17/02/2020 Determinação espectrofotométrica de vitamina B2 (riboflavina) em formulações farmacêuticas empregando sistema de análises po…

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Quím. Nova vol.23 n.5 São Paulo Sept./Oct. 2000
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Clezio Aniceto, Larissa de Souza Canaes, Orlando Fatibello-Filho*
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Recebido em 16/9/99; aceito em 12/1/00 Permalink

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Spectrophotometric determination of vitamin B2 (riboflavin) in pharmaceutical formulations using

flow injection analysis. A flow injection spectrophotometric procedure exploiting merging zones is proposed for
determining vitamin B2 (Riboflavin) in pharmaceutical preparations. The determination is based on the red-
colored complex formation between vitamin B2 and silver(I) which was measured at 520 nm. Vitamin B2 was
determined in four pharmaceutical preparations in the 1.0 to 50.0 mg L-1 concentration range, with a detection
limit of 0.5 mg L-1. The recovery from three samples ranged from 98.0 to 104.0 %. The analytical frequency was
42 h-1 and r.s.d. were lower than 1% for solutions containing 10.0, 30.0 and 50.0 mg L-1 vitamin B2 (n= 10).
The results obtained in commercial formulations using the FIA procedure were in good agreement with those
obtained by using a conventional fluorimetric procedure (r=0.9998) and also with the label values (r= 0.9997).

Keywords: vitamin B2; flow injection spectrophotometry; pharmaceutical preparations.

INTRODUÇÃO
Vitaminas são substâncias essenciais ao metabolismo dos seres vivos, sendo requeridas em quantidades
diminutas e não são sintetizadas pelos mesmos. A ausência de vitamina B2 (riboflavina) no organismo pode
causar queda de cabelo, lesões na pele, olhos, lábios, boca, órgãos genitais entre outras1,2.

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Dependendo da solubilidade, as vitaminas são classificadas em hidrossolúveis e lipossolúveis1. As vitaminas

hidrossolúveis são aquelas que se dissolvem em água, mas não em lipídios; algumas delas, porém, são
levemente solúveis em certos solventes orgânicos. Dentre as vitaminas hidrossolúveis tem-se o ácido ascórbico
(vitamina C), ácido nicotínico, riboflavina (vitamina B2), tiamina (vitamina B1), piridoxina (vitamina B6), ácido
pantotênico, biotina, ácido fólico e cianocobalamina (vitamina B12).

A carência dessas vitaminas pode ser originada tanto pela falta de alimentos (caso de populações pobres) ou de
uma dieta mal equilibrada. No caso dos países ditos desenvolvidos uma grande maioria também padece deste
mal devido à alimentação inadequada provocada, dentre outros fatores, pelo ritmo estressante da vida moderna
e também devido à ingestão de doses excessivas de medicamentos que inibem a ação das vitaminas no
organismo1,2.

Riboflavina (7,8-dimetil-10-(1'-D-ribitil) isoaloxazina)2 é um pó cristalino amarelo-alaranjado, de sabor amargo e

odor leve. No estado anidro, é estável à luz, entretanto, em soluções alcalinas, decompõe-se rapidamente. Na
presença de oxigênio, a riboflavina é transformada irreversivelmente pela luz em lumiflavina, lumiocromo e
compostos de menor importância. Ela é levemente solúvel em água e em álcool, e insolúvel em éter etilíco e
clorofórmio, sendo seu ponto de fusão igual a 285oC3.

A riboflavina é abundantemente distribuída em gêneros alimentícios animais e vegetais, tais como fígado, leite,
rim, carne, ovos, ostras, germe de trigo, nabos, beterraba e farelo de arroz1.

A Farmacopéia Americana (USP-23)4 e a A.O.A.C.5 recomendam o método fluorimétrico para a determinação de

vitamina B2, com excitação em comprimento de onda de 444 nm e medida da intensidade de fluorescência em
530 nm.

A maioria dos métodos de determinação de vitamina B2 encontrados na literatura, são por cromatografia líquida
de alta eficiência6, fluorimetria7, amperometria8, quimioluminescência9, espectrofotometria10 e microbiológico11.

A análise, o conhecimento e a distribuição de vitaminas em produtos farmacêuticos tem-se constituído em um

dos principais problemas desde que iniciou-se a investigação destes compostos. O maior interesse nestas análises
está centrado nos produtos naturais, na necessidade destes compostos em seres humanos e seu emprego na
indústria farmacêutica.

