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MICROSCÓPIO

MEDICINA

O nome microscópio, O que é ocular?, Iluminação do mincroscópio, microscopia eletrônica.

INTRODUÇÃO:

O nome microscópio (mikrós, pequeno, e skoppéoo, observar, ver através de) se deve a Jean Faber,
membro da antiga Academia dos Lincei (1624)). Este termo designa um microscópio composto por uma
objetiva e uma ocular, embora na prática tenha sido estendido a todos os instrumentos ampliadores
simples e compostos.

O microscópio é um instrumento que permite observar os objetos não perceptíveis à vista desarmada.
Isso se consegue mediante um sistema óptico composto por lentes de cristal que atravessadas pela
imagem do objeto ampliam-na. Segundo o número e a posição das lentes, distinguem-se o microscópio
simples (lupa = microscópio estereoscópio) e o microscópio composto.

Denominamos microscópio simples a toda e qualquer lente que com ou sem montagem própria, grande
ou pequena, biconvexa ou planoconvexa, amplia os objetos. É comumente chamado de lupa. Existem
numerosos modelos e variedades.

Podemos dizer que qualquer lente convergente utilizada de maneira que produza uma imagem virtual, e
portanto, direta, e maior que o objeto é um microscópio simples. As lupas somente se diferenciam na
montagem. Seu manejo é muito simples, e consiste praticamente em orientar a lente de modo que sua
face plana ou menos curva fique voltada para o objeto e colocá-la a uma distância tal que este ( o objeto
) fique situado entre o foco e o vértice e tanto mais próximo daquela quanto maior se queira a imagem.
O microscópio composto é constituído pela combinação de dois sistemas de lentes

convergentes: um próximo do olho do observador, motivo pelo qual é chamado sistema de oculares, e
que age como microscópio simples; outro, próximo do objeto denominado sistema de objetivas. Este é o
verdadeiro microscópio, que estamos acostumados a ver em todos os laboratórios.

Com os modelos simples é possível obter bons aumentos e realizar excelentes observações pois, salvo
para estudos muito especializados, que requerem grandes aumentos, um microscópio comum nos será
suficiente para passar horas muito agradáveis e nos permitirá observar qualquer classe de materiais.
Salientemos que, por muitas e variadas que sejam suas lentes, qualquer que seja sua potência, o
princípio é sempre o mesmo: é suficiente colocar a objetiva de modo que o objeto fique colocado um
pouco além do foco principal da lente, mas o mais próximo possível dele, para que a imagem formada
seja real e a maior possível ( imagem intermediária).

Dispondo a ocular de maneira que a imagem real obtida pela objetiva fique situada entre o vértice e o
foco da ocular, obter-se-á uma imagem virtual direta e maior do que a primeira. Observar-se-á pois,
uma imagem do objeto virtual invertida e sumamente aumentada.

Quanto maiores forem as curvaturas das lentes e a distâncias entre o sistema de objetivas e o sistema
de oculares maior será o aumento total.

Vimos, por conseguinte, que o microscópio composto possui dois sistemas de ampliação, o de oculares e
o de objetivas. Para calcular o aumento total de um microscópio teremos, pois, que multiplicar o
aumento próprio da objetiva pelo aumento da ocular.

Ocular: é uma lupa. As mais simples possui no seu interior duas lentes e um diafragma. No interior da
ocular temos então: lente de campo, diafragma e a ocular propriamente dita.

Objetivas: são formadas internamente por várias lentes. As resoluções alcançadas e a maior parte da
qualidade da imagem final dependem das lentes objetivas.
Há vários tipos de objetivas, que se diferenciam pela qualidade da imagem, correção de aberração e
preço.

• Tipos de objetivas:

1. Acromáticas – são a mais simples. São aquelas sem nenhuma sofisticação, que os microscópios
comuns possuem.

2. Semi-apocromática – são também chamadas de fluorita, porque este material entra na sua
constituição, dando alguma correção para as aberrações.

