UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP

CÂMPUS DE JABOTICABAL

“AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA LUTEOLÍTICA DE

DIFERENTES DOSES DE CLOPROSTENOL SÓDICO E
DINOPROST TROMETAMINA ADMINISTRADAS NOS DIAS 4
E 11 DO CICLO ESTRAL DE FÊMEAS BOVINAS DE
CORTE”

Gabriel Artur Marciano do Nascimento

Médico Veterinário

2019
 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP
CÂMPUS DE JABOTICABAL

“AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA LUTEOLÍTICA DE

DIFERENTES DOSES DE CLOPROSTENOL SÓDICO E
DINOPROST TROMETAMINA ADMINISTRADAS NOS DIAS 4
E 11 DO CICLO ESTRAL DE FÊMEAS BOVINAS DE
CORTE”

Discente: Gabriel Artur Marciano do Nascimento

Orientadora: Profa. Dra. Lindsay Unno Gimenes
Co-orientador: Dr. Rafael Rodrigues Corrêa

Dissertação apresentada à Faculdade de

Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP,
Campus de Jaboticabal, como parte das
exigências para a obtenção do título de
Mestre em Medicina Veterinária.

2019
 DADOS CURRICULARES DO AUTOR

GABRIEL ARTUR MARCIANO DO NASCIMENTO – Nascido em Barbacena-MG na

data de 13/03/1989. Formou-se em medicina veterinária pela Faculdade de Ciências
Biológicas e da Saúde (FACISA) em 12 de janeiro de 2012. Nessa mesma unidade
iniciou-se nas atividades acadêmicas com projeto de iniciação científica: Agência
Financiadora Instituto Euvaldo Lodi Nacional (IEL Nacional). Trabalha na área de
pesquisa clínica veterinária desde 2008. No ano de 2017 ingressou no programa de
mestrado em medicina veterinária, área de reprodução animal, pela UNESP -
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias - Campus de Jaboticabal, finalizando em 01/08/201, com a
dissertação intitulada: Avaliação da eficiência luteolítica de diferentes doses de
cloprostenol sódico e dinoprost trometamina administradas nos dias 4 e 11 do ciclo
estral de fêmeas bovinas de corte.
 EPÍGRAFE

“Talvez não tenha conseguido fazer o melhor, mas lutei para que o melhor fosse feito.
Não sou o que deveria ser, mas Graças a Deus, não sou o que era antes”.

Marthin Luther King

 DEDICO

Dedico este trabalho a Deus, por sempre ter me guiado.

A minha esposa Cíntia pelo companheirismo, paciência e por ajudar nos bons e maus
momentos.
A minha mãe Stella e meu irmão Jefferson, que mesmo distantes sempre me
apoiaram.
A memória do meu pai Sebastião, que continua me inspirando a buscar sempre mais.
A memória dos meus amigos Rafael Siqueira Lima de Souza e Carolina
Zucchermaglio.
E a toda a minha família e a da minha esposa por terem sempre me apoiado.
 AGRADECIMENTOS

A minha orientadora Profa. Dra. Lindsay Unno Gimenes, por toda ajuda, ensinamento
e paciência.
Ao meu coorientador Dr. Rafael Rodrigues Corrêa, por todas as contribuições e pelo
companheirismo.
A Profa. Dra. Cláudia Cristina Paro de Paz do Instituto de Zootecnia de Sertãozinho
por realizar a análise dos dados obtidos.
Ao Prof. Dr. Guilherme de Paula Nogueira do laboratório de Endocrinologia, por
realizar as análises de progesterona.
A Ana Clara e a todos os integrantes do Departamento de Patologia da Unesp-
Jaboticabal que participaram das análises histológicas realizadas no trabalho.
Aos professores integrantes das bancas de qualificação e defesa, por terem
contribuído com o trabalho.
A Ourofino por ceder os animais e os fármacos para realização do trabalho.
Aos Amigos do Centro de Pesquisa Veterinária por estarem sempre dispostos a
ajudar.
 i

SUMÁRIO
Página
Certificado da Comissão de Ética no Uso de Animais – CEUA.....................................iii
RESUMO.................................................................................................................... iv
Palavras-chave........................................................................................................... iv
ABSTRACT ................................................................................................................. v
Keywords..................................................................................................................... v
LISTA DE TABELAS .................................................................................................. vi
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. vii
CAPÍTULO 1 – Considerações gerais ......................................................................... 1
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 2
2.1. Dinâmica Folicular, Ovulação e Formação do Corpo Lúteo .............................. 2
2.2. Luteólise ............................................................................................................ 4
2.3. Apoptose ........................................................................................................... 5
2.4. Ultrassonografia Doppler ................................................................................... 7
CAPÍTULO 2 - AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA LUTEOLÍTICA DE DIFERENTES
DOSES DE CLOPROSTENOL SÓDICO E DINOPROST TROMETAMINA
ADMINISTRADAS NOS DIAS 4 E 11 DO CICLO ESTRAL DE FÊMEAS BOVINAS DE
CORTE ...................................................................................................................... 13
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 14
2. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 15
2.1. EXPERIMENTO 1 ........................................................................................ 15
2.1.1. Animais ........................................................................................................ 15
2.1.2. Delineamento Experimental ......................................................................... 15
2.1.3. Avaliações Ultrassonográficas ..................................................................... 16
2.1.4. Colheita das amostras de sangue e determinação das concentrações de
progesterona ............................................................................................................. 18
2.1.5. Análises computadorizadas do CL ............................................................... 18
2.2. EXPERIMENTO 2 ........................................................................................ 18
2.2.1. Animais ........................................................................................................ 18
2.2.2. Tratamentos ................................................................................................. 19
2.2.3. Avaliações Ultrassonográficas ..................................................................... 19
 ii

2.2.4. Colheita das amostras de sangue e determinação das concentrações de

progesterona ............................................................................................................. 21
2.2.5. Colheita dos ovários, preparação dos corpos lúteos e confecção das lâminas
de imunohistoquímica ............................................................................................... 21
2.2.6. Avaliação da atividade da caspase por imunohistoquímica (imunomarcação)
22
2.2.7. Avaliação morfométrica das células luteais .................................................. 22
2.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................... 22
3. RESULTADOS ...................................................................................................... 23
3.1. EXPERIMENTO 1 .............................................................................................. 23
3.1.1. Diâmetro e área do CL ................................................................................. 25
3.1.2. Vascularização do CL .................................................................................. 27
3.1.2.1. Avaliação subjetiva dos escores de vascularização periférica e central ... 27
3.1.2.2. Análise computadorizada da área vascularizada do CL ........................... 30
3.1.3. Concentrações séricas de progesterona ...................................................... 32
3.2. EXPERIMENTO 2 .............................................................................................. 35
3.2.1. Atividade da caspase-3 por imunohistoquímica (imunomarcação) .............. 37
3.2.2. Análise morfométrica das células luteais ..................................................... 38
3.2.3. Concentrações séricas de progesterona ...................................................... 41
4. DISCUSSÃO....................................................................................................... 41
5. CONCLUSÕES ................................................................................................... 45
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 46
7. APÊNDICE ......................................................................................................... 50
iii
 iv

AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA LUTEOLÍTICA DE DIFERENTES DOSES DE

CLOPROSTENOL SÓDICO E DINOPROST TROMETAMINA ADMINISTRADAS
NOS DIAS 4 E 11 DO CICLO ESTRAL DE FÊMEAS BOVINAS DE CORTE

RESUMO – No presente estudo os objetivos foram avaliar a resposta luteolítica

de meia dose (50%) ou dose inteira (100%) de cloprostenol sódico (CS) e dinoprost
trometamina (DT) administrados em fêmeas bovinas de corte não lactantes cíclicas,
nas fases de metaestro e diestro do ciclo estral (4 ou 11 dias após a ovulação (D0),
respectivamente), quanto a: dinâmica luteínica, vascularização central e periférica,
quantificação de pixels na área vascularizada do CL e dosagem de progesterona
sérica (Exp.1) e morfometria das células luteínicas, imunomarcação de caspase-3 e
dosagem de progesterona (P4; Exp.2). No Exp. 1, 54 fêmeas tiveram a ovulação
sincronizada e receberam os seguintes tratamentos: CS 0 µg (CS0%; n=3/ grupo), CS
250 µg (CS50%; n=5/D4 e n=7/D11), CS 500 µg (CS100%; n=5/ grupo), DT 0 mg
(DT0%; n=2/ grupo), DT 12,5 mg (DT50%; n=5/D4 e n=6/D11) ou DT 25 mg (DT100%;
n=5/D4 e n=6/D11). No Exp. 2, 25 fêmeas foram sincronizadas, alocadas nos
tratamentos no D4 e D11: CS50%; CS100%; DT50%; DT100% (n=3/ grupo, exceto
DT100% no D11, n=2) e abatidas dois dias após. Os dados foram analisados por
ANOVA em arranjo fatorial (2x2x3, no Exp. 1 e 2x2x2, no Exp. 2) com medidas
repetidas no tempo (exceto para morfometria e imunomarcação) e teste de Tukey,
com significância a 5%. No Exp. 1, animais avaliados no D4 apresentaram redução
numérica da concentração de P4, das dimensões e vascularização luteais. Já animais
avaliados a partir de D11 apresentaram redução para todos os parâmetros avaliados
ao longo dos momentos experimentais. A utilização de 50% ou 100% da dose dos
luteolíticos causaram redução semelhante nas variáveis avaliadas comparados ao
controle negativo. No Exp. 2, o número de células luteais pequenas imunomarcadas
para caspase-3 foi semelhante entre os tratamentos, sendo em maior número quando
administradas no D11. Animais tratados com 50% da dose apresentaram maior
número de células luteais grandes comparados aos tratados com 100% da dose. Para
a área das células luteais grandes, os tratamentos administrados no D11
influenciaram de maneira semelhante esta variável, enquanto que no D4 a menor área
foi detectada para animais tratados com CS100%. Animais tratados com CS e com
100% da dose dos ativos no D4 apresentaram maior área de células luteais pequenas.
Animais tratados com DT50% apresentaram menor área de células luteais pequenas.
A administração dos tratamentos em D4 e D11 causou redução na concentração de
P4. A principal diferença observada após a administração de CS e DT ocorreu no
efeito exercido pelos ativos sobre as células luteais grandes e pequenas. As
dimensões luteais, a vascularização do CL e as concentrações séricas de P4 foram
semelhantes após a administração dos ativos avaliados. A administração dos
luteolíticos em D4 foi sugestiva de luteólise parcial. Já a administração no D11 foi
eficiente em induzir luteólise completa. No presente trabalhou demonstrou-se também
a capacidade luteolítica do uso de 50% da dose de CS e DT, quando administradas
no D11.
Palavras-chave: caspase, corpo lúteo, luteólise, PGF2α, progesterona,
vascularização
 v

