Cooper para Tótós
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Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Snia
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ndice
Captulo 1 Viso geral sobre as clulas ................................................................................. 10 Origem e evoluo das clulas ............................................................................................ 10 A primeira clula ............................................................................................................. 10 Evoluo do Metabolismo ............................................................................................... 11 Procaritas Actuais.......................................................................................................... 11 Eucaritas Actuais ........................................................................................................... 12 A origem dos eucaritas .................................................................................................. 12 Desenvolvimento de Organismos Multicelulares ............................................................. 12 Clulas como modelos experimentais ................................................................................. 13 E.coli ............................................................................................................................... 13 Leveduras........................................................................................................................ 13 Caenorhabditis elegans ................................................................................................... 13 Drosophila melanogaster ................................................................................................ 13 Vertebrados .................................................................................................................... 14 Captulo 2 Composio das clulas ....................................................................................... 15 As molculas das clulas ..................................................................................................... 15 Glcidos ........................................................................................................................... 15 Lpidos ............................................................................................................................ 15 cidos Nucleicos ............................................................................................................. 15 Protenas......................................................................................................................... 18 Membranas celulares .......................................................................................................... 18 Lpidos Membranares...................................................................................................... 18 Protenas membranares .................................................................................................. 19 Transporte atravs de membranas celulares ................................................................... 19 Proteomics: Anlise de Protenas celulares a larga-escala.................................................... 19 Identificao de protenas celulares ................................................................................ 20
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Anlise global da localizao proteica .............................................................................. 20 Interaces proteicas ...................................................................................................... 20 Captulo 4 Fundamentos da Biologia Molecular .................................................................... 21 Hereditariedade, Genes e DNA ............................................................................................ 21 Genes e Cromossomas .................................................................................................... 21 Genes e Enzimas ............................................................................................................. 21 Identificao de DNA como o Material Gentico ............................................................. 21 Estrutura do DNA ............................................................................................................ 22 Replicao do DNA .......................................................................................................... 23 Expresso da Informao Gentica...................................................................................... 25 Colinearidade de Genes e Protenas ................................................................................ 25 O papel do mRNA ............................................................................................................ 25 DNA recombinante.............................................................................................................. 27 Enzimas de restrio ....................................................................................................... 27 Formao de molculas de DNA recombinante ............................................................... 28 Vectores de DNA recombinante ...................................................................................... 30 Sequenciao de DNA ..................................................................................................... 31 Expresso de genes clonados .......................................................................................... 33 Deteco de cidos Nucleicos e Protenas ........................................................................... 34 Amplificao de DNA por PCR.......................................................................................... 34 Hibridao de cidos nucleicos ........................................................................................ 34 Anticorpos como sondas para protenas .......................................................................... 37 Funo de Genes em Eucaritas .......................................................................................... 39 Transferncia Gentica em Plantas e Animais.................................................................. 39 Mutagnese de DNAs clonados ....................................................................................... 44 Introduo de Mutaes em genes celulares ................................................................... 44 Interferindo com a Expresso Gentica Celular................................................................ 44
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Captulo 5 Organizao e Sequncias dos Genomas Celulares .............................................. 45 A Complexidade dos Genomas Eucariotas ........................................................................... 45 Intres e Exes ................................................................................................................ 45 Sequncias de DNA Repetitivas ....................................................................................... 46 Duplicao de Genes e Pseudogenes ............................................................................... 47 Composio dos Genomas de Eucaritas ......................................................................... 47 Cromossomas e Cromatina.................................................................................................. 48 Cromatina ....................................................................................................................... 48 Centrmeros ................................................................................................................... 50 Telmeros ....................................................................................................................... 50 Sequncias de Genoma Completos ..................................................................................... 51 O Genoma Humano - Experincia .................................................................................... 51 Captulo 6 Replicao, Manuteno, e Rearranjos no DNA Genmico ................................... 53 Replicao do DNA .............................................................................................................. 53 DNA polimerases............................................................................................................. 53 Forquilha de Replicao .................................................................................................. 54 Fidelidade da Replicao ................................................................................................. 58 Origens e Iniciao da Replicao .................................................................................... 60 Telmeros e Telomerase: Manuteno das extremidades de cromossomas .................... 60 Reparao de DNA .............................................................................................................. 63 Reverso directa de danos a DNA .................................................................................... 64 Reparao por exciso .................................................................................................... 64 Sntese de DNA transleso............................................................................................... 64 Reparao Recombinacional ........................................................................................... 64 Recombinao entre Sequncias Homlogas de DNA .......................................................... 64 Modelos de Recombinao Homloga............................................................................. 64 Enzimas Envolvidas na Recombinao Homloga ............................................................ 64
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Rearranjos de DNA .............................................................................................................. 64 Recombinao Site-Specific ............................................................................................. 65 Transposio atravs de Intermedirios de DNA.............................................................. 65 Transposio atravs de Intermedirios de RNA .............................................................. 66 Amplificao Gnica ........................................................................................................ 67 Captulo 7 - Processamento e Sntese de RNA ......................................................................... 68 Transcrio em procariotas ................................................................................................. 68 RNA polimerase e Transcrio ......................................................................................... 68 Repressores e controlo negativo da transcrio ............................................................... 71 Controlo positivo da transcrio ...................................................................................... 72 RNA polimerases eucaritas e Factores de transcrio ........................................................ 72 RNA polimerases eucariotas ............................................................................................ 72 Factores de transcrio e Incio da transcrio pela RNA polimerase II............................. 73 Transcrio pela RNA polimerase I e III ............................................................................ 73 Regulao da transcrio em Eucariotas .............................................................................. 73 Sequncias Cis-acting reguladoras: Promotores e Enhancers ........................................... 73 Estrutura e funcionamento de Activadores da Transcrio .............................................. 75 Repressores eucaritas ................................................................................................... 75 Relao da estrutura da cromatina com a transcrio...................................................... 76 Regulao da transcrio por RNAs no codificantes ....................................................... 78 Metilao do DNA ........................................................................................................... 78 Processamento de RNA e turnover ...................................................................................... 79 Processamento de mRNA em Eucaritas ......................................................................... 79 Mecanismos de Splicing .................................................................................................. 80 Splicing Alternativo (Alternative splicing)......................................................................... 82 Edio de RNA ................................................................................................................. 82 Degradao de RNA ........................................................................................................ 83
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Captulo 8 Sntese, processamento e regulao proteica ...................................................... 84 Traduo do mRNA ............................................................................................................. 84 RNAs de transferncia ..................................................................................................... 84 O Ribossoma ................................................................................................................... 85 Organizao do mRNA e incio da traduo ..................................................................... 85 Processo de Traduo ..................................................................................................... 86 Regulao da Traduo ................................................................................................... 87 Dobragem Proteica e Processamento .................................................................................. 88 Chaperonas e Dobragem Proteica ................................................................................... 89 Enzimas que catalisam a Dobragem Proteica ................................................................... 89 Clivagem Proteica............................................................................................................ 89 Glicolizao ..................................................................................................................... 90 Ligao de Lpidos ........................................................................................................... 91 Captulo 10 Encaminhamento e transporte de protenas ...................................................... 92 O retculo endoplasmtico .................................................................................................. 92 O retculo endoplasmtico e a secreco de protenas .................................................... 92 Encaminhamento de protenas para o Retculo Endoplasmtico ...................................... 92 Insero de protena na membrana do Retculo Endoplasmtico ..................................... 94 Insero de uma protena na membrana do RE com uma sequncia-sinal clivvel e uma nica stop-transfer sequence .......................................................................................... 94 Insero de uma protena na membrana do RE com uma sequncia-sinal interna sequncia (e, portanto, no-clivvel) ............................................................................... 94 Insero de uma protena na membrana do RE com mltiplas stop-transfer sequences (domnios transmembranares) ........................................................................................ 95 Folding e Processamento proteico no Retculo Endoplasmtico ....................................... 95 Controlo de Qualidade no Retculo Endoplasmtico ........................................................ 96 O retculo endoplasmtico liso e a sntese de lpidos ....................................................... 96 Exportao de Lpidos e Protenas a partir do Retculo Endoplasmtico ........................... 97 O Aparelho de Golgi ............................................................................................................ 98
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Organizao do Golgi ...................................................................................................... 98 Glicosilao de protenas no Golgi ................................................................................... 98 Metabolismo dos lpidos e dos polissacardeos no Golgi .................................................. 99 Encaminhamento e exportao das protenas a partir do Golgi ....................................... 99 O mecanismo do transporte de vesculas .......................................................................... 100 A experimentao e a compreenso dos mecanismos do transporte de vesculas ......... 100 Selectividade do Cargo, Protenas Coat e Destacamento de Vesculas ........................... 100 Fuso de Vesculas ........................................................................................................ 101 Lisossomas ........................................................................................................................ 101 Hidrolases cidas prprias dos lisossomas ..................................................................... 101 Endocitose e formao do lisossoma ............................................................................. 102 Fagocitose e Autofagia .................................................................................................. 102 Captulo 11 Bioenergtica e Metabolismo..................................................................... 103
Mitocndrias..................................................................................................................... 103 Organizao e Funo das Mitocndrias ........................................................................ 103 O Sistema Gentico das Mitocndrias ........................................................................... 103 Importao de Protenas e Montagem de Mitocndrias ................................................ 104 Peroxissomas .................................................................................................................... 107 Funes dos Peroxissomas ............................................................................................ 107 Construo de Peroxissomas ......................................................................................... 107 Captulo 12 O citoesqueleto e o movimento celular ........................................................... 108 Estrutura e Organizao dos filamentos de actina ............................................................. 108 Montagem e Desmontagem dos Filamentos de Actina .................................................. 108 Organizao dos filamentos de Actina ........................................................................... 108 Associao com a Membrana Plasmtica....................................................................... 109 Projeces da Superfcie Celular .................................................................................... 109 Actina, Miosina e Movimento Celular ................................................................................ 109
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Filamentos Intermdios .................................................................................................... 110 Protenas dos Filamentos Intermdios........................................................................... 110 Montagem dos Filamentos Intermdios ........................................................................ 110 Organizao Intracelular dos Filamentos Intermdios ................................................... 110 Epidermlise Bulhosa Simples ....................................................................................... 111 Microtbulos .................................................................................................................... 111 Estrutura e organizao Dinmica dos Microtbulos ..................................................... 111 Organizao Intracelular dos Microtbulos ................................................................... 111 Drogas que Afectam a Estabilidade dos Microtbulos ................................................... 111 Motores Microtubulares e Movimento ............................................................................. 112 Clios e Flagelos ............................................................................................................. 112 Resumo das Funes ............................................................................................................. 112 Captulo 13 Membrana Plasmtica ..................................................................................... 113 Transporte de pequenas molculas ................................................................................... 113 Medicina Molecular: Fibrose Cstica (FC) ....................................................................... 113 Endocitose ........................................................................................................................ 114 Fagocitose ..................................................................................................................... 114 Endocitose Mediada por Receptor................................................................................. 115 Key Experiment: O Receptor de LDL .............................................................................. 116 Trfego de Protenas na Endocitose............................................................................... 118 Captulo 15 Sinalizao Celular ........................................................................................... 120 Molculas Sinalizadoras e os seus receptores .................................................................... 120 Modos de sinalizao clula-clula ................................................................................ 120 Hormonas esterides e a Superfamlia dos receptores nucleares................................... 122 Neurotransmissores ...................................................................................................... 122 Hormonas Peptdicas e Factores de crescimento ........................................................... 123 Funes dos Receptores da Superfcie Celular ................................................................... 123
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Receptores Acoplados a Protenas G ............................................................................. 123 Receptores associados a tirosina-cinases....................................................................... 124 Receptores de citocinas, e Tirosinas cinases no receptoras .......................................... 125 Receptores ligados a outros tipos de enzimas................................................................ 125 Vias de transmisso de sinais intracelulares ...................................................................... 125 A via do cAMP: Mensageiros Secundrios e Fosforilao de Protenas ........................... 125 GMP cclico ................................................................................................................... 126 Fosfolpidos e CA2+ ........................................................................................................ 126 Vias da MAP cinase ....................................................................................................... 126 Captulo 16 O ciclo celular .................................................................................................. 128 O ciclo celular da clula eucariota ..................................................................................... 128 Fases do ciclo celular ..................................................................................................... 128 Regulao do Ciclo Celular por Sinais de Crescimento e Sinais Extracelulares ................ 129 Checkpoints do ciclo celular .......................................................................................... 130 Restringindo a replicao do DNA a uma nica vez por ciclo .......................................... 130 Reguladores da progresso do ciclo celular ....................................................................... 131 Protenas-cinases e regulao do ciclo celular ............................................................... 131 Famlias de Ciclinas e Cinases dependentes de ciclinas .................................................. 132 Factores de crescimento e regulao das Cdks da fase G1 ............................................ 133 Checkpoints de verificao de erros no DNA.................................................................. 133 Captulo 17 Morte e Renovao Celular.............................................................................. 134 Morte Celular Programada ................................................................................................ 134 Eventos Durante a Apoptose (Fig 17.1) .......................................................................... 134 Fagocitose de Clulas e Fragmentos de Clulas Apoptticas (Fig 17.2) ........................... 134 Caspases ....................................................................................................................... 135 Reguladores Centrais da Apoptose: A famlia Bcl-2 ........................................................ 135 Vias Sinalizadoras que regulam a apoptose ................................................................... 136
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Clulas Estaminais e a Manuteno de Tecidos Adultos..................................................... 137 Proliferao de Clulas Diferenciadas ............................................................................ 137 Clulas Estaminais ......................................................................................................... 137 Aplicaes Mdicas de Clulas Estaminais Adultas ........................................................ 137 Clulas Estaminais Embionrias e Clonagem Teraputica .............................................. 137 Transferncia Nuclear Somtica .................................................................................... 137
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A primeira clula
Na base do aparecimento de vida est uma teoria que postula que a formao espontnea de molculas orgnicas conduziu posterior formao de macromolculas. Uma caracterstica crucial das macromolculas que deram origem vida ter sido a capacidade de autoreplicao, pois s uma macromolcula capaz de direccionar a sntese de novas cpias de si mesma seria capaz de direccionar a reproduo e posterior evoluo. As molculas com a capacidade de auto-replicao so os cidos nucleicos, cujas cadeias servem de moldes para a sntese da nova macromolcula, atravs do emparelhamento especfico de nucletidos complementares. Estudos descobriram as capacidades catalticas do RNA, que consegue direccionar a sntese de uma nova cadeia de RNA atravs de uma cadeia molde. Consequentemente, o RNA considerado o sistema gentico inicial (RNA world). Interaces entre RNA e aminocidos (aa) deram origem ao cdigo gentico actual, e o DNA substituiu o RNA como material gentico.
Auto-Replicao de RNA
A primeira clula gerou-se supostamente pelo enclausuramento de RNA auto-replicante numa membrana composta de fosfolpidos, que so os componentes bsicos de das membranas biolgicas, como as membranas plasmticas dos procaritas e eucaritas. O que permite aos fosfolpidos formar membranas que eles so molculas anfipticas, ou seja, uma poro da molcula solvel e gua e a outra no. Os fosfolpidos tm longas cadeias de carbono e hidrognio insolveis em gua (hidrofbicas), juntas a cabeas de fosfato solveis em gua (hidroflicas). Quando em meio aquoso, os fosfolpidos agregam-se espontaneamente numa bicamada, em que os grupos fosfato esto em contacto com a gua, e as cadeias de carbono e hidrognio no interior em contacto umas com as outras. Esta bicamada forma uma barreira
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estvel entre dois compartimentos aquosos - por exemplo o interior e o exterior de uma clula.
