore di Sanità; 2008. (Rapporti ISTISAN 08/36).
Presidente dell’Istituto Superiore di Sanità e Direttore responsabile: Enrico Garaci

Registro della Stampa - Tribunale di Roma n. 131/88 del 1° marzo 1988
Redazione: Paola De Castro, Sara Modigliani e Sandra Salinetti

La responsabilità dei dati scientifici e tecnici è dei singoli autori.
© Istituto Superiore di Sanità 2008

Rapporto ISTISAN 08/36
INDICE
Introduzione........................................................................................................................................ 1
Scopo del rapporto .......................................................................................................................... 3
Gli integratori alimentari ............................................................................................................... 4
Campionamento................................................................................................................................ 6
Fasi del campionamento ................................................................................................................ 6
Quantità di materiale da prelevare.......................................................................................... 6
Fase del processo dove effettuare il prelievo.......................................................................... 7
Modalità di trasporto e tempi di consegna del campione prelevato al laboratorio.................. 7
Protocollo analitico consigliato ................................................................................................. 8
Screening con metodo molecolare delle specie indicate in etichetta

mediante esame diretto del campione .................................................................................... 9
Introduzione................................................................................................................................... 9
Estrazione diretta del DNA totale dal prodotto.............................................................................. 11
Amplificazione del DNA batterico mediante PCR ........................................................................ 11
Metodica di preparazione della miscela di reazione ............................................................... 11
Visualizzazione dell’amplificato mediante elettroforesi su gel d’agarosio.................................... 13
Preparazione del gel d’agarosio.............................................................................................. 14
Lettura dei risultati......................................................................................................................... 14
Metodi per l’identificazione genetica di microrganismi probiotici ............................. 15

1. Bacillus coagulans.................................................................................................................. 17
2. Bifidobacterium bifidum ......................................................................................................... 18
3. Bifidobacterium spp................................................................................................................ 19
4. Lactobacillus acidophilus (primer Acido/Lac)....................................................................... 20
5. Lactobacillus acidophilus (primer Idlc4F/Idl22R)................................................................. 21
6. Lactobacillus casei ................................................................................................................. 22
7. Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus .......................................................................... 23
8. Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis................................................................................... 24
9. Lactobacillus helveticus ......................................................................................................... 25
10. Lactobacillus kefiri ................................................................................................................. 26
11. Lactobacillus paracasei.......................................................................................................... 27
12. Lactobacillus plantarum......................................................................................................... 28
13. Lactobacillus reuteri .............................................................................................................. 29
14. Lactobacillus rhamnosus........................................................................................................ 30
15. Lactobacillus salivarius.......................................................................................................... 31
16. Lactococcus lactis .................................................................................................................. 32
17. Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii .............................................................. 33
18. Streptococcus thermophilus.................................................................................................... 34
i
Numerazione differenziale presuntiva delle specie microbiche probiotiche

vive dichiarate in etichetta ........................................................................................................... 35
Introduzione................................................................................................................................... 35
Preparazione della diluizione iniziale e rivivificazione ................................................................. 35
Procedura di conteggio mediante tecnica della semina in superficie
(spreading-spatula method)........................................................................................................... 36
Numero di piastre di Petri per ogni diluizione........................................................................ 36
Numerazione delle colonie ............................................................................................................ 36
Numerazione delle colonie prima dell’identificazione ........................................................... 36
Espressione dei risultati nel caso di assenza di crescita batterica .................................................. 37
Metodi per la numerazione dei microrganismi probiotici ............................................... 39

19. Genere bacillus....................................................................................................................... 41
20. Genere bifidobacterium ......................................................................................................... 42
21. Genere lactobacillus ............................................................................................................... 43
22. Genere lactococcus................................................................................................................. 46
23. Genere propionibacterium...................................................................................................... 47
24. Genere streptococcus.............................................................................................................. 48
Conferma genetica di specie....................................................................................................... 49

Introduzione................................................................................................................................... 49
Preparazione del DNA da coltura batterica ................................................................................... 49
Modalità di conteggio delle colonie dopo l’identificazione ........................................... 50
Conclusioni ......................................................................................................................................... 52
Bibliografia .......................................................................................................................................... 53
Appendice
Terreni di coltura ........................................................................................................................... 57
ii
INTRODUZIONE
L’assunzione volontaria di batteri vivi non patogeni, generalmente ma non esclusivamente

sottoforma di prodotti lattiero-caseari, è una pratica diffusa nell’alimentazione umana che risale
al secolo scorso. Oggi grazie ad una serie crescente di rigorose ricerche scientifiche sugli effetti
benefici e di evidenze che confermano tale efficacia nel prevenire/trattare alcune malattie è
andata aumentando tra i consumatori l’abitudine di includere determinati tipi di batteri,
denominati probiotici, nella dieta proprio per il loro potenziale benefico.
Va sottolineato il fatto che evidenze di efficacia legate all’assunzione con la dieta di
probiotici sono state consistentemente confermate solo per un piccolo numero di condizioni.
Tuttavia la percezione dei consumatori sugli effetti benefici che essi apporterebbero ha finito
per favorirne un uso più ampio rispetto a quello che si potrebbe prevedere se fosse associato a
circoscritte situazioni, e gli integratori a base di o con probiotici sono diventati una voce sempre
più importante nel mercato degli integratori alimentari.
Secondo la più recente e accreditata definizione, il termine probiotici è riservato a quei
microrganismi vivi in grado di assicurare effetti benefici alla salute dei consumatori quando
assunti per via orale in quantità appropriata (1). Gli effetti benefici che essi esercitano sono
stati attribuiti all’azione riequilibratrice che svolgono sulla flora microbica intestinale o sulle sue
attività, all’influenza sulla risposta immunitaria della mucosa intestinale o all’integrazione di
specifiche attività enzimatiche.
Per la verità, negli ultimi 30 anni sono state proposte diverse definizioni del descrittore
probiotico, con l’intento di migliorarne e integrarne gli attributi qualificanti stabiliti dalle
precedenti definizioni, man mano che si acquisivano ulteriori conoscenze sulla fisiologia di
taluni microrganismi e sul loro ruolo terapeutico e/o benefico. In particolare, si è partiti con
l’attributo di … contribute to intestinal microbial balance (contribuire all’equilibrio della flora
intestinale) (2) per passare dapprima a considerare il requisito della vitalità unito a quello
dell’effetto benefico per la salute dell’ospite (3), indipendentemente dal fatto che i
microrganismi potevano essere colture disidratate o latti fermentati, poi al fatto che i batteri
assunti dovevano essere presenti nei prodotti, vivi e in numero adeguato per poter assicurare
l’effetto benefico e al fatto che miglioravano l’azione complessiva della flora intestinale (4-6).
Sulla base di queste definizioni un rilevante numero di microrganismi è considerato probiotico,
fatto questo che sta comportando l’effettuazione di specifici e validati studi di efficacia per la
loro conferma.
La maggior parte dei microrganismi probiotici sono specie, più frequentemente solo
determinati ceppi, appartenenti ai generi Bifidobacterium e Lactobacillus. Si tratta per lo più di
microrganismi isolati dai microbiota del tratto intestinale dell’uomo, ma sono riconosciuti
probiotici anche microrganismi che originano da habitat non umani e che sono utilizzati nella
preparazione di prodotti lattiero-caseari fermentati. Oltre ai ceppi e alle specie appartenenti ai
due suindicati generi, l’attributo probiotico è stato riconosciuto anche a microrganismi dei
generi, Streptococcus, Lactococcus, Propionibacterium, Bacillus ed Enterococcus. Tuttavia,
sono state avanzate perplessità sui microrganismi probiotici appartenenti agli ultimi due generi,
in particolare sul genere Enterococcus, per la presenza di specie patogene. Sono considerati
probiotici anche taluni lieviti appartenenti al genere Saccharomyces.
A livello internazionale, i criteri con cui stabilire la sicurezza d’uso di un ceppo batterico
sono stati autorevolmente proposti dal Joint FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of
Health and Nutritional Properties of Probiotics in Food tenutosi nell’ottobre 2001 a Cordoba in
Argentina (7). Successivamente un altro gruppo di lavoro FAO/WHO (Working Group on
1
Drafting Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food ), nel maggio 2002, a London,
Canada (8), ha, tra le altre cose, identificato e stabilito i requisiti minimi con cui poter
qualificare “probiotico”, in maniera oggettiva, una specie microbica.
A livello nazionale, la Commissione Consultiva per gli integratori alimentari e i prodotti
destinati ad un’alimentazione particolare del Ministero della Salute ha elaborato una prima linea
guida nel 2002 che, più recentemente alla luce dei criteri valutativi raccomandati dai gruppi di
esperti FAO/OMS, è stata sottoposta ad aggiornamento. Le nuove Linee Guida ministeriali (9)
emanate nel dicembre 2005 che hanno recepito tutti gli elementi di rilievo dei suddetti
documenti FAO/WHO, rappresentano il punto di riferimento obbligato per qualunque impresa
interessata al settore nel momento in cui notifica l’etichetta di un integratore a base di probiotici
al Ministero della Salute (10) e redige un proprio piano di autocontrollo. Inoltre, le stesse linee
guida rappresentano il punto di partenza obbligato per qualunque programma di valutazione di
conformità degli integratori alimentari con probiotici e di verifica dei piani di autocontrollo
delle aziende produttrici da parte delle autorità preposte al controllo ufficiale.
Si tratta di un documento che introduce più precisi elementi di valutazione dei microrganismi
probiotici così riassumibili:
– sicurezza per l’impiego nell’uomo secondo i criteri indicati dalla European Food Safety
Authority (EFSA); in particolare, assenza di determinanti genetici di antibiotico-resistenze
acquisite e/o trasmissibili (11);
– attività e vitalità a livello intestinale in quantità tale da giustificare gli eventuali effetti
benefici osservati in studi di efficacia;
– persistenza e moltiplicazione nell’intestino umano;
– capacità di conferire un beneficio fisiologico.
Ovviamente il tutto preceduto dalla verifica dell’identità tassonomica e dalla
caratterizzazione dei microrganismi a livello di specie e di ceppo integrando la verifica
fenotipica con l’analisi dei caratteri genotipici mediante tecniche per lo studio del DNA
batterico specificatamente indicate nelle citate Linee Guida.
In base a tale documento un integratore con microrganismi probiotici è da ritenersi conforme se:
– la quantità di cellule vive per porzione/posologia giornaliera è almeno di 109;
– i microrganismi sono vitali;
– la specie è correttamente indicata in etichetta utilizzando le denominazioni specificate in
nomenclature tassonomiche internazionalmente riconosciute;
– la/le specie microbica/he è/sono sicura/e per l’impiego umano;
– i germi patogeni sono assenti.
2
SCOPO DEL RAPPORTO
Dato il crescente aumento del consumo di preparazioni a base di o con probiotici, sta
diventando sempre più importante garantirne la qualità, assicurandone tra l’altro la verifica
microbiologica di conformità alle linee guida ministeriali. Infatti, in base a quanto riportato in
tale documento, è necessario che le preparazioni probiotiche, per poter avere l’effetto benefico
vantato, contengano microrganismi vivi e vitali in quantità non inferiori alla concentrazione
minima stabilita per dose/posologia, per tutto il periodo di vita commerciale.
Appare pertanto evidente la necessità di sottoporre a controllo tali preparazioni, al fine di
assicurare la soddisfazione di tali requisiti e tutelare i consumatori.
La numerazione differenziale dei batteri probiotici nelle preparazioni che contengono più
specie simili è però indubbiamente difficoltosa e, la mancanza di una raccolta organica e
omogenea di procedure analitiche specifiche per tale valutazione, a disposizione dei laboratori
del controllo ufficiale, non ha permesso finora la realizzazione dei programmi di monitoraggio
annuali di tali prodotti.
Per questa ragione si è ritenuto necessario realizzare il presente documento nel quale
vengono descritti un protocollo operativo e le metodiche analitiche adeguate alla valutazione di
conformità degli integratori alimentari a base o con probiotici, limitatamente alle specie
considerate nel presente lavoro. Si tratta di una raccolta di metodi verificati e validati in
laboratorio secondo riconosciute procedure (12), dagli autori del presente documento.
Consapevoli dell’esistenza di un’ampia varietà di terreni colturali per la ricerca di
microrganismi probiotici da integratori alimentari, quelli da noi scelti sono i terreni risultati più
idonei allo scopo.
Si precisa che anche se preparazioni farmaceutiche, dispositivi medici e alimenti qualificano
probiotici i microrganismi che li compongono/caratterizzano, i criteri di valutazione di
conformità di seguito riportati e le metodiche analitiche non possono al momento essere
considerati per essi adatte.
3
GLI INTEGRATORI ALIMENTARI
Molte specie microbiche per talune loro proprietà hanno trovato impiego in vari settori
industriali, quali quello del farmaco, quello dei presidi medico-chirurgici e, infine, quello
dell’alimentazione umana e animale. Ovviamente per ognuno di essi l’impiego dei
microrganismi è subordinato al rispetto di una serie di norme che tutelano la salute dei
consumatori e, per talune applicazioni, all’assicurazione dell’efficacia.
Nel settore alimentare, i microrganismi hanno trovato impiego nella produzione di
ingredienti alimentari, in quella dei coadiuvanti tecnologici e nella produzione di alimenti
fermentati, rispettando sempre le regole che governano la produzione e l’immissione in
commercio degli alimenti nel caso in cui per le specie microbiche impiegate fosse possibile
vantare una lunga tradizione d’uso, mentre per quelle che non presentano tale requisito viene
richiesta una specifica valutazione di sicurezza (regolamento CE 258/1997).
Un particolare e recente campo di applicazione dei microrganismi è quello della produzione
di integratori alimentari. Da alcuni anni i microrganismi che vantano effetti benefici e che
vengono commercializzati in forma diversa dagli alimenti, sono stati inclusi dal Ministero della
Sanità prima e Salute poi, tra gli integratori alimentari e conseguentemente soggetti al rispetto
delle regole di questi particolari prodotti alimentari. Questa scelta ministeriale è stata rafforzata
dalla recente pubblicazione della direttiva 2002/46/CE del 10 giugno 2002 (13), recepita in
Italia con il DM 21 maggio 2004 n.169, che definisce gli integratori alimentari, come “prodotti
alimentari destinati ad integrare la dieta normale e che costituiscono una fonte concentrata di
sostanze nutritive o di altre sostanze aventi effetto nutritivo o fisiologico, sia monocomposti che
pluricomposti, in forme di dosaggio, vale a dire in forme di commercializzazione quali capsule,
pastiglie, compresse, pillole e simili, polveri in bustina, liquidi contenuti in fiale, flaconi a
contagocce e altre forme simili, di liquidi o polveri destinati ad essere assunti in piccoli
quantitativi unitari”. In altre parole, gli integratori alimentari sono un complesso di prodotti il
cui uso risponde all’obiettivo di migliorare il metabolismo e le funzioni fisiologiche
dell’organismo attraverso un insieme di effetti aggiuntivi alle normali funzioni nutrizionali.
In questo senso, gli integratori, pur non essendo alimenti dietetici a tutti gli effetti in quanto
non destinati a rispondere ad esigenze nutrizionali o condizioni fisiologiche particolari, sono in
ogni caso prodotti dell’area alimentare e come tali assoggettati ai criteri di conformità e
sicurezza da verificare con i criteri propri di tutti gli alimenti. A questo proposito, il Ministero
della Salute, Dipartimento per la Sanità Pubblica Veterinaria, la Nutrizione e la Sicurezza
Alimentare, ha varato, già da qualche anno, un piano annuale di vigilanza degli integratori
alimentari, commercializzati come prodotti alimentari e presentati come tali (14), indirizzato
alle Regioni. Gli integratori a base di probiotici e/o preparazioni alimentari contenenti probiotici
stanno incontrando un crescente favore tra i consumatori proprio per i benefici effetti ad essi
attribuiti e/o dai consumatori percepiti. Gli alimenti probiotici sono una categoria di integratori
caratterizzata dalla presenza di specie microbiche particolari alla cui assunzione si riconosce la
capacità di favorire lo stato di benessere del consumatore.
La possibilità che una qualunque specie o ceppo probiotico possa essere impiegato in
alimentazione umana è subordinata alla sua sicurezza d’uso. Su tale aspetto, del tutto
recentemente, si è pronunciata l’EFSA (11) che ha introdotto il concetto di qualified
presumption of safety (QPS), per riconoscere quei microrganismi o loro componenti che
possono essere utilizzati negli alimenti o per la produzione di alimenti, in quanto accompagnate
da una ben stabilita storia e status di sicurezza, senza che l’autorità richieda un’opportuna
4
documentazione o ne preveda una particolare valutazione autorizzativa per concederne