O desenvolvimento de novos métodos de análise para fármacos, especialmente aqueles que apresentam em suas
formulações vitaminas, se deve ao fato de seu crescente uso na indústria farmacêutica, sendo de extrema
necessidade o desenvolvimento de procedimentos rápidos, de baixo custo, precisos e seletivos para a
determinação destas vitaminas nesses produtos, seja na forma livre ou na presença de outras substâncias,
devido ao crescimento exagerado da demanda destes produtos, ocasionado pelo aumento populacional em países
em desenvolvimento e também os modismos de consumo registrados atualmente, principalmente no caso das
vitaminas que são tidas como rejuvenescedoras e eliminadoras de certos males. Assim, já foram desenvolvidos
procedimentos em fluxo para determinação das vitaminas B112,13 e B614 em preparações farmacêuticas.

Desenvolveu-se neste trabalho um sistema de análises em fluxo, com zonas coalescentes, para a determinação
espectrofotométrica de vitamina B2 (riboflavina) em complexos multivitamínicos e fármacos.

PARTE EXPERIMENTAL
Instrumentação

Todas as medidas espectrofotométricas foram feitas em um espectrofotômetro Femto, modelo 435 com uma
célula de quartzo (caminho óptico 1,0 cm) conectado a um registrador Cole Parmer (Niles, IL, USA) modelo
12020000 de dois canais. O estudo do efeito da temperatura na reação de complexação da riboflavina-Ag(I) foi
realizado usando-se um banho termostatizado Tecnal, modelo TE 184. Para a propulsão das soluções de
referência, reagentes e amostras utilizou-se uma bomba peristáltica Ismatec (Zurich, Suiça) modelo 7618-40 e
tubos de bombeamento de Tygon de 0,8 mm de diâmetro interno. As amostras e soluções de referência foram
introduzidas no sistema FIA, utilizando-se um comutador automático Micronal modelo B352. Tubos de polietileno
e conectores de acrílico foram utilizados na montagem do módulo de análises.

As medidas de fluorescência15 (método comparativo) foram feitas com um espectrofluorímetro Hitachi, modelo F
4500 (Japão), utilizando-se lexc= 444 nm e lmed=530 nm.

Reagentes e soluções

Riboflavina (vitamina B2), cloridrato de tiamina (vitamina B1), cloridrato de piridoxina (vitamina B6) e
cianocobalamina (vitamina B12) reagentes de grau bioquímico, foram utilizados para preparação de soluções de
referência e interferentes. Os demais reagentes utilizados foram de grau analítico e água de um sistema Milli-Q
da Millipore (Redford, MA, USA-Modelo UV Plus Ultra-baixo teor de solventes orgânicos dissolvidos) foi usada na
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preparação das soluções. Sacarose, glicose, lactose, ácido cítrico, ácido ascórbico e amido foram adquiridos da
Sigma Chemical Co (St. Louis, MO, USA). Solução estoque de riboflavina 50 mg L-1 foi preparada em KNO3
0,1mol L-1. Soluções de referência de vitamina B2 de 1,0 a 40,0 mg L-1 foram preparadas diariamente em KNO3
0,1mol L-1 por diluição da solução estoque. As soluções de riboflavina preparadas foram protegidas da luz, sendo
assim acondicionadas em frascos de cor âmbar. Preparou-se semanalmente solução de nitrato de prata 0,25 mol
L-1, abrigando-a da luz por acondicionamento em frasco âmbar.

Preparação das amostras

Vitamina B2 foi determinada em amostras de comprimidos adquiridos em farmácias locais, comercializadas como
Complexo B (Roche Químicos e Farmacêuticos SA, Rio de Janeiro, RJ), Complexo B cristália injetável (Cristália
Produtos Químicos Farmacêuticos Ltda, Itapira, SP), Clusivol (Laboratórios Wyeth-Whitehall Ltda, São Paulo, SP)
e Dayvit (Aché Laboratórios Farmacêuticos S. A, Guarulhos, SP ).

No caso de amostras sólidas (drágeas), dez comprimidos de cada amostra foram macerados, e uma massa entre
100 a 300 mg foi transferida para um béquer de 100 mL contendo 25 mL de KNO3 0,1mol L-1 e agitado a seguir
até completa dissolução da amostra. As soluções foram filtradas em papel de filtro Whatman no 1, o filtrado foi
transferido para um balão de 50 mL e o volume completado com KNO3 0,1mol L-1.