EVALUATION OF THE LUTEOLITIC EFFICIENCY OF DIFFERENT DOSES OF

SODIUM CLOPROSTENOL AND DINOPROST TROMETHAMINE ADMINISTERED
ON DAYS 4 AND 11 OF THE ESTROS CYCLE OF BEEF COWS

ABSTRACT – In the present study the objectives were to evaluate the luteolytic
response of half-dose (50%) or full dose (100%) of sodium cloprostenol (SC) and
dinoprost tromethamine (DT) administered in beef cattle cyclic non-lactating, at the
metaestrous and diestrous stages of the estrous cycle (4 or 11 days after ovulation
(D0), respectively), regarding: luteal dynamics, central and peripheral vascularization,
quantification of pixels in vascularized area of CL and serum progesterone levels
(Exp.1) and luteal cell morphometry, caspase-3 immunolocation and progesterone
levels (P4; Exp.2). In Exp. 1, 54 females were synchronized ovulation and received the
following treatments: SC0µg (SC0%; n=3/group), SC250µg (SC50%; n=5/D4 and
n=7/D11), SC500µg (SC100%; n=5/group), DT0mg (DT0%; n=2/group), DT12.5mg
(DT50%; n=5/D4 and n=6/D11) or DT25mg (DT100%; n=5/D4 and n=6/D11). In Exp.
2, 25 females were synchronized, assigned to treatments on D4 and D11: SC50%;
SC100%; DT50%; DT100% (n=3/group, except DT100% on D11, n=2) and
slaughtered two days later. Data were analyzed by ANOVA in factorial arrangement
(2x2x3, in Exp. 1 and 2x2x2, in Exp. 2) with repeated measures in time (except for
morphometry and immunolocation) and Tukey test, at 5% level of significance. In Exp.
1, animals evaluated in D4 showed numerical reduction of P4 levels, luteal dimensions
and vascularization. Animals evaluated at D11 showed reduction for all parameters
evaluated over the experimental moments. The use of 50% or 100% of the luteolytic
dose caused a similar reduction in the evaluated variables compared to the negative
control. In Exp. 2, the number of caspase-3 immunostained small luteal cells was
similar between treatments, and large when administered on D11. Animals treated with
50% of the dose presented larger number of large luteal cells compared to those
treated with 100% of the dose. For the area of large luteal cells, treatments
administered on D11 influenced this variable similarly, while at D4 the smallest area
was detected for animals treated with SC100%. Animals treated with SC and with
100% of the dose on D4 showed larger area of small luteal cells. Animals treated with
DT50% had smaller area of small luteal cells. Administration of treatments on D4 and
D11 caused a reduction in P4 levels. The main difference observed after administration
of SC and DT occurred in the effect exerted by the actives on the large and small luteal
cells. Luteal dimensions, CL vascularization and serum P4 levels were similar after
administration of the luteolytics agents. Administration of luteolytics on D4 was
suggestive of partial luteolysis. The administration on D11 was efficient in inducing
complete luteolysis. The study also demonstrated the luteolytic ability to use 50% of
the dose of SC and DT when administered in D11.
Keywords: caspase, corpus luteum, luteolysis, PGF2α, progesterone, vascularization
 vi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Valores de P para cada variável analisada, conforme fatores principais e

interações. ................................................................................................................. 24

Tabela 2. Valores para escore de vascularização periférica do CL, conforme interação

entre o dia do ciclo estral (D4 e D11), a dose de PGF2α utilizada e o tempo após
administração dos tratamentos. Valores na mesma linha seguidos por diferentes letras
minúsculas são significantes. Valores na mesma coluna seguidos por diferentes letras
maiúsculas são significantes. .................................................................................... 28

Tabela 3. Percentual de área vascularizada do CL, conforme interação entre o dia do

ciclo estral (D4 e D11), a dose de PGF2α utilizada e o tempo após administração dos
tratamentos. Valores na mesma linha seguidos por diferentes letras minúsculas são
significantes. Valores na mesma coluna seguidos por diferentes letras maiúsculas são
significantes............................................................................................................... 30

Tabela 4. Percentual de área vascularizada do CL, conforme interação entre o tipo de

PGF2α (CS: cloprostenol sódico, DT: Dinoprost Trometamina), a dose utilizada e o
tempo após administração dos tratamentos. Valores na mesma linha seguidos por
diferentes letras minúsculas são significantes. Valores na mesma coluna seguidos por
diferentes letras maiúsculas são significantes........................................................... 31

Tabela 5. Concentração de progesterona sérica (ng/ml) em animais avaliados a partir

do momento D11, conforme tipo (CS: Cloprostenol Sódico, DT: Dinoprost
Trometamina) e dose de PGF2α utilizada (0%, 50% ou 100%). ............................... 33

Tabela 6. Valores de P para cada variável analisada, conforme efeitos principais e

interações. ................................................................................................................. 36
 vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Delineamento experimental para avaliação do efeito luteolítico de diferentes

doses de cloprostenol sódico e dinoprost trometamina administradas nos dias 4
(metaestro) e 11 (diestro) do ciclo estral sincronizado de fêmeas bovinas de corte. 17

Figura 2. Diagrama esquemático do experimento para avaliação do efeito luteolítico

de diferentes doses de cloprostenol sódico e dinoprost trometamina administradas nos
dias 4 (metaestro) e 11 (diestro) do ciclo estral sincronizado de fêmeas bovinas de
corte. ......................................................................................................................... 20

Figura 3. Dinâmica do diâmetro (A) e da área (B) do CL, conforme interação entre a
dose de PGF2α e o tempo após administração dos tratamentos. Valores para a
mesma dose (0%, 50% e 100%) seguidos por diferentes letras minúsculas são
significantes. Valores para o mesmo momento (0 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h) seguidos
por diferentes letras maiúsculas são significantes. ................................................... 25

Figura 4. Dinâmica do diâmetro (A) e da área (B) do CL, conforme interação entre o
dia do ciclo estral e o tempo após administração dos tratamentos. Valores para o
mesmo dia (Dia 4 e Dia 11) seguidos por diferentes letras minúsculas são
significantes............................................................................................................... 26

Figura 5. Dinâmica da área do CL, conforme interação entre o tipo de PGF2α e a dose
utilizada. Valores seguidos por diferentes letras minúsculas são significantes. ........ 27

Figura 6. Dinâmica do escore de vascularização periférica do CL, conforme interação

entre o dia do ciclo estral (D4 e D11), a dose de PGF2α utilizada e o tempo após
administração dos tratamentos. ................................................................................ 28

Figura 7. Dinâmica do escore de vascularização central do CL, conforme interação

entre a dose de PGF2α utilizada e o tempo após administração dos tratamentos.
Valores para a mesma dose (0%, 50% e 100%) seguidos por diferentes letras
minúsculas são significantes. Valores para o mesmo momento (0 h, 24 h, 48 h, 72 h e
96 h) seguidos por diferentes letras maiúsculas são significantes. ........................... 29
 viii

Figura 8. Dinâmica do escore de vascularização central do CL, conforme interação

entre o dia do ciclo estral e o tempo após administração dos tratamentos. Valores para
o mesmo dia (Dia 4 e Dia 11) seguidos por diferentes letras minúsculas são
significantes............................................................................................................... 29

Figura 9. Dinâmica da área vascularizada do CL, conforme interação entre o dia do

ciclo estral (D4 e D11), a dose de PGF2α utilizada e o tempo após administração dos
tratamentos. .............................................................................................................. 30

Figura 10. Dinâmica da área vascularizada do CL, conforme interação entre o tipo de
PGF2α (CS: Cloprostenol Sódico, DT: Dinoprost Trometamina), a dose utilizada e o
tempo após administração dos tratamentos. ............................................................. 31

Figura 11. Dinâmica da concentração de progesterona sérica, conforme interação

entre a dose de PGF2α utilizada e o tempo após administração dos tratamentos.
Valores para a mesma dose (0%, 50% e 100%) seguidos por diferentes letras
minúsculas são significantes. Valores para o mesmo momento (0 h, 8 h, 24 h, e 48 h)
seguidos por diferentes letras maiúsculas são significantes. .................................... 32

Figura 12. Dinâmica da concentração de progesterona sérica observada em animais

avaliados a partir do momento D11, conforme dose de PGF2α utilizada (0%, 50% ou
100%). ....................................................................................................................... 33

Figura 13. Dinâmica da concentração de progesterona sérica em animais avaliados a

partir do momento D11, conforme tipo (CS: Cloprostenol Sódico, DT: Dinoprost
Trometamina) e dose de PGF2α utilizada (0%, 50% ou 100%). ............................... 33

Figura 14. Dinâmica da concentração de progesterona sérica, conforme interação

entre dia do ciclo estral e o tempo após administração dos tratamentos. Valores para
o mesmo dia (Dia 4 e Dia 11) seguidos por diferentes letras minúsculas são
significantes............................................................................................................... 34

Figura 15. Dinâmica da concentração de progesterona sérica observada em animais

avaliados a partir do momento D4, conforme dose de PGF2α utilizada (0%, 50% ou
100%). ....................................................................................................................... 35
 ix

Figura 16. Número de células luteais pequenas imunomarcadas por campo, conforme
interação entre o dia do ciclo estral, o tipo (CS: Cloprostenol Sódico; DT: Dinoprost
Trometamina) e a dose de PGF2α utilizados. Valores seguidos por diferentes letras
minúsculas são significantes. .................................................................................... 37

Figura 17. Número de células luteais grandes imunomarcadas por campo, conforme
fator dose de PGFα. Valores seguidos por diferentes letras minúsculas são
significantes............................................................................................................... 38

Figura 18. Área das células luteais grandes, conforme interação entre o dia do ciclo
estral, o tipo (CS: Cloprostenol Sódico; DT: Dinoprost Trometamina) e a dose de
PGF2α utilizados. Valores seguidos por diferentes letras minúsculas são significantes.
.................................................................................................................................. 39

Figura 19. Área das células luteais pequenas, conforme interação entre o dia do ciclo
estral e o tipo PGF2α utilizada (CS: Cloprostenol Sódico; DT: Dinoprost Trometamina).
Valores seguidos por diferentes letras minúsculas são significantes. ....................... 39

Figura 20. Área das células luteais pequenas, conforme interação entre o dia do ciclo
estral e a dose de PGF2α utilizada. Valores seguidos por diferentes letras minúsculas
são significantes. ....................................................................................................... 40

Figura 21. Área das células luteais pequenas, conforme interação entre o tipo de
PGF2α (CS: Cloprostenol Sódico; DT: Dinoprost Trometamina) e a dose utilizada.
Valores seguidos por diferentes letras minúsculas são significantes. ....................... 41