l’utilizzo.
Si tratta di un approccio simile al sistema americano GRAS (generally regnized as safe) da
cui si differenzia per il fatto che l’attributo di QPS è riconosciuto a tutti i microrganismi della
stessa specie e non al singolo ceppo e, conseguentemente, l’autorizzazione all’impiego non è
propria ed esclusiva dell’impresa richiedente.
Per poter ottenere tale riconoscimento, però, i microrganismi debbono soddisfare alcuni
criteri, in particolare non veicolare determinanti di resistenza agli antibiotici. Si tratta di un
importante criterio di sicurezza in quanto i microrganismi che portano geni per la resistenza agli
antibiotici possono trasferirli ai germi commensali o patogeni, con pericolose implicazioni per
la sanità pubblica.
5
CAMPIONAMENTO
La verifica di conformità al dichiarato in etichetta di integratori con microrganismi probiotici

(relativamente alla specie, al numero di microrganismi e alla loro sicurezza d’uso), deve essere
effettuata analizzando un’appropriata quantità di prodotto ottenuta prelevando un numero di
confezioni (campione globale), conformemente alla metodologia di seguito descritta.
Il campione globale così ottenuto viene considerato rappresentativo del lotto. A questo
proposito, si ritiene appropriato applicare un tipo di campionamento per randomizzazione
semplice (o campionamento casuale semplice). A tal fine il campione viene scelto in modo tale
da garantire la casualità della selezione.
In mancanza di una specifica definizione di lotto, per tali prodotti è stata adottata la
definizione di lotto e le altre definizioni accessorie che seguono:
– Partita/lotto
quantità identificabile di integratore alimentare contenente probiotici, consegnata in
un’unica volta, per la quale è stata accertata, dall’addetto al controllo ufficiale, la presenza
di caratteristiche comuni, quali l’origine, la/le specie microbica/e, il tipo d’imballaggio, il
confezionatore, lo spedizioniere, la marcatura, la data di scadenza.
– Sottopartita
porzione di una grande partita designata per l’applicazione delle modalità di prelievo.
Ciascuna sottopartita deve essere fisicamente separata e identificabile.
– Campione globale
campione ottenuto riunendo tutte le aliquote prelevate dalla partita o dalla sottopartita.
– Aliquota
quantitativo di materiale prelevato in un solo punto della partita o della sottopartita (la/le
confezione/i), corrispondente a ciascuna delle parti equivalenti in cui deve essere
suddiviso il campione globale. Ogni aliquota corrispondente ad un quarto/quinto del
campione globale e deve essere sigillata con piombi.
– Unità campionaria
unità elementare del campione (la singola forma commerciale o di dosaggio di cui alla
definizione di integratore). Una o più unità campionarie vanno a costituire un’aliquota.
Fasi del campionamento

Prelievo
La quantità di materiale da prelevare (campione globale = numero di confezioni) deve essere
sufficiente per eseguire tutte le determinazioni microbiologiche previste.
Nel caso in cui oltre ai microrganismi probiotici sia prevista la ricerca dei patogeni, quali
Salmonella e Listeria, la quantità minima di materiale necessaria per lo svolgimento delle analisi è
di 60 grammi e/o mL (25 grammi e/o mL per la ricerca di Salmonella, grammi e/o mL per la
ricerca di Listeria, 10 grammi e/o mL almeno per la numerazione dei microrganismi probiotici = 1
aliquota), da moltiplicare per 4/5 in modo da ottenere il numero complessivo delle aliquote
previste dalla normativa vigente (15).
6
Dove effettuare il prelievo

Alla produzione il prelievo deve essere effettuato alla fine del confezionamento; al dettaglio,
invece, si raccomanda di effettuare il campionamento presso i grossisti.
In quest’ultimo caso, adottare le condizioni di prelievo che garantiscano una sufficiente
rappresentatività del lotto oggetto del campionamento.
Modalità di trasporto e tempi di consegna al laboratorio del campione

prelevato
Per garantire che il campione prelevato giunga al laboratorio di analisi nelle stesse
condizioni in cui si trovava al momento del prelievo, è necessario assicurare idonee condizioni
di trasporto, che rispettino le temperature di conservazione indicate nell’etichetta di ciascun
prodotto.
Il campione correttamente prelevato e trasportato deve giungere al laboratorio nel minor
tempo possibile.
7
PROTOCOLLO ANALITICO CONSIGLIATO
Il protocollo analitico illustrato nel presente documento è suddiviso in fasi sequenziali (Figura
1). Nella prima fase, le analisi molecolari vengono direttamente effettuate sul DNA totale estratto
dal campione, al fine di identificare i diversi gruppi tassonomici dichiarati in etichetta. Con la
seconda fase, propriamente microbiologica, viene verificata la vitalità e il numero presuntivo delle
specie microbiche mediante conta su terreni differenziali e selettivi. Nelle fasi successive le
colture vengono sottoposte a conferma dell’identità e del numero.
Le fasi del protocollo analitico, sono riportate in uno schema riassuntivo, per rendere più
agevole la visualizzazione dei principali passaggi da effettuare.
FASE I: Screening molecolare delle specie microbiche dichiarate in etichetta
Estrazione del DNA