Evoluo do Metabolismo
As clulas necessitaram de desenvolver os seus prprios mecanismos de gerao de energia e sntese de molculas necessrias replicao. Todas as clulas usam adenosina 5-trifosfato (ATP) como fonte de energia para conduzir a sntese de constituintes celulares e outras actividades que implicam o gasto de energia, como o movimento celular. Os mecanismos para gerao de ATP surgiram em 3 fases, a gliclise, a fotossntese, e o metabolismo oxidativo. A gliclise um mecanismo pelo qual a energia em molculas orgnicas pr-formadas poderia ser convertido em ATP, que poderia ser depois usado como fonte energtica para conduzir outras reaces metablicas. O desenvolvimento da fotossntese foi o passo evolucionrio seguinte, permitindo clula colher energia da luz solar, tornando-a independente da utilizao de molculas orgnicas pr-formadas. O uso de H2O em reaces fotossintticas produz O2, e foi este mecanismo o responsvel por tornar a atmosfera terrestre abundante em O2, que consequentemente alterou o ambiente em que as clulas habitavam, levando ao desenvolvimento do metabolismo oxidativo. Como o O2 uma molcula muito reactiva, providenciou um mecanismo de gerao de energia a partir de molculas orgnicas muito mais eficiente que a simples gliclise anaerbica.
Procaritas Actuais
Os procaritas actuais dividem-se em dois grupos: archeabacteria (algumas vivem em ambientes extremos) e eubacteria, as formas comuns de bactrias da actualidade. Os procaritas mais complexos so as cianobactrias, as quais desenvolveram inicialmente a fotossntese. A estrutura tpica de uma clula procarita ilustrada pela E.coli, uma habitante do trato intestinal humano: rodeada por uma parede celular rgida (porosa), abaixo da qual existe uma membrana plasmtica, na qual uma bicamada fosfolipdica est associada a protenas. O
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seu DNA uma molcula circular no nucleide, no sendo separada do citoplasma, como nos eucaritas. O seu citoplasma abunda em ribossomas (locais da sntese proteica).
Eucaritas Actuais
Todas so envolvidas por uma membrana plasmtica e contm ribossomas, mas so maiores e mais complexas, sendo o seu organelo mais proeminente o ncleo (local de sntese de RNA e replicao de DNA; a traduo d-se em ribossomas, no citoplasma). Contm outros organelos no citoplasma, que ao compartimentalizarem as diferentes actividades metablicas da clula as tornam muito mais eficientes. As mitocndrias (onde se d o metabolismo oxidativo e produo de ATP) e os cloroplastos tm papis fundamentais no metabolismo energtico. Os lisossomas e peroxissomas so compartimentos metablicos especializados na digesto de macromolculas e reaces oxidativas, respectivamente. O retculo endoplasmtico (processa e transporta protenas e sintetiza lpidos) e o aparelho de Golgi (matura protenas e sintetiza lpidos) dedicam-se distribuio e transporte de protenas destinadas secreo, incorporao na membrana plasmtica e lisossomas. As clulas eucaritas ainda tm uma rede de filamentos proteicos que se estende no citoplasma, o citoesqueleto, que d estrutura clula, determinando o seu formato, e organizao geral do seu citoplasma, sendo tambm responsvel pelo movimento celular e transporte e posicionamento de organelos numa clula.
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E.coli
Os procaritas so os seres de eleio para o estudo de aspectos fundamentais da bioqumica e da biologia molecular, devido sua simplicidade, quando comparados a outros seres. A E.coli a espcie de bactria mais estudada, pois relativamente simples, e fcil de propagar e estudar em laboratrio. O seu pequeno genoma (4.6 milhes de pb e 4300 genes), aliado sua rpida proliferao laboratorial, confere-lhe vantagens na anlise gentica. Alm disso, uma populao clone de E.coli, na qual todas as clulas derivam da mesma clula original, pode ser facilmente isolada num meio de cultura com agar, permitindo tornar a escolha de espcies resistentes a antibiticos rpida e fcil. As misturas de nutrientes na qual a E.coli se divide mais rapidamente (20 minutos) inclui glicose, sais, compostos orgnicos (aa, vitaminas e precursores de cidos nucleicos). Tambm pode ser cultivada num meio mais pobre, contendo apenas amnia e glicose, sendo contudo o crescimento mais lento.
Leveduras
As leveduras, os eucariotas mais simples, tm vantagens experimentais semelhantes E.coli, sendo o modelo da biologia celular dos eucariontes. A espcie mais estudada a s.cerevisiae, contendo um genoma com aproximadamente 6000 genes. Apesar da sua simplicidade, exibe as caractersticas tpicas das clulas eucaritas: ncleo rodeado por uma membrana nuclear, DNA organizado em cromossomas, e o citoplasma contm citoesqueleto e organelos. Em condies ptimas dividem-se a cada 2 horas, sendo ideais para manipulaes genticas semelhantes quelas realizadas em bactrias.
Caenorhabditis elegans
As leveduras unicelulares so modelos muito importantes para o estudo de clulas eucaritas, mas a compreenso de seres multicelulares requer o uso de plantas ou de animais, organismos mais complexos. A c.elegans permite o estudo do desenvolvimento animal e da diferenciao celular. O seu genoma bem maior e mais complexo do que o de eucariontes unicelulares mas bem mais simples e manusevel que o da maioria dos outros animais, sendo facilmente sujeitado a manipulao gentica. Os indivduos adultos so compostos por apenas 959 clulas somticas, e entre 1000 e 2000 clulas da linha germinativa.
Drosophila melanogaster
Esta mosca da fruta tem sido um modelo crucial no estudo da biologia do desenvolvimento, e apesar de conter mais pb no seu genoma, contm menos genes que a c.elegans, sendo tambm fcil de manter e reproduzir laboratorialmente (tem um ciclo reprodutivo curto duas semanas). A anlise gentica realizada na Drosophila permitiu a identificao de inmeros genes que controlam o desenvolvimento e a diferenciao.
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Vertebrados
Os animais mais complexos so os vertebrados, que incluem os humanos, mamferos, entre outros. O genoma humano tem aproximadamente 3 mil milhes de pb, contm 20 000 a 25 000 genes, e mais de 200 tipos diferentes de clulas especializadas. Esta complexidade torna os vertebrados difceis de estudar do ponto de vista da biologia molecular. Uma abordagem para o estudo de seres humanos e outros mamferos o crescimento de clulas isoladas em cultura, onde podem ser manipuladas, sob condies laboratoriais. O uso de clulas em cultura permitiu elucidar os mecanismos da replicao de DNA, expresso gentica, sntese proteica, processamento, e diviso celular. Alm do mais, as propriedades de algumas clulas altamente especializadas (neurnios, clulas musculares), tornam-nas modelos importantes para o estudo de aspectos particulares da biologia celular. Por exemplo, os neurnios so excelentes modelos para o estudo do transporte de ies atravs da membrana. Entre os mamferos, o rato o modelo mais adequado para anlise gentica, que facilitada pela disponibilidade do seu genoma completo. A adequao do rato como modelo para o desenvolvimento humano indicada no s pela semelhana entre os genomas humano e do rato, como tambm pelo facto de mutaes em genes homlogos provocarem o desenvolvimento de defeitos em ambas as espcies.
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Glcidos
Incluem acares simples (monossacridos), bem como polissacridos. Os monossacridos (como a glicose) so os principais nutrientes de uma clula, e a sua degradao a fonte de energia celular e de precursores para a biossntese de componentes celulares. Os polissacridos so a forma de armazenamento de acares e formam os componentes estruturais das clulas, servindo tambm como marcadores em processos de reconhecimento celular.
Lpidos
So os principais componentes das membranas celulares, sendo tambm uma forma de armazenamento energtico muito importante, alm de funcionarem como molculas sinalizadoras e hormonas esterides (estrognios, testosterona, etc).
cidos Nucleicos
Os cidos nucleicos DNA e RNA so as molcula de armazenamento de informao da clula. O DNA tem como funo servir de material gentico, sendo que nos eucariontes se localiza no ncleo. Existem diferentes tipos de RNA: mRNA (mensageiro), que transporta informao do DNA para os ribossomas, servindo como molde para a sntese proteica; o rRNA e o tRNA esto envolvidos na sntese proteica. O RNA alm de transportar informao, capaz de catalizar algumas reaces qumicas (de sntese proteica e processamento de RNA). O RNA e o DNA so polmeros de nucletidos, que consistem em bases: purinas (dois anis), como a Adenina (A) e a Guanina (G); ou pirimidinas (um anel), como a Citosina (C), a Timina (T) e o Uracilo (U).
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O DNA consiste em duas purinas (A e G), e duas pirimidinas (C e T). O RNA contm Uracilo em vez de Timina, como no DNA.
As bases (purinas e pirimidinas) esto ligadas a glcidos, no caso do DNA desoxirribose; no caso do RNA ribose, formando assim nuclesidos. Os nuclesidos ligam-se a um ou mais grupos fosfato no carbono 5, formando os nucletidos.
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A polimerizao de nucletidos para formar cidos nucleicos envolve a formao de ligaes fosfodister, entre o fosfato 5 de um nucletido e o grupo hidroxilo 3 de outro. Oligonucletidos so pequenos polmeros de nucletidos, enquanto que os maiores polmeros se chamam polinucletidos. Os polinucletidos so sempre sintetizados de 5->3, com a adio de um nucletido livre na extremidade 3 da cadeia em crescimento (ligao ao grupo hidroxilo). Assim, por conveno, as sequncias de bases escrevem-se no sentido 5->3. A informao est contida no DNA e no RNA atravs da ordem das bases (A, T, G, C e U) na cadeia de polinucletidos. O DNA uma molcula de dupla cadeia, cujas duas cadeias de polinucletidos correm em sentidos opostos. As bases ficam no interior da molcula, e as duas cadeias so juntas por pontes de hidrognio entre bases complementares: A emparelha com T (A T) por 3 pontes, e G emparelha com C (G = C) por duas pontes. Esta complementaridade de bases permite que uma cadeia de DNA ou RNA sirva de molde para a sntese da cadeia complementar. A informao carregada no DNA e no RNA direcciona, entre outras coisas, a sntese de protenas especficas, que controlam as actividades celulares. Os nucletidos tambm participam noutros processos celulares. Por exemplo, o ATP (adenosina 5-trifosfato), que um nucletido, a principal forma de energia qumica das clulas, existindo tambm outros nucletidos com estas funes. Alm disso, alguns nucletidos (como o cAMP) so importantes molculas intracelulares sinalizadoras.
A diferena entre uma ribose e uma desoxirribose no carbono 2 sendo que a ribose a este carbono tem ligado um grupo hidroxilo (HO) enquanto a desoxirribose tem apenas ligado um hidrognio (H). O grupo fosfato dos nucletidos tem tendncia a reagir com o HO do carbono 2 atacando-o. Ora quando isto acontece a molcula de RNA torna-se instvel e degradada. Como o DNA no tem o grupo hidroxilo este no reage com o grupo fosfato e por isso esta molcula mais estvel. por esta razo que a nossa informao gentica codificada por DNA e no por RNA (Exame 1 Fase, 2008/2009).
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Protenas
As protenas executam as tarefas implcitas pela informao gentica, sendo as macromolculas mais diversas, e realizando uma grande variedade de funes: componentes estruturais das clulas, transporte e armazenamento de pequenas molculas (hemoglobina armazena O2), transmisso de informaes entre clulas (hormonas), e defesa imunolgica (anticorpos). A sua propriedade fundamental a capacidade de actuarem como enzimas, que catalizam praticamente todas as reaces qumicas dos sistemas biolgicos. So polmeros de 20 tipos de aa, que se distinguem pelas diferenas nas cadeias laterais. Os aa so ligados por ligaes peptdicas, entre o grupo -amina de um aa e o grupo -carboxilo de outro aa. Os polipptidos so cadeias lineares de centenas ou milhares de aa, que tm duas extremidades: N-terminus, ou terminal amina; C-terminus, ou terminal carboxilo. Os polipptidos so sintetizados do N-terminus para o C-terminus, e a sequncia de aa num polipptido escrita na mesma ordem. Cada protena consiste numa sequncia de aa especfica, que define a estrutura de uma protena. A conformao tridimensional de uma protena corresponde ao seu estdio termodinmico mais estvel, que depende das interaces entre os diferentes aa. Logo, a sequncia de DNA que d origem protena tambm determina a sua estrutura.
Membranas celulares
A estrutura e funo das clulas depende em muito das membranas, que para alm de separarem os ambientes intracelular do extracelular, definem compartimentos internos nas clulas eucaritas, delimitando o ncleo e os organelos celulares. As membranas biolgicas so bicamadas de fosfolpidos associadas a protenas, que so responsveis por diversas funes especializadas: receptores de sinais externos; transporte selectivo de molculas atravs da membrana; transporte de electres de fosforilao oxidativa. Alm disso, as protenas membranares controlam as interaces entre as clulas de seres multicelulares.
Lpidos Membranares
Os constituintes essenciais das membranas celulares so os fosfolpidos, que so molculas anfipticas, que consistem de duas cadeias hidrofbicas de cidos gordos ligadas a uma extremidade polar hidroflica que contm um grupo fosfato. Como as cadeias de cidos gordos so pouco solveis em gua, os fosfolpidos tendem a formar bicamadas em meio aquoso (efeito entrpico e ligaes Van der Waals), gerando uma barreira estvel entre dois compartimentos aquosos. As bicamadas lipdicas funcionam como fluidos bi-dimensionais, nos quais molculas individuais (lpidos e protenas), podem rodar e mover-se em direces laterais. Esta fluidez uma caracterstica crucial das membranas, e depende da temperatura e da composio da lipdica da membrana. Por exemplo, as interaces entre cadeias curtas de cidos gordos so mais fracas que entre cadeias longas, logo membranas com cidos gordos curtos so menos rgidas e mantm-se fluidas a temperaturas mais baixas. Lpidos compostos por cadeias insaturadas tambm aumentam a fluidez da membrana, pois a presena de ligaes duplas dificulta o empacotamento dos lpidos. 18
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O colesterol possui anis de hidrocarbonetos que so rgidos, e interagem com as cadeias de cidos gordos dos outros lpidos, diminuindo a mobilidade dos cidos gordos, tornando a membrana mais rgida. Por outro lado , a insero do colesterol interfere com as interaces entre as cadeis de cidos gordos, mantendo a fluidez a baixas temperaturas. Assim, o colesterol funciona como um tampo de fluidez da membrana.
Protenas membranares
As protenas so os constituintes principais das membranas celulares, estando inseridas numa bicamada lipdica, segundo o modelo do mosaico fluido. As protenas dividem-se em duas classes principais: protenas intrnsecas (inseridas directamente na bicamada), e protenas extrnsecas (associadas indirectamente membrana, geralmente interagindo com protenas intrnsecas). A maioria das protenas intrnsecas so transmembranares, pois cruzam a bicamada lipdica, tendo pores expostas a ambos os lados da membrana. As pores transmembranares so geralmente -hlices, formadas por resduos apolares, que interagem com a poro hidrofbica da membrana. A membrana pode tambm ser atravessada por uma estrutura em -barril. As protenas transmembranares so molculas anfipticas, pelo que as suas pores hidroflicas esto expostas ao ambiente aquoso. As protenas tambm podem ser ancoradas a membranas por lpidos ligados covalentemente a cadeias polipeptdicas, e as diferentes modificaes lipdicas ditam a que face da membrana as protenas ficam ancoradas.
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Interaces proteicas
Vrias abordagens a larga-escala tm sido aplicadas para identificar interaces entre protenas e complexos, com o objectivo de elucidar as redes complexas das interaces proteicas que regulam o comportamento celular.
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Genes e Cromossomas
Cada caracterstica de um ser determinada por um par de factores herdados, que se chamam genes. Uma cpia de um gene (alelo) que especifica uma caracterstica herdada de cada progenitor. Quando mais de que um alelo diferente est presente num ser, aquele que se manifesta dito alelo dominante, e o outro recessivo. O gentipo a composio gentica de um organismo, enquanto o fentipo so as caractersticas observveis, que resultam da expresso dos genes de um organismo. Os genes so transportados pelos cromossomas, sendo que a maioria dos animais e plantas apresentam duas cpias de cada cromossoma: so diplides. Durante a formao das clulas da linha germinativa, d-se a meiose (tipo de diviso celular), na qual apenas um cromossoma do par de cromossomas transmitido descendncia. Assim, o ocito e o espermatozide so haplides, contendo apenas uma cpia de cada cromossoma. A unio destas duas clulas haplides durante a fecundao cria um novo ser diplide, contendo agora cada par de cromossomas, derivado um do pai e outro da me. O comportamento dos pares de cromossomas semelhante ao dos genes, levando concluso que os genes so transportados pelos cromossomas.
Genes e Enzimas
Um gene especifica a sequncia de aa de uma cadeia polipeptdica.