Figura 22. Dinâmica da concentração de progesterona sérica, conforme interação

entre dia do ciclo estral e o tempo após administração dos tratamentos. Valores para
o mesmo dia (Dia 4 e Dia 11) seguidos por diferentes letras minúsculas são
significantes............................................................................................................... 41
 1

CAPÍTULO 1 – Considerações gerais

1. INTRODUÇÃO

Atualmente, o rebanho bovino brasileiro é composto por cerca de 214,69

milhões de cabeças (ABIEC, 2019). Observa-se predominância de animais de origem
zebuína (Bos indicus) nos rebanhos nacionais. Este grupo genético possui boa
capacidade de adaptação às condições climáticas (altas temperaturas e umidade) e à
sazonalidade da disponibilidade de alimentos encontrados no Brasil tropical. Contudo,
apesar da maior adaptação dos zebuínos às condições tropicais, na grande maioria
dos rebanhos brasileiros é possível observar comprometimento nos índices
reprodutivos, ligado principalmente ao prolongamento do período de anestro pós-parto
(Baruselli et al., 2004, Baruselli et al., 2008), falhas na detecção do estro e a
puberdade tardia dos animais (Sá Filho et al., 2008).
Devido às limitações citadas acima, houve grande interesse econômico nos
últimos anos no desenvolvimento de tratamentos que tivessem por objetivo a indução
e/ou sincronização do estro e da ovulação para que fosse possível a realização da
inseminação artificial em tempo fixo (IATF; Sá Filho et al., 2008). A utilização da IATF
facilitou o manejo, pois permitiu que grande número de animais pudesse ser
inseminado em curto espaço de tempo, reduziu a mão de obra e concentrou as
atividades, principalmente na criação de gado de corte, em que a estação de monta é
uma ferramenta muito utilizada no manejo do rebanho (Cunha et al., 2013).
O entendimento da fisiologia do ciclo estral de fêmeas bovinas é de suma
importância para melhorar a eficiência de fármacos nos protocolos de sincronização
de estro. O ciclo estral bovino tem duração média de 21 dias e compreende duas fases
distintas, uma caracterizada pela alta concentração de estrógeno (fase estrogênica) e
outra pela progesterona (fase luteal). A fase luteal é caracterizada pela presença do
corpo lúteo (CL) produtor de progesterona, e compreende o período entre a ovulação
e a luteólise, com duração aproximada de 17 dias. Na ausência de um embrião viável
a prostaglandina F2α (PGF2α) é secretada naturalmente pelo endométrio e causa a
regressão funcional e estrutural do corpo lúteo (Rippe, 2009). A luteólise funcional é
 2

caracterizada pelo rápido declínio das concentrações de progesterona, enquanto a

luteólise estrutural é identificada pela diminuição de tamanho e peso do CL em
consequência da apoptose das células luteínicas (Neuvians et al., 2003).
A PGF2α e seus análogos são utilizadas na Medicina Veterinária por possuírem
ação luteolítica e, por isso, possuem papel fundamental na indução ou em protocolos
de sincronização do estro. Dentre os análogos da PGF2α utilizados na produção
animal, podemos citar o cloprostenol, o luprostiol, o tiaprost e o dinoprost. O efeito do
tratamento depende da fase do ciclo em que ele é realizado. Quando utilizados em
fases responsivas do ciclo, os análogos da PGF2α induzem rápida luteólise,
provocando redução das concentrações de progesterona, aumento do estradiol, um
pico de hormônio luteinizante e consequente ovulação (Stotzel et al., 2012).

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. Dinâmica Folicular, Ovulação e Formação do Corpo Lúteo

Milhares de folículos estão presentes em cada ovário das fêmeas bovinas, mas
na grande maioria das vezes ocorre a ovulação de apenas um a cada ciclo estral. As
observações ultrassonográficas mostraram que o desenvolvimento folicular durante o
ciclo estral das fêmeas bovinas ocorre em padrão de ondas e, a cada onda de
crescimento folicular, um folículo dominante segue em desenvolvimento, enquanto
suprime o desenvolvimento de outros folículos com tamanho superior a 4 mm
(Jainudeen e Hafez, 2004).
O processo de desenvolvimento folicular nas fêmeas bovinas divide-se em três
fases: recrutamento, divergência e dominância (Ginther et al., 1996). Em cada onda
folicular ocorre o recrutamento de um grupo de pequenos folículos, porém apenas um
deles será selecionado para dominância e continuará o crescimento enquanto os
demais entram em processo de atresia folicular (Noakes et al., 2001). O folículo
dominante que se desenvolver na presença de altos níveis de progesterona também
entrará em atresia folicular. A ovulação do folículo dominante apenas ocorrerá quando
existir um processo luteolítico efetivo, que garanta baixos níveis de progesterona na
 3

fase final do crescimento (Rippe, 2009). A ovulação marca o final da fase folicular e
início da fase luteínica. Após a ovulação forma-se o CL, a partir das células do folículo
ovulatório (revisado por Martin e Ferreira, 2009).
Durante o processo de ovulação, fluido folicular e oócito são liberados do
folículo, formando uma cavidade para o desenvolvimento do CL. Após a ovulação,
várias mudanças estruturais são observadas: ruptura da membrana basal, invasão da
cavidade folicular pelas células da teca interna e da granulosa, que sofrem hipertrofia
e hiperplasia, proliferação de novos vasos sanguíneos, além de aumento do fluxo
sanguíneo ao longo do desenvolvimento luteínico (Damber et al., 1987).
O CL participa de grande parte dos processos reprodutivos. Ele é um órgão
endócrino transitório, cuja principal função é a produção de progesterona, esteroide
que prepara o endométrio para implantação e manutenção da gestação inicial
(Sakamoto et al., 1995).
O CL bovino se desenvolve rapidamente no período entre 2 a 3 dias após a
ovulação (revisado por Miyamoto et al., 2009). O CL maduro é formado por uma gama
de células heterogêneas. As principais células com função secretora são as luteínicas
esteroidogênicas grandes e pequenas (O’shea et al., 1986; 1989). Células luteínicas
pequenas são originadas a partir da transformação de células da teca, enquanto que
células luteínicas grandes são formadas a partir da transformação de células da
granulosa. Porém, durante o desenvolvimento do CL, células luteínicas pequenas
podem se transformar em células luteínicas grandes (Hansel e Dowd, 1986).
Além das células esteroidogênicas, o CL é formado por células endoteliais,
fibroblastos, células de músculo liso e células do sistema imune (O’shea et al., 1986;
1989). O CL possui uma vasta rede de vascularização composta por vasos
sanguíneos e microcapilares. Células endoteliais vasculares chegam a atingir até 50%
do número total células luteais. O CL bovino também produz muitos fatores
angiogênicos incluindo o fator de crescimento endotelial vascular, fator de crescimento
fibroblástico e angiopoietina-1 e 2. Além dos fatores angiogênicos, o CL bovino produz
sustâncias vasoativas como a endotelina-1, angiotensina II, óxido nítrico e PGF2α. Os
fatores angiogênicos e os vasoativos estão intimamente ligados à regulação do fluxo
sanguíneo do CL e à produção de progesterona (revisado por Miyamoto et al., 2009).
 4

2.2. Luteólise

Em casos em que não ocorre a concepção, a regressão do CL é essencial para

permitir o início de um novo ciclo reprodutivo (Knickerbocker et al., 1988; Niswender
et al., 1994). Nesses casos o CL é funcional por período de 17 a 18 dias e, após este
período, ele regride dentro de pouco tempo para permitir a próxima ovulação (revisado
por Miyamoto et al., 2009). Dois processos estão envolvidos na regressão luteínica: a
diminuição da secreção de progesterona seguida pela diminuição do tecido luteínico.
As alterações morfológicas associadas a luteólise espontânea ou induzida são
semelhantes. Acúmulos de grânulos lipídicos no citoplasma de células luteínicas,
degeneração dos capilares e aumento do número de vesículas lisossomais são
observadas no processo luteolítico. Com o avançar do processo de regressão
luteínica, existe eventual diminuição do número de células luteínicas esteroidogênicas
(Knickerbocker et al., 1988; Niswender et al., 1994).
Diversos estudos tem confirmado que a PGF2α produzida no tecido
endometrial é o principal agente responsável por desencadear o processo luteolítico.
Em 1923, Loeb foi o primeiro a demonstrar a função do útero sobre o controle da
regressão do CL, evidenciando que a histerectomia em cobaias causava a
persistência do corpo lúteo. Esse efeito também foi observado em bovinos, ovinos,
caprinos, suínos e equinos. Em bovinos demonstrou-se que a histerectomia unilateral
causava a persistência do corpo lúteo ipsilateral ao corno uterino removido, enquanto
que a remoção do corno uterino contra lateral ao ovário que continha o CL não
influenciou o processo de regressão luteínica (Knickerbocker et al., 1988).
Posteriormente, estudos baseados na histerectomia parcial e anastomose vascular
sugeriram que, em diversas espécies, a PGF2α exerce efeito local entre cada corno
uterino e o seu ovário ipsilateral (revisado por Silva et al., 2010).
O estradiol produzido pelo folículo pré-ovulatório desencadeia a liberação de
ocitocina pela hipófise, que por sua vez estimula a liberação de pequenas quantidades
de PGF2α pelo útero. A PGF2α, por meio de mecanismo de feedback positivo,
estimula a liberação adicional de ocitocina pelo tecido luteínico e PGF2α tanto pelo
tecido luteínico quanto pelo útero (Niswender et al., 2000). A PGF2α produzida pelo
 5

endométrio, que é liberada em forma de pulsos (revisado por Bertan et al., 2006,
McCraken et al., 1999), atinge a circulação venosa uterina e, por meio de mecanismo
contracorrente, envolvendo transporte ativo, chega ao sistema arterial ovariano,
produzindo vasoconstrição e, consequentemente, desencadeando a luteólise
(Cunningham, 2004).
Após alcançar a circulação sanguínea do CL, a PGF2α se liga a receptores
específicos presentes na membrana de células luteais grandes, desencadeando o
aumento das concentrações de proteína quinase C e de Ca 2+ intracelular (Niswender
et al., 2000). O aumento de Ca2+ está relacionado com o desencadeamento da
apoptose e da morte celular, necessários para a ocorrência de luteólise estrutural. Já
o aumento da proteína quinase C tem papel fundamental na diminuição da secreção
de progesterona (luteólise funcional; revisado por Trevisol et al., 2013).
A PGF2α causa degeneração das células endoteliais luteínicas, resultando em
redução da densidade capilar, reduzindo assim o fluxo sanguíneo do parênquima
luteal (Niswender et al., 2000). A vasoconstrição leva à diminuição do fluxo sanguíneo
ovariano e a síntese de progesterona declina progressivamente até alcançar valores
menores que 1 ng/mL (Niswender et al., 2000, revisado por Trevisol et al., 2013).
O processo de degeneração dos capilares sanguíneos, observado logo no
início do processo luteolítico, é marcado pela protusão das células endoteliais em
direção ao lúmen, contorno irregular da lâmina basal e sobreposição de células
endoteliais, fragmentação das células endoteliais, condensação nuclear, aumento de
inclusões apoptóticas, vacuolização do citoplasma e completa desintegração dos
capilares (Knickerbocker et al., 1988).