Estrazione del DNA
totale dal prodotto
totale dal prodotto
Amplificazione Visualizzazione dell’amplificato

del DNA batterico mediante elettroforesi
FASE II: Numerazione presuntiva delle colonie tipiche relativa alle specie microbiche vive dichiarate in etichetta
Semina per spatolamento

Semina per spatolamento
su terreni differenziali e selettivi agarizzati
su terreni differenziali e selettivi agarizzati
Esame morfologico e microscopico

Esame morfologico e microscopico
delle colonie
delle colonie
Numerazione presuntiva Identificazione biochimica presuntiva

Numerazione presuntiva Identificazione biochimica presuntiva
delle colonie tipiche delle colonie tipiche
delle colonie tipiche delle colonie tipiche
FASE III: Conferma genetica delle specie vitali
Estrazione del
Estrazione del
DNA da coltura batterica
DNA da coltura batterica

FASE IV: Numerazione delle specie microbiche vitali
Numerazione definitiva differenziale Risultato finale

Numerazione definitiva differenziale Risultato finale
delle colonie tipiche
delle colonie tipiche
Figura 1. Schema riassuntivo delle principali fasi del protocollo analitico
8
SCREENING CON METODO MOLECOLARE DELLE

SPECIE INDICATE IN ETICHETTA MEDIANTE ESAME
DIRETTO DEL CAMPIONE
Introduzione
Il fatto che gli integratori alimentari vengano commercializzati utilizzando forme
tipicamente farmaceutiche e non substrati alimentari su cui i microrganismi una volta
moltiplicati possono essere distribuiti, impone l’adozione di accorgimenti tecnologici tesi a
conservare la vitalità delle specie utilizzate e la loro durabilità per un ampio periodo di tempo.
Varie procedure possono essere utilizzate a questo fine, per lo più riconducibili
all’essiccamento della coltura. Questo può comportare una riduzione della vitalità per effetto
di più o meno importanti lesioni cellulari variabili da genere a genere e addirittura da specie a
specie. In particolare nel caso di preparazioni con colture miste, vi è la necessità di stabilire se
nella materia prima, nel semilavorato o nel prodotto finito, una o più specie siano morte o se,
per un qualsiasi errore nella miscelazione delle colture, una o più specie siano riscontrabili
con i test di vitalità.
Il ricorso ai metodi molecolari appare, pertanto, una scelta obbligata; essi permettono,
infatti, di fugare ogni dubbio sulla reale presenza di tutte le specie previste, poiché il DNA
rimane essenzialmente stabile e non è influenzato dalle condizioni di coltura, né suscettibile,
almeno a breve termine, agli eventuali stress ambientali.
In particolare, i geni che codificano l’rRNA (RNA ribosomiale) (5S, 16S e 23S) sono tra i
più conservati nel genoma dei microrganismi, sono presenti in un elevato numero di copie,
sono ubiquitari ed essenziali per tutte le funzioni cellulari; oltre alle regioni conservate, le
sequenze dei geni per l’rRNA comprendono motivi altamente variabili, presenti unicamente in
certi gruppi tassonomici, che riflettono le distanze filogenetiche fra i microrganismi. Queste
caratteristiche rendono l’analisi dell’rRNA lo studio più utilizzato per l’identificazione
tassonomica dei microrganismi.
Il metodo molecolare adottato è stato quello dell’amplificazione dei geni codificanti
l’rRNA mediante PCR (Polymerase Chain Reaction). La scelta di primer (corti
oligonucleotidi complementari alla regione d’interesse), specifici per le zone polimorfiche
dell’rDNA, permette l’amplificazione genetica specificamente dei microrganismi che
posseggono quelle regioni, e conseguentemente il loro riconoscimento al grado tassonomico
desiderato (genere, specie, e talvolta fino a sottospecie). In alcuni casi sono stati selezionati
target diversi dall’rRNA, sulla base della specificità riportata in letteratura.
I primer specifici per l’identificazione delle specie batteriche (Tabella 1), sono stati
selezionati dalla letteratura scientifica disponibile. Per l’identificazione accurata di alcune
specie batteriche, sono stati utilizzate diverse coppie di primer. Solo nel caso di Bacillus
coagulans e di Lactobacillus kefiri, non essendo disponibili dati in letteratura, i primer sono
stati selezionati sulla base delle sequenze del 16S rDNA per B. coagulans e del gene per la
subunità α della RNA polymerase (rpoA) per Lactobacillus kefiri, presenti in banca dati.
9
Tabella 1. Primer utilizzati per l’identificazione di specie dei microrganismi probiotici
Gruppo Sigla e sequenza dei primer Target (bp)* Rif.

tassonomico bibl.
Bacillus Spo3: 5’-TCT TGC GGC TCA ACC GCA AGC GG-3’ 16S rDNA 720 /
coagulans Spo4: 5’-TGC AGG CGG GTT GCA GCC TGC-3’
a
Bifidobacterium Idb21F: 5’-TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCT-3’ 16S-23S IS 1018 (16)
bifidum Idbc1R: 5’-ATC CGA ACT GAG ACC GGT T-3’
Bifidobacterium BifidF: 5’-CTC CTG GAA ACG GGT GG-3’ 16S-23S ISa 563 (17)
spp BifidR: 5’-GGT GTT CTT CCC GAT ATC TAC A-3’
L. acidophilus b Acido: 5’-TGA ACC AAC AGA TTC ACT TC-3’ 16S rDNA 1000 (18)
Lac: 5’-TGA CGA CAG CCA TGC ACC A-3’
a
Idlc4F: 5’-AGGGTGAAGTCGTAACAAGTAGCC-3’ 16S-23S IS 606 (19)
Idl22R: 5’-AACTATCGCTTACGCTACCACTTTGC-3’
L. casei W1: 5’-TGC ACT GAG ATT CGA CTT AA-3’ 16S rDNA 295 (20)
Y2: 5’-CCC ACT GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3’
L. delbrueckii Ldel7: 5’-ACA GAT GGA TGG AGA GCA GA-3’ 16S rDNA 450 (21)
subsp. bulgaricus Lac2: 5’-CCT CTT CGC TCG CCG CTA CT-3’
c (22)
L. delbrueckii Lb1: 5’-AAA AAT GAA GTT GTT TAA AGT AGG TA-3’ pepIP 1600
subsp. lactis Llb1: 5’-AAG TCT GTC CTC TGG CTG G-3’
L. fermentum Ferm1: 5’-GTT GTT CGC ATG AAC AAC GCT TAA-3’ 16S rDNA 889 (23)
Lowlac: 5’-CGA CGA CCA TGA ACC ACC TGT-3’
L. helveticus Tri f: 5’-TCT TAT TAC GCA ATG GAC CAA-3’ HtrA 918 (24)
Tri r: 5’-AAT ACC GTT CTT GAG GTT AGA-3’
L. kefiri LK1: 5’CAA CAA TCA AAG GGG TTG TTG-3’ RpoA 500 (25)
Lk2: 5’TCA CTA GGA GTA ATT GAA CCA-3’
L. paracasei W2: 5’-CCGAGATTCAACATGG-3’ 16S rDNA 295 (20)
L. plantarum Plant: 5’-ATC ATG ATT TAC ATT TGA GTG-3’ 16S rDNA 996 (23)
L. reuteri Reut1: 5’-TGA ATT GAC GAT GGA TCA CCA GTG-3’ 16S rDNA 1000 (23)
L. rhamnosus W3: 5’-TGC ATC TTG ATT TAA TTT TG-3’ 16S rDNA 295 (20)
L. salivarius Sal1: 5’-ATT CAC TCG TAA GAA GT-3’ 16S rDNA 993 (23)
Lactococcus lactis G1: 5’-GAA GTC GTA ACA AGG-3’ 16S-23S ISa 380 (26)
L1: 5’-CAA GGC ATC CAC CGT-3’
Propionibacterium PffI: 5’-GTA CTG CTG GTG CCC TG-3’ 16S rDNA 241 (27)
freudenreichii PrfII: 5’TAG CTT GCT ACA CAA AAC TC-3’
subsp. shermanii PfrI: 5’AGG AGC CTT TTC GCC ATC-3’ 16S-23S IS
a
346
PrfII: 5’TAG CTT GCT ACA CAA AAC TC-3’
S. thermophilus ThI: 5’-ACG GAA TGT ACT TGA GTT TC-3’ 16S-23S ISa 600 (28)
ThII: 5’-TTT GGC CTT TCG ACC TAA C-3’
* base pair
(a) Intergenic Sequence
(b) sensu strictu
(c) Gene per la prolina-imino peptidasi
10
Estrazione diretta del DNA totale dal prodotto

Per procedere all’estrazione del DNA totale dal campione, possono essere utilizzati vari kit
commerciali (quali ad esempio QIAamp DNA stool Mini Kit - Qiagen; Nucleospin Tissue kit -
Macherey Nagel o equivalenti), mediante i quali il DNA, rilasciato dalle cellule che subiscono
la lisi della parete e della membrana, viene estratto attraverso la dissociazione dei complessi
DNA-proteine e successivamente purificato per separazione dalle macromolecole presenti
(proteine, polisaccaridi, ecc.). Il DNA estratto secondo le istruzioni riportate nel kit, viene
sottoposto ad amplificazione mediante PCR.
Amplificazione del DNA batterico mediante PCR

La PCR è una metodica attraverso cui, una sequenza di acido nucleico può essere amplificata
esponenzialmente in vitro.
La reazione (Figura 2) consiste nell’alternanza di tre fasi, che vengono ripetute ciclicamente
per un numero determinato di volte: denaturazione del DNA, attraverso la quale il templato
prescelto viene separato nei singoli filamenti; annealing o ibridazione dei primer
oligonucleotidici che fungono da inneschi capaci di ibridarsi con le rispettive sequenze
complementari presenti sui due filamenti; polimerizzazione o estensione del filamento stampo,
catalizzata dall’enzima Taq-polimerasi che provoca l’allungamento degli inneschi aggiungendo
nucleotidi alle catene.
La reazione viene completata da una fase di estensione finale, allo scopo di ottenere prodotti
completi e consentire quindi una totale polimerizzazione di tutte le molecole iniziate.
Figura 2. Un ciclo di PCR
Metodica di preparazione della miscela di reazione