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Outra experincias vieram demonstrar que era o DNA, e no protenas o material gentico. Foi provada que a actividade do extracto transformador (como no caso dos pneumococcus) era abolida quando se procedia a digesto enzimtica de DNA e no de protenas. Foi tambm demonstrado que quando um vrus (bacterifago) infecta uma clula, necessrio que o DNA viral entre na bactria, e no o protena viral, de forma a que o vrus se replique. Alm disto, o DNA viral que se transmite s partculas virais descendentes.
Estrutura do DNA
A molcula de DNA uma hlice que d uma volta a cada 3,4 nm, sendo que a cada volta existem 10 bases. Esta dupla hlice possui um backbone (coluna) de acar e fosfato do lado de fora, contendo na poro interna bases, orientadas para formarem pontes de hidrognio entre as purinas e as pirimidinas de cadeias opostas. Para justificar que A emparelha com T e G com C, esto os resultados de experincias que demonstram que a quantidade de adenina sempre igual de timina, e que a quantidade de guanina sempre igual de citosina. Assim, devido a esta complementaridade de bases, as duas cadeias de DNA so complementares. Logo, cada cadeia contm a informao necessria para especificar a sequncia das bases da outra.
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A estrutura do DNA
Replicao do DNA
As duas cadeias de DNA podem-se separar e servir como moldes para a sntese de novas cadeias complementares, cuja sequncia seria ditada pelo emparelhamento especfico de bases complementares. Este processo denomina-se replicao semiconservativa, pois cada cadeia de DNA pai conservada, constituindo metade da nova cadeia sintetizada (apenas metade da dupla hlice sintetizada, sendo a outra herdada).
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A experincia por detrs da teoria da replicao semiconservativa foi realizada marcando o DNA com istopos de diferentes densidades. E.coli foram cultivadas durante vrias geraes num meio contendo o istopo de azoto pesado (15N) no lugar do istopo normal de azoto leve (14N). O DNA destas bactrias continha, consequentemente, 15N e era mais pesado que o das bactrias cultivadas num meio com 14N. Depois as bactrias seriam transportadas de volta para o meio contendo 14N e cresceriam durante apenas uma gerao adicional. O DNA extrado destas bactrias e analisado por ultracentrifugao numa soluo com CsCl formaria bandas segundo as densidades das molculas de DNA. O DNA da bactria transferida do meio com 15N para o meio com 14N durante uma gerao gerava bandas com uma densidade intermdia entre a densidade do DNA de 15N e o DNA de 14N, indicando que esta densidade representa uma molcula hbrida com uma cadeia leve e outra pesada.
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A capacidade do DNA servir como molde da sua prpria replicao foi demonstrada pois, a DNA polimerase (enzima da E.coli) consegue catalisar a replicao de DNA in vitro, apenas na presena de um molde de DNA, ao incorporar directamente os nucletidos numa molcula de DNA complementar.
O papel do mRNA
Apesar da sequncia de nucletidos no DNA especificar a ordem dos aa nas protenas, no o prprio DNA que intervm directamente na sntese proteica. Como nos eucariontes, o DNA se encontra no ncleo e a sntese proteica se d no citosol, ter que existir outra molcula que transporte a informao gentica para os locais de sntese (ribossomas). Assim, o mRNA o intermedirio da sntese proteica, sendo sintetizado a partir de um molde de DNA.
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O RNA difere do DNA, pois: constitudo por uma cadeia simples (o DNA uma cadeia dupla); o seu componente glicdico a ribose e no a desoxirribose (no carbono 2 de uma ribose liga-se o grupo OH (hidroxilo) e de uma desoxirribose um H); e a sua base pirimidnica Uracilo (U) substitu a Timina (T) do DNA. Como o RNA se localiza principalmente no citoplasma, aparece como sendo o intermedirio lgico da passagem de informao do DNA para os ribossomas. Com estes dados surgiu o dogma central: DNA RNA Protenas. As molculas de RNA so sintetizadas a partir de um molde de DNA (transcrio) e as protenas so sintetizadas de moldes de RNA (traduo). As molculas de RNA que servem como moldes para a sntese proteica chamam-se de mRNAs: RNAs mensageiros. So transcritos pela enzima RNA polimerase, que catalisa a sntese de RNA a partir de um molde de DNA. Existem mais 2 tipos de RNA importantes para a sntese proteica: RNA ribossomal (rRNA) que um componente dos ribossomas e o RNA de transferncia (tRNA) que serve como molcula adaptadora dos aminocidos ao longo do mRNA.
Cdigo Gentico
Devido no complementaridade entre os aminocidos e o mRNA, existem tRNAs que servem de adaptadores durante a traduo. Cada aminocido diferente ligado, por uma enzima especfica, ao tRNA apropriado. O emparelhamento entre as bases de mRNA e tRNA dirige o aminocido que lhe est ligado para o local correcto do molde de mRNA. A partir de sequncias das quatro bases nucleotdicas do DNA - adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G) - possvel formar exactamente 64 palavras cdigo de trs letras diferentes, tripletos ou codes, pois 43=64. Estes tripletos so a unidade da mensagem gentica que vai codificar a ordenao de sries de aminocidos que caracterizam diversas protenas. Das 64 palavras possveis, 3 so sinais de paragem (codes STOP), indicando se chegou ao fim do cdigo de uma protena. Os restantes tripletos codificam os 20 aminocidos, por isso mais que um tripleto pode codificar o mesmo aminocido (degenerescncia do cdigo gentico). A leitura dos nucletidos comea num local fixo, gerando um quadro de leitura (reading frame), que o conjunto sucessivo de 3 bases que 26
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forma codes sucessivos. Uma alterao no quadro de leitura (frameshift) causa a mudana da sequncia de codes, de uma mesma cadeia de DNA. No caso de mutaes por adio ou remoo de 1 ou 2 nucletidos, esta causa uma mudana no quadro de leitura, fazendo com que todos os aa subsequentes sejam alterados. Adies ou remoes de 3 nucletidos alteram apenas um aa, sendo que o quadro de leitura do resto do gene se mantm normal. O cdigo gentico tem caractersticas muito importantes: Universalidade, que postula uma linguagem comum a praticamente todas as clulas. As excepes existem em certos protozorios e no DNA mitocondrial. Redundncia ou degenerescncia do cdigo gentico, o resultado da existncia de 61 codes a indicar a sntese de protenas, e apenas existirem 20 aa diferentes. Assim, vrios codes codificam o mesmo aa. No ambiguidade, o mesmo codo no codifica aa diferentes. Pouca especificidade do 3 codo, vrios codes que sintetizam o mesmo aa tm o 3 codo igual, pelo que o 3 codo menos especfico, e o 1 o mais especfico. O tripleto AUG tem duas funes, codificando a metionina e representando o codo de iniciao da traduo (sntese proteica). Os tripletos UAA, UAG e UGA so codes de finalizao, no codificando aa, e sinalizando o fim da sntese proteica.
DNA recombinante
At dcada de 1970 parecia impossvel o isolamento e manipulao de genes. Este obstculo foi superado pelo desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante, que possibilitou aos cientistas isolar, sequenciar e manipular genes individuais.
Enzimas de restrio
O primeiro passo no desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante foi a caracterizao de enzimas de restrio, que clivam o DNA em sequncias especficas. So o bisturi que
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permite cortar o DNA, fazendo parte do grupo das nucleases, enzimas responsveis por clivar as ligaes fosfodister entre nucletidos adjacentes. Estas enzimas foram identificadas em bactrias, onde servem como mtodo de defesa contra a entrada de DNA estranho (provindo de vrus, etc) na clula. As enzimas de restrio reconhecem de 4 a 8 pb, sendo estas sequncias especficas, que originam fragmentos de DNA. Porque que o DNA da bactria no digerido pelas suas prprias endonucleases (enzimas de restrio)? As enzimas de restrio no funcionam sozinhas numa bactria, trabalhando em conjunto com enzimas que modificam o DNA bacteriano, tornando-o irreconhecvel pelas endonucleases. Este sistema permite que apenas DNA estranho-no modificado seja digerido por endonucleases. Os fragmentos gerados pela clivagem de uma endonuclease podem ser separados, identificados e purificados numa electroforese de DNA em gel, consoante o comportamento dos fragmentos de DNA num campo elctrico. O gel pode ser de agarose ou poliacrilamida, sendo fundido na presena de um tampo. A soluo deitada num molde e deixada solidificar, formando uma matriz cuja densidade depende da agarose. Ao ser aplicado um campo elctrico atravs do gel, o DNA carregado negativamente (grupos fosfato) migra em direco ao nodo, o elctrodo positivo. A velocidade de migrao depende: tamanho da molcula, concentrao de agarose, intensidade do campo elctrico. O gel funciona como um filtro, retardando o movimento das molculas maiores. Para a separao de molculas leves, usa-se um gel com maior concentrao de agarose. Para se visualizar o gel de agarose utiliza-se o corante brometo de etdio, que possui grupos qumicos que se intercalam com as bases do DNA, sendo que o corante ligado ao DNA fluoresce com mais intensidade que o corante livre, quando irradiado com UV. rea do gel perpendicular ao poo denomina-se pista. Os fragmentos de DNA com o mesmo tamanho migram a mesma distncia gerando bandas. Os locais de restrio para diferentes endonucleases de restrio gera mapas de restrio de molculas de DNA.
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Os fragmentos de DNA gerados para criar molculas recombinantes so normalmente digeridos por enzimas de restrio. Estas clivam nos locais de restrio deixando extremidades com cadeias simples soltas, que se podem associar umas com as outras por complementaridade de bases, sendo que as ligaes entre nucletidos adjacentes so catalisadas por DNA ligases. Assim, dois fragmentos de DNA digeridos pela mesma endonuclease pode ser ligados criando uma molcula de DNA recombinante. Em certos casos, podem-se sintetizar DNA linkers (oligonucletidos, que contm os locais de restrio), e adicion-los s extremidades do DNA de interesse, e posteriormente inseri-lo no vector.
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Sequenciao de DNA
A sequenciao uma tcnica que permite: inferir a sequncia de aa sintetizados por um gene especfico, ao sabermos a sequncia de nucletidos desse gene; estudar as propriedades de sequencias de DNA que regulam a expresso do gene. Processo de sequenciao 1. Desnaturao do DNA a sequenciar 2. Incubao do DNA com um primer (sequncia de DNA complementar essencial para comear a replicao do DNA), na presena de DNA polimerase e dos quatro desoxinucletidos (dATP, dCTP, dTTP, e dCTP), um dos quais radioactivo.
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3. O produto desta reaco depois dividido por quatro tubos, a cada um dos quais se junta um didesoxiribonucleosido-trifosfato (ddATP, ddCTP, ddTTP, e ddCTP), que so nucletidos modificados, desprovidos de grupo hidroxilo no carbono 3, e, portanto, impedem o alongamento das cadeias de DNA em que so incorporados. 4. Como em cada tubo existem milhes de molculas de DNA, originam-se fragmentos de diversos tamanhos consoante a posio de cada nucletido na sequncia original. 5. O DNA de cada tubo desnaturado e colocado num gel de acrilamida com ureia (para evitar a renaturao do DNA durante a electroforese). 6. No final, o gel seco e autoradiografado. 7. Os nucletidos radioactivos incorporados do origem a uma srie de bandas que indicam o tamanho dos fragmentos de DNA produzidos em cada tubo de reaco. 8. Ao contrrio dos gis de agarose, os gis de acrilamida permitem resolver molculas de DNA cujo comprimento difere apenas num nucletido. 9. Como a sntese de DNA ocorre de 5 para 3, os fragmentos menores resultam de uma incorporao do dNTP mais prxima da extremidade 5.
10. Em consequncia, a leitura do gel de baixo para cima indica a sequncia de nucletidos da cadeia 5-3. Para iniciar a reaco de sequenciao necessrio um primer, logo o DNA desconhecido tem de ser enquadrado numa sequncia conhecida, para a qual o primer ser complementar.
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A sequenciao automtica permite acelerar e mecanizar a maior parte do processo de anlise dos resultados. Os diferentes produtos de reaco (G; A; T; C) tm incorporados nucletidos fluorescentes em vez de nucletidos radioactivos, cada um deles com uma cor diferente, num total de 4 cores. A leitura do sinal fluorescente feita por um scanner apropriado que, estando acoplado ao aparelho de electroforese, faz a leitura directamente do gel enquanto a electroforese decorre. A leitura feita em simultneo com a migrao dos fragmentos atravs do gel: sempre que no local do scanner passa uma banda que fluoresce numa cor representado um pico no grfico dos resultados e o software atribui-lhe a letra correspondente cor detectada.
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nucletidos radioactivos ou fluorescentes. DNA radioactivo usado como sonda para hibridao com sequncias complementares de DNA e RNA, detectados devido radioactividade dos hbridos resultantes de 2 cadeias. O Southern Blotting permite a anlise de fragmentos genticos de grandes dimenses e no exige o conhecimento prvio da sequncia de nucletidos da regio de interesse. A tcnica envolve: 1. Separao de DNA por electroforese em gel de agarose; 2. Transferncia das molculas separadas para um suporte slido (membrana ou filtro de nitrocelulose) e hibridao com uma sonda marcada (radioactivamente ou por fluorescncia); 3. Deteco do sinal da sonda (por autoradiografia ou UV). Devido s grandes dimenses do DNA genmico, para que se possa proceder sua separao, necessrio trat-lo com uma enzima de restrio. Esta enzima vai cortar o DNA de forma previsvel, dando origem a milhares de fragmentos diferentes que cobrem um leque vasto de tamanhos, produzindo um aspecto tpico de mancha arrastada (smear) aps a electroforese. As dimenses dos fragmentos genmicos formados vo ser caractersticos de cada indivduo, j que so consequncia da existncia de um local de restrio da enzima usada em determinada posio do genoma e, portanto, reflectem a sequncia do genoma.
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Southern blotting
Aplicaes da Southern blotting: Estudo de variaes polimrficas da sequncia do genoma: STRs short tandem repeats; VNTRs - variable number of tandem repeats; SNPs - single nucleotide polymorphisms As mutaes podem causar diferenas no tamanho dos fragmentos de restrio observados numa populao (RFLPs - restriction fragment length polymorfisms): por destruio ou criao de locais de restrio; por aumento ou reduo do nmero de nucletidos situado entre dois locais de restrio (so diferenas de dimenso facilmente detectveis por esta tcnica).
O Northern Blotting permite analisar o RNA, da mesma forma que o Southern para DNA , e como o RNA j fragmentado o passo da digesto com enzimas no necessrio. Esta tcnica d-nos a informao da expresso de um gene.
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A Hibridao in situ (FISH) de cidos nucleicos pode ser usada para detectar sequncias de DNA ou RNA homlogas em cromossomas ou clulas intactas , sendo os resultados analisados por examinao microscpica de fluorescncia. Esta tcnica pode ser utilizada para detectar o locus do gene no cromossoma, e mRNAs especficos em clulas do mesmo tecido.
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Western blotting
Na Imunoprecipitao as clulas so incubadas com aminocidos radioactivos que vo marcar as suas protenas. Os extractos celulares marcados so incubados com anticorpos que se ligam com o seu antignio-alvo. Os complexos anticorpo-antignio obtidos so isolados e sujeitos a electroforese permitindo a deteco dos antignios radioactivos por autoradiografia.
Imunoprecipitao
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o vector possuir um marcador de seleco, pode-se escolher as clulas correctamente transformadas, cultivando-as num meio que inibe o crescimento de clulas normais.
Os retrovrus podem tambm ser usados como vectores para a insero de um gene de interesse numa clula animal. Eles so particularmente teis, uma vez que o seu ciclo de vida envolve a integrao estvel do DNA viral no genoma da clula infectada.
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Vectores retrovirais
Genes clonados podem tambm ser introduzidos na linha germinativa de seres multicelulares, permitindo o seu estudo no contexto de um animal intacto, em vez de apenas clulas em cultura. Um mtodo utilizado para gerar ratos que transportam o gene de interesse (ratos transgnicos) a microinjeco directa de DNA clonado no proncleo de um ovo fertilizado. Os ovos injectados so ento transferidos para mes de aluguer, e desenvolvem-se. Uma fraco da descendncia ter integrado o DNA de interesse no seu genoma, sendo que este est presente em todas as clulas do animal. Como o DNa est presente tanto nas somticas,
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como nas clulas da linha germinativa, o DNA de interesse transferido cruzando a descendncia.
