Análises bromatológicas

Em carboidratos, fibras e proteínas

Prof.: Eliane Paiva, MSc.
 MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE CARBOIDRATOS NOS
ALIMENTOS 


Os testes qualitativos para açúcares estão baseados

no seguinte:

• Reações coloridas provenientes da

condensação de produtos de degradação dos
açúcares em ácidos fortes com vários
compostos orgânicos;

• As propriedades redutoras do grupo carbonila.

 MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE CARBOIDRATOS NOS
ALIMENTOS 


Entre os métodos quantitativos disponíveis para

determinação de açúcares totais de açúcares
redutores, os mais utilizados em alimentos são:

• Munson-Walker: método gravimétrico baseado na

redução de cobre pelos grupos redutores dos
açúcares;

• Lane-Eynon: método titulométrico também baseado na

redução de cobre pelos grupos redutores dos açúcares
 MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE CARBOIDRATOS NOS
ALIMENTOS 


• Somogy: método microtitulométrico baseado

também na redução do cobre.

• Métodos cromatográficos: papel, camada

delgada, coluna, gasosa e cromatografia
líquida de alta eficiência

• Métodos óticos: Refratometria, Polarimetria,

Densimetria
 Determinação de açúcares em laboratório,
segundo Instituto Adolfo Lutz, 2008

• A avançada tecnologia disponível hoje possibilita a determinação e a

identificação de açúcares em concentrações extremamente baixas
nos mais variados tipos de amostras.

• Essa tecnologia também está disponível para a determinação de

açúcares em alimentos, onde a Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE) em suas várias combinações atinge especial
destaque.

• Entretanto, o método de Fehling, já utilizado há décadas para esse

fim, mantém-se como referência em laboratório.

• O método de Fehling possui como princípio a capacidade de os

açúcares redutores reduzirem o Cu2+ (azul) a Cu1+ (vermelho) sob
aquecimento em pH fortemente alcalino
Determinação de açúcares em laboratório,
segundo Instituto Adolfo Lutz, 2008
Todos os
monossacarídeos
são redutores.

Entre os
oligossacarídeos, a
lactose e a
maltose são
redutores.

A sacarose não é
um açúcar redutor.

Aspecto do reagente de Fehling (a) azul – antes de

reagir com o açúcar redutor e (b) vermelho – após
reação com o açúcar redutor
 Exemplo
• Um técnico de laboratório, ao determinar o teor de açúcares
redutores em glicose em uma amostra de biscoito doce através do
método de Fehling realizou a análise utilizando triplicatas (Prova 1,
Prova 2 e Prova 3).

• Ele realizou os procedimentos em sequência, conforme se descreve

a seguir: Após homogeneizar e pulverizar a amostra, ele pesou a
amostra em triplicata utilizando como recipiente de pesagem um
béquer de 100 ml. Os pesos estão descritos na Tabela 3.2.
• 1. Transferiu cada prova para um balão volumétrico (de 100 ml) específico.
• 2. Completou o volume com água destilada e filtrou em papel filtro.
• 3. O filtrado (solução-amostra) foi transferido para uma bureta.

• 4. Em um balão de fundo chato, pipetou exatamente 10 ml de Solução de Fehling A

(solução de CuSO4) e 10 ml de Solução de Fehling B (solução de tartarato de sódio e
potássio + NaOH). Adicionou ainda 40 ml de água destilada.

• 5. A solução do balão de fundo chato foi levada à ebulição.

• 6. Mantendo-se a ebulição, a solução-amostra foi adicionada às gotas sobre a solução

do balão de fundo chato.

• 7. Quando a solução do balão passou de azul à incolor com formação de precipitado

vermelho, o gotejamento da solução-amostra foi interrompido e o volume gasto foi
anotado. Os volumes gastos para cada prova são dispostos na Tabela abaixo:
 8. Aplicou os valores obtidos à fórmula:

Onde: A = volume total da solução amostra (100 ml, neste caso) a = massa
de glicose que reage com 10 ml de solução de Fehling (previamente
determinada em laboratório) = será considerado 0,045 P = peso da amostra
(g) V = gasto da solução-amostra (ml) Os valores obtidos foram os da Tabela
3.4.
FIBRAS EM ALIMENTOS


• São substâncias componentes dos tecidos

vegetais, que não constituem fonte de energia,
porque não podem ser hidrolizadas por enzimas
do intestino humano.