Prelevare 1-5µL di DNA totale batterico estratto e aggiungerlo alla miscela di reazione di
amplificazione (volume finale 50 μL), composta come specificato nelle schede di ogni singolo
microrganismo. Prima di aggiungere la Taq polymerasi, pretrattare la miscela a 99 °C per 10
min (tale trattamento può essere effettuato direttamente nel Thermal Cycler).
11
Dopo raffreddamento della miscela, aggiungere la Taq polimerasi e procedere con la

reazione di amplificazione, che consiste di un numero di cicli, tempi e temperature ottimali
specifici per ogni microrganismo (Tabella 2).
Tabella 2. Condizioni di PCR ottimali per ogni singolo microrganismo
Specie Primer Ciclo Amplificazione Cicli Ciclo

iniziale totali finale
Denaturazione Annealing Estensione
B. coagulans Spo3+Spo4 95 °C 95 °C 65 °C 72 °C 30 72 °C
x5min x1min x1min x1min x10min
B. bifidum Idb21F+Idbc1R 96 °C 94 °C 63 °C 72 °C 35 72 °C
x2min x30s x40s x30s x5min
Bifidobacterium BibiF1+BibiF2 96 °C 94 °C 63 °C 72 °C 35 72 °C
spp x2min x30s x40s x30s x5min
L. acidophilus Acido+Lac 95 °C 95 °C 55 °C 72 °C 30 72 °C
L. acidophilus Idlc4F+Idl22R 94 °C 94 °C 51 °C 68 °C 35 68 °C
L. casei W1+Y2 94 °C 50 °C 72 °C 94 °C 45 72 °C
x3min x45s x1min x45s x5min
L. delbruekii Ldel7+Lac2 95 °C 94 °C 58 °C 72 °C 35 72 °C
subsp. bulgaricus x3min x30s x1min x1min x10min
L. delbruekii Lb1+Llb1 94 °C 94 °C 58 °C 72 °C 35 72 °C
subsp. lactis x2min x45s x30s x30s x10min
L. helveticus Tri f+Tri r 94 °C 94 °C 50 °C 72 °C 35 72 °C
x2min x45s x45s x1min x7min
L. kefiri LK1+Lk2 95 °C 95 °C 50 °C 72 °C 35 72 °C
L. paracasei W2+Y2 94 °C 50 °C 72 °C 94 °C 45 72 °C
L. plantarum Plant+Lowlac 95 °C 95 °C 65 °C 72 °C 45 72 °C
L. reuteri Reut1+Lowlac 95 °C 95 °C 65 °C 72 °C 45 72 °C
L. rhamnosus W3+Y2 94 °C 50 °C 72 °C 94 °C 45 72 °C
L. salivarius Sal1+Lowlac 95 °C 95 °C 65 °C 72 °C 45 72 °C
Lc. lactis G1+L1 - 94 °C 55 °C 72 °C 25 72 °C
x1min x2min x3min x10min
Propionibacterium PffI+PrfII 94 °C 94 °C 50 °C 72 °C 35 72 °C
freudenreichii PfrI+PrfII x2min x30s x30s x30s x10min
subsp. shermanii
S. thermophilus ThI+ThII 92 °C 95 °C 55 °C 72 °C 30 72 °C
12
Per permettere di valutare la specificità della metodica, nell’allestimento di una reazione di

PCR è necessario, insieme ai campioni da testare, allestire sempre un controllo positivo (DNA
estratto dal ceppo di riferimento rappresentativo della specie in esame) (Tabella 3) e un
controllo negativo (DNA estratto da un ceppo diverso dalla specie in esame), al fine di
evidenziare la presenza di falsi positivi o falsi negativi 1 .
Tabella 3. Ceppi di riferimento utilizzati *

2
Specie Numero ATCC/DSM/NCDO
Bacillus coagulans ATCC 7050
Bifidobacterium bifidum ATCC 35914
Lactobacillus acidophilus ATCC 314
Lactobacillus casei ATCC 393
Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ATCC 11842
Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis ATCC 7830
Lactobacillus helveticus ATCC 15009
Lactobacillus kefiri ATCC 8007
Lactobacillus paracasei NCDO 151 T
Lactobacillus plantarum ATCC 39542
Lactobacillus reuteri DSMZ 20016 T
Lactobacillus rhamnosus ATCC 53103
Lactobacillus salivarius subsp. salivarius ATCC 11741
Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 11454
Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii ATCC 9614
Streptococcus salivarius ATCC 13419
Streptococcus thermophilus ATCC 19258
* Possono essere ugualmente utilizzati ceppi appartenenti a collezioni internazionali diversi da quelli riportati in questa tabella.
Visualizzazione dell’amplificato mediante elettroforesi

su gel d’agarosio
L’elettroforesi su gel d’agarosio permette la valutazione degli amplificati ottenuti dalla
reazione di amplificazione, attraverso la migrazione delle molecole di DNA in funzione del peso
molecolare e sotto l’influenza di un campo elettrico. La presenza del bromuro d’etidio 3
nell’agarosio, permette la rilevazione dei campioni mediante lettura con un transilluminatore
UV. In Tabella 4 vengono riportati i materiali necessari per l’allestimento di un’elettroforesi.
Tabella 4. Materiali necessari per la preparazione dell’elettroforesi e relativa concentrazione
Materiali Concentrazione
Agarosio per biologia molecolare --
Tampone per elettroforesi (TAE o altro equivalente) 10X
Soluzione colorante (Blu di bromofenolo o equivalente) 6X
Bromuro d’etidio 10 mg/mL
Marker molecolare 100 bp --
1
Si raccomanda di mantenere sempre in ghiaccio i campioni da analizzare e tutti i reagenti della reazione.
2
ATCC = American Type Culture Collection.
DSMZ = Deutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH.
NCDO = National Collection of Dairy Organisms.
3
Colorante fluorescente intercalante tra le basi del DNA, che viene stimolato utilizzando luce ultravioletta a una
lunghezza d'onda di 300nm.
13
Preparazione del gel d’agarosio

Preparare 1L di tampone TAE 1X dalla soluzione stock 10X (2M Tris-Acetate, 5mM EDTA-
Na2 pH8) da utilizzare sia per la corsa elettroforetica che per la preparazione dell’agarosio
all’1% (1g di agarosio in 100 mL di TAE 1X).
Dopo aver sciolto l’agarosio e fatto raffreddare a 50 °C in bagnomaria, aggiungere 6μL di
bromuro d’etidio e versarlo nell’apposito supporto già predisposto con il pettine per creare i
pozzetti; lasciare solidificare per 30-40 min. Dopo tale periodo e dopo aver estratto il pettine, il
gel è pronto per essere inserito nella camera elettroforetica, per il caricamento dei campioni.
I campioni vengono preparati aggiungendo un colorante, il blu di bromo fenolo, che permette
di seguire meglio la migrazione del campione nel gel e sottoposti alla corsa elettroforetica per 1-
1,5 ore applicando una differenza di potenziale pari a 70-80V.
Visualizzare i risultati esponendo il gel ai raggi UV.
Lettura dei risultati

Per considerare positivo il riscontro dell’analisi per uno specifico microrganismo, devono
essere soddisfatte le seguenti condizioni:
1. in corrispondenza del campione in esame è presente una banda delle dimensioni attese,
paragonandola per dimensione a quella di un marcatore di peso molecolare noto;
2. la banda di interesse è allineata a quella del controllo positivo;
3. la banda corrispondente al controllo negativo è assente.
Per considerare negativo il riscontro dell’analisi per uno specifico microrganismo, devono
essere soddisfatte le seguenti condizioni:
1. in corrispondenza del campione in esame è presente una banda di dimensioni diverse da
quelle attese, o non è presente alcuna banda di amplificazione;
2. la banda attesa relativa al controllo positivo è presente;
3. la banda relativa al controllo negativo è assente.
Per considerare non conforme il riscontro dell’analisi per uno specifico microrganismo, si
deve riscontrare una delle seguenti condizioni:
1. la banda relativa al controllo positivo è assente;
2. la banda relativa al controllo negativo è presente.
14
Metodi per l’identificazione genetica

di microrganismi probiotici
15
16
1. BACILLUS COAGULANS
1.1. Oggetto e campo d’applicazione
Metodo per l’identificazione genetica di Bacillus coagulans mediante amplificazione dei

geni codificanti l’rRNA (tecnica della PCR).
1.2. Principio del metodo
Amplificazione genica di sequenze del 16S rRNA, attraverso l’utilizzo di primer specifici
per il riconoscimento di specie e/o sottospecie.
1.3. Preparazione del DNA
Per l’estrazione del DNA, vedere quanto riportato al paragrafo “Estrazione diretta del
DNA totale dal prodotto” a pagina 11.
1.4. Allestimento ed esecuzione della reazione di PCR
Comportarsi secondo quanto descritto al paragrafo “Metodica di preparazione della

miscela di reazione” a pagina 11 adottando le seguenti condizioni specifiche:
Reagenti di PCR Concentrazione Volume (μL)

H2O distillata sterile ---- 35,75
Buffer 10X 1X 5
MgCl2 25 mM 1,5 mM 3
dNTPs 2,5 mM 0,2 mM 4
Primer senso 100 μM 0,5μM 0,5
Primer antisenso 100 μM 0,5μM 0,5
DNA ---- 1
Taq DNA polymerase 5 U/μL 1,25U 0,25
Volume finale ---- 50
Sigla e sequenza dei primer Target Dim. prod. (bp)
Spo3: 5’ TCT TGC GGC TCA ACC GCA AGC GG 3’ 16S rRNA 720
Spo4: 5’ TGC AGG CGG GTT GCA GCC TGC 3’
Condizioni di PCR
Denaturazione 95 °C x 5’
Amplificazione 95 °C x 1’
Annealing 65 °C x 1’ (30 cicli)
Estensione 72 °C x 1’
Estensione finale 72 °C x 10’
1.5. Lettura dei risultati
Riferirsi a quanto riportato nell’ultimo paragrafo di pagina 14.
17
2. BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM
Metodo per l’identificazione genetica di Bifidobacterium bifidum mediante

amplificazione dei geni codificanti l’rRNA (tecnica della PCR).
Amplificazione genica di sequenze del 16S rRNA IS, attraverso l’utilizzo di primer
specifici per il riconoscimento di specie e/o sottospecie.