As propriedades de clulas estaminais embrionrias (ES) providenciam um meio alternativo para a introduo de genes clonados em ratos. As clulas ES podem ser cultivadas a partir de embries de ratos precoces, podendo depois ser reintroduzidos na me e desenvolver um novo ser. por isso tambm possvel introduzir o DNA clonado em clulas ES em cultura, seleccionar as clulas transformadas de forma estvel, e introduzi-las de volta num embrio de rato. Estes embries originam uma descendncia quimrica, na qual algumas clulas derivam das clulas embrionrias normais, e outras das clulas ES transformadas. Em alguns ratos, as clulas ES so incorporadas na linha germinativa, e o cruzamento destes ratos com outros permite que a descendncia herde o gene de interesse.
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Intres e Exes
Em termos moleculares, gene um segmento de DNA que expresso num produto funcional (RNA ou protena). Muito do DNA eucaritico consiste em sequncias entre genes (spacer sequences). Mas dentro do prprio gene tambm podem existir: Exes (sequncias codificantes) e Intres (sequncias no codificantes). O gene totalmente transcrito a RNA que posteriormente sofre splicing (processamento) - remoo dos intres, ficando apenas os exes de modo a formar um mRNA maduro.
A quantidade de DNA em intres muito maior que em exes, sendo que na maioria dos genes humanos a percentagem de intres de aproximadamente 90% do material gentico. Os intres esto presentes na maioria dos genes eucariticos, excepto nalguns seres mais simples (leveduras) e em alguns procaritas. Todavia, intres aparecem em genes raros de alguns procaritas. Logo, a presena ou ausncia de intres no permite uma distino absoluta entre genes procaritas e eucaritas (apesar de prevalecerem principalmente em eucaritas mais complexos). Pensa-se que os intres representam sequncias que foram importantes no inicio da evoluo, ou que a facilitaram, permitindo a recombinao de exes de alguns genes. O desaparecimento de intres em alguns procaritas deve-se seleco natural por rpida 45
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replicao (genoma sem intres menor e replica-se mais rapidamente), que no foi to relevante para os eucaritas, que assim mantiveram os seus intres. Os intres tm um papel no controlo da expresso gentica: a presena de intres permite que os exes de um gene sejam combinados de formas diferentes, resultando na sntese de diferentes protenas. Este processo denomina-se splicing alternativo, e responsvel por estender o reportrio funcional de 20 a 25 mil genes do genoma humano (por isso que so sintetizados mais tipos diferentes de protenas que o nmero de genes diferentes existente). Os intres podem tambm ter ajudado a evoluo, facilitando a recombinao entre exes de diferentes genes exon shuffling. Isto suportado pelo facto de alguns genes serem quimeras de exes derivados de vrios outros genes.
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elementos do tipo transposo, mais especificamente retrotransposes (captulo 6), o que significa que a sua transposio mediada pela transcriptase reversa. Uma terceira classe de elementos dispersos so os elementos tipo-retrovrus (8% do DNA humano), que tambm se movem no DNA como retrotransposes. Uma quarta classe de elementos dispersos, os Transposes de DNA (3% do DNA humano), movem-se ao longo do genoma, sendo copiados e reinseridos como sequncias de DNA, em vez de se moverem por meio da transcrio reversa. Assim, praticamente metade do genoma humano consiste em elementos repetitivos dispersos, que se replicaram e moveram ao longo do genoma, por meio de intermedirios de DNA ou RNA. Assim, 40% do genoma humano deve-se transcrio reversa. Algumas destas sequncias ajudam a regular a expresso genica, mas a maioria parece no ter contribuio para a clula, representando selfish DNA elements, que foram seleccionados, pela sua capacidade de se replicarem no genoma do hospedeiro, mais do que por lhe conferirem uma vantagem selectiva.
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Genoma da levedura S 4% do seu genoma contm intres, sendo 70% do genoma sequncias que codificam um total de 6 000 protenas. Genomas de C.elegans e Drosophila So 10 vezes maiores que o da levedura, mas contm apenas 2 a 3 vezes mais genes, contendo mais intres. Genoma de seres humanos 20 a 30 vezes maiores que o da C.elegans e Drosophila mas contm apenas 20 000 a 25 000 genes. Apenas 1,2% do genoma humano codifica protenas, sendo 20% constitudo por intres, e mais de 60% constitudo por vrios tipos de sequncias repetitivas ou duplicaes de DNA, sendo que o restante corresponde a pseudogenes, e exes que esto presentes nas extremidades 5 e 3 dos mRNAs mas no so traduzidos a protenas. Concluindo, o tamanho aumentado dos genomas de eucaritas superiores deve-se muito mais presena de grandes quantidade de sequncias repetitivas e intres do que ao aumento no nmero de genes.
Cromossomas e Cromatina
O genoma de procaritas contm cromossomas nicos, que so normalmente molculas de DNA circular, enquanto que o genoma de eucaritas composto por vrios cromossomas, contendo cada um uma molcula de DNA linear. O DNA de clulas eucaritas est ligado a pequenas protenas (histonas) que compactam o DNA de forma ordenada no ncleo.
Cromatina
Chama-se cromatina ao complexo formado pelo DNA e as protenas. As protenas mais abundantes so as histonas que contm uma proporo alta de aminocidos bsicos que facilitam a ligao molcula de DNA carregada negativamente. Existem outras protenas para alm das histonas (nonhistone chromossomal proteins) que participam em vrios processos como a replicao de DNA e a expresso gentica.
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O nucleossoma a unidade estrutural bsica da cromatina, que consiste em DNA enrolado num ncleo de histonas. O cromatossoma a subunidade da cromatina que consiste numa sequncia de 166 pb enroladas volta do ncleo das histonas. O empacotamento do DNA com as histonas compem uma fibra de cromatina composta por cromatossomas separados por segmentos de DNA ligante (DNA linker).
Estrutura de um cromatossoma
A condensao da cromatina varia durante o ciclo celular: Em Interfase a maior parte da cromatina est relativamente descondensada (eucromatina) e distribuda ao longo do ncleo. Em interfase os genes so expressos e o DNA replicado (preparao para a diviso celular). Os genes que so mais expressos esto num estado mais descondensado para facilitar o acesso da maquinaria de transcrio. Todavia, 10% da cromatina em interfase est altamente condensada (heterocromatina) e estando inactiva para transcrio, contendo tambm muitas sequncias repetitivas. Durante a Mitose os cromossomas esto muito condensados e no podem servir de molde para a sntese de RNA, pelo que a transcrio cessa.
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Centrmeros
O centrmero uma regio especializada do cromossoma que assegura a distribuio correcta dos cromossomas duplicados pelas clulas filhas, durante a mitose. 1. O DNA replicado durante a interfase, resultando na formao de 2 cpias de cada cromossoma; 2. Assim que a clula entra em mitose, a condensao da cromatina leva formao de cromossoma que consistem em 2 cromatdeos idnticos, que esto ligados na regio do centrmero; 3. Os microtbulos do fuso acromtico ligam-se ao centrmero e os 2 cromatdeos separam-se e movem-se para plos opostos. 4. No fim da mitose, a membrana nuclear reposta e os cromossomas descondensam Assim, os centrmeros servem de locais de associao entre os cromatdeos e os microtbulos, consistindo em sequncias especificas de DNA qual protenas (centromere-associated protenas) se ligam, formando uma estrutura especializada: kinetochore ou cinetocoro. a ligao dos microtbulos ao cinetocoro que medeia a juno dos cromossomas ao fuso acromtico. As protenas associadas aos centrmeros actuam como motores moleculares que conduzem o movimento dos cromossomas ao longo das fibras
Telmeros
Os telmeros so sequncias no final dos cromossomas eucaritas que so importantes para a replicao e manuteno. Consistem em sequencias simples de DNA repetidas, contendo
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resduos G numa cadeia. Estas sequncias so repetidas milhares de vezes terminando com uma cadeia simples de DNA. As sequncias repetidas do telmero formam loops no final dos cromossomas aos quais se juntam protenas que protegem a terminao do cromossoma da degradao. Os telmeros so importantes para a replicao do final das molculas de DNA linear. A DNA polimerase capaz de estender uma cadeia de DNA em crescimento, mas no capaz de iniciar a sntese na extremidade 5 de uma cadeia de DNA linear ( nesta extremidade que se liga o primer para a replicao, pelo que a extremidade 5 no replicada). Assim, as extremidades dos cromossomas no podem ser replicados pela aco normal da DNA polimerase. A manuteno dos telmeros parece determinar a capacidade reprodutiva das clulas. Esta manuteno realizada pela Telomerase, que uma protena capaz de produzir telmeros e de os associar molcula que est a ser replicada para continuar a replicao. uma transcriptase reversa da classe das DNA polimerases que sintetiza DNA a partir do RNA. Ela carrega consigo o RNA que lhe serve de molde e que complementar s sequncias repetidas que sintetiza os telmeros.
Estrutura de um telmero
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funcionaram como esboos para que com esforos subsequentes se completasse a sequenciao do genoma. O Impacto Descobriu-se que o nmero de genes humanos eram muito pequeno (20 a 25 mil genes), e ao que parece, o splicing alternativo muito comum no genoma humano, pelo que muitos genes codificam mais que uma protena. Alm disso, os intres representam 20 % do genoma humano, e as sequncias repetitivas aproximadamente 60%. de realar ainda que 40% do genoma humano composto por sequncias que derivaram da transcrio reversa.
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DNA polimerases
A polimerase I descoberta na E.coli a principal responsvel na reparao de DNA danificado. As clulas eucaritas e procaritas contm DNA polimerase diferentes, que tm funes diferentes, como replicao e reparao. Nos procarionte, a DNA polimerase III a polimerase responsvel pela replicao do DNA. Em eucariontes, existem 3 DNA polimerases (, e ) responsveis pela replicao do DNA. Finalmente, a DNA polimerase est localizada na mitocndria e responsvel pela replicao do DNA mitocondrial. Todas as DNAs polimerase tem 2 caractersticas fundamentais: 1. Todas sintetizam apenas na direco 53, adicionando um dNTP ao grupo hidroxilo do carbono 3 da cadeia em crescimento. 2. Apenas conseguem adicionar dNTPs a uma cadeia primer pr-formada, no so capazes de iniciar a sntese de DNA de novo, ao catalisar a polimerizao de dNTPs livres. As RNA polimerases por outro lado, conseguem iniciar a sntese de uma nova cadeia de RNA na ausncia de um primer. Estas caractersticas das DNA polimerases atribuem um alto grau de fidelidade replicao.
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Forquilha de Replicao
As forquilhas de replicao so regies de sntese de DNA activa. Em cada forquilha, as cadeias pais de DNA separam-se e as duas novas cadeias filhas so sintetizadas. Mas, se as duas cadeias da dupla hlice so antiparalelas (correm em sentidos opostos), a sntese contnua das duas cadeias na forquilha de replicao requereria que uma cadeia fosse sintetizada no sentido 53 e a outra no sentido 35. Mas as DNA polimerases apenas adicionando dNTPs no sentido 53. Como pode ento a outra cadeia ser sintetizada? Estudos demonstram que apenas uma cadeia sintetizada de uma forma contnua na direco global da replicao de DNA, sendo que a outra formada de curtos pedaos de DNA sintetizados no sentido contrrio ao do movimento da forquilha de replicao. Estes pedaos, fragmentos de Okazaki, so juntos pela aco da DNA ligase, formando uma nova cadeia de DNA intacta. A cadeia sintetizada continuamente chamada de leading strand, enquanto que a outra cadeia (dos fragmentos de Okazaki) se denomina lagging strand.
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Como ento iniciada a sntese dos fragmentos de Okazaki? Pequenos fragmentos de RNA servem como primers para a replicao de DNA. A sntese de RNA pode iniciar-se de novo, atravs da enzima primase, que sintetiza pequenos fragmentos de RNA, complementares lagging strand, na forquilha de replicao. Os fragmentos de Okazaki so depois sintetizados estendendo estes primers de RNA atravs da actividade da DNA polimerase.
Para se formar uma lagging strand contnua de DNA, os primers de RNA devem ser removidos e substitudos por DNA. Em procariontes a DNA polimerase I encarrega-se de remover os primers de RNA, funcionando tambm como uma exonuclease, que hidrolisa DNA ou RNA em ambas a direces. A aco de exonuclease da DNA polimerase I no sentido 53 remove os ribonucletidos das extremidades 5 dos fragmentos de Okazaki, permitindo que estes sejam substitudos por dNTPs, gerando fragmentos constitudos apenas por DNA. Em eucariontes, os primers de RNA so removidos pela actividade conjunta de RNase H (degrada o RNA de hbridos RNA-DNA) e exonucleases 53. Os espaos so preenchidos pela DNA polimerase e os fragmentos de DNA so ligados pela DNA ligase, gerando uma lagging strand intacta.
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Existem outras protenas que actuam ao nvel da forquilha de replicao. Uma classe de protenas liga-se s DNAs polimerases e mantm-nas ligadas ao molde de DNA, para que continuem a sntese da nova cadeia de DNA. Estas protenas formam complexos com as DNA polimerases responsveis pela polimerizao das cadeias, reconhecendo e ligando-se poro de DNA entre o primer de RNA e o molde de DNA. O anel formado por este complexo mantm a associao necessria entre a DNA polimerase e o molde de DNA, para que a replicao proceda, permitindo a sntese ininterrupta de milhares de nucletidos de DNA.
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Outras protenas desdobram o molde de DNA e estabilizam as regies de cadeia simples. As helicases so enzimas que catalisam o desdobramento do DNA pai (acoplado com a hidrlise de ATP) a jusante da forquilha de replicao. Depois o DNA desdobrado estabilizado por protenas de ligao ao DNA de cadeia simples, que mantm o molde de DNA desdobrado e estendido numa cadeia simples, para que possa ser copiado pela polimerase. O desdobramento da cadeia de DNA na forquilha de replicao causa o enrolamento do DNA sobre si prprio, que evitado pela aco de topoisomerases. A sntese simultnea da leading e da lagging strand na forquilha de replicao conseguida atravs da formao de dmeros de DNAs polimerases, auxiliadas pelas protenas acessrias. Em eucariontes, as histonas ligadas cromatina do DNA pai so divididas pelas cadeias de DNA filhas, e novas histonas so depois adicionadas.
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Fidelidade da Replicao
A preciso na replicao de DNA crtica para a reproduo de uma clula. A frequncia de erros durante a replicao corresponde incorporao de uma base incorrecta por cada 108 a 109 nucletidos incorporados. A seleco de uma base simplesmente pela sua ligao por hidrognio base complementar resultaria numa frequncia de erros na ordem de uma base incorrecta a cada 100 a 1000 nucletidos incorporados. Assim, o elevado grau de fidelidade atingido resulta em grande parte das actividades da DNA polimerase. A DNA polimerase no catalisa a incorporao de qualquer nucletido que se ligue por pontes de hidrognio cadeia molde. Em vez disso, discrimina activamente a incorporao de bases no correspondentes. Alm disto, existe outro mecanismo responsvel pela preciso da replicao de DNA, que a actividade de proofreading da DNA polimerase. As DNA polimerases replicativas tm actividade de exonuclease na direco 35. Esta exonuclease remove selectivamente bases incorrectamente emparelhadas incorporadas na extremidade da cadeia em crescimento, aumentando a preciso da replicao.
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Quando o DNA sintetizado na direco 53, a energia requerida para a polimerizao deriva da hidrlise do grupo trifosfato 5 de um dNTP livre aquando da sua reaco com o grupo hidroxilo 3 da cadeia em crescimento. Se o DNA se estendesse no sentido 35, a energia para a polimerizao derivaria da hidrlise do grupo trifosfato 5 do nucletido terminal j incorporado na cadeia. Este arranjo eliminaria a possibilidade de proofreading, pois a remoo de um nucletido terminal mal emparelhado eliminaria tambm o grupo trifosfato 5 necessrio como fonte de energia para a elongao posterior da cadeia. Assim, como a sntese do DNA se d no sentido 53 pode-se assegurar uma maior preciso no processo de replicao.