• Uma definição mais precisa de fibras não é

possível porque as substâncias não digeríveis
incluem misturas complexas e heterogêneas de
substâncias, não existindo ainda uma
concordância acerca de qual parte da substância
constitui a fibra.
 FIBRAS EM ALIMENTOS


Celulose:
• A celulose é composta de uma única cadeia longa de
unidades de glicose unida Por ligações as quais as enzimas
digestivas não conseguem hidrolizar.

• A celulose está presente nas frutas (polpa e casca), nas

hortaliças (haste e folhas), nos legumes e cereais

Hemicelulose: Difere estruturalmente da celulose porque

possui menos unidades de glicose.

São utilizadas como laxante e na produção de alimentos de

baixas calorias, devido à sua capacidade de produzir volumes
e sensação de saciedade.
 FIBRAS EM ALIMENTOS

LIGNINA: É um polímero de fenóis e ácidos encontrados na

porção lenhosa de vegetais.

Pectinas: Formada por muitas unidades de ácido

galacturônico, absorvem água e formam gel, é amplamente
utilizada na indústria de alimentos. Encontrada em todos os
frutos.

Gomas e Mucilagens: Semelhantes a pectina, exceto porque

suas unidades são formadas por ligações de galactose e
polissacarídeos.

Encontradas nas secreções de vegetais ou sementes

CLASSIFICAÇÃO DAS FIBRAS
Os componentes da fibra na dieta podem ser classificados com base
nas suas propriedades físicas e papel fisiológico em:

• a- Fibras solúveis: retardando o esvaziamento gástrico, aumentando o

tempo de transito intestinal, tornando mais lenta a absorção da
glicose, retardando a hidrólise do amido, reduzem os níveis elevados
de colesterol.

Exemplo. pectinas, gomas e certas hemiceluloses

• b- Fibras insolúveis: Diminuem o tempo de transito intestinal,

aumenta o volume fecal, tornando mais lenta a absorção de glicose
e retardando a digestão do amido.

Ex. celulose, lignina e muitas hemicelulose

 METODOLOGIA PARA ANÁLISE DE
FIBRAS ALIMENTARES
• Fibra Bruta (Método Weende): É o resíduo orgânico dos
alimentos após a eliminação da água e dos lipídeos e
hidrólise à quente com ácidos e álcalis diluídos.

• Fibra Detergente (Método Van Soest): É baseado na separação

das diversas frações constituintes das fibras por meio de
reagentes específicos, denominados detergentes.

• As técnicas que usam detergentes ácidos e/ou neutros,

quando não acompanhados do uso de amilase e da
determinação do nitrogênio residual, podem dar valores
superestimados, incluindo nestes resultados de teores de
amido e proteínas não solubilizados, não permitindo também a
avaliação dos componentes solúveis.
 MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE
FIBRAS
• O método para determinação de fibra bruta foi desenvolvido por
cientistas alemães em 1864 e seu procedimento resumido é o seguinte:

• Pesar 2 g de amostra e extrair a gordura com éter de petróleo;

• Ferver em refluxo com ácido sulfúrico 1,25% por 30 minutos

• Filtrar em filtros especiais, lavando com água fervendo até acabar todo
o ácido;
• Ferver o resíduo com solução de NaOH 1,25% por 30 minutos;
• Filtrar em cadinho de Gooch (de fundo poroso);
• Secar em estufa e pesar;
• Incinerar em mufla, esfriar e pesar;
• O peso perdido na incineração é calculado como fibra bruta.
O método para determinação de fibra
bruta
• CONSIDERAÇÕES SOBRE O MÉTODO:

• Tamanho das partículas das amostras: quanto mais fina for moída a partícula
menor será a quantidade de fibra.

• Presença de gordura na amostra: afeta um pouco o resultado da fibra;

• Ebulição da amostra: ebulição muito forte diminui a quantidade de fibras;

Filtração após as fervuras com ácido e base: as filtrações geralmente são
difíceis e lentas. Mas é importante terminar as filtrações até o fim.