3. Apocromáticas – possuem correção ampla. Abrangem todo o espectro.

4. Planapocromática – possui imersão, com aumento de 63 X e abertura numérica de 1,4. Com ela se
consegue o máximo de resolução de um microscópio óptico.

Objetivas de imersão: são objetivas de maior aumento um que se utiliza óleo de imersão para aproveitar
toda a abertura numérica da lente. O óleo possui índice de refração tal que impede que os raios
luminosos sofram reflexão ao passar do material para o ar contido entre a lamínula e a objetiva.

Condensador: é formado por várias lentes internas. Tem por finalidade concentrar a de modo que a
objetiva receba um cone cheio de luz. É regulado pelo diafragma de abertura.

Iluminação do Microscópio óptico

A iluminação é por Transparência, sendo o objeto observado fino suficiente para a luz o atravessar. Uma
lâmpada ou espelho trazem a luz da parte inferior do microscópio e esta atravessa o condensador, o
material a ser observado e depois a objetiva. Há microscópios que a luz provém do mesmo lado da
objetiva. Chama-se epi-iluminação.

A luz usada: pode ser natural mas a mais comum é a de uma lâmpada com filamento de tungstênio.
Emite luz quase branca (levemente amarelada).

Para obter o máximo de resolução do microscópio basta seguir a técnica de iluminação de Kohler. Como
proceder?

1. Fechar o diafragma de abertura e focalizá-lo, mexendo no condensador. Aparecerá uma imagem

facetada.

2. Centralizar a imagem acima.

3. Abrir o diafragma de abertura até iluminar uniformemente o campo.

Modalidades de observação em microscópios ópticos

1. Campo claro

2. Campo escuro

3. Contraste de fase

4. Contraste interferencial

5. Polarização
6. Fluorescência

7. Microscópio invertido

8. Microscópio estereoscópico

9. Confocal a laser

1. Campo claro: todo os microscópios funcionam com campo claro. É utilizado para observação de
materiais corados, geralmente entre lâmina e lamínula.

2. Campo escuro: são microscópios que utilizam condensadores especiais. A luz fica de tal modo
inclinada, que não penetra diretamente na objetiva. A luz atinge o material e somente a porção desviada
pelo objeto penetra na objetiva, formando a imagem. O fundo fica claro e o material brilhante. Se não
houver objeto o campo fica totalmente escuro. Esta modalidade da microscopia é utilizada para material
de tamanho muito pequeno que sejam muito transparentes e apresentam pouco contraste para serem
observados em campo claro.

3. Contraste de fase: baseia-se nos princípios físicos da difração da luz. Este microscópio é dotado de um
sistema óptico especial que transforma diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de
intensidade. Assim, as diferenças de fase, para as quais o olho não é sensível, tornam-se visíveis, pois
são traduzidas em diferenças de intensidade luminosa, facilmente perceptível. O microscópio de
contraste de fase pode ser usado de modo que as estruturas celulares apareçam escuras (fase positiva)
ou claras (fase negativa).

4. Contraste interferencial: é muito útil quando se trabalha com materiais excessivamente espessos para
contraste de fase ou quando se deseja visualizar pequenos detalhes de células sem corar, cujo halo de
contraste de fase esteja provocando alterações na imagem.
5. Polarização: é utilizado na observação de materiais que sejam birrefringentes (estruturas
anisotrópicas, com índices diferentes de refração como músculo, ossos, celulose, fibras, cabelos, cristais,
etc.). O microscópio de polarização possui dois prismas: um polarizador e outro analisador. A luz ao
penetrar em estruturas como as citadas se desdobra em duas. O prisma deixa passar uma das vibrações
luminosas mas não a outra, de modo que as estruturas que forem isotrópicas serão canceladas e no seu
lugar ficará escuro. As estruturas birrefringentes (anisotrópicas) produzirão um tipo de vibração
luminosa que passará, ficando brilhante. Somente as estruturas birrefringentes aparecerão brilhantes,
ficando o restante do material escuro.