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Existem ainda mecanismos adicionais (Reparao de DNA) que permitem a remoo de bases incorrectamente incorporadas na nova cadeia de DNA, contribuindo tambm para a correcta replicao da informao gentica.
Apesar de origens de replicao nicas serem suficientes para replicar os genomas virais e bacterianos, mltiplas origens so necessrias para replicar os genomas muito maiores dos eucariontes durante um perodo de tempo razovel. Nas leveduras as origens de replicao denominam-se ARS (autonomuosly replicating sequences), e so os locais de ligao dum complexo proteico, o ORC (origin recognition complex), que necessrio para a iniciao da replicao de DNA em origens de leveduras. Este complexo ORC recruta outras protenas (helicases, etc) para a origem, levando iniciao da replicao. A funo das protenas do complexo ORC a mesma para todos os eucariontes, das leveduras aos mamferos. Contudo, para eucaritas mais complexos, a iniciao da replicao pode ser determinada por aspectos como a estrutura da cromatina.
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sequncias repetitivas dos telmeros, mantendo-os na ausncia de um molde de DNA para dirigir a sua sntese.
Aco da telomerase
O DNA dos telmeros uma sequncia de repeties simples, com uma extremidade 3 de cadeia simples, na leading strand. A telomerase transporta a sua prpria molcula de RNA, que complementar ao DNA dos telmeros. A extremidade 3 de cadeia simples emparelha com o RNA da telomerase, que serve de molde para a extenso da leading strand por uma unidade de repetio. A lagging strand de DNA telomrico pode ento ser elongada por priming de RNA convencional e actividade da DNA polimerase. Defeitos na telomerase e a normal manuteno dos telmeros esto associados a inmeras doenas humanas. A actividade da telomerase regulada em clulas em diviso de forma a manter o tamanho dos telmeros. Apesar de nas clulas embrionrias o tamanho dos telmeros no ser afectado, nas clulas somticas a actividade da telomerase no suficiente para manter o tamanho dos telmeros por um nmero indefinido de divises. Assim, os telmeros encurtam gradualmente com a idade, levando morte celular. Muitos sndromas de envelhecimento precoce esto ligados perda anormal e elevada de telmeros. Por outro lado, clulas cancerosas exprimem elevados nveis de telomerase, permitindo-lhes continuar a dividir indefinidamente.
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Aco da Telomerase
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Reparao de DNA
O DNA pode sofrer mutaes durante a replicao, atravs da incorporao incorrecta de bases. Pode tambm sofrer mudanas qumicas espontneas ou como resultado da exposio a qumicos ou radiaes. Tais danos ao DNA podem bloquear a replicao ou transcrio. Para manter a integridade dos genomas, as clulas desenvolveram mecanismos de reparao de DNA, que se didivem em duas classes: reverso directa da reao qumica responsvel pelos danos; remoo das bases danificadas seguida da subsitituio por novos nucletidos. Quando a reparao de DNA falha, outros mecanismos celulares entram em aco. Existem duas formas de danificao espontnea do DNA: desaminao (perda da amina NH2) da adenina, citosina e guanina; e depurinao (perda das bases de purinas), que resulta da quebra da ligao entre as bases de purina e a desoxirribose.
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Reparao Recombinacional
O DNA danificado pode ser substitudo pela recombinao com uma molcula ntegra. Este mecanismo muito importante em casos de reparao de DNA durante a replicao, e de quebras de DNA em ambas as cadeias.
Rearranjos de DNA
A recombinao homloga rearranja os cromossomas homlogos, mas no produz alteraes nas posies dos genes ao longo do genoma. Estes fenmenos de rearranjo que movem os
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genes ao longo do genoma so importantes tanto para a regulao gnica, como para a evoluo de gerao de biodiversidade.
Recombinao Site-Specific
Com ampla homologia entre as sequncias, a recombinao site-specific ocorre entre sequncias especificas do DNA, normalmente homlogas em apenas uma pequena parte do DNA. Esta interaco mediada por protenas e no por complementaridade de bases. Um exemplo desta recombinao a integrao e remoo do DNA viral aquando da infeco da E.Coli pelo bacterifago. Esta recombinao ainda importante para os rearranjos programados que ocorrem nos genomas celulares, como o caso do desenvolvimento do sistema imunolgico. Os anticorpos so resultado deste tipo de recombinao entre os genes para as imunoglobulinas (linfcitos B) e os receptores de clulas T, o que lhes permite identificar um grande nmero de antignios. As RAG 1 e RAG 2 esto envolvidas em processos de clivagem e juno na recombinao site-specific para a formao de anticorpos.
A recombinao VDJ
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replicao e integrao num novo local, ficando a sequncoa de insero original no seu local inicial.
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Amplificao Gnica
A amplificao gnica resulta na replicao repetitiva de uma certa regio do cromossoma. Em certos casos, a amplificao gnica serve para aumentar a expresso gentica durante o desenvolvimento. A amplificao tambm ocorre frequentemente em clulas cancerosas, onde pode resultar na elevada expresso de genes que contribuem para a proliferao celular descontrolada.
Amplificao gnica
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Primeiro, genes com promotores que diferem destas sequncias consenso so transcritos menos eficientemente do que genes com promotores com sequncias mais prximas. Segundo, mutaes nas sequncias consenso -10 ou -35 tm fortes efeitos na funcionalidade do promotor. Terceiro, os locais onde a RNA polimerase se liga ao promotor foram identificados por experiencias footprinting. A subunidade liga-se especificamente a sequncias nas regies -10 e -35 do promotor, confirmando a importncia destas sequncias. O DNA footprinting uma tcnica que permite identificar exactamente onde uma protena se liga ao DNA (por exemplo a identificao dos locais de ligao da RNA polimerase).
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Footprinting de DNA
Concluindo, na ausncia de a RNA polimerase liga-se no especificamente ao DNA, com baixa afinidade. direcciona a RNA polimerase para o promotor, levando ao inicio da transcrio. Aps a adio de cerca de 10 nucletidos, a subunidade libertada da RNA polimerase, que depois deixa o promotor e continua a elongao. medida que avana, a RNA polimerase desenrola a cadeia de DNA frente, e volta a enrolar atrs.
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A sntese continua at a polimerase encontrar um sinal de terminao. A transcrio cessa, o RNA libertado da polimerase, e a enzima desassocia-se. H dois mecanismos alternativos: 1. O mais simples inverso simtrica da sequncia repetida GC seguida de aproximadamente 7 A. Isto leva a formao de um segmento de RNA que pode formar um loop estvel por complementaridade de bases, que por sua vez leva quebra da sua associao com a cadeia de DNA e termina a transcrio. 2. Pode ser terminada por uma protena especfica (Rho) que se liga a segmentos de grande extenso.
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Terminao da transcrio
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Promotor eucarita
Genes transcritos pela RNA polimerase II tm alguns elementos importantes no promotor, como a TATA box e a sequencia Inr, que servem como local de ligao especifico para os factores de transcrio. Mas existem outras sequncias igualmente importantes que servem como local de ligao a diversos factores de regulao que controlam a expresso de genes individualmente. Localizam-se na maior parte das vezes a montante (upstream) da TATA box, a 100 nucletidos, ou at a 10 Kb. Estas sequncias so chamadas enhancers 2 repeties de 72 pares de bases, essenciais transcrio a partir deste promotor. Descobriu-se que estas repeties estimulavam a transcrio, e que a sua actividade no depende nem da distncia ao promotor, nem da sua orientao relativamente ao promotor so eficazes tanto upstream, como downstream, forward ou backward.
Aco de enhancers
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Isto possvel devido capacidade do DNA fazer loopings, que permite que um factor de transcrio ligado a um enhancer muito distanciado, possa interagir com as protenas associadas RNA polimerase ou Mediador. A ligao de protenas especificas reguladoras da transcrio a enhancers responsvel pelo controlo da expresso de genes durante o desenvolvimento e a diferenciao, assim como durante a resposta da clulas a hormonas e factores de crescimento. Um exemplo: O enhancer da imunoglobulina est apenas activo nos linfcitos. Assim esta sequncia reguladora em parte responsvel pela especificidade destas clulas. Apesar do DNA looping permitir aos enhancers actuar a uma distncia considervel, a actividade de qualquer enhancer especfica a um determinado promotor. Esta especificidade mantida em parte por insulator ou elementos barreira, que dividem os cromossomas em domnios independentes e apenas permitem que um enhancer actue apenas no seu promotor. Nota: Uma grande barreira para a terapia gentica que os genes introduzidos so muitas vezes mal regulados ou inactivados por causa da estrutura da cromatina prxima.
Repressores eucaritas
A expresso gentica das clulas eucaritas regulada por repressores assim como por activadores da transcrio. Os repressores ligam-se a sequencias especificas de DNA e inibem a transcrio. Nalguns casos, os repressores limitam-se a interferir com a ligao de outras factores de transcrio ao DNA. Por exemplo, a ligao de um repressor perto do local de inicio da transcrio, pode bloquear a interaco da RNA polimerase com o promotor, que uma aco semelhante aos repressores nas bactrias.
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Ao contrrio dos repressores que simplesmente interferem com o local de activao da transcrio, h outros, os repressores activos, que contm locais especficos que inibem a transcrio via interaces protena-protena.
Muitos repressores activos tm um importante papel na regulao, como por exemplo no crescimento celular e diferenciao. Os alvos dos repressores so diferentes: os repressores podem inibir a transcrio interagindo com protenas especficas, com o Mediador ou factores de transcrio, e corepressores que actuam modificando a estrutura da cromatina. Um importante papel dos repressores, tambm inibir a expresso de certos genes em certas clulas, levando assim diferenciao celular.
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condensao tem implicaes claras na transcrio, por isso a estrutura da cromatina um aspecto crtico da expresso gentica nas clulas eucaritas. Genes que esto a ser transcritos encontram-se na forma descondensada (eucromatina). Os factores de transcrio e a RNA polimerase tm de ultrapassar o problema do DNA estar condensado, em vez de estar livre, pois difcil ligarem-se estando o DNA enrolado nas histonas, podendo at nem conseguir reconhecer o local de ligao. Vrias modificaes so caractersticas de cromatina transcricionalmente activa, como modificaes nas histonas, rearranjo dos nucleossomas, e a associao de duas protenas cromossomais no histnicas, chamadas protenas HMGN. A acetilao de histonas (HAT) est relacionada com a activao da transcrio nos cromossomas em diversas clulas eucaritas. As histonas tm dois domnios: um domnio envolvido nas interaces com outras histonas e no enrolamente de DNA volta do nucleossoma, e um outro domnio, o domnio amino-terminal, rico em lisina e que pode ser modificado por acetilao. (A lisina tem carga positiva, o DNA carga negativa devido ao grupo fosfato. Se se acetilar as lisinas estas deixam de ser posigtivas, e deixam de ser atradas pelo DNA, descondensando.) Estudos fizeram a ligao entre a acetilao de histonas e a regulao da transcrio, demonstrando que os activadores da transcrio e os repressores esto associados com as histonas acetiltransferases (HAT) e desacetilases (HDAC), respectivamente. Parece que alteraes especficas nas histonas afectam a expresso dos genes, providenciando locais de ligao para as protenas reguladoras histone code.
Acetilao de Histonas
Outro modo de regular a estrutura da cromatina atravs dos factores de remodelao dos nucleossomas, que actuam sem remover ou alterar as histonas.
Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Snia
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Metilao do DNA
Este outro mecanismo que controla a transcrio nos eucaritas. Os resduos de citosina podem ser modificados pela adio de um grupo metilo. O DNA metilado especificamente em citosinas localizadas antes de Guaninas, na cadeia de DNA, e esta metilao est relacionada com a represso da transcrio. Os genes no cromossoma X inactivo esto tambm metilados, o que supe que este processo est tambm envolvido no processo de inactivao.
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Metilao de DNA
A metilao tem tambm um importante papel de regulao num fenmeno conhecido como genomic imprinting, que controla a expresso de alguns genes envolvidos no desenvolvimento de embries. H alguns imprinting genes cuja expresso depende se provm do pai ou da me. Nalguns casos apenas o alelo paterno expresso, e o alelo materno transcricionalmente inactivo. Metilao de DNA parece ter um papel chave na distino entre alelos paternos e maternos. O gene H19 um exemplo. transcrito apenas o alelo materno. Este gene especificamente metilado durante o desenvolvimento das clulas germinativas masculinas, mas no nas femininas.
Imprinting gentico
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Mas a modificao mais significativa a remoo dos intres, por splicing. As sequncias codificantes de RNA (exes) so interrompidas por outras no codificantes (intres) que so retiradas.
Mecanismos de Splicing
Vrios sistemas foram desenvolvidos in vitro para explicar este mecanismo.
Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Snia
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1. Primeiro, o pr-mRNA clivado no local de splicing 5, e a extremidade 5 do intro une-se a um nucletido de adenina perto da extremidade 3 do intro (branch point). Neste passo, uma ligao pouco usual faz-se entre o terminal 5 do intro, e o grupo hidroxilo, no carbono 2, da adenina. O resultado um loop formado pelo intro. 2. O segundo passo a clivagem na extremidade 3 do intro e a ligao dos 2 exes. O intro retirado e posteriormente degradado. Estas reaces envolvem 3 sequncias especficas: sequncias na extremidade 5 do intro, na extremidade 3 deste, e no local de ligao (branch point) (onde a extremidade 5 se liga ao intro, formando um loop).
Splicing de pr-mRNA
Anlises bioqumicas revelaram que o splicing ocorre num grande complexo spliceossoma composto por protenas e RNAs. Os RNAs constituintes do spliceosoma denominam-se small nuclear RNA (snRNA) e so U1, U2, U4, U5 e U6. O primeiro passo realizado pelo spliceossoma a ligao de U1 snRNA ao local de splicing 5. Esta ligao involve o reconhecimento de certos pares de bases. U2 snRNA liga-se de seguida ao branch point, tambm por complementariedade de bases. De seguida, um complexo formado por U4/U6 e U5 snRNAs incorporado no spliceosoma. A reaco de splicing acompanhada por rearranjos nos snRNAs. U5 liga-se de seguida s sequncias na extremidade 3 do intro, seguido do corte e ligao dos exes. Os snRNA no se limitam a reconhecer as sequncias consenso, mas clivam tambm o intro self-splicing. So capazes de remover os seus prprios intres na ausncia de outras protenas ou factores de RNA. Os intres contm frequentemente vrias sequncias que so semelhantes s sequncias consenso, por isso o spliceossoma tem de ter capacidade para identificar os locais correctos, de modo a reproduzir um mRNA funcional.
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Intres Self-splicing
Edio de RNA
A Edio de RNA refere-se a eventos que introduzem alteraes nas sequncias codificantes de protenas de alguns mRNA. Este tipo de alteraes inclui a desaminao das citosinas em uridinas e adenosinas em inosinas. Um dos melhores exemplos a edio de mRNA da apolipoprotena B, que transporta lpidos no sangue. Neste caso, dois diferentes tecidos geram duas formas diferentes de apolipoprotenas a partir do mesmo mRNA. Nos humanos, a ApoB100 sintetizada no fgado por traduo de um mRNA no editado. No entanto, uma protena mais curta sintetizada no intestino como resultado da traduo de um mRNA editado, onde um C foi trocado por um U por desaminao. Esta alterao altera do codo da glutamina (CAA) no mRNA no editado, para um codo de terminao (UAA), resultando na sntese de um mRNA mais curto.
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Degradao de RNA
Os mRNAs funcionais de eucaritas so degradados a diferentes velocidades, funcionando como um mecanismo adicional de controlo da expresso gentica. Em alguns casos, sinais extracelulares so responsveis pelas taxas de degradao de mRNAs. As clulas possuem um sistema de controlo de qualidade (nonsense-mediated mRNA decay) que leva degradao de mRNAs que no tm a sequncia completa prevenindo a sntese de protenas anormais. A degradao no citoplasma outro modo de controlo da expresso dos genes. Enquanto o rRNA e tRNA so muito estveis, o mRNA bacteriano rapidamente degradado, permitindo respostas rpidas e variaes ambientais. mRNA eucarita por outro lado tem taxas de degradao variadas, sendo outra forma de regulao da expresso gentica. A degradao no citoplasma ocorre por: encurtamento das cadeias poli-A; remoo do cap na extremidade 5; degradao por nucleases a partir das extremidades. Existem ainda mRNAs instveis que codificam protenas reguladoras e contm muitas sequncias ricas em AU perto da extremidade 3.