• A fibra foi definida em base nutricional como “matérias vegetais insolúveis que
não são digeridas por enzimas proteolíticas e diastásicas, e que não podem ser
utilizadas exceto por fermentações microbianas no trato digestivo de animais”.
Os métodos gravimétricos

• 1. Métodos detergentes: fibras insolúveis em

detergentes

• 2. Métodos enzimáticos: fibra insolúvel somente;

fibra insolúvel + fibra solúvel

• As técnicas que usam detergentes ácidos e/ou

neutros, quando não acompanhados do uso de
amilase e da determinação do nitrogênio residual,
podem dar valores superestimados, incluindo nestes
resultados de teores de amido e proteínas não
solubilizadas, não permitindo também a avaliação
dos componentes solúveis.
Os métodos detergentes mais comumente utilizados são:


• a. Fibra por detergente ácido (ADF): determina

celulose+ lignina.

• b. Fibra por detergente neutro (NDF): determina

celulose + hemicelulose + lignina.

• É utilizado como método oficial para determinação

de fibra dietética em grãos e cereais.
 Determinação de fibras em alimentos,
segundo Instituto Adolfo Lutz, 2008
• O teor de fibras em um alimento é o resíduo orgânico
obtido após a amostra sofrer determinado tipo de
tratamento químico. A seguir será apresentada a técnica
para determinação da fibra bruta.

• Exemplo Um técnico em laboratório necessita determinar o

teor de fibra bruta em uma amostra de barra de cereal.

• A determinação será conduzida utilizando triplicatas (Prova

1, Prova 2 e Prova 3). Ele realizou os procedimentos em
sequência, conforme o descrito a seguir:
 Determinação de fibras em alimentos, segundo Instituto
Adolfo Lutz, 2008
• 1. A amostra (2,00 g) previamente triturada foi desengordurada em
aparelho de Soxhlet .

• 2. A amostra (desengordurada) foi transferida para um balão de fundo

chato onde se adicionou solução ácida: ácido acético glacial (500 ml)
+ água (450 ml) + ácido nítrico (50 ml) + ácido tricloroacético (20 g).

• 3. O balão foi mantido em refluxo por 40 minutos.

• 4. Após, o resíduo foi filtrado em cadinho de Gooch e lavado com

água fervente até lavar todo o ácido.

• 5. O resíduo ainda foi lavado com álcool e éter.

• 6. O resíduo foi seco a 105ºC até peso constante. O peso do resíduo

seco foi obtido como mostra a Tabela 3.5.
7. Após incinerou-se o resíduo em mufla a 550ºC e depois resfriou-se.
A perda de peso foi considerada fibra bruta como se demonstra na
Tabela 3.6.

Os valores foram aplicados à fórmula a seguir e os

resultados obtidos são expressos na Tabela 3.7.
Os valores foram aplicados à fórmula a seguir e os resultados obtidos são
expressos na Tabela 3.7.

Onde: N= fibra bruta (g) P= peso da amostra (g)

Proteína
• A palavra proteína deriva do grego proteos, que
significa “ocupar o primeiro lugar”.

• As proteínas contêm C (50 a 5%); H (6 a 8%); O (20

a 24%); N (15 a 18%) e S (0,2 a 0,3%).

• Quimicamente são polímeros de alto peso molecular,

cujas unidades básicas são os aminoácidos ligados
entre si por ligações peptídicas formando longas
cadeias, em várias estruturas geométricas e
combinações químicas para formar as proteínas
especificas, cada qual com sua própria especificidade
fisiológica.
 Proteínas - Análise em laboratório,
segundo Instituto Adolfo Lutz, 2008
• A determinação do teor de proteínas em alimentos geralmente
é realizada através do método de Kjeldahl, no qual o teor de
nitrogênio da amostra é determinado.

• Devido a composição das proteínas por aminoácidos, o teor

de nitrogênio (dos grupos amino) pode ser diretamente
correlacionado com o conteúdo proteico da amostra.

• No método de Kjeldahl, a amostra é digerida em ácido

sulfúrico, o nitrogênio é separado por destilação por arraste
de vapor, e sua quantidade é determinada por volumetria.
Utiliza-se um fator de conversão para transformar massa de
nitrogênio em massa de proteína.
METODO DE KJELDAHL:
METODO DE KJELDAHL:
METODO DE KJELDAHL:
METODO DE KJELDAHL:
METODO DE KJELDAHL:
METODO DE KJELDAHL:
METODO DE KJELDAHL:
METODO DE KJELDAHL:
METODO DE KJELDAHL:
METODO DE KJELDAHL:
METODO DE KJELDAHL:
METODO DE KJELDAHL:
• Exemplo Um técnico em laboratório necessita
determinar o teor de proteínas em uma amostra de
biscoito. A determinação será conduzida utilizando
triplicatas (Prova 1, Prova 2 e Prova 3).
• Ele realizou os procedimentos em sequência,
conforme se descreve a seguir: 1. Pesou exatamente
1 g de amostra em papel de seda e transferiu para
o tubo de digestão, adicionando em sequência ácido
sulfúrico (25 ml) e mistura catalítica (6 g) (Figura 5.7).