2.3. Apoptose

Apoptose é o processo de morte celular que causa alterações morfológicas

como diminuição do tamanho celular, condensação nuclear, fragmentação do DNA e
alterações da membrana. Quando células sofrem apoptose, geralmente são
fagocitadas por células vizinhas ou por fagócitos especializados, como macrófagos,
células dendríticas ou neutrófilos (Carou et al., 2015).
 6

Betts et al. (1984) avaliaram as alterações morfométricas do CL de fêmeas

bovinas de corte induzidas pela administração de cloprostenol sódico (500 µg). Os
autores observaram diminuição do número de células em mitose, aumento do número
de células picnóticas e em cariorrexe após a administração do tratamento. Essas
alterações estão intimamente relacionadas com o processo de apoptose das células
luteínicas.
A apoptose de células luteínicas e vasculares é o principal evento que causa a
regressão do CL. O processo de apoptose possui duas principais vias de sinalização:
mediada por receptores ou via extrínseca e a mitocondrial ou via intrínseca. Na via
extrínseca, o sinal ocorre após a ativação dos “receptores de morte” Fas e TNF, que
promovem a ativação de caspase-8. A via apoptótica intrínseca é ativada por estímulo
de estresse que altera a permeabilidade mitocondrial, levando a liberação de
citocromo C, que se liga ao fator apoptótico-1 ativador de proteases e procaspase-9,
formando um complexo conhecido como apoptossoma, levando à ativação de
caspase-9. As vias extrínseca e intrínseca levam a ativação dos efetores finais da
cascata de caspases, caspases-3, 6 e 7. Essas caspases clivam uma variedade de
polipeptídeos intracelulares, incluindo importantes elementos estruturais do
citoplasma, como actina, componentes do sistema de reparo do DNA (poli (ADP-
ribose) polimerase), uma série de proteínas kinases e o inibidor da caspase-ativada
DNAse (ICAD; Stocco et al., 2007).
Em um estudo, que avaliou o papel da administração de PGF2α para induzir
luteólise em ratas pseudogestantes e os mecanismos de ativação das vias intrínsecas
e extrínsecas de apoptose, foi observado que houve aumento da atividade das
caspases-9, 8 e 3. Quando um inibidor da caspase-8 foi usado antes da administração
de PGF2α, a ativação de caspase-3 induzida pelo uso de PGF2α foi completamente
bloqueada, entretanto, houve inibição parcial quando um inibidor da caspase-9 foi
utilizado. Isso sugere a grande importância da via de apoptose extrínseca no processo
de luteólise induzido pela PGF2α (Yadav et al., 2005).
Carambula et al. (2002) avaliaram a participação da enzima caspase-3 no
processo de apoptose de células cultivadas in vitro do CL de camundongos. Os efeitos
foram avaliados em CLs oriundos de camundongos convencionais e caspase-3
deficientes. Os pesquisadores demonstraram que células luteais oriundas de animais
 7

convencionais foram positivas para atividade de caspase-3 e apresentaram todas as

características ligadas ao processo de apoptose, enquanto que para as células
luteínicas provenientes de animais caspase-3 deficientes a expressão dessas
características foi observada em menor frequência ou não foram observadas.
A participação da cascata de caspases na luteólise em bovinos foi demonstrada
tanto na regressão natural do CL (Park et al., 2013), quanto no processo induzido pela
ação de agentes luteolíticos (Korzekwa et al., 2014). Park et al. (2013), avaliando o
perfil de expressão proteica nas diferentes fases do CL, detectaram a presença de
caspase-3 clivada somente na fase de regressão luteal. Korzekwa et al. (2014),
avaliando o efeito da PGF2α e seus análogos na função secretora de células luteais
bovinas, demonstraram aumento da atividade de caspase-3 em cultura de células
luteais bovinas expostas aos tratamentos luteolíticos propostos.
Nishimura et al. (2008) avaliando a resposta de células luteais bovinas
incubadas em alta e baixa tensão de oxigênio (20% e 3% de oxigênio,
respectivamente), demonstraram que sob a baixa tensão de oxigênio, células luteais
expressaram maiores quantidades de RNAm e exibiram maior atividade da enzima
caspase-3 quando comparadas às mantidas sob alta tensão de oxigênio. Esses
resultados demonstram a participação da enzima caspase-3 no processo de apoptose
do CL.

2.4. Ultrassonografia Doppler

O diagnóstico ultrassonográfico representou um grande avanço tecnológico na

avaliação reprodutiva de grandes animais. As descobertas relacionadas à dinâmica
ovariana, função uterina e viabilidade fetal estão fortemente atreladas ao uso da
ultrassonografia, que vem sendo amplamente utilizada na pesquisa científica e na
rotina das atividades pecuárias. Dentre as opções de uso disponíveis, destaca-se a
ultrassonografia convencional no modo B (escala de cinza), que é a forma mais usada,
e que proporciona imagem bidimensional das estruturas avaliadas (Pugliesi et al.,
2017).
 8

Nos últimos anos a ultrassonografia Doppler ganhou espaço em pesquisas para

avaliação do sistema reprodutivo da fêmea bovina. Essa técnica possibilita a avaliação
funcional de órgãos e tecidos por meio da detecção de áreas com perfusão sanguínea.
Destaca-se, entre as possibilidades de uso da ultrassonografia no modo Doppler, a
avaliação da funcionalidade do CL (Pugliesi et al., 2017).
Na ultrassonografia Doppler dos vasos sanguíneos, o objeto estático é o
transdutor e as estruturas refletoras em movimento, que geram os ecos retornados ao
transdutor, são hemácias. Convencionalmente, no modo Color-Flow Doppler os
aparelhos são programados para codificar o movimento que se aproxima e se afasta
do transdutor nas cores vermelha e azul, respectivamente. No entanto, as cores
vermelha e azul não indicam fluxo arterial ou venoso. Em muitos aparelhos, as cores
podem ser invertidas ou alteradas de acordo com a preferência do operador. O modo
Power-Flow Doppler é uma inovação da exibição das imagens geradas pelo modo
Color-Flow. O modo Power Doppler aumenta a sensibilidade de 3 a 5 vezes para
exibição do fluxo sanguíneo no interior de tecidos macios quando comparado ao modo
Color Doppler convencional. A maior sensibilidade permite a avaliação de vasos com
menor diâmetro ou fluxo lento que não aparecem no modo Color Doppler por terem
velocidade incompatível (Ginther e Utt, 2004).
Pugliesi et al. (2014), avaliando métodos de diagnóstico precoce da gestação
em vacas de corte, observaram que independentemente do tamanho do corpo lúteo,
o fluxo sanguíneo luteínico é positivamente associado com a secreção de
progesterona e é facilmente estimado por meio da proporção de sinais coloridos
observados em imagens do CL obtidas por meio da utilização da ultrassonografia
Doppler. A técnica de diagnóstico precoce da gestação utilizando a ultrassonografia
Doppler é baseada na detecção da luteólise funcional (diminuição do fluxo sanguíneo
luteínico) e estrutural (diminuição da área luteínica). Baseado nesses resultados, os
autores afirmam que a estimativa da vascularização e tamanho luteínico por
ultrassonografia Doppler é um indicador de gestação altamente eficiente 20 dias após
a IA.
Kaya et al. (2017) demonstraram, por meio da utilização de ultrassonografia
Doppler e quantificação das concentrações de progesterona, a correlação positiva
entre o fluxo sanguíneo luteínico e a secreção de progesterona em vacas leiteiras. No
 9

mesmo estudo, os autores não observaram correlação significativa entre o fluxo

sanguíneo luteínico e o tamanho do corpo lúteo ou entre o tamanho do corpo lúteo e
a secreção de progesterona.

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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 13

CAPÍTULO 2 - AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA LUTEOLÍTICA DE DIFERENTES

DOSES DE CLOPROSTENOL SÓDICO E DINOPROST
TROMETAMINA ADMINISTRADAS NOS DIAS 4 E 11 DO CICLO
ESTRAL DE FÊMEAS BOVINAS DE CORTE

Gabriel Artur Marciano do Nascimentoab,*, Ana Clara Degan Mattosa, Vanessa Garcia
Rizzi Mussib, Rafael Rodrigues Corrêac, Cláudia Cristina Paro de Pazd, Rosemeri de
Oliveira Vasconcelose, Paulo Henrique Leal Bertoloe, Guilherme de Paula Nogueiraf,
Lindsay Unno Gimenesa

aDepartamento de Reprodução Animal, FCAV, UNESP, Jaboticabal, Brasil

bOurofino Saúde Animal, Cravinhos, Brasil
cMédico Veterinário Autônomo, Jaboticabal, Brasil
dInstituto de Zootecnia, Centro APTA de Bovinos de Corte, Sertãozinho, Brasil
eDepartamento de Patologia Veterinária, FCAV, UNESP, Jaboticabal, Brasil
fDepartamento de Produção e Saúde Animal, FMVA, UNESP, Araçatuba, Brasil

*Autor para Correspondência

e-mail: [email protected]; [email protected]

RESUMO
No presente estudo os objetivos foram avaliar a resposta luteolítica de meia dose
(50%) ou dose inteira (100%) de cloprostenol sódico (CS) e dinoprost trometamina
(DT) administrados em fêmeas bovinas de corte não lactantes cíclicas, nas fases de
metaestro e diestro do ciclo estral (4 ou 11 dias após a ovulação (D0),
respectivamente), quanto a: dinâmica luteínica, vascularização central e periférica,
quantificação de pixels na área vascularizada do CL e dosagem de progesterona
sérica (Exp.1) e morfometria das células luteínicas, imunomarcação de caspase-3 e
dosagem de progesterona (P4; Exp.2). No Exp. 1, 54 fêmeas tiveram a ovulação
sincronizada e receberam os seguintes tratamentos: CS 0 µg (CS0%; n=3/ grupo), CS
250 µg (CS50%; n=5/D4 e n=7/D11), CS 500 µg (CS100%; n=5/ grupo), DT 0 mg
(DT0%; n=2/ grupo), DT 12,5 mg (DT50%; n=5/D4 e n=6/D11) ou DT 25 mg (DT100%;
n=5/D4 e n=6/D11). No Exp. 2, 25 fêmeas foram sincronizadas, alocadas nos
tratamentos no D4 e D11: CS50%; CS100%; DT50%; DT100% (n=3/ grupo, exceto
DT100% no D11, n=2) e abatidas dois dias após. Os dados foram analisados por
ANOVA em arranjo fatorial (2x2x3, no Exp. 1 e 2x2x2, no Exp. 2) com medidas
repetidas no tempo (exceto para morfometria e imunomarcação) e teste de Tukey,
com significância a 5%. No Exp. 1, animais avaliados no D4 apresentaram redução
numérica da concentração de P4, das dimensões e vascularização luteais. Já animais
avaliados a partir de D11 apresentaram redução para todos os parâmetros avaliados
ao longo dos momentos experimentais. A utilização de 50% ou 100% da dose dos
luteolíticos causaram redução semelhante nas variáveis avaliadas comparados ao

Artigo elaborado segundo as normas da revista Theriogenology.