Regulao da estabilidade do mRNA do receptor de transferrina B Regulao do mRNA para o receptor transferrina: Os nveis de mRNA para o receptor transferrina (receptor membranar que permite a entrada de ferro na clula) so controlados pela disponibilidade de ferro. Se a disponibilidade de ferro for adequada, o mRNA rapidamente degradado, como resultado de uma clivagem perto da extremidade 3. Se o ferro for escasso, contudo, uma protena reguladora liga-se sequncia perto da extremidade 3 do mRNA, protegendo-o da clivagem.
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RNAs de transferncia
Cada um dos 20 aminocidos tem que ser alinhado com os codes correspondentes do mRNA. Para isso existe o tRNA, que serve como adaptador para este processo, fazendo a ligao entre o mRNA e o aminocido correspondente. Este tem uma estrutura de L, requerida para se encaixar do ribossoma durante a traduo. Todos os tRNAs terminam numa extremidade 3 com a sequncia CCA qual se liga o aminocido. Na outra poro do tRNA localiza-se uma sequncia de 3 nucletidos complementar ao codo (anticodo). A ligao dos aminocidos ao tRNA especfico catalisada pela aminoacil tRNA sintetase (ATP-dependente), que reconhece um aminocido para o tRNA correcto.
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O Ribossoma
Os ribossomas so locais de sntese proteica, tanto nos procaritas, como nos eucaritas. Neles se faz a ligao entre o tRNA e o mRNA. Os ribossomas tm duas subunidades que geralmente se apresentam separadas no citoplasma, s se ligando para efectuar a sntese proteica, contendo cada uma delas protenas e rRNA. O ribossoma permite manter os aa juntos e a realizao das ligaes peptdicas durante a sntese proteica.
Nos procaritas os codes de iniciao de mRNAs so precedidos por uma sequncia, a sequncia Shine-Dalgarno, que alinha o mRNA no ribossoma para a traduo, atravs da complementaridade de bases com a extremidade 3 do rRNA. Assim, este emparelhamento permite no s a iniciao da traduo na extremidade 5, como em locais internos do mRNA, no caso de mRNAs policistrnicos
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Em contraste, os ribossomas eucariticos reconhecem o mRNA ligando-se ao cap de 7metilguanosina na extremidade 5. Depois os ribossomas descem ao longo do mRNA at encontrarem o codo de iniciao (geralmente AUG - metionina). Em engenharia gentica muito importante notar que RNAs humanos no contm a sequncia Shine-Dalgarno, e por isso quando se recorre a um vector plasmdico e se coloca num procarita, se o gene de interesse no contiver esta sequncia, o ribossoma do procarita no conseguir reconhecer o local a partir do qual se comea a sntese proteica.
Processo de Traduo
A traduo divide-se em 3 etapas: iniciao, elongamento e finalizao. Iniciao 1. Ligao do mRNA e de um tRNA iniciador, que transporta usualmente o aminocido metionina subunidade menor de um ribossoma; 2. A subunidade maior do ribossoma liga-se ao conjunto, ficando o ribossoma funcional. So necessrias protenas no ribossomais especificas factores de iniciao eucariticos. Alongamento a fase de traduo dos codes sucessivos do mRNA e da ligao dos aminocidos. Os locais do ribossoma a que se liga o tRNA designam-se stios P, A e E. 1. O tRNA iniciador liga-se ao stio P; 2. O prximo tRNA liga-se ao sitio A, pelo emparelhamento com o segundo codo; 3. H a formao de uma primeira ligao peptdica entre o aminocido que ele transporta e a metionina;
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4. Durante este processo o ribossoma move 3 nucletidos ao longo do mRNA, posicionando o codo seguinte no sitio A vazio; 5. O alongamento do pptido continua at que um codo STOP seja translocado no sitio A do ribossoma. Finalizao 1. Os codes de finalizao no tm nenhum anticodo complementar, mas existem factores de libertao que reconhecem os sinais e terminam a sntese proteica. Estes factores ligam-se a um codo STOP no sitio A e estimulam a hidrlise do polipptido completo do ribossoma; 2. O tRNA libertado, as subunidades do ribossoma e o mRNA dissociam-se.
A sntese proteica um processo com as seguintes propriedades: 1. Complexidade: faz interferir vrios agentes 2. Rapidez: uma clula eucaritica junta 140 aminocido de uma cadeia de hemoglobina em dois a trs minutos. 3. Amplificao: a mesma zona de DNA pode ser transcrita vrias vezes, formando-se assim vrias molculas de mRNA idnticas. Por outro lado, os polirribossomas mostram que a traduo da mesma mensagem descodificada simultaneamente por vrios ribossomas. Originam-se, deste modo, vrias cadeias polipeptdicas idnticas, resultando cada uma delas da traduo efectuada por cada ribossoma. Desta forma, apesar de o mRNA ter curta durao, como a sua mensagem podem ser traduzida vrias vezes amplificada a sua actividade.
Regulao da Traduo
A traduo de mRNAs particulares pode ser regulada pela ligao de protenas repressoras, microRNAs no-codificantes, e poliadenilao controlada. De forma global, a actividade das clulas modulada em resposta ao stress celular, disponibilidade de nutrientes, e estimulao por factores de crescimento (FC).
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Um mecanismo de regulao da traduo a ligao de protenas repressoras (que bloqueiam a traduo) a sequncias de RNA especficas. Um exemplo a regulao da sntese de ferritina, a protena que armazena ferro dentro a clula. A traduo da ferritina regulada pela disponibilidade de ferro: mais ferritina sintetizada se o ferro for abundante. Esta regulao mediada por uma protena, que na ausncia do ferro se liga a uma sequncia na UTR 5 do mRNA da ferritina, bloqueando a sua traduo. Na presena de ferro, o repressor no se liga UTR 5, permitindo que a traduo prossiga.
de realar que a ligao da mesma protena reguladora a locais diferentes do mRNA pode gerar efeitos diferentes na expresso gnica, num caso podendo inibir a traduo, e noutro estabilizando o mRNA, aumentando a sntese proteica. Outro mecanismo envolve a modulao da actividade dos factores de iniciao, particularmente o IF-2. No entanto este processo tem efeitos globais na actividade de traduo, no sendo especfico. Contrariamente a estes processo, existe um que envolve o factor IF-4E que se vai ligar extremidade 5 dos mRNAs e age como uma protena reguladora da traduo, estimulando o inicio da traduo, pelo recrutamento da pequena subunidade do ribossoma. A regulao da traduo pode ainda ser efectuada por miRNAs (cadeia dupla), que se associam ao complexo RISC, desdobrando-se em duas cadeias simples. Depois o miRNA conduz o RISC sequncia complementar de mRNA, levando clivagem do mRNA ou represso da sua traduo.
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Clivagem Proteica
A clivagem proteica da cadeia polipeptdica, designada de protelise, um passo importante na maturao de muitas protenas (um exemplo a frequente remoo da metionina iniciadora). So frequentemente adicionadas sequncias sinalizadoras, que marcam o destino da protena. necessrio clivar essa sequncia para que a protena mature.
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Outro exemplo o da insulina, que sintetizada contendo uma nica cadeia, que contm uma sequncia sinalizadora. Inicialmente clivada essa sequncia sinalizadora, pelo que a restante cadeia estabelece as ligaes que iro dar origem sua conformao tridimensional. Por fim, esta cadeia clivada em dois pontos, sendo retirado um segmento intermdio, originando-se assim dois domnios diferentes. A presena daquele segmento intermdio no para contribuir para a funo da protena, mas sim para a sua correcta conformao.
Glicolizao
Muitas protenas so modificadas por adio de glcidos, num processo denominado de glicosilao, e passam a designar-se glicoprotenas. As pores glicdicas desempenham um papel importante na dobragem proteica no retculo endoplasmtico, na marcao de protenas e como locais de reconhecimento nas interaces clula a clula. As glicoprotenas so geralmente segregadas ou incorporadas na membrana, e o processo de glicosilao ocorre no reticulo endoplasmtico, geralmente, durante a traduo. Existe a N ou O glicosilao,
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dependendo do local onde esta ligado o glcido, e isso faz com que difira o local onde e realizada a glicosilao
Ligao de Lpidos
Algumas protenas so modificadas pela ligao de lpidos cadeia polipeptdica, que geralmente marcam e ancoram essas protenas membrana plasmtica. Existem trs tipos de adio de lpidos: N-miristoilao, prenilao e palmitoilao. Um quarto tipo, a adio de glicolpidos, tem um papel importante no ancoramento de algumas protenas na face extracelular da membrana.
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O retculo endoplasmtico
O RE um organito que consiste num conjunto de tubos e sacos (cisternas) que se estendem da membrana nuclear para o citoplasma, sendo o maior organito de muitas clulas eucariticas. Estas cisternas encontram-se delimitadas pela membrana do retculo endoplasmtico. Consideram-se 3 domnios na membrana do retculo: RE rugoso, coberto de ribossomas na sua superfcie externa; RE de transio, em que ocorre a exportao de vesculas para o Golgi; e, por fim, RE liso, que est envolvido no metabolismo de lpidos.
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durante ou aps a traduo dos mRNA pelos ribossomas livres. Nos mamferos, este encaminhamento ocorre principalmente durante a traduo dos mRNA (embora possa ser pstraduo), enquanto nas leveduras, por exemplo, o encaminhamento maioritariamente posterior traduo. As protenas destinadas a outros organitos, tais como citoplasma, mitocndrias, cloroplastos ou peroxisomas so sintetizadas nos mesmos ribossomas livres e libertadas directamente no citosol. No existe diferena estrutural entre os ribossomas livres e os ribossomas associados a RE. Toda a sntese proteica se inicia em ribossomas livres. No entanto, ribossomas livres envolvidos na sntese de protenas de secreo so encaminhados para a membrana do retculo endoplasmtico atravs de uma sequncia-sinal intrnseca prpria protena em traduo. Estes pequenos segmentos de sinalizao so normalmente clivados da cadeia polipeptdica durante a transferncia da protena para o lmen do retculo endoplasmtico. Esta hiptese foi estudada em 1971, atravs de experiencias in vitro em que se conclui que ribossomas livres traduzem protenas de secreo um pouco maiores do que a protena secretada in vivo. No entanto, se na experincia fossem includos microssomas (a unidade bsica do retculo endoplasmtico rugoso) verificava-se uma clivagem daquelas protenas dimenso esperada. Estas experincias deram mais detalhe hiptese que propunha a existncia de uma sequncia no terminal amina que encaminharia a cadeia polipeptdica at ao ER e seria posteriormente clivada por uma protease microssomal. As concluses foram confirmadas por outras experincias envolvendo DNA recombinante, em que a adio de uma sequncia codificante de uma sequncia sinal se mostrou suficiente para direccionar a protena recombinante ao retculo endoplasmtico. Depois de emergirem do ribossoma, durante a traduo, as sequncias-sinal so reconhecidas e acopladas a uma signal recognition particle (SRP) que consiste em seis polipptidos e ainda um pequeno RNA (srpRNA). A SRP liga-se ento ao ribossoma e sequncia-sinal, inibindo a traduo at que o complexo SRP, ribossoma e cadeia polipeptdica em crescimento se ligue ao receptor de SRP, na membrana do RE. A ligao daquele complexo ao receptor de SRP promove a separao deste ltimo do complexo, originando-se uma SRP livre para um novo ciclo de encaminhamento. J acoplado membrana do RE, o ribossoma liga-se ento a uma protena de translocao, que promove a insero da sequncia-sinal num canal da membrana - translocon. Todo este processo mediado pela ligao de GTP SRP e ao receptor de SRP. a transferncia do complexo ribossoma + cadeia polipeptdica para o translocon que abre o canal de membrana e permite, a prossecuo da traduo atravs deste. A sequncia-sinal ento clivada e a cadeia polipeptdica libertada no lmen do RE. O encaminhamento de cadeias polipeptdicas para o RE pode, nalguns casos, ser feito aps a traduo. Estas protenas so sintetizadas nos ribossomas livres, mantidas na estrutura primria por protenas (chaperonas) do citosol (para que possam entrar no translocon) e a sua sequncia-sinal reconhecida por receptores da membrana do RE associados ao translocon. No h necessidade de SRP.
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Insero de uma protena na membrana do RE com uma sequnciasinal clivvel e uma nica stop-transfer sequence1
A sequncia-sinal clivada medida que o polipptido atravessa a membrana do RE e, portanto, a poro terminal amina da cadeia exposta ao interior do lmen. No entanto, a translocao do pptido interrompida por uma stop-transfer sequence que fecha o translocon e sai deste lateralmente, de forma a ancorar-se s caudas hidrofbicas dos fosfolpidos da membrana do ER. A continuao da traduo aps a stop-transfer sequence resulta numa protena de transmembranar com a poro carboxlica no lado citoslico.
Insero de uma protena na membrana do RE com uma sequnciasinal interna sequncia (e, portanto, no-clivvel)2
Esta posio interna da sequncia sinal pode levar introduo de protenas na membrana do RE em ambas as orientaes. Assim, a sequncia-sinal pode determinar uma insero tal do polipptido que a sua poro N-terminal se expe no lado citoslico. A restante cadeia polipeptdica translocada para o interior do lmen do RE medida que a traduo ocorre. A sequncia sinal no clivada e actua, ento, como domnio transmembranar, ancorando a protena bicamada lipdica. Pode tambm acontecer que a sequncia-sinal promova a translocao do domnio N-terminal atravs da membrana; a prossecuo do processo de traduo resulta numa protena transmembranar com a sua poro N-terminal voltada para o lmen do RE. Note-se que a orientao a mesma obtida quando a sequncia-sinal clivvel e seguida por uma stop-transfer sequence.
Sequncia usualmente em hlice- que impede a translocao da cadeia peptdica a montante para o lmen do RE. Figura 10.12 2 Figura 10.12
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Insero de uma protena na membrana do RE com mltiplas stoptransfer sequences (domnios transmembranares)3
Uma sequncia-sinal interna pode determinar na insero de uma cadeia polipeptdica com a sua poro N-terminal no lado citoslico. Uma stop-transfer sequence sinaliza o encerramento do canal de translocao, originando-se um loop no lmen do retculo endoplasmtico. A traduo continua no citosol at que uma nova sequncia-sinal traduzida reabre o canal de translocao; a prossecuo da traduo origina um loop no citosol. O processo pode ser repetido mltiplas vezes, resultando em protenas que atravessam a membrana vrias vezes. A maior parte das protenas transmembranares destinadas a outros compartimentos na via de secreo so a eles dirigidas atravs de vesculas de transporte. No entanto, h excepes, como por exemplo protenas da membrana interna do ncleo, que contgua membrana do RE.
Figura 10.14
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O Aparelho de Golgi
O aparelho (ou complexo) de Golgi funciona como uma fbrica em que as protenas recebidas do RE so processadas e destinadas a vrios locais: endossomas, membrana citoplasmtica, lisossomas ou meio extra-celular. Conforme j referido, a sntese de esfingomielina e glicolpidos tem lugar neste organito.
Organizao do Golgi
Na maioria das clulas o Golgi constitudo por cisternas e vesculas cujos limites so membranas lipdicas. Uma das propriedades deste organito a sua polaridade, tanto em estrutura como em funo. Assim, as protenas do RE entram pela face cis, convexa e orientada para o ncleo, e saem pela face trans, cncava. Este processo de transporte essencial na manuteno da estrutura e funcionalidade do complexo de Golgi, como demonstram experincias em que o transporte de vesculas a partir do RE bloqueado. Ao passar pelo Golgi, as protenas so modificadas e destinadas aos seus locais. No Golgi podem considerar-se quatro compartimentos: a rede cis, a rede trans e as pilhas Golgi medial e trans. nestas ltimas que ocorrem os principais metabolsimos do complexo de Golgi. As protenas modificadas so posteriormente transportadas rede trans, um centro de distribuio, dirigindo as molculas aos seus destinos.