Figura 5.7: Tubo de digestão contendo

amostra, mistura catalítica e ácido
sulfúrico
• 2. Manteve em aquecimento em bloco digestor a 350ºC até
a obtenção de solução com cor azul-esverdeada.
• 3. Após resfriar, adicionou quantidade suficiente de solução
concentrada de hidróxido de sódio (suficiente para pequeno
excesso de base) e iniciou o processo de destilação por
arraste de vapor, recebendo o destilado em 25 ml de
solução de ácido sulfúrico 0,05 M (com indicador vermelho
de metila) (Figura 5.8).
• Destila-se até obter de 250 a 300 ml de destilado. Durante
esse processo a solução passará do vermelho ao amarelo.

Figura 5.8: Destilado de nitrogênio contendo

tubo de digestão (com líquido azul – a) e
erlenmeyer contendo ácido sulfúrico (com
líquido vermelho – b)
• 4. O excesso de ácido sulfúrico foi titulado
com hidróxido de sódio 0,1 M (Figura 5.9) até
que a solução (amarela) volte à cor vermelha.

Figura 5.9: Titulação com solução de

hidróxido de sódio 0,1 M
 • 5. Os volumes de NaOH 0,1 M gastos que
foram utilizados (Tabela 5.2)

6. Os dados foram aplicados à formula a seguir:

Onde: V = diferença entre o número de ml de ácido sulfúrico 0,05 M e

o número de ml de hidróxido de sódio 0,1 M gastos na titulação f =
fator de conversão (utilizado 6,25)*
P = peso da amostra * Existem outros fatores de conversão, como 5,83
(para farinha de centeio), 5,46 (para amendoim) dentre outros. Para
verificar outros fatores de conversão consulte INSTITUTO ADOLFO LUTZ,
2008, página 199.
• Os resultados estão demonstrados na Tabela
5.3.
FASE DA DIGESTÃO
FASE DA DIGESTÃO
FASE DA DESTILAÇÃO
FASE DESTILAÇÃO
FASE DA TITULAÇÃO
FASE DA TITULAÇÃO
EXTRAÇÃO DE LIPÍDIO
PESAGEM
LIPIDIO RETIRADO DA AMOSTRA
METODO DE DUMAS


• O método descoberto por Dumas (1831) determina

N total, após combustão da amostra a 700 – 800
ºC, por medida volumétrica do N gasoso.

• A medida é difícil e sujeita a erros, porque a

quantidade de amostra é muito pequena e às vezes
não representativa de todo o alimento.

• Existe um equipamento recentemente construído que

completa a análise em 10 minutos e com boa
precisão.
ANÁLISE POR GRUPOS

MÉTODO POR BIURETO


O método por biureto foi proposto por Riegler

em 1914, baseado na observação de que
substâncias contendo duas ou mais ligações
peptídicas formam um complexo de cor roxa
com sais de cobre em soluções alcalinas.

A intensidade da cor formada é proporcional à

quantidade de proteína, e a medida é feita
num colorímetro.
Vantagens método por Biureto

• Ser bastante específico por não apresentar

problemas de interferentes.

• É simples, rápido e barato.

• Por envolver uma reação com a ligação peptídica,

o método determina proteína, ao contrário do
método de Kjeldahl que determina N total.
Desvantagem do método por Biureto

• A necessidade de uma curva de calibração

tomada com um padrão conhecido de proteína, por
exemplo, uma proteína determinada por Kjeldahl.

• A cor formada no complexo não é idêntica para

todas as proteínas, porém os desvios causados são
menores do que em outros métodos colorimétricos.
METODO POR FENOL (FOLLIN-
CIOCALTEAU-LOWRY)

• Foi uma das primeiras determinações colorimétricas de

proteína, realizada a partir de 1912.

• É um método bastante utilizado e que se baseia na

interação das proteínas com o reagente fenol e cobre
em condições alcalinas.