Buffer 10X 1X 5
Primer senso 100 μM 1μM 0,5
Primer antisenso 100 μM 1μM 0,5
DNA ---- 1
Idb21F: 5’ TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCT 3’ 16S rRNA IS 1018

Idbc1R: 5’ ATC CGA ACT GAG ACC GGT T 3’
Condizioni di PCR
Amplificazione 94 °C x 30’’
Annealing 63 °C x 40’’ (35 cicli)
Estensione 72 °C x 30’’
18
3. BIFIDOBACTERIUM SPP
Metodo per l’identificazione genetica di Bifidobacterium spp mediante amplificazione dei



Buffer 10X 1X 5
DNA ---- 1
BibiF1: 5’ CCA CAT GAT CGC ATG TGA TTG 3’ 16S rRNA IS 278
BibiF2: 5’ CCG AAG GCT TGC TCC CAA A 3’
Condizioni di PCR
19
4. LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS (primer Acido/Lac)
Metodo per l’identificazione genetica di Lattobacillus acidophilus mediante


Reagenti di PCR Concentrazione finale Volume (μL)

Buffer 10X 1X 5
DNA ---- 1

Acido: 5’-TGA ACC AAC AGA TTC ACT TC-3’ 16S rRNA 1000
Lac: 5’-TGA CGA CAG CCA TGC ACC A-3’
Condizioni di PCR con primer acido e lac

Denaturazione 95 °C 5’
Amplificazione 95 °C 1’
Annealing 55 °C 1’ (30 cicli)
Estensione 72 °C 1’
Estensione finale 72 °C 7’
20
5. LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS (primer Idlc4F/Idl22R)
Metodo per l’identificazione genetica di Lattobacillus acidophilus mediante

5.3. Estrazione del DNA


Buffer 10X 1X 5
MgCl2 25mM 1,5 mM 3
dNTPs 2,5mM 0,2 mM 4
Primer antisenso μM 0,5μM 0,5
DNA ---- 1

Idlc4F: 5’-AGGGTGAAGTCGTAACAAGTAGCC- 3’ 16S-23S IS 606
Idl22R: 5’-AACTATCGCTTACGCTACCACTTTGC- 3’
Condizioni di PCR con primer Idlc4f + Idl22r

21
6. LACTOBACILLUS CASEI
Metodo per l’identificazione genetica di Lactobacillus casei mediante amplificazione dei



Buffer 10X 1X 5
Primer antisense 100 μM 0,5μM 0,5
DNA ---- 1
W1: 5’-TGC ACT GAG ATT CGA CTT AA-3’ 16S rRNA 295
Condizioni di PCR
22
7. LACTOBACILLUS DELBRUECKII SUBSP. BULGARICUS
Metodo per l’identificazione genetica di Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

mediante amplificazione dei geni codificanti l’rRNA (tecnica della PCR).


Buffer 10X 1X 5
DNA ---- 1
Ldel7: 5’ ACA GAT GGA TGG AGA GCA GA 3’’ 16S rRNA 450
Lac2: 5’ CCT CTT CGC TCG CCG CTA CT 3’
Condizioni di PCR
23
8. LACTOBACILLUS DELBRUECKII SUBSP. LACTIS
Metodo per l’identificazione genetica di Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis mediante

Amplificazione genica di sequenze del gene per la prolina-iminopeptidasi (pepIP),

attraverso l’utilizzo di primer specifici per il riconoscimento di specie e/o sottospecie.

Buffer 10X 1X 5
DNA ---- 1
Lb1: 5’ AAA AAT GAA GTT GTT TAA AGT AGG TA 3’ pepIP 1600
Llb1: 5’ AAG TCT GTC CTC TGG CTG G 3’
Condizioni di PCR
24
9. LACTOBACILLUS HELVETICUS
Metodo per l’identificazione genetica di Lactobacillus helveticus mediante amplificazione

dei geni codificanti l’rRNA (tecnica della PCR).
Amplificazione genica di sequenze del gene per la serina-proteasi trypsin-like (htrA),

attraverso l’utilizzo di primer specifici per il riconoscimento di specie e/o sottospecie.


Buffer 10X 1 X 5
DNA ---- 1
Tri f: 5’ TCT TAT TAC GCA ATG GAC CAA 3’ htrA 918
Tri r: 5’ AAT ACC GTT CTT GAG GTT AGA 3’
Condizioni di PCR
25
10. LACTOBACILLUS KEFIRI
Metodo per l’identificazione genetica di Lactobacillus kefiri mediante amplificazione dei

Amplificazione genica di sequenze del gene per la subunità α della RNA polymerase
(rpoA), attraverso l’utilizzo di primer specifici per il riconoscimento di specie e/o
sottospecie.


Buffer 10X 1X 5
DNA ---- 1

LK1: 5’CAA CAA TCA AAG GGG TTG TTG 3’ rpoA 500
Lk2: 5’TCA CTA GGA GTA ATT GAA CCA 3’
Condizioni di PCR
26
11. LACTOBACILLUS PARACASEI
Metodo per l’identificazione genetica di Lactobacillus paracasei mediante amplificazione



Buffer 10X 1X 5
DNA ---- 1

W2: 5’-CCGAGATTCAACATGG-3’ 16S rRNA 295
Condizioni di PCR
27
12. LACTOBACILLUS PLANTARUM
Metodo per l’identificazione genetica di Lactobacillus plantarum mediante



Buffer 10X 1X 5
DNA ---- 1
Plant: 5’ ATC ATG ATT TAC ATT TGA GTG 3’ 16S rRNA 996
Lowlac: 5’ CGA CGA CCA TGA ACC ACC TGT 3’
Condizioni di PCR
28
13. LACTOBACILLUS REUTERI
Metodo per l’identificazione genetica di Lactobacillus reuteri mediante amplificazione



Buffer 10X 1X 5
DNA ---- 1
Reut1: 5’ TGA ATT GAC GAT GGA TCA CCA GTG 3’ 16S rRNA 1000
Condizioni di PCR
29
14. LACTOBACILLUS RHAMNOSUS
Metodo per l’identificazione genetica di Lactobacillus rhamnosus mediante



Buffer 10X 1X 5
DNA ---- 1
W3: 5’-TGC ATC TTG ATT TAA TTT TG-3’ 16S rRNA 295
Condizioni di PCR
30
15. LACTOBACILLUS SALIVARIUS
Metodo per l’identificazione genetica di Lactobacillus salivarius mediante amplificazione



Buffer 10X 1X 5
DNA ---- 1
Sal1: 5’ ATT CAC TCG TAA GAA GT 3’ 16S rRNA 993

Condizioni di PCR
31
16. LACTOCOCCUS LACTIS
Metodo per l’identificazione genetica di Lactococcus lactis mediante amplificazione dei

Amplificazione genica di sequenze del 16S-23S rRNA intergenic spacer, attraverso

l’utilizzo di primer specifici per il riconoscimento di specie e/o sottospecie.


Buffer 10X 1X 5
DNA ---- 1
G1: 5’ GAA GTC GTA ACA AGG 3’ 16S-23S IS 380

L1: 5’ CAA GGC ATC CAC CGT 3’
Condizioni di PCR
32
17. PROPIONIBACTERIUM FREUDENREICHII

SUBSP. SHERMANII
Metodo per l’identificazione genetica di Propionibacterium freudenreichii subsp.
shermanii mediante amplificazione dei geni codificanti l’rRNA (tecnica della PCR).

Amplificazione genica di sequenze del 16S-23S rRNA IS attraverso l’utilizzo di primer


Buffer 10X 1X 5
DNA ---- 1
Sigla e sequenza dei primer 4 Target Dim. prod. (bp)

PffI: 5’ GTA CTG CTG GTG CCC TG 3’ 16S-23S rRNA IS 241
PrfII: 5’TAG CTT GCT ACA CAA AAC TC 3’
PfrI: 5’AGG AGC CTT TTC GCC ATC 3’ 16S-23S IS 346
PrfII: 5’TAG CTT GCT ACA CAA AAC TC 3’
Condizioni di PCR

4
I primer PfrI e PfrII non distinguono le due sottospecie frederenchi e shermani. La coppia di primer PffI e PfrII riconoscono la
sottospecie frederenchi. Un prodotto positivo con i primer PfrI e PfrII e un prodotto negativo con i primer PffI e PfrII
identificano la sottospecie shermani.
33
18. STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS
Metodo per l’identificazione genetica di Streptococcus thermophilus mediante

Amplificazione genica di sequenze del 16S-23S rRNA intergenic spacer, attraverso

l’utilizzo di primer specifici per il riconoscimento di specie e/o sottospecie.


Buffer 10X 1X 5
DNA ---- 1
ThI: 5’ ACG GAA TGT ACT TGA GTT TC 3’ 16S-23S IS 600

ThII: 5’ TTT GGC CTT TCG ACC TAA C 3’
Condizioni di PCR
34
NUMERAZIONE DIFFERENZIALE PRESUNTIVA

DELLE SPECIE MICROBICHE PROBIOTICHE VIVE
DICHIARATE IN ETICHETTA
Introduzione
Per valutare il numero dei microrganismi vivi relativo alle specie microbiche dichiarate in
etichetta, pur consapevoli dell’esistenza di una diversa vitalità tra i vari componenti di una
popolazione microbica, si è ritenuto opportuno dare la preferenza a metodi basati sul conteggio
delle colonie in un terreno agarizzato, dopo opportuna rivivificazione e incubazione, partendo dal
presupposto che ogni cellula viva dia luogo ad una popolazione (colonia).
A tal fine vengono di seguito descritte metodiche di numerazione standardizzate e/o specifiche
per ciascun genere dei seguenti microrganismi Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus,
Lactococcus, Bacillus, Propionibacterium e strategie di coltivazione finalizzate alla numerazione
differenziale di specie diverse nell’ambito non solo di una popolazione mista di generi diversi, ma
anche di specie diverse appartenenti allo stesso genere. Più precisamente, si propone l’utilizzo di
particolari accorgimenti che sfruttano le caratteristiche fisiologiche proprie di una data specie
batterica, quali la capacità di crescere a temperature diverse, la capacità di metabolizzare
particolari substrati, la capacità di produrre colonie facilmente distinguibili su determinati terreni
selettivi per la presenza di sostanze come gli antibiotici (29).
La composizione e le modalità di preparazione dei terreni selettivi per ciascun microrganismo
considerato, sono riportati nell’appendice 1.
È opportuno effettuare la ricerca dei microrganismi patogeni Salmonella spp (30) e Listeria
monocytogenes (31, 32), in quanto inseriti tra i criteri microbiologici per la valutazione della
sicurezza degli alimenti (33).
Sia i metodi microbiologici per la ricerca e numerazione di microrganismi probiotici, che quelli
per la ricerca dei microrganismi patogeni sono stati opportunamente verificati e validati secondo
quanto previsto dalla norma ISO 17025 (12).
Preparazione della diluizione iniziale e rivivificazione

Come già ricordato, gli integratori alimentari a base di probiotici generalmente si presentano
sotto le seguenti forme commerciali: capsule, compresse, bustine, tavolette masticabili, flaconcini.
Nel caso dei flaconcini con tappo dosatore prelevare solo il contenuto del tappo dosatore; nel
caso delle capsule prelevare solo il contenuto dell’involucro costituente la capsula stessa. Nel caso
delle compresse ridurre in polvere mediante mortaio e pestello sterili.
Sospendere la porzione di unità campionaria da sottoporre ad analisi e addizionarla
dell’opportuna quantità di diluente in modo da ottenere la diluizione 1:10 (sospensione iniziale),
lasciare riposare a temperatura ambiente per 45’ (34) per favorire la rivivificazione e allestire le
diluizioni decimali successive.
Al fine di evitare qualunque influenza negativa sui batteri anaerobi stretti, portare ad
ebollizione al momento dell’analisi il diluente e mantenerlo in questo stato per almeno 10 min;
lasciar raffreddare prima del suo utilizzo e impiegare nel più breve tempo possibile, possibilmente
in condizione di anaerobiosi.
Procedere alla semina nei terreni selettivi idonei, di seguito specificati per ogni microrganismo
da ricercare.
35
Procedura di conteggio mediante tecnica della semina

in superficie (spreading-spatula method)
Si suggerisce di utilizzare la tecnica della semina in superficie in quanto risulteranno
facilitate l’osservazione della morfologia delle colonie e il loro prelievo per le successive fasi di
identificazione.
Trasferire sterilmente 0,1mL della sospensione iniziale sulla superficie dei terreni selettivi,
solidificate in piastre di Petri. Ripetere l’operazione con ogni diluizione decimale. Mediante
l’uso di spatole sterili distribuire uniformemente l’inoculo sulla superficie dell’agar, evitando di
toccare i bordi della piastra.
Lasciare le piastre a temperatura ambiente per circa 15 minuti per permettere all’inoculo di
assorbirsi e incubarle per il tempo, la temperatura e le concentrazione di ossigeno specifiche per
il microrganismo considerato.
Per le preparazioni contenenti anaerobi stretti eseguire tutte le operazioni analitiche sotto una
cappa per anaerobiosi.
Numero di piastre di Petri per ogni diluizione