 14

controle negativo. No Exp. 2, o número de células luteais pequenas imunomarcadas

para caspase-3 foi semelhante entre os tratamentos, sendo em maior número quando
administradas no D11. Animais tratados com 50% da dose apresentaram maior
número de células luteais grandes comparados aos tratados com 100% da dose. Para
a área das células luteais grandes, os tratamentos administrados no D11
influenciaram de maneira semelhante esta variável, enquanto que no D4 a menor área
foi detectada para animais tratados com CS100%. Animais tratados com CS e com
100% da dose dos ativos no D4 apresentaram maior área de células luteais pequenas.
Animais tratados com DT50% apresentaram menor área de células luteais pequenas.
A administração dos tratamentos em D4 e D11 causou redução na concentração de
P4. A principal diferença observada após a administração de CS e DT ocorreu no
efeito exercido pelos ativos sobre as células luteais grandes e pequenas. As
dimensões luteais, a vascularização do CL e as concentrações séricas de P4 foram
semelhantes após a administração dos ativos avaliados. A administração dos
luteolíticos em D4 foi sugestiva de luteólise parcial. Já a administração no D11 foi
eficiente em induzir luteólise completa. No presente trabalhou demonstrou-se também
a capacidade luteolítica do uso de 50% da dose de CS e DT, quando administradas
no D11.

Palavras-chaves: caspase, corpo lúteo, luteólise, PGF2α, progesterona,

vascularização.

1. INTRODUÇÃO
Dentre os fármacos empregados em protocolos de IATF, pode-se destacar o
uso da Prostaglandina F2α (PGF2α) e seus análogos [1], cuja função é causar a
regressão do corpo lúteo (CL) [2], e consequente redução das concentrações
plasmáticas de progesterona (P4) [3].
Dentre os análogos da PGF2α, pode-se destacar o cloprostenol sódico e o
dinoprost trometamina. Diversos autores observaram efeitos semelhantes destes
princípios ativos na indução de estro [4], taxa de concepção [5] e serviços por
concepção [6]. No entanto, há trabalhos demonstrando diferença no efeito dos ativos,
como maior eficiência do dinoprost em induzir regressão luteal [7] e maior taxa de
prenhez após uso do cloprostenol na sincronização do estro [8].
O momento da administração da PGF2α é fundamental para regressão do CL.
A administração deste tratamento no diestro é capaz de induzir luteólise completa [9-
11]. No entanto, se o tratamento for realizado no metaestro (até 5 dias após a
ovulação), se observa luteólise parcial, caracterizada por reduções transitórias nas
dimensões luteais [11, 12] e na concentração sérica de progesterona [11-14].
Outro importante fator relacionado com a eficiência do tratamento luteolítico é
a dose de PGF2α administrada. Demonstrou-se que doses reduzidas de PGF2α (50%
da dose recomendada para bovinos) em fases responsivas do CL podem ser
eficientes em induzir luteólise completa [13]. No entanto, doses inferiores a 25% da
 15

recomendada, não são eficazes em provocar o mesmo efeito, promovendo luteólise

parcial [12-14].
Os objetivos no presente estudo foram avaliar a resposta de 50% ou 100% da
dose de cloprostenol sódico e dinoprost trometamina administradas em fêmeas
bovinas de corte na fase de metaestro ou diestro do ciclo estral (4 ou 11 dias após a
ovulação, respectivamente) sobre a dinâmica luteal, as características de
vascularização e quantificação de pixels no CL, as concentrações de progesterona,
bem como a morfometria e imunomarcação de caspase-3 no CL.

2. MATERIAL E MÉTODOS
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética no Uso de
Animais da Universidade Estadual Paulista “Júlio Mesquita Filho” – UNESP
Jaboticabal (protocolo no 006001/18).

2.1. EXPERIMENTO 1

2.1.1. Animais
Foram utilizadas 54 fêmeas bovinas, sendo 34 Nelore (nulíparas = 17;
multíparas = 17) e 20 mestiças (nulíparas = 13; multíparas = 7), com idade média de
35,0 ± 2,1 meses e peso médio de 392,3 ± 8,2 Kg. Foram selecionadas apenas fêmeas
cíclicas (confirmadas por duas avaliações ultrassonográficas com intervalo de 10 dias,
previamente ao início do experimento), não lactantes, com escore de condição
corporal (ECC) ≥2,75 (em escala de 1 a 5) [15], provenientes da fazenda João Martins,
Guatapará – SP (21o29’48”S-48º02’16”W).
Os animais foram mantidos em piquetes com pastagem de Brachiara brizantha
com livre acesso à água e à suplementação mineral. O experimento foi conduzido
entre os meses de junho e outubro de 2018.

2.1.2. Delineamento Experimental

No presente estudo o delineamento foi inteiramente casualizado, com arranjo
fatorial de tratamentos: 2 (momentos do ciclo estral: D4 e D11) x 2 (análogos de
PGF2: dinoprost trometamina e cloprostenol sódico) x 3 (doses de PGF2: 0, 50% e
100% da dose recomendada em bula).
O estudo foi realizado em duas repetições, com intervalo de 77 dias.
Previamente ao início dos tratamentos com os agentes luteolíticos, foi realizada a
sincronização da ovulação com protocolo à base de estrógeno e progesterona (sem o
uso de eCG), para obtenção de dois lotes simultâneos de animais, referentes ao 4º e
11º dia do ciclo estral (Figura 1).
Para obter homogeneidade no momento da ovulação, foi realizado
acompanhamento ultrassonográfico a cada 12 h a partir de 60 h da retirada do
dispositivo intravaginal de progesterona e somente os animais ovulados entre 72 e 84
h foram alocados nos grupos experimentais. O dia da ovulação foi considerado como
 16

D0. Quatro (D4) ou onze (D11) dias após a ovulação os animais foram randomizados
de acordo com o ECC (média 3,11 ± 0,04), raça e diâmetro do CL (média 1,62 ± 0,04
cm), para receber os seguintes tratamentos (Figura 1): no D4 (CS 0%, n=3; CS 50%
n=5; CS 100%, n=5; DT 0%, n=2; DT 50%, n=5; DT 100%, n=5) e no D11 (CS 0%,
n=3; CS 50% n=7; CS 100%, n=5; DT 0%, n=2; DT 50%, n=6; DT 100%, n=6).

2.1.3. Avaliações Ultrassonográficas

As avaliações ultrassonográficas foram realizadas para detecção do momento
da ovulação, conforme descrito no item 2.1.2, utilizando o modo B do aparelho, e para
avaliação da dinâmica luteínica imediatamente antes do tratamento com PGF2 (0 h),
24, 48, 72 e 96 h após o mesmo (Figura 1), utilizando o modo B e a função Color
Doppler.
Todas as avaliações foram realizadas pelo mesmo operador, utilizando
aparelho de ultrassom portátil (Z5 VET com transdutor linear 5MHz, Mindray Medical
International, China). O diâmetro do CL foi determinado usando a função distância do
modo B, utilizando a fórmula: diâmetro = (comprimento máximo + altura máxima)/2. A
área do CL foi calculada utilizando a função traço do modo B.
Para avaliações utilizando a função Doppler, o transdutor do aparelho foi
configurado com frequência de 5,0 MHz, configurações constantes de ganho de cor
(70), filtro de parede (309) e velocidade de detecção do fluxo sanguíneo (5 cm/seg).
Para avaliação da vascularização do CL foram consideradas duas variáveis:
vascularização periférica e vascularização central. Os escores de vascularização
foram estimados no momento das avaliações, seguindo a seguinte classificação,
adaptada dos critérios descritos por Pugliese et al. (2017) [16]: vascularização
periférica - escore 0: ausência de sinais coloridos na borda do CL, escore 1:
preenchimento de até 25% da borda do CL com sinais coloridos; escore 2:
preenchimento de 26 a 50% da borda do CL com sinais coloridos; escore 3:
preenchimento de 51 a 75% da borda do CL com sinais coloridos; escore 4:
preenchimento de 76 a 100% da borda do CL com sinais coloridos; vascularização
central - escore 0: ausência de sinais coloridos na região central do CL, escore 1:
presença de sinais coloridos em baixa quantidade e de tamanho reduzido na região
central do CL; escore 2: presença de poucos sinais coloridos, mas de tamanho
moderado na região central do CL; escore 3: presença de quantidade moderada de
sinais coloridos médios e grandes na região central do CL; escore 4: presença de
grande quantidade de sinais coloridos médios e grandes em toda a região central do
CL (Anexo I).
 17

Figura 1. Delineamento experimental para avaliação do efeito luteolítico de diferentes doses de cloprostenol sódico e dinoprost
trometamina administradas nos dias 4 (metaestro) e 11 (diestro) do ciclo estral sincronizado de fêmeas bovinas de corte.
 18

2.1.4. Colheita das amostras de sangue e determinação das concentrações de

progesterona
Amostras de sangue (10 mL) foram colhidas por punção da veia jugular
utilizando tubos à vácuo sem anticoagulante (Vaccutainer®, BD, Franklin Lakes, NJ,
USA). As amostras foram colhidas antes do tratamento com PGF2  (0 h), 8, 24 e 48
h após o mesmo, centrifugadas a 2086 x g durante 15 minutos, acondicionadas, em
duplicata, em microtubos de 2,0 mL (Eppendorf®) e imediatamente armazenadas em
freezer a -20ºC, até o momento das análises, realizadas no Laboratório de
Endocrinologia Animal da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade
Estadual Paulista – Campus de Araçatuba. As concentrações séricas de progesterona
foram determinadas usando kit comercial para técnica de radioimunoensaio (ICN
Pharmaceuticals, Inc., Costa Mesa, CA, USA). O limite de quantificação e detecção
foi de 0,290 e 0,068 ng/mL, respectivamente. O coeficiente de variação intra e inter-
ensaio foi de 7,17% e 11,74%, respectivamente.

2.1.5. Análises computadorizadas do CL

Durante as avaliações ultrassonográficas, foram gravados vídeos individuais
de cada CL, com 5 segundos de duração, utilizando a função cineloop. Os vídeos
registrados capturaram tanto imagens modo B como da função Doppler,
compreendendo cortes que exibiam o maior diâmetro e máxima vascularização do CL.
Todas as imagens foram analisadas no programa de computador Image J 1.50e
(National Institutes of Health), com o qual foi obtido o número total de pixels e número
de pixels da área vascularizada do CL. Com a obtenção desses dois valores foi
possível calcular o percentual de área vascularizada do CL, pela seguinte fórmula:
% de área vascularizada = (no de pixels coloridos/no total de pixels) x 100.