• A reação colorimétrica envolve uma oxidação, catalisada

por cobre, de aminoácidos aromáticos por um reagente
heteropolifosfato (fosfotungístico- fosfomolibídico),
desenvolvendo uma cor azul, que vai ser medida num
colorímetro e comparada com uma curva padrão.
MÉTODO POR FENOL- VANTAGENS
• E de 10 a 20 vezes mais sensível que a
determinação por UV, e 100 vezes mais
sensível que o método por biureto.

• É bastante específico, pois são poucas as

substâncias potencialmente interferentes,
sendo a sacarose, em alta concentração, um
dos poucos interferentes.
MÉTODO POR FENOL- DESVANTAGEM

• A intensidade da cor pode variar com a

composição em aminoácidos da proteína
analisada e também com as condições analíticas.

• É lento.

• Destrói a amostra.

• Operações múltiplas (muita manipulação).

METODO POR ESPECTROFOTOMETRIA
ULTRAVIOLETA

• A maioria das proteínas possui absorção UV

em 280 nm devido à presença de tirosina,
triptofano e fenilalanina, que são aminoácidos
aromáticos, com anel benzênico, e, portanto,
com duplas ligações conjugadas.

Vantagem:

• Não destrutivo.
METODO POR ESPECTROFOTOMETRIA
ULTRAVIOLETA
E as desvantagens são:

• Os resultados não são muito precisos porque eles vão depender

da concentração dos três aminoácidos na composição da proteína.

• Não tem interferência com sais de amônia, mas os ácidos

nucléicos podem dar interferência na análise.

• A preparação da amostra para a leitura espectrofotométrica é

muito longa. A determinação pode ser feita também pela medida
da fluorescência UV devido principalmente ao triptofano.

• Este método foi desenvolvido a princípio para leite e produtos

lácteos, porém atualmente é também utilizado em produtos
cárneos e agrícolas.
METODOS TURBIDIMÉTRICOS
• A medida é baseada na turbidez causada pela proteína precipitada por algum
agente precipitante, como ácido tricloroacético, ferricianeto de potássio e
ácido sulfosalisílico.

As vantagens do método são:

• É rápido.

• Simples para amostras líquidas, onde a proteína está em solução.

As desvantagens são:

• Não compensa ser utilizado para amostras sólidas, onde a proteína deve ser
extraída para uma solução.
• Os resultados variam com o tipo de proteína.
• Pode haver precipitação de outras substâncias com as proteínas, causando
interferência no método.
• O método depende de calibração com padrões conhecidos de proteínas
determinados por outros métodos.
 MÉTODO DYE-BINDING
• Este método apareceu por volta de 1944, e seu uso em alimentos
tem aumentado nos últimos anos.

• Quando uma amostra é tratada com excesso de corante (tipo

indicador), o corante e a proteína reagem quantitativamente para
formar um complexo insolúvel que pode ser separado por
centrifugação ou filtração.

• O excesso de corante não reagido em solução é medido

colorimetricamente e, por diferença, obtém-se indiretamente a
quantidade de proteína da amostra.

• Uma relação entre a quantidade do corante de ligação e o

conteúdo de proteína de uma amostra permite a construção, para
cada tipo de alimento, de uma tabela de conversão onde as % de
proteína são lidas.
 MÉTODO DYE-BINDING
• O método é normalmente utilizado em amostras de grãos de cereais, sementes
oleaginosas, produtos vegetais e animais e laticínios.

• Existem equipamentos comerciais disponíveis que tornam o método rápido e

sem a desagradável manipulação dos reagentes corrosivos utilizados no método
de Kjeldahl. Estes equipamentos fazem, num mesmo conjunto. a reação
colorimétrica, a filtração do complexo insolúvel e a medida colorimétrica da
solução filtrada.

• Os corantes utilizados no método são: laranja G, laranja 12, vermelho A, preto

búfalo e preto amino 10B.

• Este método tem boa correlação com o método oficial de Kjeldahl.

• A maior desvantagem é que ele depende do equipamento próprio para atender

as vantagens citadas acima.
MÉTODOS FISICOS


• São vários os métodos físicos disponíveis,

mas, como eles não são muito utilizados,
serão apenas citados.

• São os seguintes: índice de refração;

densidade específica; viscosidade; tensão
superficial; condutividade; polarização.