Nel caso dei laboratori che operano in qualità, secondo i principi della norma ISO 17025
(12), seminare una singola piastra di Petri per ogni diluizione. Nel caso di un laboratorio che
non opera in qualità utilizzare due piastre di Petri per diluizione (35).
Numerazione delle colonie

In presenza di una popolazione mista (indicazione in etichetta di più specie), la conta delle
colonie va effettuata sia prima che dopo l’identificazione della specie (test di conferma).
Per la numerazione presuntiva considerare separatamente tutte le colonie con caratteristiche
morfologiche simili.
Numerazione delle colonie prima dell’identificazione

Procedere al calcolo del numero (N) di microrganismi presenti nell’aliquota analizzata,
calcolando la media ponderata tra le due diluizioni successive prese in considerazione, in base
alla seguente formula (35):
ΣC
___________
N=
V x 1,1 x d
Dove:
ΣC è la somma delle colonie ottenute dalla conta delle piastre relative alle due diluizioni
successive prese in considerazione, e di cui almeno una contiene 10 colonie;
V è il volume, espresso in millilitri, dell’inoculo seminato in ogni piastra;
d è la diluizione corrispondente alla prima diluizione considerata.
36
Esempio:
Prima diluizione considerata: 10-2 ,

numero di colonie contate alla diluizione 10-2 = 116
Seconda diluizione considerata: 10-3
Numero di colonie contate alla diluizione 10-3 = 24
Volume dell’inoculo: 0,1mL
Prima diluizione considerata: 10-2
Calcolo:
ΣC 116 + 24 140
_____________ _________________ __________
N= = = = 127272,7
V x 1,1 x d 0,1 x 1,1 x 10-2 0,0011
Arrotondando il risultato, il numero di microrganismi sarà 130000 o 1,3 x 105 per grammo o
millilitro di prodotto.
Espressione dei risultati nel caso di assenza di crescita batterica

In caso di assenza di crescita batterica riportare il risultato come segue: meno di 1/d
microrganismi per millilitro o per grammo di prodotto analizzato, dove d è il fattore di
diluizione della sospensione iniziale o della prima diluizione inoculata.
37
38
Metodi per la numerazione

dei microrganismi probiotici
39
40
19. GENERE BACILLUS
19.1. Oggetto e campo di applicazione
Metodo per la numerazione presuntiva di Bacilli sporigeni mediante conteggio delle

colonie dopo incubazione in aerobiosi a 37 °C su terreno solido (36).

Semina per spatolamento sulla superficie di un terreno solido [Triptone Soya Agar (TSA)]
di 0,1mL del campione in esame (o della sospensione iniziale) e delle successive
diluizioni decimali. Incubazione delle piastre a 37 °C per 24h.
19.3. Terreni di coltura e diluenti

Maximum recovery diluent (MRD)
Triptone Soya Agar (TSA)
19.4. Procedimento
Prelevare asetticamente un’opportuna quantità del campione da esaminare e diluirla in
rapporto 1:10 (sospensione iniziale) in MRD. Omogeneizzare opportunamente.
Trasferire asetticamente 5mL della sospensione così ottenuta in una provetta sterile e
riscaldare in bagno termostatato a 80 °C per 10 minuti. Raffreddare ed eseguire diluizioni
decimali fino a quella ritenuta utile per un adeguato conteggio.
Con una pipetta sterile, trasferire in ogni piastra di TSA 0,1mL della sospensione iniziale
(diluizione 1:10) o 0,1mL del campione in esame, se liquido. Ripetere la procedura per le
diluizioni successive. Utilizzando una spatola sterile, (una per ogni diluizione), distribuire
con attenzione l’inoculo sulla superficie dell’agar il più rapidamente possibile, cercando
di non toccare i bordi della piastra.
19.5. Incubazione
Incubare le piastre in aerobiosi a 37 °C per 24h.
19.6. Conta presuntiva delle colonie

Procedere al conteggio di tutte le diverse tipologie di colonie sviluppatesi come riportato
al paragrafo “Numerazione delle colonie prima dell’identificazione” a pagina 36.
Annotare i risultati.
19.6.1. Identificazione delle colonie presuntive

Subcolturare nello stesso terreno agarizzato utilizzato per il conteggio tutte le colonie
selezionate. Effettuare in doppio ogni subcoltura in modo tale da poterne congelare una a
-80 °C in microbank, e utilizzare l’altra per le ulteriori determinazioni analitiche.
a) esame microscopico previa colorazione del Gram.
b) identificazione fenotipica mediante la determinazione del profilo biochimico,
utilizzando sistemi miniaturizzati di identificazione: API 50 CHB (Biomerieux o
equivalenti), seguendo le istruzioni del produttore.
41
20. GENERE BIFIDOBACTERIUM

Metodo per la numerazione e l’identificazione presuntiva di microrganismi appartenenti al

genere Bifidobacterium mediante conteggio delle colonie dopo incubazione in anaerobiosi a
37 °C su terreno solido (37).

Semina per spatolamento sulla superficie di un terreno solido selettivo della sospensione
iniziale (o di 0,1mL del campione in esame se liquido) e delle successive diluizioni decimali.
Incubazione delle piastre a 37 °C per 3gg in anaerobiosi.

HHD agar
MRS agar + 0,05% L-cisteina HCl (29)
20.4. Procedimento
Eseguire ulteriori diluizioni decimali fino a quella ritenuta utile per un adeguato conteggio.
Con una pipetta sterile, trasferire in ogni piastra di HHD agar[ e/o MRS agar + 0,05% L-
cisteina HCl] 0,1mL della sospensione iniziale (diluizione 1:10) o 0,1mL del campione in
esame, se liquido. Ripetere la procedura per le diluizioni successive. Utilizzando una spatola
sterile, (una per ogni diluizione), distribuire con attenzione l’inoculo sulla superficie dell’agar
il più rapidamente possibile, cercando di non toccare i bordi della piastra.
20.5. Incubazione
Incubare le piastre in anaerobiosi a 37 °C per 48-72h.

Procedere al conteggio di tutte le diverse tipologie di colonie sviluppatesi come riportato al
paragrafo “Numerazione delle colonie prima dell’identificazione” a pagina 36. In particolare
su HHD agar procedere al conteggio delle colonie tipiche di bifidobatteri che appaiono
bianche trasparenti come piccole gocce d’acqua (Bianchi Salvadori, comunicazione
personale). Annotare i risultati.
selezionate. Effettuare in doppio ogni subcoltura in modo tale da poterne congelare una a -80
°C in microbank, e utilizzare l’altra per le ulteriori determinazioni analitiche.
Procedere come segue:
a) esame microscopico previa colorazione del Gram
utilizzando sistemi miniaturizzati di identificazione: API rapid ID 32A (Biomerieux o
42
21. GENERE LACTOBACILLUS
Metodo per la numerazione presuntiva di microrganismi vivi appartenenti al genere

Lactobacillus mediante conteggio delle colonie dopo incubazione in anaerobiosi 37 °C su
terreno solido (38-40).
Semina per spatolamento sulla superficie di un terreno solido selettivo (MRS agar) di
0,1mL della sospensione iniziale e delle successive diluizioni decimali. Incubazione delle
piastre a 37 °C per 3gg.
– Maximum recovery diluent (MRD)

– MRS agar acidificato
Tenere presente che non tutti i lattobacilli crescono su MRS agar acidificato e alcuni
crescono lentamente, in questi casi è opportuno utilizzare l’MRS agar non acidificato.
21.4. Procedimento

rapporto 1:10 (sospensione iniziale) in MRD. Omogeneizzare opportunamente in
stomacher .
Eseguire ulteriori diluizioni decimali con lo stesso diluente fino a quella ritenuta utile per
un adeguato conteggio. Trasferire sterilmente in ogni piastra di MRS agar 0,1mL della
sospensione iniziale (diluizione 1:10) o 0,1mL del campione in esame, se liquido.
Ripetere la procedura per le diluizioni decimali successive. Utilizzando una spatola
sterile, (una per ogni diluizione), distribuire con attenzione l’inoculo sulla superficie
dell’agar il più rapidamente possibile, cercando di non toccare i bordi della piastra.
21.5. Incubazione
Incubare a 37 °C in anaerobiosi per 72 ore.

Nel caso in cui in uno stesso campione siano presenti sia Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus che Lactobacillus acidophilus, è consigliabile incubare in anaerobiosi a 45 °C
il primo, e in aerobiosi a 37 °C il secondo (41).