2.2. EXPERIMENTO 2

2.2.1. Animais
Foram utilizadas 23 fêmeas bovinas, sendo 15 Nelore (nulíparas = 5; multíparas
= 10) e 8 mestiças (nulíparas = 6; multíparas = 2), com idade média de 54,0 ± 3,0
meses e peso médio de 492,2 ± 17,2 Kg. Foram selecionadas apenas fêmeas cíclicas
(confirmadas por duas avaliações ultrassonográficas com intervalo de 10 dias,
previamente ao início do experimento), não lactantes, com escore de condição
corporal (ECC) ≥2,75 (em escala de 1 a 5) [15], provenientes da fazenda João Martins,
Guatapará – SP (21o29’48”S-48º02’16”W).
Os animais foram mantidos em piquetes com pastagem de Brachiara brizantha
com livre acesso à água e à suplementação mineral. O experimento foi conduzido
entre os meses de março e maio de 2018.
 19

2.2.2. Tratamentos
Os critérios de seleção e sincronização da ovulação para a distribuição dos
tratamentos foi a mesma descrita no item 2.1.2. do Experimento 1 (Figura 2). O dia da
ovulação foi considerado como D0. Quatro (D4) ou onze (D11) dias após a ovulação
os animais foram randomizados de acordo com o ECC (média 3,66 ± 0,02), raça e
diâmetro do CL (média 1,44 ± 0,07 cm), e distribuídos nos seguintes tratamentos: no
D4 (CS 50%, n=3; CS 100%, n=3; DT 50%, n=3; DT 100%, n=3) e no D11 (CS 50%,
n=3; CS 100%, n=3; DT 50%, n=3; DT 100%, n=2). As fêmeas foram abatidas dois
dias após a realização dos tratamentos.

2.2.3. Avaliações Ultrassonográficas

As avaliações ultrassonográficas foram realizadas para detecção do momento
da ovulação e para randomização dos grupos experimentais imediatamente antes do
tratamento com PGF2 (0 h; Figura 2), conforme descrito no item 2.1.3, utilizando o
modo B do aparelho.
 20

Figura 2. Diagrama esquemático do experimento para avaliação do efeito luteolítico de diferentes doses de cloprostenol sódico e
dinoprost trometamina administradas nos dias 4 (metaestro) e 11 (diestro) do ciclo estral sincronizado de fêmeas bovinas
de corte.
 21

2.2.4. Colheita das amostras de sangue e determinação das concentrações de

progesterona
Os procedimentos de colheita, processamento e estocagem das amostras, bem
como a determinação das concentrações de progesterona foram realizadas conforme
descrito no item 2.1.4. As amostras foram colhidas antes do tratamento com PGF2
(0 h) e 24 h após o mesmo. O limite de quantificação e detecção foi de 0,290 e 0,068
ng/mL, respectivamente. O coeficiente de variação intra e inter-ensaio foi de 7,17% e
11,74%, respectivamente.

2.2.5. Colheita dos ovários, preparação dos corpos lúteos e confecção das
lâminas de imunohistoquímica
Após o abate dos animais, o ovário contendo o CL foi removido e acondicionado
em frasco coletor universal contendo solução fixadora de formol tamponado a 10%
(PAF), com pH 7,0.
O processamento do material foi realizado no Laboratório de Histopatologia do
Departamento de Patologia Veterinária da Universidade Estadual Paulista – Campus
de Jaboticabal. O corpo lúteo foi isolado e fracionado, e os fragmentos obtidos foram
armazenados em PAF por até 72 h e após, foram lavados com solução de PBS pH
7,5. Posteriormente, os tecidos foram desidratados em uma sequência de soluções
alcoólicas em concentrações graduais e crescentes (70%, 90%, Absoluto e Xilol) e
foram “emblocados” em parafina. Os blocos foram submetidos a cortes contínuos com
espessura de 5 μm com auxílio de micrótomo (SLEE, cut 6062) em lâminas
silanizadas.
A metodologia para confecção das lâminas para imunohistoquímica foi
adaptada de Bertolo et al. (2019) [17]. As lâminas foram reidratadas em soluções
alcoólicas com concentrações decrescentes (Xilol, Absoluto, 90% e 70%) e, em
seguida, os tecidos foram desparafinizados em estufa a 60ºC por uma hora e,
posteriormente, hidratados novamente em soluções alcoólicas com concentrações
decrescentes, conforme citado acima, até a lavagem em água destilada.
Foi realizada análise imunohistoquímica para apoptose com anticorpo primário
anti-caspase 3 (Abcam, Cód. ab4051). A recuperação antigênica foi pelo calor em
panela de vapor (Philips Walita), com solução de citrato pH 6,0, durante 40 minutos.
Em seguida, as lâminas foram mantidas durante 20 minutos em temperatura
ambiente. Posteriormente a esse período, foi feito bloqueio da peroxidase endógena
com solução de metanol (Synth) e peróxido de hidrogênio (30 volumes, Synth) a 8%,
por uma hora, em temperatura ambiente e em local protegido da luz. Para realização
do bloqueio de proteínas inespecíficas foi utilizado produto comercial (Protein Block,
DakoCytomation, Cód. X0909), durante uma hora, em câmara úmida a temperatura
ambiente. Adicionalmente foi feito o bloqueio com leite em pó desnatado a 8% (Molico,
Nestlé), durante uma hora, em câmara úmida escura a temperatura ambiente. A
 22

incubação do anticorpo primário foi realizada na diluição de 1:200 por 18 h a 4º C.

Após isso, os tecidos foram incubados com o complexo de polímeros ligados à
peroxidase (kit Advance HRP, DakoCytomation, Cód. K4068). Entre cada um dos
passos descritos foram realizados banhos em água destilada e em solução tampão
Tris HCl, pH 7,4. Para a visualização da reação foi utilizado o cromógeno DAB (3,3-
diaminobenzidina – DakoCytomation, Cód. K3468-1). Os tecidos foram contra-
corados com Hematoxilina de Harris e o meio de montagem utilizado foi o Entellan
(Merck). Como controle positivo da reação foi utilizado linfonodo de cão, material já
existente no Departamento de Patologia Animal da Unesp – Campus de Jaboticabal.
O controle negativo foi feito com diluente de anticorpo (DakoCytomation, Cód. S3022),
em substituição ao anticorpo primário.

2.2.6. Avaliação da atividade da caspase por imunohistoquímica

(imunomarcação)
Foi confeccionada uma lâmina de imunohistoquímica de cada ovário e cinco
campos de cada lâmina foram analisados. A quantificação da imunorreação foi
realizada por meio da contagem de células luteais grandes e pequenas
imunomarcadas para caspase-3 por campo (Anexo II). As lâminas foram analisadas
com auxílio de microscópio óptico (IX70, Olympus Corporation, Japão), utilizando
aumento de 40x. O número de células imunomarcadas de cada tipo celular foi utilizado
para a análise estatística.

2.2.7. Avaliação morfométrica das células luteais

A avaliação morfométrica das células luteais foi realizada a partir das lâminas
de imunohistoquímica, utilizando o software Image Pro Plus (Media Cybernetics). Foi
analisada a área (μm2) de 100 células luteais grandes e 100 células luteais pequenas
em cada lâmina [18]. A área de cada tipo celular foi utilizada nas análises estatísticas.

2.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA

O Experimento 1 seguiu delineamento inteiramente ao acaso com arranjo
fatorial 2 (fases do ciclo estral) x 2 (tipos de PGF2) x 3 (doses), com medidas
repetidas no tempo. Foram incluídos no modelo os efeitos fixos de fase do ciclo estral,
tipo e dose de PGF2α, tempo após a administração do tratamento, bem como
interações.
O Experimento 2 seguiu delineamento inteiramente ao acaso com arranjo
fatorial 2 (fases do ciclo estral) x 2 (tipos de PGF2) x 2 (doses), com medidas
repetidas no tempo apenas para a variável progesterona. Foram considerados no
modelo os efeitos principais de fase do ciclo estral, tipos de PGF e dose, bem como
as interações entre estes fatores. No caso da concentração de progesterona, foi
incluído como efeito principal também o tempo.
 23

Como efeitos aleatórios foram incluídos a raça, a categoria, as repetições, o

animal e o ECC para os dois experimentos.
Os dados de ambos experimentos estão representados pela média ajustada
por LS Means ± erro padrão da média. Foi utilizado ANOVA seguido de teste de Tukey
(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) com significância a 5%.

3. RESULTADOS

3.1. EXPERIMENTO 1
Os valores de P relacionados às variáveis analisadas, conforme efeitos
principais e interações estão demonstradas na Tabela 1.
 24

Tabela 1. Valores de P para cada variável analisada, conforme fatores principais e interações.

Dia*
Dia* Dia* Dia* PGF2α*
Dia* Dia* PGF2α* Dia* PGF2α* Dose* PGF2α*
Variável Dia PGF2α Dose Tempo Dose* PGF2α* Dose* Dose*
PGF2α Dose Dose Tempo Tempo Tempo Dose*
PGF2α Tempo Tempo Tempo
Tempo
Diâmetro (cm) 0,585 0,824 <0,001 <0,001 0,827 0,338 0,177 <0,001 0,898 <0,001 0,652 0,621 0,504 0,744 0,947
Área (cm2) 0,556 0,431 <0,001 <0,001 0,998 0,219 0,035 <0,001 0,971 <0,001 0,522 0,750 0,835 0,822 0,966
VP 0,002 0,526 <0,001 <0,001 0,341 0,322 0,903 <0,001 0,522 <0,001 0,770 0,999 0,002 0,999 0,391
VC 0,535 0,291 <0,001 <0,001 0,145 0,382 0,535 <0,001 0,805 <0,001 0,805 0,591 0,330 0,305 0,702
AV (%) 0,046 0,660 <0,001 <0,001 0,319 0,328 0,973 <0,001 0,380 <0,001 0,774 0,652 <0,001 0,021 0,072
Progesterona
<0,001 0,050 <0,001 <0,001 0,676 0,124 0,137 <0,001 0,820 <0,001 0,685 0,498 0,068 0,646 0,434
(ng/ml)
Dia: dia do ciclo estral; PGF2: tipo de PGF2; Dose: dose de PGF2; Tempo: tempo após administração do tratamento; VP: vascularização
periférica; VC: vascularização central; AV: área vascularizada. Valores de p<0,05 são significativos.
 25

3.1.1. Diâmetro e área do CL

Interação dose x tempo
O uso de 50% ou 100% da dose dos agentes luteolíticos causou redução das
dimensões do CL de animais tratados já a partir de 24 h (p<0,05). Para animais não
tratados (dose 0%), foi observado aumento (p<0,05) das dimensões do CL ao longo
dos momentos avaliados. A utilização de 100% ou 50% da dose convencional dos
ativos apresentou o mesmo efeito sobre as dimensões do CL avaliadas (Figura 3).