A extenso destas modificaes depende de diversos factores tais como estrutura da protena e quantidade de enzimas de processamento disponveis no Golgi, que varia de acordo com o tipo de clula. Assim, consoante estes factores variem possvel obter glicoprotenas muito variadas. As glicosiltransferases adicionam resduos de monossacardeos, enquanto as glicosidades removem esses mesmos resduos.
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O processamento dos resduos glicdicos N-linked das protenas lisossomais difere do aplicado s protenas dirigidas membrana citoplasmtica ou secreo. Estes so modificados por uma reaco de fosforilao de manose, cuja enzima reconhece a estrutura tridimensional das protenas lisossomais (folding). Esta etapa previne a remoo dos resduos noutras etapas de processamento. O sinal manose-6-fosfato ento reconhecido por um receptor prprio na regio trans do Golgi, que encaminha a glicoprotena para os lisossomas ou endossomas.
Outras modificaes proteicas podem ter lugar no Golgi, tais como: adio sequencial de resduos glicdicos s cadeias laterais de serina e treonina dentro de sequncias especficas.
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vesculas especficas dirigidas queles organitos. No caso das plantas e leveduras, em que no existem lisossomas, as protenas so transportadas para os vacolos.
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vesculas clathrin-coated podem ter variados destinos. Como os alvos requerem diferentes protenas, diferentes protenas medeiam o seu transporte at aos diferentes destinos.
Fuso de Vesculas
A fuso de uma vescula de transporte com a membrana do alvo envolve dois eventos: (1) o reconhecimento da membrana alvo por parte da vescula e (2) a fuso das membranas e a consequente libertao do contedo para o organelo-alvo. Estudos dos ltimos anos sustentam modelos de fuso de vesculas baseados no reconhecimento entre protenas da vescula e do alvo tethering, seguida de fuso das mesmas. Anlises destas protenas permitiram o desenvolvimento da hiptese SNARE, em que a fuso das vesculas mediada por interaces entre protenas transmembranares SNARE (vSNAREs [protenas transmembranares das vesculas] e t-SNARES [dos alvos]). a interaco entre as SNAREs que promove a aproximao das membranas, a sua instabilidade e consequente fuso das mesmas. No entanto, todo este processo, que envolve docking, tehtering e fusion envolve a formao de um complexo proteico semelhana do que acontece no destacamento de vesculas. As protenas Rab, GTP bindind-proteins, participam em muitos destes processos de fuso e destacamento de vesculas e esto directamente envolvidas na especificidade dos transportes de vesculas. (Para pormenores, v. p. 423). A exocitose um tipo especfico de fuso de vesculas transportadoras com a membrana citoplasmtica, em que o contedo da vescula libertado secretado para o exterior da clula (Cooper tambm utiliza o termo exocitose para fuses com outras membranas celulares, v. tabela 10.1). Neste processo intervm tambm GTP-binding proteins e um complexo proteico de oito subunidades.
Lisossomas
Os lisossomas so organelos delimitados por membrana que contm enzimas capazes de degradar todos os tipos de biomolculas aos seus monmeros constituintes. Pode dizer-se que o lisossoma funciona como o sistema digestivo da clula, permitindo a digesto de molculas provindas do meio extra-celular ou dos prprios constituintes das clulas. Podem apresentar diferentes formas consoante o seu contedo.
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mutaes nos genes que codificam as enzimas responsveis pela adio do sinal de manose-6fosfato s protenas destinadas aos lisossomas. Estas enzimas tm um pH de actuao ptimo consideravelmente abaixo do pH citoplasmtico, o que garante uma digesto controlada. O carcter cido dos lisossomas assegurado pelo uptake de H+, que, com gasto de ATP, assegura uma concentrao de protes 100 vezes superior no lisossoma.
Fagocitose e Autofagia
Nos lisossomas, alm da via da secreo e da via endoctica, convergem tambm duas outras vias: a fagocitose e a autofagia. A fagocitose consiste num uptake de grandes partculas, associadas emisso de pseudpodes pela clula fagoctica. Origina-se uma vescula fagoctica que se funde com o lisossoma, procedendo-se digesto do seu contedo. Os lisossomas assim formados podem ser muito grandes e heterogneos, em funo do seu contedo. Os lisossomas so tambm responsveis pela autofagia, ou seja, o gradual turnover os prprios componentes da clula. A autofagia, ao contrrio da fagocitose, ocorre em todas as clulas e desempenha tarefas crticas em certas etapas do desenvolvimento embrionrio. O primeiro passo da autofagia a enclausura de um organelo numa membrana derivada da membrana do retculo endoplasmtico. A vescula resultante um autofagossoma funde-se com um lisossoma, ocorrendo a digesto do material nela presente.
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So constitudas por uma dupla membrana com um espao intermembranar e uma matriz. Na matriz esto presentes o patrimnio gentico do organito e enzimas necessrias ao metabolismo oxidativo. A membrana interna, que apresenta cristas projectadas na matriz que aumentam a sua rea, possui protenas envolvidas na fosforilao oxidativa e protenas de transporte. tambm impermevel maioria dos ies e pequenas molculas, mantendo o gradiente de protes que dirige a fosforilao oxidativa. A membrana externa possui porinas que permitem a passagem de pequenas molculas, tornando o espao intermembranar anlogo ao citoplasma.
As mitocndrias possuem o seu prprio sistema gentico, constitudo por molculas de DNA circular. Pensa-se que evoluram de bactrias, provavelmente de Rickettsias, por endossimbiose. O DNA mitocondrial contm praticamente todos os genes que codificam os rRNAs e tRNAs mitocondriais, sendo as restantes protenas necessrias ao seu metabolismo codificadas pelo genoma nuclear.
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O seu cdigo gentico ligeiramente diferente do das restantes clulas, atravs de uma extenso do mecanismo wobble e alteraes da correspondncia entre codo e aminocido. As mitocndrias de um organismo so provenientes exclusivamente do ocito, pelo que as doenas mitocondriais so transmitidas pela me.
(estes assuntos esto explicados em muito maior detalhe dos documentos disponibilizados pela Teresa Tomaz)
Como j foi referido, a maioria dos genes que codificam protenas necessrias replicao e expresso do DNA mitocondrial esto no ncleo da clula. Alguns destes genes foram transferidos para o ncleo aquando a associao endossimbitica entre clulas. As protenas mitocondriais codificadas pelo genoma nuclear so sintetizadas em ribossomas livres e tm que atravessar parte ou toda dupla membrana mitocondrial para o seu destino final, a matriz, o espao intermembranar ou a prpria membrana.
1. Ligao das pr-sequncias a receptores membranares associados ao complexo Tom. 2. Passagem atravs de outro complexo Tom (poro), na membrana externa. 3. Passagem pelo do espao intermembranar. 4. Passagem atravs do complexo Tim (poro), na membrana interna. 5. A continuao da passagem da protena requer o potencial electroqumico gerado atravs da membrana interna. Este torna a matriz negativa e o espao intermembranar positivo, o que dirige a pr-sequncia positiva para a matriz.
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1. Hsp70 citoslica mantm as protenas num estado apenas parcialmente folded para que possam ser translocadas atravs das membranas. 2. Hsp70 mitocondrial (associada ao complexo Tim) funciona como alavanca para puxar a protena para a matriz. 3. Hsp70 mitocondrial (da matriz) ajudam ao trmino do folding proteico. 4. Hsp60 mitocondrial (chaperonina) dentro da qual pode existir folding adicional.
NOTA: todas as interaces entre protenas e chaperonas necessitam de ATP dentro e fora da mitocndria e do potencial electroqumico gerado atravs da membrana interna.
As protenas destinadas s membranas possuem sinais de importao mitocondriais internos em conjunto ou no com pr-sequncias.
1. Reconhecimento, em associao com uma chaperona Hsp90, por um complexo Tom diferente do do primeiro caso. 2. Passagem atravs do mesmo complexo Tom (poro), na membrana externa. 3. Reconhecimento, no espao intermembranar, por complexos Tim e levados a outro complexo Tim (poro), na membrana interna. 4. Reconhecimento de sinais stop-transfer que promovem a integrao das protenas na membrana.
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1. Reconhecimento, em associao com uma chaperona Hsp70, pelo mesmo complexo Tom do caso anterior. 2. Passagem atravs de outro complexo Tom (poro), na membrana externa. 3. Umas protenas so integradas directamente na membrana atravs do complexo Tom (poro), quanto que outras migram para o espao intermembranar e so depois integradas na membrana.
1. Reconhecimento, em associao com uma chaperona Hsp70, pelo mesmo complexo Tom do caso anterior. 2. Passagem atravs de outro complexo Tom (poro), na membrana externa. 3. Umas protenas migram directamente para o espao intermembranar. 4. Outras so transportadas pelo complexo Tim (poro) na membrana interna at matriz, onde a sequncia sinal clivada e expe um sinal secundrio que as dirigem para o espao intermembranar *ou para a membrana interna.
NOTA: A translocase que dirige as protenas do caso anterior a partir da matriz tambm responsvel pela integrao das poucas protenas membranares codificadas pelo genoma da mitocndria.
Os fosfolpidos mitocondriais so removidos do retculo endonplasmtico por protenas de transferncia de fosfolpidos e integrados nas membranas mitocondriais. As mitocndrias sintetizam cardiolipina, um fosfolpido incomum.
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Peroxissomas
So pequenos organitos revestidos por membrana que contm enzimas envolvidas num leque de reaces metablicas, algumas de metabolismo energtico. No possuem genoma, todas as suas protenas (peroxinas) esto codificadas no genoma nuclear e so na sua maioria* sintetizadas em ribossomas livres. Normalmente replicam-se por diviso.
1. Diversas reaces de oxidao, tendo como substratos cido rico, purinas, metanol e o mais importante, cidos gordos. 2. Degradao do perxido de hidrognio (H2O2, gua oxigenada) atravs da enzima catalase, criado nas suas prprias reaces de oxidao. 3. Biossntese de lpidos, do aminocido lisina e plasmalogneos - fosfolpidos presentes apenas no crebro e corao).
Construo de Peroxissomas
*As peroxinas provm tanto de ribossomas livres como do retculo endoplasmtico. As provenientes do retculo podem fundir-se entre si ou com peroxissomas preexistentes, e funcionam tambm como receptores para as peroxinas sintetizadas nos ribossomas livres, que so reconhecidas atravs de sequncias especficas. Protenas e lpidos so constantemente integrados nos peroxissomas, o que implica numa variao da sua constituio ao longo da sua maturao. As doenas lisossomais devem-se tanto falta de enzimas individuais como disfuno das vias de integrao de protenas, sendo estas ltimas responsveis pela falha em mltiplas enzimas.
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estabelece ligaes cruzadas entre os filamentos de actina, originando redes ortogonais (Fig 12.11).
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Filamentos Intermdios
Ao contrrio dos filamentos de actina e dos microtbulos, os filamentos intermdios no esto directamente envolvidos no movimento celular. Apresentam uma funo estrutural, visto que fornecem fora mecnica s clulas e tecidos.
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Microtbulos
So o terceiro componente do citoesqueleto, sendo estruturas rgidas que, tal como a actina, so dinmicas. Esto envolvidos na determinao da forma da clula, numa grande variedade de movimentos celulares, no transporte intracelular de organelos e na separao dos cromossomas durante a mitose.
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Clios e Flagelos
Os clios e os flagelos so projeces baseadas em microtbulos, que permitem o movimento (locomoo) de uma grande variedade de clulas eucariticas. Para visualizar exemplos de clios e flagelos consultar Fig 12.53. A principal estrutura dos clios e flagelos o axonema, que composto por micortbulos e por protenas a eles associadas. Os microtbulos encontram-se organizados numa disposio 9+2, na qual um par central de microtbulos est rodeado por 9 conjuntos de 2 microtbulos. Os microtbulos perifricos esto ligados por pontes de nexina e apresentam 2 braos de dinenas. a actividade motora dessas dinenas axonemais que dirige o batimento dos clios e dos flagelos. (Fig 12.54) As extremidades negativas dos microtbulos dos clios e flagelos esto ancorados no corpo basal, que uma estrutura similar ao centrolo e que contm 9 tripletos de microtbulos (Fig 12.55) Resumo das Funes Os microtbulos permitem a locomoo (os clios e os flagelos apresentam um esqueleto de microtbulos). Os microtbulos participam no transporte intracelular de vesculas e organelos. Os microtbulos intervm na separao dos cromossomas durante a mitose, visto que so essenciais para a formao do fuso mittico, que pode ser visualizada na Fig 12.58
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Preveno e Tratamento O isolamento do gene da fibrose cstica possibilita um mapeamento gentico para a identificao dos indivduos portadores do alelo mutado. A compreenso do funcionamento da CFTR como canal de Cl- tem sugerido novas abordagens para o tratamento. Uma possibilidade a utilizao de drogas que estimulem a abertura de outros canais de CL- nos epitlios afectados. Alternativamente, a terapia gnica possibilita a potencial reposio dos genes da CFTR normal no epitlio respiratrio dos pacientes com fibrose cstica. Esta possibilidade baseou-se em experincias que demonstraram que a introduo do gene normal da CFTR em cultura de clulas de paciente com fibrose cstica era suficiente para restaurar a funo do canal de CL-. Alm disso, a aplicao em potencial da terapia gnica para FC grande pela facilidade de acesso s clulas epiteliais que revestem as vias areas superiores (utilizando o sistema de asperso de aerosis).
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Estudos com animais experimentais tm demonstrado que vectores virais podem transmitir o cDNA da CFTR para o epitlio respiratrio, e em 1993 iniciou-se o primeiro protocolo experimental de tratamento em humanos contudo a eficincia de de transferncia tem sido baixa e a expresso do cDNA da CFTR transferido tem sido mantida por menos de um ms.
Endocitose
Endocitose o processo atravs do qual as clulas eucariticas so capazes de englobar macromolculas e partculas do meio que as circunda. Na endocitose, o material a ser internalizado circundado por uma rea de membrana plasmtica, que brota para o lado de fora para formar a vescula que conter o material a ser internalizado.
Fagocitose
Durante a fagocitose as clulas internalizam grandes partculas como bactrias, resto celulares ou at clulas intactas. A ligao de uma partcula aos receptores de superfcie de uma clula fagoctica leva emisso de pseudpodes, que circundam as partculas e depois as suas membranas fundemse para formar uma grande vescula intracelular (fagossoma). Os fagossomas fundem-se com os lisossomas, formando fagolisossomas, nos quais o material ingerido digerido por aco de hidrolases cidas dos lisossomas. As amibas utilizam a fagocitose para capturar partculas alimentares, como bactrias ou outros protozorios. Em animais multicelulares, o principal papel da fagocitose fornecer defesa contra microrganismos invasores e eliminar clulas velhas ou danificadas do corpo. Nos mamferos a fagocitose uma funo de dois tipos de glbulos brancos, os macrfagos (eliminam microrganismos de tecidos infectados e clulas velhas ou mortas) e os neutrfilos (eliminam microrganismos de tecidos infectados).
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A internalizao do colesterol por clulas de mamferos permite uma melhor compreenso da endocitose mediada por receptor. O colesterol transportado atravs da corrente sangunea na forma de partculas lipoproteicas, sendo a mais comum a lipoprotena de baixa densidade (LDL). A internalizao de LDL por clulas de mamferos d-se mediante a ligao do LDL com receptores especficos de superfcie celular que se encontram concentrados nas regies recobertas por clatrina e so internalizados por endocitose. A hipercolesterolmia familiar (abordada de forma mais detalhada mais frente) permitiu descobertas importantes no processo de internalizao do LDL. uma doena hereditria e os pacientes com esta doena apresentam nveis muito elevados de colesterol srico e sofrem de ataques cardacos precocemente. As clulas desses pacientes so incapazes de internalizar LDL a partir dos fluidos extracelulares, resultando na acumulao de altos nveis de colesterol na circulao, pois a doena resulta de uma mutao no receptor de LDL (concentrado nas regies recobertas por clatrina). Essas mutaes podem ser de dois tipos: as clulas podem simplesmente no ser capazes de se ligar ao LDL (demonstrando que os receptores especficos
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de superfcie celular so necessrios para a internalizao de LDL); ou as clulas podem ligar-se mas ser incapazes de internaliz-lo (os receptores destes pacientes so incapazes de se concentrar nas regies recobertas por clatrina, o que evidencia o papel central das regies recobertas por clatrina na endocitose mediada por receptores).