43

utilizzando sistemi miniaturizzati di identificazione: API 50 CHL (Biomerieux o
21.7. Colture miste
Per i prodotti contenenti più specie appartenenti al genere Lactobacillus è necessario

utilizzare particolari strategie colturali per renderne più agevole la differenzazione. In questo
caso è opportuno affiancare alla numerazione presuntiva sopra descritta, quella ottenuta
sfruttando le caratteristiche proprie di una data specie batterica, quali, ad esempio, la capacità di
crescere a temperature diverse da quella ottimale; la capacità di metabolizzare particolari
substrati, la capacità di produrre colonie facilmente distinguibili, sul terreno colturale di base
modificato con l’aggiunta di specifiche sostanze, o su terreni selettivi (Tabella 6). In particolare,
si può utilizzare:
– MRS agar con l’aggiunta di vancomicina per selezionare la crescita dei lattobacilli etero
fermentanti. (2ml di una soluzione contenente 0,05g di vancomicina /100ml aggiunti ad
1litro di terreno; concentrazione finale: 1mg/litro) (29);
– MRS agar con l’aggiunta di L-cisteina/HCl (concentrazione finale: 0,05%) e di blu di
bromo fenolo (concentrazione finale: 0,002%) per ottenere colonie facilmente
distinguibili per morfologia, taglia e colore (42);
– HHD agar per differenziare i lattobacilli omofermentanti (il glucosio è fermentato
esclusivamente in acido lattico) da quelli eterofermentanti (il glucosio è fermentato in
acido lattico, CO2, etanolo e/o acido acetico) (37, 43).
44
Tabella 6. Condizioni di coltura differenziali di specie appartenenti al genere Lactobacillus
Microrganismi* MRS agar + MRS agar + blu di MRS agar MRS agar MRS agar MRS agar HHD incubato a
vancomicina bromofenolo incubato incubato a 30 °C incubato incubato 37 °C per 48-72 h
incubato a 37 °C incubato a 15 °C in anaerobiosi a 45 °C a 52 °C in anaerobiosi
per 72h a 37 °C per 48 h in
in anaerobiosi anaerobiosi
L. acidophilus / colonie piatte dai assenza / / / colonie blu con
margini irregolari di crescita alone bianco
L. bulgaricus / colonie dai margini / / / assenza colonie blu
irregolari di crescita
L. casei crescita§ ^ / crescita§ / assenza / colonie bianche
di crescita
L. helveticus / / assenza / crescita§ crescita§ colonie di colore
di crescita variabile dal blu al
verde
L. kefiri crescita§ / / crescita§ / colonie bianche
L. lactis / / / / / crescita§ colonie di colore
45
variabile dal blu al
verde
§
L. paracasei crescita piccole colonie / / / / colonie bianche
bluastre dai margini
regolari
L. plantarum crescita§ colonie con centro crescita§ crescita§ assenza / colonie bianche
blu scuro e dai di crescita
margini regolari
L. rhamnosus crescita§ ^ / crescita§ / crescita§ / colonie bianche
L. reuteri crescita§ colonie dai margini assenza / crescita§ / colonie bianche
irregolari di crescita
L. salivarius / / / / / / colonie di colore
variabile dal blu al
verde
* specie più frequentemente incontrate nelle preparazioni
§
colonie di colore variabile dal bianco al crema
^ nel caso in cui in uno stesso campione siano presenti entrambi questi microrganismi, per determinare il numero di L. casei, si procede sottraendo il numero di L. rhamnosus
ottenuto dopo incubazione a 43 °C per 72 h in anaerobiosi dalla conta microbica totale (L. casei e L. rhamnosus) ottenuta dopo incubazione a 37 °C per 72 h in anaerobios
22. GENERE LACTOCOCCUS
Metodo per la numerazione presuntiva di microrganismi appartenenti al genere

Lactococcus mediante conteggio delle colonie dopo incubazione in aerobiosi a 30 °C su
terreno solido (41).

Semina per spatolamento sulla superficie di un terreno solido selettivo (M17 agar) di
0,1mL della sospensione iniziale (o di 0,1mL del campione in esame se liquido) e delle
successive diluizioni decimali. Incubazione delle piastre a 30 °C per 72h.

M17 agar
22.4. Procedimento
Eseguire ulteriori diluizioni decimali fino a quella ritenuta utile per un adeguato
conteggio.
Con una pipetta sterile, trasferire in ogni piastra di M17 agar 0,1mL della sospensione
iniziale (diluizione 1:10) o 0,1mL del campione in esame, se liquido. Ripetere la
procedura per le diluizioni successive. Utilizzando una spatola sterile, (una per ogni
diluizione), distribuire con attenzione l’inoculo sulla superficie dell’agar il più
rapidamente possibile, cercando di non toccare i bordi della piastra.
22.5. Incubazione


utilizzando sistemi miniaturizzati di identificazione: API 50 CHL (Biomerieux
o equivalenti), seguendo le istruzioni del produttore.
46
23. GENERE PROPIONIBACTERIUM

Metodo per la numerazione e l’identificazione presuntiva di microrganismi appartenenti
al genere Propionibacterium mediante conteggio delle colonie dopo incubazione in
aerobiosi 30 °C su terreno solido (29, 44).

Semina per spatolamento sulla superficie di un terreno solido non selettivo
(Propionibacterium isolation medium) della sospensione iniziale (o di 0,1mL del
campione in esame se liquido) e delle successive diluizioni decimali. Incubazione delle
piastre a 30 °C per 8-9gg.

Propionibacterium isolation medium
23.4. Procedimento
Eseguire ulteriori diluizioni decimali fino a quella ritenuta utile per un adeguato
conteggio.
Con una pipetta sterile, trasferire in ogni piastra di Propionibacterium isolation medium
0,1mL della sospensione iniziale (diluizione 1:10) o 0,1mL del campione in esame, se
liquido. Ripetere la procedura per le diluizioni successive. Utilizzando una spatola sterile,
(una per ogni diluizione), distribuire con attenzione l’inoculo sulla superficie dell’agar il
più rapidamente possibile, cercando di non toccare i bordi della piastra.
23.5. Incubazione
Incubare le piastre a 30 °C in anaerobiosi per 8-9gg.


-80 °C in microbank, e utilizzare l’altra per le ulteriori determinazioni analitiche .
utilizzando sistemi miniaturizzati di identificazione: API rapid ID 32A
(Biomerieux o equivalenti), seguendo le istruzioni del produttore.
47
24. GENERE STREPTOCOCCUS

Metodo per la numerazione e l’identificazione presuntiva di Streptococcus thermophilus
mediante conteggio delle colonie dopo incubazione in aerobiosi a 37 °C su terreno solido
(45, 46).

Semina per spatolamento sulla superficie di un terreno solido selettivo (M17 agar) di
0,1mL della sospensione iniziale (o 0,1mL del campione in esame se liquido) e delle
successive diluizioni decimali. Incubazione delle piastre a 37 °C per 48h.

M17 agar
HHD agar (37)
24.4. Procedimento
Prelevare asetticamente un’opportuna aliquota del campione da esaminare e diluirla in
rapporto 1:10 (sospensione iniziale) in MRD/[è possibile utilizzare in alternativa HHD in
cui il microrganismo forma colonie blu]. Omogeneizzare opportunamente.
Eseguire ulteriori diluizioni decimali fino a quella ritenuta utile per un adeguato conteggio.
Con una pipetta sterile, trasferire in ogni piastra di M17 agar 0,1mL della sospensione
iniziale (diluizione 1:10) o 0,1mL del campione in esame, se liquido. Ripetere la
procedura per le diluizioni successive. Utilizzando una spatola sterile, (una per ogni
diluizione), distribuire con attenzione l’inoculo sulla superficie dell’agar il più
rapidamente possibile, cercando di non toccare i bordi della piastra.
24.5. Incubazione
Nel caso in cui in uno stesso campione fossero presenti S. thermophilus e batteri
appartenenti al genere Lactococcus, è consigliabile incubare l’M17 agar a 45 °C.


a) esame microscopico previa colorazione del Gram;
utilizzando sistemi miniaturizzati di identificazione: API 50 CHL (Biomerieux
o equivalenti), seguendo le istruzioni del produttore.
48
CONFERMA GENETICA DI SPECIE
Introduzione
La corretta identificazione delle specie dei batteri utilizzati a scopo probiotico è un pre-
requisito fondamentale per la loro sicurezza d’uso e funzionalità.
A tale scopo, seguendo le indicazioni delle linee guida ministeriali, per l’identificazione genetica
delle specie, si è proceduto ad un approccio polifasico o combinato, nel quale cioè l’identificazione
fenotipica è stata integrata da un metodo molecolare, basato sullo studio del DNA.
Preparazione del DNA da coltura batterica

– Preparare una coltura batterica del microrganismo da analizzare in terreno agarizzato
specifico e incubare le piastre alla temperatura e per il tempo previsti dal metodo per il
microrganismo in esame.
– Prelevare una colonia ben isolata e risospenderla in 9 mL dello specifico brodo di crescita5 .
– Incubare le provette alla temperatura e per il tempo previsti per il microrganismo studiato.
– Centrifugare 1 mL di brodocoltura a 5000 rpm per 10 min a 4 °C.
– Lavare il pellet per due volte con 1 mL di TAE 1X centrifugando dopo ogni lavaggio a
12000 rpm per 3 min a 4 °C e scartando ogni volta il surnatante.
– Risospendere il pellet in 1 mL di H2O distillata sterile.
– Sottoporre i campioni a sonicazione (con una frequenza pari a 500 kHz) per 10 min, per
facilitare la rottura della parete cellulare durante il successivo trattamento termico per 10
min a 99 °C 6 .
Il DNA è ora pronto per essere amplificato o congelato a -20 °C fino al momento dell’utilizzo
(Figura 3).
Procedere con l’amplificazione secondo quanto riportato nella sezione “Metodi per
l’identificazione genetica di microrganismi probiotici”.
Figura 3. Amplificazione del DNA da coltura batterica
5
MRS broth a 37°C x 24-48h, in anaerobiosi per i Lattobacilli; HHD broth a 37°C x 48-72h in aerobiosi, per i
Bifidobatteri; M17 broth a 37°C x 24-48h in aerobiosi, per Streptococchi e Lactococchi; TSB a 37°C x 24-
48h in aerobiosi, per i Bacilli sporigeni; Cooked meat medium a 37°C x 48-72h, per i Propionibatteri.
6
Tale procedura è risultata essere la più adatta allo scopo del lavoro; in alternativa possono essere
utilizzati altri sistemi equivalenti compresi i kit di estrazione disponibili in commercio.
49
MODALITÀ DI CONTEGGIO DELLE COLONIE

DOPO L’IDENTIFICAZIONE
Per ogni piastra presa in considerazione per la conta totale, selezionare un numero (A) di
colonie (in genere A = 5) che presentano caratteristiche morfologiche simili e sottoporle a test di
conferma (identificazione genetica) come indicato nella sezione “Metodi per l’identificazione
genetica di microrganismi probiotici”. Sulla base della risposta dei test di identificazione,
calcolare, per ogni piastra, il numero (a) di colonie conformi ai criteri di identificazione, usando
la formula (35):
b
a= _________
xC
A
Dove:
b è il numero di colonie conformi ai criteri di identificazione tra le A colonie identificate
C è il numero totale di colonie presuntive contate su una piastra
Calcolare il numero N di microrganismi identificati presenti nel campione analizzato
utilizzando la formula
ΣC
N = ______________
V x 1,1 x d
sostituendo ΣC con Σa.
Esempio:
Prima diluizione considerata: 10-2 ,
Delle 160 colonie contate, 10 sono state sottoposte ai test identificativi; 8 colonie sono
risultate conformi ai criteri di identificazione.
b 8
a = _________ x C = _________ x 160 = 128
A 10
Seconda diluizione considerata: 10-3