A p= <0,001
Diâmetro do CL
2,00
1,82Abc 1,86Aab 1,89Aab
1,73Abc
1,80 1,66a
1,60 1,63a
0%
1,60c
cm

1,40 1,39Bb
50%
1,36Bb 1,22Bc
1,20 1,14Bcd 100%
1,22Bbc 1,06Bd
1,00 0,96Bd
1,11Bcd
0,80
0h 24 h 48 h 72 h 96 h

B Área do CL p= <0,001

3,30
2,80 2,79Aa
2,35a 2,60Aa 2,74Aa
2,30 2,30a 2,40Aab
0%
cm2

1,80 2,09b 1,60Bb

50%
1,28Bc 1,16Bc
1,30 1,60Bb
1,07Bc 100%
1,27Bc
0,80 1,05Bcd 0,81Bd
0,30
0h 24 h 48 h 72 h 96 h

Figura 3. Dinâmica do diâmetro (A) e da área (B) do CL, conforme interação entre a
dose de PGF2α e o tempo após administração dos tratamentos. Valores para
a mesma dose (0%, 50% e 100%) seguidos por diferentes letras minúsculas
são significantes. Valores para o mesmo momento (0 h, 24 h, 48 h, 72 h e
96 h) seguidos por diferentes letras maiúsculas são significantes.

Interação dia x tempo

Foi observada apenas redução numérica (p≥0,05) no diâmetro e na área do CL
entre os momentos 0 h e 96 h para animais que se encontravam no D4 (Figura 4).
Para animais que se encontravam no D11 foi observada redução (p<0,05) das
dimensões do CL entre os momentos 0 h e 96 h, sendo significativa já em 24 h (Figura
4).
 26

A Diâmetro do CL p= <0,001

1,80
1,70 1,72a
1,60
1,54 1,52b
1,50 1,45 1,44
cm
1,40 1,46 1,40 Dia 4
1,30 1,39bc Dia 11
1,20 1,29cd 1,21d
1,10
1,00
0h 24 h 48 h 72 h 96 h

B p= <0,001
Área do CL
2,80
2,52a
2,30
1,98 1,92b 1,81 1,81
1,80 1,80
cm2

1,81 Dia 4
1,63c
1,30 1,49cd 1,31d Dia 11
0,80

0,30
0h 24 h 48 h 72 h 96 h

Figura 4. Dinâmica do diâmetro (A) e da área (B) do CL, conforme interação entre o
dia do ciclo estral e o tempo após administração dos tratamentos. Valores
para o mesmo dia (Dia 4 e Dia 11) seguidos por diferentes letras minúsculas
são significantes.

Interação PGF2 x dose

A área do CL de animais não tratados (CS 0% e DT 0%) foi superior (p<0,05)
ao dos animais tratados com as diferentes doses (50% e 100%) de cloprostenol sódico
e dinoprost trometamina (Figura 5). No entanto, não foi observada diferença entre o
efeito dos diferentes ativos utilizados nas diferentes doses sobre o volume do CL
(p≥0,05; Figura 5).
 27

p= <0,035
Área do CL
3,50
2,81a
3,00
2,50 2,24a

2,00 1,55b
cm2
1,50b Cloprostenol Sódico
1,41b 1,34b
1,50
Dinoprost Trometamina
1,00
0,50
0,00
0% 50% 100%

Figura 5. Dinâmica da área do CL, conforme interação entre o tipo de PGF2α e a dose
utilizada. Valores seguidos por diferentes letras minúsculas são
significantes.

3.1.2. Vascularização do CL

3.1.2.1. Avaliação subjetiva dos escores de vascularização periférica e central

Interação dia x dose x tempo
Animais não tratados (0%) avaliados a partir do D4 mantiveram escores
constantes de vascularização periférica (p≥0,05; Tabela 2 e Figura 6). Aqueles que
receberam 50% da dose dos ativos avaliados no referido momento apresentaram
apenas redução numérica no escore de vascularização periférica (p≥0,05; Tabela 2 e
Figura 6). Apenas animais tratados com 100% da dose dos ativos avaliados no D4
apresentaram redução (p<0,05) de escore em 72 h e 96 h com relação a 0 h (Tabela
2 e Figura 6). Não houve diferença entre os escores de vascularização periférica entre
animais não tratados (0%) e animais tratados com 50% da dose dos agentes
luteolíticos testados (Tabela 2 e Figura 6). Já animais tratados com 100% da dose
apresentaram escore de vascularização central menor (p<0,05) que animais não
tratados (0%) nos momentos 72 h e 96 h e menor que animais tratados com 50% da
dose no momento 96 h (p<0,05; Tabela 2 e Figura 6).
Para animais que se encontravam no D11, o escore de vascularização
periférica permaneceu constante para animais não tratados (dose 0%; p≥0,05; Tabela
2 e Figura 6). Animais que receberam os agentes luteolíticos apresentaram redução
dos escores de vascularização periférica (p<0,05), a partir de 48 h para animais
tratados com 50% da dose e a partir de 24 h para animais tratados com 100% da dose
(Tabela 2 e Figura 6). A utilização de 100% ou 50% da dose convencional dos ativos
no D11 teve o mesmo efeito sobre os escores de vascularização periférica (Tabela 2
e Figura 6).
 28

Tabela 2. Valores para escore de vascularização periférica do CL, conforme interação

entre o dia do ciclo estral (D4 e D11), a dose de PGF2α utilizada e o tempo
após administração dos tratamentos. Valores na mesma linha seguidos por
diferentes letras minúsculas são significantes. Valores na mesma coluna
seguidos por diferentes letras maiúsculas são significantes.

Tempo
Dia*Dose
0h 24 h 48 h 72 h 96 h
D4*0% 2,17±0,30 2,17±0,30 2,17±0,30 2,42±0,30A 2,42±0,30A
D4*50% 2,00±0,21 1,60±0,21 1,50±0,21AB 1,50±0,21ABC 1,90±0,21A
D4*100% 1,90±0,21a 1,30±0,21ab 1,30±0,21ABab 0,90±0,21BCb 0,70±0,21BCb
D11*0% 1,83±0,30 1,83±0,30 2,17±0,30A 2,00±0,30AB 2,00±0,30AB
D11*50% 2,18±0,18a 1,54±0,18a 0,69±0,18Bb 0,31±0,18Cb 0,07±0,18Cb
D11*100% 1,92±0,20a 1,10±0,20b 0,82±0,20ABbc 0,45±0,20Cbc 0,08±0,20Cc

Vascularização Periférica do CL p= 0,002

3,00
2,50 Dia 4*0%
2,00
Dia 4*50%
1,50
Dia 4*100%
1,00
Dia 11*0%
0,50
Dia 11*50%
0,00
Dia 11*100%
-0,50
0h 24 h 48 h 72 h 96 h

Figura 6. Dinâmica do escore de vascularização periférica do CL, conforme interação

entre o dia do ciclo estral (D4 e D11), a dose de PGF2α utilizada e o tempo
após administração dos tratamentos.

Interação dose x tempo

A administração de 50% ou 100% da dose dos agentes luteolíticos induziu a
redução dos escores de vascularização central do CL de animais tratados já a partir
de 24 h (p<0,05; Figura 7). Para animais não tratados (dose 0%), os escores de
vascularização central permaneceram constantes entre 0 h e 96 h (p≥0,05; Figura 7).
A utilização de 100% ou 50% da dose convencional dos ativos teve o mesmo efeito
sobre a vascularização central do CL (Figura 7).
 29

Vascularização Central do CL p= <0,001

1,50
1,33A
1,23a 1,33A
1,10 1,17A
0,90a
0,92A 0%
0,70 0,88
50%
0,45ABb 0,30Bb 0,40Bb
0,30 0,20Bb 100%
0,13Bb 0,05Bb 0,10Bb
0,10Bb
-0,10
0h 24 h 48 h 72 h 96 h

Figura 7. Dinâmica do escore de vascularização central do CL, conforme interação

entre a dose de PGF2α utilizada e o tempo após administração dos
tratamentos. Valores para a mesma dose (0%, 50% e 100%) seguidos por
diferentes letras minúsculas são significantes. Valores para o mesmo
momento (0 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h) seguidos por diferentes letras
maiúsculas são significantes.

Interação dia x tempo

Foi observada apenas redução numérica (p≥0,05) nos escores de
vascularização central do CL entre os momentos 0 h e 24 h, para animais que se
encontravam no D4 (Figura 8). A partir de 24 h após o tratamento foi observado
aumento numérico (p≥0,05) dos escores de vascularização central (Figura 8). Para
animais que se encontravam no D11, foi observada redução (p<0,05) nos escores de
vascularização central do CL entre os momentos 0 h e 96 h, sendo significativa já em
24 h (Figura 8).

Vascularização Central do CL p= <0,001

1,40
1,20 1,22a
1,00
0,80 0,78 0,81
0,74 Dia 4
0,60 0,57b 0,56 Dia 11
0,40 0,43 0,42b
0,39b 0,42b
0,20
0,00
0h 24 h 48 h 72 h 96 h

Figura 8. Dinâmica do escore de vascularização central do CL, conforme interação

entre o dia do ciclo estral e o tempo após administração dos tratamentos.
Valores para o mesmo dia (Dia 4 e Dia 11) seguidos por diferentes letras
minúsculas são significantes.
 30

3.1.2.2. Análise computadorizada da área vascularizada do CL

Interação dia x dose x tempo
Animais que se encontravam no momento D4 mantiveram percentual constante
de área vascularizada do CL ao longo dos momentos avaliados (p≥0,05; Tabela 3 e
Figura 9). No entanto, após a administração dos tratamentos foi observada redução
numérica no percentual de área vascularizada (p≥0,05; Tabela 3 e Figura 9). Para
animais que se encontravam no D11 da fase luteínica, a área vascularizada do CL
permaneceu constante para animais não tratados (dose 0%; p≥0,05; Tabela 3 e Figura
9). Animais que receberam os agentes luteolíticos no D11 apresentaram redução da
área vascularizada (p<0,05), a partir de 24 h, independentemente da dose utilizada
(Tabela 3 e Figura 9). A administração de 50% ou 100% da dose dos agentes
luteolíticos em D11 causou o mesmo efeito sobre a área vascularizada do CL (Tabela
3 e Figura 9).