No caso de amostras líquidas (injetáveis), uma alíquota de 300 mL da amostra foi transferida para um balão de 25
mL e o volume foi completado com KNO3 0,1mol L-1.

O procedimento fluorimétrico proposto pela Farmacopéia Brasileira15 foi empregado para a determinação dos
teores de vitamina B2 nas quatro amostras comerciais.

Sistema de análises por injeção em fluxo

A Figura 1 mostra o esquema do sistema de análises por injeção em fluxo com zonas coalescentes utilizado. Na
posição de injeção, a amostra (L1, 250 mL) e o reagente (L2, 250 mL; AgNO3 0,25 mol L-1) foram injetados
simultaneamente no transportador KNO3 0,1mol L-1 a uma vazão de 4,4 mL min-1 em cada canal, confluindo no
ponto X. O complexo riboflavina-Ag(I) formado no reator B (0,8 mm de di e 100 cm de comprimento) foi
transportado à célula de fluxo e a absorbância foi monitorada espectrofotometricamente a 520 nm.

RESULTADOS E DISCUSSÃO
A riboflavina reage com íons Ag+(aq) produzindo um complexo vermelho16 com forte absorção em 520 nm (e=
5550 L mol-1 cm-1) no intervalo de pH entre 6,5 e 7,1. Esse complexo 1:1 formado nessas condições de pH e a
20oC possui uma constante de estabilidade da ordem de 108, indicando uma alta afinidade dessa vitamina pelo
cátion prata16, sendo assim essa reação explorada no presente trabalho.

Efeito da concentração de AgNO3

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Estudou-se a influência da concentração de nitrato de prata nas concentrações de 0,01; 0,05; 0,1; 0,15; 0,20;
0,25 e 0,30 mol L-1 sobre o sinal analítico, nas condições experimentais descritas na Figura 1. As melhores
sensibilidade e estabilidade da linha base foram obtidas em AgNO3 0,25 mol L-1. Assim, em todo esse trabalho
utilizou-se esse reagente nessa concentração.

Efeito do comprimento da alça de amostragem

Estudou-se o efeito do comprimento da alça de amostragem de 25 a 150 cm (volumes de 125 a 750 mL) para
soluções de referência de vitamina B2 de 20, 30 e 40 mg L-1 e vazão constante de 4,4 mL min-1 e concentração
de AgNO3 0,25 mol L-1. Observaram-se que os sinais analíticos obtidos aumentaram para alças de até 50 cm
(250 mL), permanecendo constante para as alças de amostragem com volumes superiores. Assim selecionou-se
essa alça de amostragem para o desenvolvimento desse trabalho, afim de não diminuir a freqüência analítica do
procedimento FIA.

Efeito da vazão do transportador

Estudou-se o efeito da vazão de 1,4; 2,5; 3,6; 4,4 e 5,0 mL min-1 da solução transportadora de nitrato de
potássio 0,1 mol L-1 em cada canal. O sinal analítico aumentou até a vazão de 4,4 mL min-1, permanecendo
constante nas vazões maiores. Sendo assim, fixou-se uma vazão de 4,4 mL min-1 para a solução transportadora
de KNO3 0,1 mol L-1. Estudo preliminar do efeito da concentração do transportador KNO3 variando de 0,02 a 1,0
mol L-1, mostrou que a melhor concentração de KNO3 foi a de 0,1 mol L-1. Concentrações menores de 0,1 mol L-
1,levaram a um aumento da instabilidade da linha base e concentrações superiores, a um aumento do efeito
Schlieren.

Efeito do comprimento da bobina reacional

Estudou-se o efeito do comprimento da bobina de reação de 50, 100, 150, 200, 250 e 300 cm sobre o sinal
analítico. Observou-se que para os comprimentos de 100, 150 e 200 cm os sinais transientes obtidos foram
praticamente constantes não havendo perda significativa da absorbância (sinal analítico). Para os comprimentos
de 50, 250 e 300 cm os sinais transientes obtidos foram inferiores aos sinais analítico obtidos com a bobina
reacional de 100 cm. Assim, selecionou-se a bobina de reação de 100 cm de comprimento. Nos comprimentos
menores que 100 cm, o rendimento da reação de complexação foi muito inferior aquele obtido no comprimento
de reator de 100 cm. Por outro lado, comprimentos de 250 e 300 cm, levaram a um aumento acentuado da
dispersão da zona de amostra.