6. Fluorescência: este microscópio é semelhante com o convencional, exceto por apresentar um sistema
diferente de iluminação e jogos de filtro – um que filtra a luz antes da mesma alcançar o material e
outro que filtra a luz emitida pelo mesmo. O espécime a ser estudado deve ser previamente marcado
com algum composto fluorescente. Somente a luz emitida pelo objeto é observada, ficando desse modo
brilhante com fundo negro. O microscópio óptico de fluorescência trabalha com sistema epi-iluminação.

7. Microscópio invertido: permite a observação de material muito espesso, impossível de visualizar nos
demais microscópios. Permite que observe células dentro dos tubos e garrafas, sem contudo, precisar
abri-las evitando-se assim problemas de contaminação.

8. Microscópio estereoscópico: possuem as oculares (lupa) que ampliam o material permitindo

observações de espécimens para dissecções.

9. Confocal laser: possui uma série de peculiaridades que prime observar material espesso, sem corar,
vivo ou não, pois focaliza diferentes planos focais, obtendo-se cortes ópticos. Ele trabalha, geralmente,
com o mesmo tipo de sistema óptico usado pela florescência convencional, com a diferença que neste,
todo o campo fica iluminado enquanto que no LSM, o sistema óptico focaliza somente um ponto em
determinada profundidade no espécimen. Uma fonte luminosa bastante forte e brilhante é requerida e
desse modo usa-se o laser. A luz do laser passa por um pequeno orifício e ilumina um único ponto do
espécimen. A fluorescência emitida pelo material é coletada e conduzida para um detector, que possui
um segundo orifício pequeno. Dessa forma a imagem final que teremos é aquela captada pelo segundo
orifício.

Limite da resolução X Número de abertura

O limite de resolução corresponde à menor distância entre dois pontos em que eles ainda podem ser
distinguidos separadamente. Desse modo, O poder de resolução do microscópio corresponde aos
menores limites de resolução possíveis. Assim,

d=Kx*

N.A.

Onde K é uma constante (0,61), * é o comprimento de onda utilizado e N.A. é o número de abertura da
lente objetiva. Desse modo, ao utilizarmos um microscópio devemos logo reparar o número de abertura
de suas objetivas, pois o melhor microscópio é aquele que vai apresentar o maior número de abertura
pois seu limite de resolução será menor.

Poder de resolução

O poder de resolução é inversamente proporcional ao limite de resolução. O melhor microscópio é

aquele com maior poder de resolução.

O limite de resolução do olho humano é em torno de 0,2 mm. O melhor microscópio óptico possui limite
de resolução de 0,2 mm. Logo quanto menor o comprimento de onda melhor a resolução.

MICROSCOPIA ELETRÔNICA

A relação entre o limite de resolução e o comprimento de onda de uma radiação luminosa é verdadeiro
para qualquer forma de radiação , seja ela um feixe de luz ou de elétrons. Com elétrons entretanto , o
limite de resolução pode ser muito pequeno. O comprimento de onda de um elétron diminui com o
aumento da sua velocidade. Em um microscópio eletrónico , com uma voltagem de aceleração de
100.000 V , o comprimento de onda de um elétron é 0,004 nm .Teoricamente , a resolução de tal
microscópio seria cerca de 0,002 nm , que é 10.000 vezes maior do que a do microscópio ótico.

Entretanto , devido ao fato das aberrações de uma lente de elétrons serem mais difíceis de se corrigir do
que aquelas produzidas por uma lente de vidro, o poder de resolução da maioria dos mais modernos
microscópios eletrônicos é, nas melhores condições, 0,1 nm. Ainda mais, problemas na preparação da
amostra, contraste e danos causados pela radiação limitam, efetivamente, a resolução normal para
materiais biológicos para 2 nm. Contudo, este valor é cerca de 100 vezes melhor do que a resolução do
microscópio óptico .

MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO (TEM)

O microscópio eletrônico de transmissão é semelhante ao microscópio óptico, a pesar de muito maior e

invertido. A fonte de iluminação é um filamento ou cátodo que emite elétrons do topo de uma coluna
cilíndrica de cerca de 2 metros de altura. Sendo os elétrons espalhados através de colisão com as
moléculas de ar, primeiramente o ar tem que ser bombeado para fora da coluna para criar vácuo. Os
elétrons são então acelerados a partir do filamento por um ânodo e atravessam um pequeno orifício
formando um feixe de elétrons que desce pela coluna. Bobinas magnéticas, colocadas ao longo da
coluna, convergem o feixe de elétrons assim como as lentes de vidro convergem a luz em um
microscópio óptico.

A amostra é colocada no vácuo, através de uma câmara de compressão, na trajetória do feixe de

elétrons. Como para o microscópio óptico a amostra é usualmente corada, neste caso, com material
denso ao elétron, como veremos na próxima seção. Alguns dos elétrons que atravessam a amostra são
espalhados pelas estruturas coradas com material denso aos elétrons o restante é convergido para
formar uma imagem de forma análoga ao processo de formação de uma imagem no microscópio óptico
em uma placa fotográfica ou em uma tela fosforescente. Devido ao fato de os elétrons disperso se
desviarem do feixe, as regiões densas da amostra são destacadas como áreas de fluxo reduzido de
elétrons, as quais se mostram escuras.

COLORAÇÃO NEGATIVA

Permitem a visualização de macromoléculas com auto resolução. Apesar de macromoléculas isoladas,

como DNA ou proteínas, de alta massa molecular, podem ser prontamente analisadas ao microscópio
eletrônico, se elas forem sombreadas com metal para produzir contraste, detalhes mais minuciosos
podem ser vistos utilizando-se coloração negativa. As moléculas, sustentadas por um filme delgado de
carbono ( o qual é praticamente transparente aos elétrons ), são lavadas com uma solução concentrada
de sal mais pesado com acetato de uranila.
Após amostra secar, uma camada muito fina do sal do metal cobre completamente o filme de carbono
exceto no local onde esta localizada a amostra. Devido ao fato das macromoléculas permitirem a
passagem dos elétrons, muito mais facilmente do que a coloração de metal pesado circundante, uma
imagem oposta ou negativa da molécula criada. Coloração negativa é especialmente útil para
observação de grandes agregados de macromoléculas, como no caso dos vírus ou dos ribossomos e para
visualização da estrutura da sub unidade dos filamentos de proteína.

Sombreamento e coloração negativa são capazes de produzir uma visão de superfície de alto contraste
de pequenos agrupamentos de macromoléculas, mas ambos são limitados em termos de resolução
devido ao tamanho da menor partícula do metal utilizado, tanto no caso do sombreamento quanto na
coloração empregada.

MICORCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA

FUNCIONAMENTO:

O SEM - Microscópio Eletrônico de Varredura - utiliza os elétrons que são emitidos da superfície de
amostra. A amostra a ser examinada é fixada, desidratada e coberta com uma camada fina de metal
pesado. A amostra é varrida por um feixe de elétrons. O trajeto do feixe de elétrons é, em seguida,
modificado por um conjunto de bobinas refletoras que o fazem percorrer o espécimen ponto a ponto e
ao longo de linhas paralelas (VARREDURA). Ao atingirem o espécimen, os elétrons causam diversos
efeitos. Emitem elétrons secundários que são colhidos pelo coletor, passam por um sistema de
amplificação e são transformados em pontos de mais ou menos luminosidade. As micrografias são
obtidas por fotografia da imagem na tela.

UTILIZAÇÃO:

Obter imagens tridimensionais de superfícies.

MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE CRIOFRATURA

FUNCIONAMENTO:

As células são congeladas à temperatura do nitrogênio líquido (-196C) e depois fraturado com uma
lâmina de bisturi. O corte do plano da fratura tenta mostrar o interior da membrana celular.

UTILIZAÇÃO:

Possibilita uma forma de visualização do lado interno das membranas celulares.