Delle 20 colonie contate, 5 sono state sottoposte ai test identificativi; 4 colonie sono risultate
conformi ai criteri di identificazione.
b 4
a = _________ x C = _________ x 20 = 16
A 5
In base ai risultati ottenuti dopo l’identificazione si procede al calcolo del numero di

microrganismi identificati presenti nel campione in base alla formula:
Σa 128 + 16 144
_____________ ________________ __________
N = = = = 1309090
-3
V x 1,1 x d 0,1 x 1,1 x 10 0,00011
50
Arrotondando il risultato il numero di microrganismi sarà 1300000 o 1,3 x 106 per grammo o
millilitro di prodotto.
Per il calcolo dell’incertezza di misura, previsto per i metodi microbiologici di numerazione
batterica fare riferimento alla norma ISO 19036 (47).
In caso di specie batterica diversa da quella attesa riportare il risultato come segue: meno di
1/d nome della specie ricercata per millilitro o per grammo di prodotto analizzato dove d è il
fattore di diluizione della sospensione iniziale o della prima diluizione inoculata.
51
CONCLUSIONI
La partita o sottopartita è ritenuta conforme alle linee guida ministeriali o a quanto dichiarato
in etichetta se:
– la carica batterica è uguale o superiore al dichiarato in etichetta;
– ogni microrganismo dichiarato è presente in forma vitale;
– la denominazione di specie è in accordo con la nomenclatura tassonomica riconosciuta
dalla International Union of Microbiological Societies;
– il prodotto non contiene specie patogene (Salmonella spp e L. monocytogenes, secondo
il regolamento CE 1441/2007) (33).
Sono in corso approfondimenti per includere le metodologie con cui procedere alla
numerazione e identificazione di specie probiotiche utilizzate in prodotti immessi sul mercato
dopo il 2006.
Si stanno altresì valutando metodi molecolari con cui poter effettuare contemporaneamente
conta e identificazione di specie.
52
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measurement uncertainty for quantitative determinations Geneva: International Organization for
55
56
APPENDICE
Terreni di coltura
57
58
ACQUA PEPTONATA TAMPONATA (BPW)

Digerito enzimatico di caseina 10,0g
Cloruro di sodio 5,0g
Idrogeno fosfato di sodio dodecaidrato
(Na2HPO4.12H2O) 9,0g
Diidrogeno posfato di potassio (KH2PO4) 1,5g
Acqua 1000mL
Preparazione
Sciogliere in 1000mL di acqua distillata i vari componenti o l’opportuna quantità del terreno completo
disidratato. Riscaldare se necessario. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15min.
pH 7,0 +/- 0,2 a 25 °C.
COOKED MEAT MEDIUM (TERRENO ALLA CARNE COTTA)

Muscolo di cuore 454,0g
Peptone 10,0g
Estratto di carne 10,0g
Glucosio 2,0g
Acqua 1000mL
Preparazione
Sospendere 1 grammo del terreno completo disidratato in 10mL di acqua distillata contenuti in una
provetta. Lasciare a riposo per 15 minuti e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti. Evitare di
raffreddare le provette troppo rapidamente.
pH 7,2 ± 0,2 a 25 °C
HHD AGAR
Fruttosio 2,5g
Saccarosio 0,2g
Potassio fosfato monobasico 2,5g
Idrolisato triptico di caseina 10g
Peptone di soia 1,5g
Idrolisato acido di caseina 3,0g
Estratto di lievito 1,0g
Verde bromo cresolo 0,066g
Agar 20,0g
Acqua 1000mL
59
Preparazione
Sospendere in 1000mL di acqua distillata i vari componenti o l’opportuna quantità del terreno
completo disidratato*. Aggiungere 1g di Tween 80. Scaldare fino ad ebollizione, sotto continua
agitazione Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.
pH finale 7,0±0,1.
*nella forma commerciale il terreno completo è presente solo nella formulazione HHD brodo, per
ottenere il terreno agarizzato basta aggiungere 20 grammi di agar a 1000mL di terreno completo.
HHD BRODO
Fruttosio 2,5g
Saccarosio 0,2g
Potassio fosfato monobasico 2,5g
Idrolisato triptico di caseina 10,0g
Idrolisato acido di caseina 3,0g
Verde bromo cresolo 0,066g
Acqua 1000mL
Preparazione
completo disidratato. Aggiungere 1g di Tween 80. Scaldare fino ad ebollizione, sotto continua
agitazione. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.
pH finale 7,0±0,1.
MAXIMUM RECOVERY DILUENT (PEPTONE SALINE DILUENT)

(MRD)
Peptone 1,0g
Acqua 1000mL
Preparazione
completo disidratato. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.
pH 7,0 ± 0,2 a 25 °C.
60
M17 BRODO
Tryptone 5,0g
‘Lab-Lemco’ powder 5,0g
Acido ascorbico 0,5g
Solfato di magnesio 0,25g
Di-sodio-glycerofosfato 19,0g
Acqua 950mL
Preparazione
Sospendere in 950 mL di acqua distillata i vari componenti o l’opportuna quantità del terreno
completo disidratato. Portare ad ebollizione e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.
Raffreddare a 50 °C e aggiungere 50 mL di una soluzione sterile di lattosio al 10%.
pH 6,9 ± 0,2 a 25 °C
Soluzione di lattosio al 10%

Dissolvere 10 g di Lattosio in 100 mL di acqua distillata. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15
minuti o per filtrazione su membrana da 0,2 µm.
M17 AGAR
Tryptone 5,0
Peptone di soia 5,0
Estratto di carne 5,0
Estratto di lievito 2,5
Acido ascorbico 0,5
Magnesio solfato 0,25
Di-sodio-glicerofosfato 19,0
Agar 11,0
Acqua 950mL
Preparazione
Sospendere in 950 mL di acqua distillata i vari componenti o l’opportuna quantità del terreno
Raffreddare a 50 °C e aggiungere 50 mL di una soluzione sterile di lattosio al 10%.
pH 6,9 ± 0,2 a 25 °C
Soluzione di Lattosio al 10%

Dissolvere 10g di Lattosio in 100 mL di acqua distillata. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15
minuti o per filtrazione su membrana da 0,2 µm.
61
MRS AGAR
Peptone 10,0g
Glucosio 20,0g
Tween 80 1,08g
Idrogeno fosfato di-potassio 2,0g
Sodio acetato 3H2O 5,0g
Triammonio citrato 2,0g
Magnesio solfato 7H2O 0,2g
Manganese solfato 4H2O 0,05g
Agar da 12,0g a 18,0ga
Acqua 1000mL
a
dipende dal potere gelificante dell’agar
Preparazione
pH: 6,2 ± 0,2 a 25 °C
Distribuire il terreno raffreddato in piaster di Petri.
MRS AGAR acidificato

Procedure come per l’MRS agar
pH 5,4±0,1 a 25 °C
MRS BRODO
Peptone 10,0g
Glucosio 20,0g
Tween 80 1,08g
Idrogeno fosfato di-potassio 2,0g
Sodio acetato 3H2O 5,0g
Triammonio citrato 2,0g
Magnesio solfato 7H2O 0,2g
Manganese solfato 4H2O 0,05g
Preparazione
completo disidratato. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15 minuti.
pH 6,2 ± 0,2 a 25 °C
62
PROPIONIBACTERIUM ISOLATION MEDIUM

Sodio lattato 10,0g
Peptone 20,0g
Agar 15,0g
Acqua 1000mL
Preparazione
Sospendere in 1000mL di acqua distillata i vari componenti. Sterilizzare in autoclave a 121 °C per 15
minuti.
pH 7,0± 0,2 a 25 °C
Distribuire il terreno raffreddato in piastre di Petri.
63
La riproduzione parziale o totale dei Rapporti e Congressi ISTISAN
deve essere preventivamente autorizzata.
Le richieste possono essere inviate a: [email protected].
Stampato da Tipografia Facciotti srl

Vicolo Pian Due Torri 74, 00146 Roma
Roma, ottobre-dicembre 2008 (n. 4) 15° Suppl.
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Metodi microbiologici tradizionali e metodi molecolari per l'analisi degli

Article · January 2008

Paolo Aureli Concetta Scalfaro

SEE PROFILE SEE PROFILE

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Metodi microbiologici tradizionali

Paolo Aureli, Alfonsina Fiore, Concetta Scalfaro, Giovanna Franciosa

Istituto Superiore di Sanità

Per informazioni su questo documento scrivere a: [email protected].

Il rapporto è accessibile online dal sito di questo Istituto: www.iss.it.

Citare questo documento come segue:

Presidente dell’Istituto Superiore di Sanità e Direttore responsabile: Enrico Garaci

Redazione: Paola De Castro, Sara Modigliani e Sandra Salinetti

© Istituto Superiore di Sanità 2008

Scopo del rapporto .......................................................................................................................... 3

Gli integratori alimentari ............................................................................................................... 4

Protocollo analitico consigliato ................................................................................................. 8

Screening con metodo molecolare delle specie indicate in etichetta

Metodi per l’identificazione genetica di microrganismi probiotici ............................. 15

Numerazione differenziale presuntiva delle specie microbiche probiotiche

Metodi per la numerazione dei microrganismi probiotici ............................................... 39

Conferma genetica di specie....................................................................................................... 49

Modalità di conteggio delle colonie dopo l’identificazione ........................................... 50

L’assunzione volontaria di batteri vivi non patogeni, generalmente ma non esclusivamente

SCOPO DEL RAPPORTO

GLI INTEGRATORI ALIMENTARI

documentazione o ne preveda una particolare valutazione autorizzativa per concederne

La verifica di conformità al dichiarato in etichetta di integratori con microrganismi probiotici

Fasi del campionamento

Dove effettuare il prelievo

Modalità di trasporto e tempi di consegna al laboratorio del campione

PROTOCOLLO ANALITICO CONSIGLIATO

FASE I: Screening molecolare delle specie microbiche dichiarate in etichetta

Estrazione del DNA

Amplificazione Visualizzazione dell’amplificato

Semina per spatolamento

Esame morfologico e microscopico

Numerazione presuntiva Identificazione biochimica presuntiva

FASE III: Conferma genetica delle specie vitali

Amplificazione Visualizzazione dell’amplificato

FASE IV: Numerazione delle specie microbiche vitali

Numerazione definitiva differenziale Risultato finale

Figura 1. Schema riassuntivo delle principali fasi del protocollo analitico

SCREENING CON METODO MOLECOLARE DELLE

Tabella 1. Primer utilizzati per l’identificazione di specie dei microrganismi probiotici

Gruppo Sigla e sequenza dei primer Target (bp)* Rif.

Estrazione diretta del DNA totale dal prodotto

Amplificazione del DNA batterico mediante PCR

Figura 2. Un ciclo di PCR

Metodica di preparazione della miscela di reazione

Dopo raffreddamento della miscela, aggiungere la Taq polimerasi e procedere con la

Tabella 2. Condizioni di PCR ottimali per ogni singolo microrganismo

Specie Primer Ciclo Amplificazione Cicli Ciclo

Per permettere di valutare la specificità della metodica, nell’allestimento di una reazione di

Tabella 3. Ceppi di riferimento utilizzati *

Visualizzazione dell’amplificato mediante elettroforesi

Tabella 4. Materiali necessari per la preparazione dell’elettroforesi e relativa concentrazione

Preparazione del gel d’agarosio

Lettura dei risultati