Curva analítica

A curva analítica foi obtida por injeções sucessivas em triplicata de volumes de soluções de referência de
riboflavina nas concentrações de 1,0 a 50,0 mg L-1 em nitrato de potássio 0,1 mol L-1, vazão de 4,4 mL min-1 da
solução transportadora (nitrato de potássio 0,1 mol L-1), alça de amostragem de 50 cm (250 mL) e bobina de
reação de 100 cm. A curva analítica obtida pode ser descrita pela equação: A = -0,0013 + 6,23x10-3 [B2], onde
A é a absorbância e [B2] a concentração de riboflavina em mg L-1, apresentou uma linearidade no intervalo de
concentração dessa vitamina de 1,0 a 50,0 mg L-1 e um limite de detecção de 0,5 mg L-1(três vezes o sinal do
branco/inclinação da curva analítica). A freqüência analítica foi 42 h-1 e os sinais transientes em triplicata obtidos
para as soluções de referência de riboflavina e aqueles em triplicata para as soluções de amostras são
apresentados na Figura 2.

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Estudo da repetibilidade

Estudou-se a repetibilidade do procedimento proposto para concentrações de 10, 30 e 50 mg L-1 de vitamina B2,
obtendo-se desvios padrão relativos menores que 1% para as concentrações estudadas (n=10).

Estudo da seletividade e de adição/recuperação da riboflavina em amostras comerciais

Estudou-se o efeito da adição de algumas substâncias geralmente presentes nas amostras comerciais como
sacarose, glicose, lactose, ácido cítrico, ácido ascórbico, amido e as vitaminas B1 (cloridrato de tiamina), B6
(cloridrato de piridoxina) e B12 (cianocobalamina) sobre o sinal analítico do procedimento FIA proposto. Desses
compostos investigados nas razões de concentrações de 10:1; 1:1 e 1:10, somente o ácido ascórbico causou
alguma interferência negativa em concentrações iguais ou superiores daquela da vitamina B2. No entanto, a
concentração de ácido ascórbico nos produtos farmacêuticos analisados estavam sempre numa concentração
inferior àquela de vitamina B2, não interferindo assim nas determinações quantitativas.

A Tabela 1 apresenta os resultados encontrados de adição e recuperação de soluções de referência de riboflavina

(vitamina B2) em formulações farmacêuticas nas concentrações de 10,0; 20,0 e 30,0 mg L-1. A recuperação de
vitamina B2 variou de 98,0 a 104,0 %, indicando assim ausência de interferência das matrizes dessas amostras
ensaiadas. Esses resultados são confirmados com os teores de vitamina B2 concordantes encontrados utilizando-
se o procedimento fluorimétrico e o proposto.

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Aplicações

A Tabela 2 apresenta os teores de vitamina B2 encontrados em quatro formulações farmacêuticas comerciais

empregando-se um método oficial15, o procedimento proposto e também os valores rotulados.

Os resultados encontrados utilizando-se o procedimento espectrofotométrico em FIA estão em boa concordância

com aqueles resultados encontrados usando-se o método da farmacopéia brasileira15 (r=0,9998) ou o teor
declarado pelo fabricante (r=0,9997) e dentro de um intervalo de erro relativo aceitável, mostrando assim a
importância do procedimento FIA desenvolvido. Como mostrado, esse procedimento apresenta boa exatidão e
precisão, alta freqüência analítica e baixo consumo de reagentes, podendo assim ser adaptado em laboratórios de
análise de rotina desses produtos farmacêuticos.

CONCLUSÕES
Os estudos realizados neste trabalho evidenciaram a viabilidade do emprego do método espectrofotométrico em
fluxo para determinação da riboflavina após reação de complexação com a prata (Ag(I)) em nitrato de potássio
0,1 mol L-1.

Os resultados obtidos empregando o método FIA proposto estão de acordo com os resultados obtidos usando o
método recomendado da farmacopéia brasileira e também com os teores rotulados. Este método FIA apresentou
precisão satisfatória com boa reprodutibilidade e sensibilidade e uma freqüência analítica de 42 h-1, empregando
apenas um volume de 250 mL da solução de amostra.

AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem o apoio financeiro recebido do CNPq, CNPq/PADCT, FAPESP, FINEP, bem como a bolsa de
doutorado do CNPq para CA e bolsa PIBIC para LSC.

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