MICROSCOPIA CRIOELETRÔNICA

FUNCIONAMENTO:

Uma camada muito fina ( ~ 100 nm ) de uma amostra hidratada rapidamente congelada. Um prendedor
de amostra e necessário para manter esta amostra hidratada a -160C no vácuo do microscópio, onde
esta pode ser observada diretamente, sem fixação, coloração ou secagem.

UTILIZAÇÃO:

Visão de estruturas internas tridimensionais de vírus por exemplo.

CONCLUSÃO

Os conhecimentos sobre as células progridem à medida que as técnicas de investigação se aperfeiçoam.

O aparecimento de um novo instrumento de trabalho, ou a aplicação mais engenhoso de um aparelho já
existente, leva sempre a novas descobertas e à elucidações de algumas funções celulares.
Muitas técnicas de microscopia óptica estão disponíveis para a observação de células. Células que foram
fixadas e coradas podem ser estudadas em um microscópio óptico convencional, enquanto anticorpos
acoplados a corantes fluorescentes podem ser usados para localizar moléculas específicas nas células
em um microscópio de fluorescência.

O microscópio confocal de varredura proporciona secções ópticas finas, e pode ser usado para
reconstruir uma imagem tridimensional, células vivas podem ser observadas em contraste de fase,
contraste de interferência diferencial, ou óptica de campo escuro. Todas as formas de microscopia
óptica são facilitados por técnicas de processamento eletrônico de imagens, que ampliam e retiram a
imagem.

O advento do microscópio eletrônico e seu emprego para estudos morfológicos e citoquímicos

representam enorme impulso para o conhecimento das funções celulares, como na determinação da
estrutura detalhada das membranas e organelas na célula. Imagens tridimensionais da superfície das
células e tecidos podem ser obtidos por microscopia eletrônica de varredura, enquanto o interior da
membrana e células podem ser visualizados por técnicas de criofraturas e criodecapação
respectivamente.

A influência do microscópio eletrônico foi tão grande que levou a uma revisão completa nos conceitos
morfológicos dos constituintes celulares. Atualmente, a forma e a estrutura das organelas são
geralmente descritos conforme aparecem no microscópio eletrônico.

O emprego conjunto das técnicas modernas, incluindo a radioautografia, a cultura de células em meios
nutritivos definidos, o emprego da microscopia de fluorescência, do microscópio eletrônico de
varredura, das técnicas de criofratura e das técnicas bioquímicas, veio ampliar de tal maneira o estudo
da célula. Que se tornou usual designar essa nova abordagem sob a Biologia Celular e Molecular através
da microscopia.

LISTA DE ABREVIATURAS

Na seqüência de aparecimento:

DAC : Doença Arterial Coronária

ATC : Angioplastia Transluminal Percutânea

CENIC : Central Nacional de Intervenções cardiovasculares

INCOR - FMUSP: Instituto do Coração da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

NHLBI : National Heart, Lung and Blood Institute

UI : Unidade Coronariana

IAM : Infarto Agudo do Miocárdio

PGDF : Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas

CCV : Cirurgia cardiovascular

RM : Revascularização do Miocárdio

FE : Fração de Ejeção

VE : Ventrículo Esquerdo

IC : Insuficiência Cardíaca

HAS : Hipertensão Arterial Sistêmica

DM : Diabetes Mellitus

UCO : Unidade Coronariana

HEL : Hospital Evangélico de Londrina

CINE : Cineangiocoronarioventriculografia

Publicado por: Equipe Brasil Escola

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Biólogo

Microscopia

pozzana
6 anos atrás

Microscópio Eletrônico De Transmissão

Microscopia: Com o avanço da tecnologia e a invenção do microscópio, pudemos finalmente observar as

unidades estruturais e funcionais dos organismos vivos — a célula. 

Desde então, estes avanços permitiram que a biologia desse um enorme salto. Principalmente após a
invenção do microscópio eletrônico,  com potencial de aumento muito superior ao óptico.

Microscopia

Microscópio óptico

O microscópio é um instrumento óptico com capacidade de ampliar imagens de objetos muito pequenos
graças ao seu poder de resolução. Este pode ser composto ou simples: microscópio composto tem duas
ou mais lentes associadas; microscópio simples é constituído por apenas uma lente células.