A clatrina organiza-se numa estrutura semelhante a uma cesta de basquete que distorce a membrana, formando pontos de invaginao. Uma protena de ligao a GTP, a dinamina, organiza-se em anis em redor desses pontos invaginados, promovendo finalmente a liberao das vesculas cobertas para o lado de dentro da clula. Fluidos extracelulares tambm podem ser incorporados nas vesculas cobertas conforme estas brotam da membrana plasmtica, de modo que a endocitose mediada por receptor resulta numa internalizao no-selectiva de fluidos extracelulares e outros materiais (endocitose de fase fluida), alm da internalizao de macromolculas especficas. As regies recobertas por clatrina geralmente ocupam 1 a 2% da rea da superfcie da membrana plasmtica. Enquanto a endocitose dependente da clatrina a principal via de internalizao tanto de fluidos como de macromolculas especficas, as clulas tambm usam vrios mecanismos independentes da clatrina, um desses mecanismos envolve a captao de molculas em caveolas (pequenas invaginaes da membrana plasmtica), noutro mecanismo, vesculas grandes podem mediar a internalizao de fluidos, num processo conhecido por macropinocitose.
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contraste a HMG-CoA redutase no afectada pela adio de LDL s clulas dos pacientes, resultando numa superexpresso de colesterol pelas clulas FH. Contudo, experincias subsequentes indicaram que esta anomalia na regulao da enzima HMG-CoA redutase no resultante de mutaes no gene da enzima, em vez disso, a regulao anormal da enzima parecia estar relacionada com uma incapacidade das clulas FH de extrai colesterol a partir do LDL. Brown e Goldstein, em 1974, demonstraram que a leso nas clulas FH resultante de um defeito na ligao do LDL ao seu receptor na superfcie celular.
Esquematicamente:
Fibroblastos humanos normais Adio de LDL Inibe a actividade de HMG-CoA redutase (enzima cuja actividade limita a via de biossntese de colesterol) Clulas dos pacientes Adio de LDL Actividade de HMG-CoA redutase no afectada Resulta numa superexpresso de colesterol pelas clulas FH Mas esta anomalia no resultante de uma mutao no gene da enzima, porque as clulas estavam incapacitadas para extrair colesterol a partir da LDL. Leso nas clulas FH resultante de um defeito na ligao de LDL ao seu receptor na superfcie celular
As experincias
Em 1974 Brown e Goldstein realizaram experincias em que analisaram a ligao de LDL marcado com istopo radioactivo a fibroblastos obtidos tanto de indivduos normais como pacientes de FH.
Os dados das experincias sugerem que os fibroblastos normais possuem um receptor especfico para o LDL que est ausente ou alterado nas clulas FH, eles concluram que o defeito da ligao de LDL observado em clulas FH pode representar uma leso gentica primria nesta enfermidade, respondendo pela incapacidade do LDL em inibir a HMG-CoA redutase e pela resultante superproduo de colesterol. Experincias adicionais demonstraram que o LDL ligado a fibroblastos normais estava associado com a membrana da clula, sugerindo que o receptor de LDL seja uma protena de superfcie celular.
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O Impacto
Aps a identificao do receptor de LDL, Brown e Goldstein demonstraram que o LDL ligado superfcie celular rapidamente internalizado e degradado nos lisossomas, gerando colesterol livre. Posteriormente, em colaborao com Richard Anderson, estabeleceram que o receptor de LDL internalizado por endocitose a partir de regies recobertas por ligantes. Alm disso, os seus estudos iniciais demonstraram que o receptor de LDL reciclado para a membrana plasmtica aps a dissociao do seu ligante dentro da clula.
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Os endossomas jovens mantm um pH interno cido (de 6 a 6,2) como resultado da aco da bomba de H+ da membrana, o que leva dissociao de vrios ligantes dos seus receptores dentro do endossoma jovem. A reciclagem para a membrana plasmtica o principal destino das protenas de membrana internalizadas pela endocitose mediada por receptores, com vrios receptores (como o receptor LDL) regressando membrana plasmtica aps a dissociao dos seus ligantes nos endossomas jovens. Ligantes e protenas de membrana que so destinados para a degradao nos lisossomas so transportados dos endossomas jovens para os endossomas maduros (mais cidos que os jovens), que esto localizados prximos ao ncleo. Estes endossomas maduros evoluem para lisossomas e tornam-se ainda mais cidos (pH em torno do 5). Dentro dos lisossomas o material endocitado degradado por aco de hidrolases cidas. Alguns receptores so transportados para os lisossomas, onde so degradados juntamente com os seus ligantes. H um tipo especializado de reciclagem dos endossomas que desempenha uma importante funo na transmisso de impulsos nervosos. As vesculas sinpticas vazias so recolhidas da membrana plasmtica em vesculas cobertas por clatrina, que se fundem com endossomas jovens, a as vesculas so regeneradas, acumulam novos suprimentos de neurotransmissores e so recicladas para a membrana plasmtica, ficando ento disponveis para um novo ciclo de transmisso sinptica.
gEm clulas polarizadas, receptores internalizados tambm podem ser transferidos atravs da clula para domnios celulares opostos da membrana plasmtica (p. e. domnio basolateral endossoma jovem membrana apical), um processo denominado transcitose.
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Devido aos seus caracteres hidrofbicos, estas hormonas so capazes de entrar nas clulas, difundindo-se pela membrana celular. Dentro da clula ligam-se a receptores intracelulares, que so membros da superfamlia dos receptores nucleares. Estes so factores de transcrio que contm domnios para a ligao ao ligando, ligao ao DNA, e activao da transcrio. A ligao do ligando regula funo destes receptores, activando ou inibindo os genes alvo, pelo que estas hormonas esto directamente relacionadas com a regulao da expresso gentica.
Neurotransmissores
Os neurotransmissores transportam sinais entre neurnios, ou de um neurnio para clulas alvo (como as clulas musculares). So pequenas molculas hidroflicas, que incluem: acetilcolina; dopamina; epinefrina (adrenalina); serotonina; histamina; glutamato; glicina; e o cido GABA. A libertao dos neurotransmissores sinalizada pela chegada de um potencial de aco no terminal do neurnio. Os neurotransmissores difundem-se pela fenda sinptica e
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ligam-se aos receptores na superfcie da clula alvo. H neurotransmissores que tambm tm funo hormonal, como a epinefrina. Como so molculas hidroflicas, os neurotransmissores so incapazes de se difundirem atravs da membrana celular. Muitos receptores so canais inicos dependentes de ligandos, pelo que a ligao dos neurotransmissores induz uma mudana conformacional que abre estes canais, resultando num fluxo de ies atravs da membrana. Outros receptores de neurotransmissores esto associados a protenas G, que indirectamente induzem a abertura de canais.
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2. A ligao da hormona altera a conformao do receptor acoplado protena G, estimulando a libertao do GDP e a sua troca por GTP; 3. A subunidade ligada ao GTP fica activa e dissocia-se do complexo ( e ); 4. Tanto a , como o complexo e vo actuar sobre as molculas alvo; 5. A actividade da terminada quando o GTP se hidrolisa a GDP; 6. A subunidade inactiva (ligada ao GDP) reassocia-se ao complexo e , voltando tudo ao ponto de partida (de repouso), pronto para um novo ciclo.
H vrios tipos de protenas G, e estas ligam-se a diferentes tipos de receptores. Alm disto, algumas subunidades de certas protenas G regulam canais inicos. (neurotransmissor acetilcolina).
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autofosforilao aumenta a actividade cinsica, e induz a criao de locais para a ligao com protenas alvo, que sero fosforiladas.
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2. O cAMP liga-se s subunidades regulatrias da PKA, libertando as subunidades catalticas 3. As subunidades catalticas livres ficam activas e fosforilam resduos de serina das protenas alvo. Cada ligando activa apenas um receptor, contudo um receptor por estimular centenas de molculas. E cada uma dessas molculas pode estimular a produo de outras, ao longo da cascata de sinalizao. Assim, a ligao de hormonas a um pequeno nmero de receptores activa um grande nmero de enzimas alvo intracelulares. Em certos casos, o cAMP pode regular canais inicos (sensao de odores).
GMP cclico
O GMP cclico (cGMP) tambm ele um importante mensageiro secundrio em clulas animais. O cGMP formado pela guanilil ciclase, e degradado por uma fosfodiesterase. A estimulao das guanilil ciclases (NO ou ligandos peptdicos) eleva os nveis de cGMP, que vo mediar respostas biolgicas (exemplo: dilatao de vasos sanguneos). A maioria das vezes o cGMP activa protenas cinases dependentes de cGMP, podendo tambm regular canais inicos.
Fosfolpidos e CA2+
Os fosfolpidos e o clcio so mensageiros secundrios comuns, activados a jusante de receptores associados a protenas G ou associados a tirosina cinases. A hidrlise do fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) gera diacilglicerol e inositol 1,4,5 trifosfato (IP3), que activa a protena cinase C e mobiliza o clcio de reservas intracelulares, respectivamente. O aumento dos nveis de clcio intracelulares activam diversas protenas alvo, como as cinases dependentes de Ca2+/calmodulina.
FC + Receptor ocorre troca de GDP por GTP na Ras activa a Raf cinase fosforila/activa MEK fosforila/activa ERK ERK passa para o ncleo e liga-se a regies reguladoras de DNA (activa determinados genes) transcrio protena determina entrada no ciclo celular
Esquema da via das MAP cinases cascatas de fosforilao
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vida da clula, o processo mais crtico de todo o ciclo, pois nele que ocorre a separao dos cromossas e a citocinese. Compreende uma srie de sub-etapas que sero abordadas mais frente. Clulas embrionrias e clulas estaminais correspondem a dois exemplos em que os ciclos celulares escapam regra geral. Com efeito, aps a fertilizao do ovo ocorrem ciclos sucessivos que incluem, entre as mitoses, apenas uma rpida fase S. No ocorre crescimento celular. No caso das clulas estaminais, estas percorrem a fase G1 e seguem para a fase G0, uma fase de latncia em que as clulas permanecem metabolicamente activas, mas no proliferam, salvo se houver um estmulo externo, como um factor de crescimento. O estudo das fases do ciclo celular requer a identificao das clulas. Enquanto as sub-fases da fase M so facilmente vislumbradas ao microscpio ptico, as fases G1, S e G2 necessitam de uma interpretao bioqumica. Clulas em fases S podem ser facilmente identificadas por autoradiografia, se cultivadas num meio com nucletidos radioactivos durante poucos minutos. Estas anlises permitem estimar o tempo que dura cada uma das fases. Considere-se a situao de se colocarem nucletidos radioactivos num meio com clulas em cultivadas durante diferentes tempos. Clulas que se encontravam na fase S sero observadas durante vrias horas, pois incorporaram os ditos nucletidos. Clulas marcadas radioactivamente em mitose sero observadas apenas passadas 4 horas, o que sugere que entre G2 e Fase M medeia esse intervalo de tempo. Clulas em diferentes fases do ciclo celular apresentam diferentes quantidades de DNA (para pormenores, v. p. 652). Experimentalmente, pode determinar-se essa quantidade (entre 2n e 4n) clulas com recurso a marcadores fluorescentes e a uma posterior medio da intensidade.
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dimenses mnimas para que a diviso possa prosseguir. O START representa, assim, uma verificao da existncia, ou no, das condies necessrias divisog. Na maior parte das clulas animais o processo anlogo, designando-se o checkpoint START por restriction point. No entanto, so factores de crescimento extracelulares que sinalizam a proliferao e determinam a entrada na fase S e no resto do ciclo, diferentemente do que acontece nas leveduras, em que a disponibilidade de nutrientes no meio mais relevante. No caso da ausncia de factores de crescimento durante a fase G1, a clula no progride no ciclo e entra num estado de latncia denominado G0, em que a taxa metablica reduzida. Os fibroblastos so um exemplo pertinente de clulas que permanecem num estado de latncia G0 at que factores de crescimento derivados de plaquetas, extravasados dos vasos sanguneos quando, por exemplo, h uma ferida, estimulam a sua proliferao. Existem tambm clulas eucariotas em que o principal ponto de controlo das condies necessrias diviso feito no final da fase G2, como por exemplo S. Pombe. No caso dos vertebrados, os ocitos ilustram esta regulao, podendo estas clulas ficar retidas na fase G2 vrias dcadas at que um contexto hormonal adequado permite a prossecuo para a Fase M.
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O mecanismo molecular que controla as origens de replicao envolve as protenas helicases MCM que a elas se ligam, juntamente com protenas de reconhecimento da origem de replicao. As MCM actuam como factores que controlam o incio da replicao. Assim, as MCM associam-se s origens da replicao exclusivamente durante a fase G1 e abandonamnas assim que a replicao se inicia j na fase S. A ligao das MCM durante as outras fases do ciclo impedida pela actividade das protenas-cinases que regulam a progresso no ciclo.
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ACdc2 forma complexos com a ciclina B durante S e G2. A Cdc2 ento fosforilada no aminocido 161, o que lhe confere actividade, como tambm no aminocido 15 (e tambm no aminocido 14 nas clulas dos vertebrados), o que inibe a Cdc2. A dos aminocidos 14 e 15 activa o MPF ao nvel da transio entre G2 e a fase M. A actividade da MPF terminada no fim da Mitose por degradao proteoltica da ciclina B.
Uma vez fosforilada, a Cdk1 fosforila vrias protenas que iniciam os eventos da fase M. Por seu turno, esta protena estimula tambm a degradao da Ciclina B, que ocorre por um processo de degradao proteoltca mediado pela ubiquinona. Esta degradao, por seu turno, inactiva a Cdk1 e termina a Mitose.
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Caspases
As caspases so uma famlia de proteases que conduzem aos acontecimentos que caracterizam a apoptose. Entre os seus alvos esto as lminas nucleares. Elas clivam ao longo da protena logo a seguir ao aspartato, fazendo com que a lmina fique fragmentada (Fig 17.4). As principais aces das caspases so destruir o inibidor da DNase, clivar lminas nucleares e protenas do citoesqueleto, o que conduz fragmentao do ncleo, destruio do citoesqueleto, e fragmentao celular. Todas as caspases so sintetizadas como precursores inactivos, que podem ser convertidos na sua forma activa atravs de clivagem proteoltica, catalisada por outras caspases. Assim, a activao de uma caspase iniciadora desencadeia uma cadeia de reaces que levam activao de caspases a jusante e morte celular. Nas clulas de mamferos, a caspase iniciadora a Caspase 9, que activada ligando-se Apaf1 e formando um complexo com mltiplas subunidades chamado apoptossoma. A formao deste apoptossoma tambm requer citocromo C (cytC), que libertado da mitocndria por estmulos que desencadeiam a apoptose. Uma vez activada no apoptossoma, a Caspase9 cliva e activa caspases efectoras, que levam morte celular.
Interaces regulatrias entre membros da famlia Bcl-2 Clula Normal Pro-apoptticas BH3-only esto inactivas Pro-apoptticas multidomnios so inibidas pelas Antiapoptticas. Clula em Apoptose 1. Sinais que desencadeiam a apoptose activam as Proapoptticas BH3-only 2. Pro-apoptticas BH3-only inibem as Antiapoptticas 3. Activao das Pro-apoptticas multidomnios 4. Libertao de cyt C 5. Activao das caspases 6. Apoptose
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As caspases tambm so reguladas pela famlia de protenas IAP, que suprimem directamente a apoptose, inibindo as caspases, e marcando-as para degradao em proteossomas.
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Clulas Estaminais
Clulas Estaminais so clulas que se dividem para produzir clulas-filhas, uma das quais se mantm clula estaminal, e a outra se diferencia. Servem para manter os tecidos e rgos de organismos adultos, ao contriburem para a reposio de clulas perdidas. As clulas estaminais foram identificadas em diversos tecidos adultos, como o sistema hematopoitico, a pele, o intestino, msculo esqueltico, crebro e corao.
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teraputica, na qual as clulas estaminais embrionrias derivariam de um embrio clonado e usado para transplantao teraputica. ATENO: Para uma compreenso rpida e geral dos mecanismos da apoptose, foram feitos apontamentos pelo Miguel Guia, que ajudam a assimilar a matria.
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