Acredita-se que o microscópio tenha sido inventado em 1590 por Hans Janssen e seu filho Zacharias,
dois holandeses fabricantes de óculos.

Vídeo Incríveis imagens de microscópio

Fantásticas imagens de microscópio

Tudo indica, porém, que o primeiro a fazer observações microscópicas de materiais biológicos foi o
neerlandês Antonie van Leeuwenhoek (1632 – 1723). Serve-se especialmente para os cientistas, que
utilizam este instrumento para estudar e compreender os micro-organismos.
Desenho de microscópios de propriedade de Leeuwenhoek. by Henry Baker

Os microscópios de Leeuwenhoek eram dotados de uma única lente, pequena e quase esférica. Nesses
aparelhos ele observou detalhadamente diversos tipos de material biológico, como embriões de plantas,
os glóbulos vermelhos do sangue e os espermatozoides presentes no sêmen dos animais.

Foi também Leeuwenhoek quem descobriu a existência dos micróbios, como eram antigamente
chamados os seres microscópicos, hoje conhecidos como micro-organismos.

Tipos de microscópios

Os microscópios dividem-se em duas categorias principais:

Microscópio óptico: funciona com um conjunto de lentes (ocular e objetiva) que ampliam a imagem
transpassada por um feixe de luz que pode ser: Microscópio de campo claro; De fundo escuro; De
contraste de fase ou Microscópio de interferência.

Microscopia Eletrônica

Microscópio eletrônico: amplia a imagem por meio de feixes de elétrons, estes dividem-se em duas
categorias: Microscópio de Varredura e de Transmissão.

Há ainda os microscópios de varredura de ponta que trabalham com uma larga variedades de efeitos
físicos (mecânicos, ópticos, magnéticos, elétricos).

Um tipo especial de microscópio eletrônico de varredura é por tunelamento, capaz de oferecer

aumentos de até cem milhões de vezes, possibilitando até mesmo a observação da superfície de
algumas macromoléculas, como é o caso do DNA.
Importância do microscópio

Com o aparelho foi possível estudar seres unicelulares e pluricelulares invisíveis a olho nú, incluindo é
claro, as bactérias e protozoários responsáveis pela maioria das doenças hoje conhecidas.

A citologia é dependente de equipamentos que permitam a visualização completa das células humanas,

pois a maioria delas são tão pequenas que não podem ser observadas sem o auxílio de instrumentos
óticos de ampliação.

Tecido da mucosa intestinal. by euthman

O olho humano tem um limite de resolução de 0,2 mm. Abaixo desse valor, não é possível enxergar os
objetos sem o auxilio de instrumentos, como lupas e, principalmente, o microscópio.

O crédito da invenção do microscópio é discutível, mas sabe-se que em 1590 os irmãos neerlandeses
Franz, Johan e Zacarias Janssen compuseram um artefato rudimentar munido de um sistema de lentes,
que permitia a ampliação e a observação de pequenas estruturas e objetos com razoável nitidez.

O aparelho foi denominado de microscópio e constituiu a principal janela da ciência para o mundo além
da capacidade de resolução do olho humano.

Pólen observado no microscópio eletrônico

Em 1665, o inglês Robert Hooke usou um microscópio para observar uma grande variedade de
pequenos objetos, além de animais e plantas que ele mesmo representava em fiéis ilustrações.
Hooke percebeu além que a casca do carvalho era formada por uma grande quantidade de alvéolos
vazios, semelhantes à estrutura dos favos de uma colmeia. Naquela época, Hooke não tinha noção de
que estava observando apenas contornos de células vegetais mortas.

Publicou as suas descrições e ilustrações em uma obra denominada Micrographia, em que usa a
designação “little boxes or cells” (pequenas caixas ou celas) para denominar os alvéolos observados,
dando origem assim ao termo célula. O termo acabou tornando-se definitivo.

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