Tabela 3. Percentual de área vascularizada do CL, conforme interação entre o dia do

ciclo estral (D4 e D11), a dose de PGF2α utilizada e o tempo após
administração dos tratamentos. Valores na mesma linha seguidos por
diferentes letras minúsculas são significantes. Valores na mesma coluna
seguidos por diferentes letras maiúsculas são significantes.

Tempo
Dia*Dose
0h 24 h 48 h 72 h 96 h
D4*0% 18,52±3,33 17,24±3,33 16,06±3,33 15,96±3,33AB 20,30±3,33A
D4*50% 17,41±2,30 10,13±2,30 11,76±2,30 11,28±2,30AB 18,00±2,30A
D4*100% 15,71±2,30 9,23±2,30 9,16±2,30 7,17±2,30AB 7,23±2,30AB
D11*0% 14,25±3,33 17,93±3,33 18,26±3,33 19,64±3,33A 17,57±3,33A
D11*50% 21,24±2,03a 12,35±2,03b 3,54±2,03c 1,24±2,03Bc 0,29±2,03Bc
D11*100% 18,70±2,21a 6,76±2,21b 3,97±2,21b 2,12±2,21Bb 0,73±2,21Bb

Área Vascularizada do CL p= <0,001

24,00
21,00
18,00 Dia 4*0%
15,00 Dia 4*50%
12,00 Dia 4*100%
%

9,00
6,00 Dia 11*0%
3,00 Dia 11*50%
0,00
Dia 11*100%
-3,00
0h 24 h 48 h 72 h 96 h

Figura 9. Dinâmica da área vascularizada do CL, conforme interação entre o dia do

ciclo estral (D4 e D11), a dose de PGF2α utilizada e o tempo após
administração dos tratamentos.
 31

Interação PGF2 x dose x tempo

Animais não tratados mantiveram percentual de área vascularizada do CL
constante ao longo dos momentos avaliados (p≥0,05; Tabela 4 e Figura 10). Animais
tratados com os diferentes agentes luteolíticos apresentaram redução da área
vascularizada (p<0,05). Tal efeito foi observado a partir de 24 h para animais tratados
com CS 100% e DT 50%, e a partir de 48 h para animais com DT 100% (Tabela 4 e
Figura 10). Animais tratados com CS 50% apresentaram redução da área
vascularizada no momento 72 h (Tabela 4 e Figura 10). A administração de 50% ou
100% da dose dos diferentes agentes luteolíticos avaliados exerceu efeito semelhante
sobre a área vascularizada ao longo dos momentos avaliados (Tabela 4 e Figura 10).

Tabela 4. Percentual de área vascularizada do CL, conforme interação entre o tipo de

PGF2α (CS: cloprostenol sódico, DT: Dinoprost Trometamina), a dose
utilizada e o tempo após administração dos tratamentos. Valores na mesma
linha seguidos por diferentes letras minúsculas são significantes. Valores na
mesma coluna seguidos por diferentes letras maiúsculas são significantes.

Tempo
PGF2α*Dose
0h 24 h 48 h 72 h 96 h
CS*0% 15,93±2,98 16,66±2,98 20,34±2,98A 17,64±2,98 18,08±2,98
CS*50% 16,21±2,13a 11,55±2,13ab 7,84±2,13ABab 6,39±2,13b 13,08±2,13ab
CS*100% 19,20±2,30a 7,36±2,30b 7,46±2,30ABb 5,34±2,30b 3,91±2,30b
DT*0% 16,84±3,64 18,51±3,64 13,98±3,64AB 17,96±3,64 19,79±3,64
DT*50% 22,44±2,21a 10,93±2,21b 7,46±2,21ABb 6,13±2,21b 5,21±2,21b
DT*100% 15,21±2,21a 8,63±2,21ab 5,67±2,21Bb 3,95±2,21b 4,04±2,21b

Área Vascularizada do CL p= <0,021

25,00

20,00 CS 0%
CS 50%
15,00
%

CS 100%
10,00 DT 0%

5,00 DT 50%
DT 100%
0,00
0h 24 h 48 h 72 h 96 h

Figura 10. Dinâmica da área vascularizada do CL, conforme interação entre o tipo de
PGF2α (CS: Cloprostenol Sódico, DT: Dinoprost Trometamina), a dose
utilizada e o tempo após administração dos tratamentos.
 32

3.1.3. Concentrações séricas de progesterona

Interação dose x tempo
A administração de 50% ou 100% da dose dos ativos avaliados causou redução
semelhante da concentração sérica de progesterona entre 0 h e 48 h, podendo ser
observada redução significativa já no momento 8 h (p<0,05; Figura 11). Para animais
tratados com 100% da dose, a concentração de progesterona atingiu concentrações
abaixo de 1 ng/ml em até 8 h após o tratamento, enquanto que para animais tratados
com 50% da dose esse efeito foi observado em até 24 h (Figura 11). Para animais não
tratados (dose 0%), a concentração sérica de progesterona circulante permaneceu
estável (p≥0,05) e acima de 1 ng/ml até 48 h após o início das avaliações (Figura 11).

Progesterona Sérica p= <0,001

4,00
3,43a 3,49A
3,00 3,11a 2,85A
2,80A
2,00 2,13 0%
ng/ml

50%
1,17Bb
1,00 0,68Bb 0,81Bb 100%
0,97Bb
0,00 0,18Bb
0,28Bb

-1,00 0h 8h 24 h 48 h

Figura 11. Dinâmica da concentração de progesterona sérica, conforme interação

entre a dose de PGF2α utilizada e o tempo após administração dos
tratamentos. Valores para a mesma dose (0%, 50% e 100%) seguidos por
diferentes letras minúsculas são significantes. Valores para o mesmo
momento (0 h, 8 h, 24 h, e 48 h) seguidos por diferentes letras maiúsculas
são significantes.

Avaliando isoladamente o efeito após a administração das diferentes doses de

PGF2α no momento D11, foi possível observar comportamento similar após o uso de
50% ou 100% da dose (Figura 12). Foi observada queda contínua na concentração
sérica de progesterona entre 0 h e 48 h, com concentrações abaixo de 1 ng/ml para
ambos os tratamentos em até 24 h após a administração (Figura 12). Ainda com
relação aos tratamentos administrados em D11, a análise considerando tipo e dose
de PGF2α demonstra efeito semelhante sobre a concentração sérica de progesterona
após administração dos tratamentos avaliados (Tabela 5 e Figura 13). Foi observada
queda contínua na concentração sérica de progesterona entre 0 h e 48 h, com
concentrações abaixo de 1 ng/ml para todos os tratamentos em até 24 h após a
administração (Tabela 5 e Figura 13).
 33

Progesterona Sérica
7,00
6,00 5,90
5,00 4,96
4,00 3,50 Dia 11*0%
ng/ml 3,00 3,24 3,45
2,93 Dia 11*50%
2,00 1,64
1,00 Dia 11*100%
1,62 0,50
0,00 0,46 0,06
0,05
-1,00
0h 8h 24 h 48 h

Figura 12. Dinâmica da concentração de progesterona sérica observada em animais

avaliados a partir do momento D11, conforme dose de PGF2α utilizada
(0%, 50% ou 100%).

Tabela 5. Concentração de progesterona sérica (ng/ml) em animais avaliados a partir

do momento D11, conforme tipo (CS: Cloprostenol Sódico, DT: Dinoprost
Trometamina) e dose de PGF2α utilizada (0%, 50% ou 100%).

Tempo
Dia*PGF2α*Dose
0h 8h 24 h 48 h
D11*CS*0% 2,12±0,64 3,10±0,64 3,00±0,64 1,91±0,64
D11*CS*50% 5,42±0,42 1,36±0,42 0,53±0,42 0,06±0,42
D11*CS*100% 5,82±0,50 1,61±0,50 0,26±0,50 0,00±0,50
D11*DT*0% 4,37±0,79 3,90±0,79 2,85±0,79 4,99±0,79
D11*DT*50% 4,49±0,45 1,93±0,45 0,47±0,45 0,04±0,45
D11*DT*100% 5,98±0,45 1,63±0,45 0,67±0,45 0,12±0,45

Progesterona Sérica
7,00
6,00
Dia 11*CS*0%
5,00
4,00 Dia 11*CS*50%
ng/ml

3,00 Dia 11*CS*100%

2,00 Dia 11*DT*0%
1,00 Dia 11*DT*50%
0,00
Dia 11*DT*100%
-1,00
0h 8h 24 h 48 h

Figura 13. Dinâmica da concentração de progesterona sérica em animais avaliados a

partir do momento D11, conforme tipo (CS: Cloprostenol Sódico, DT:
Dinoprost Trometamina) e dose de PGF2α utilizada (0%, 50% ou 100%).
 34

Interação dia x tempo

Animais que se encontravam no momento D4 mantiveram concentrações
constantes (p≥0,05) de progesterona durante as avaliações realizadas entre 0 h e 48
h (Figura 14). Apesar da ausência de alterações na concentração sérica de
progesterona para animais avaliados a partir de D4, a análise dos dados agrupados
conforme dose de PGF2α demonstra redução seguida de aumento, ao menos
numéricos, para animais tratados com 50% ou 100% da dose no período entre 0 h e
48 h. Dos 20 animais que receberam algum tratamento luteolítico no D4, 14 (CS 50%
= 2; CS 100% = 5; DT 50% = 3; DT 100% = 4) apresentaram concentração de
progesterona abaixo de 1 ng/ml 48 h após o tratamento.
Animais avaliados a partir do momento D11 apresentaram redução (p<0,05) da
concentração de progesterona entre 0 h e 48 h, podendo ser observada redução
significativa já no momento 8 h (Figura 14). Conforme demonstrando na Tabela 5 e
na Figura 15, a administração dos tratamentos propostos no momento D11 foi
eficiente em reduzir a concentração de progesterona sérica. Dos 24 animais tratados
no referido momento, apenas dois (tratados com DT 100%) não apresentavam
concentração de progesterona abaixo de 1 ng/ml 24 h após o tratamento. No entanto,
no momento 48 h todos os animais tratados apresentavam concentração de
progesterona abaixo de 1 ng/ml.

Progesterona Sérica p= <0,001

6,00
5,00
4,70a
4,00
ng/ml

3,00 Dia 4

2,00 2,25b Dia 11

1,30c 1,79
1,08 1,07
1,00 1,21 1,19c

0,00
0h 8h 24 h 48 h

Figura 14. Dinâmica da concentração de progesterona sérica, conforme interação

entre dia do ciclo estral e o tempo após administração dos tratamentos.
Valores para o mesmo dia (Dia 4 e Dia 11) seguidos por diferentes letras
minúsculas são significantes.
 35

Progesterona Sérica
5,00
4,00
3,53
3,00
Dia 4*0%
ng/ml
2,68
2,00 2,22
1,56 Dia 4*50%
1,26
1,00 1,02
0,96 0,85 Dia 4*100%
0,69 0,29
0,00 0,31 0,09
-1,00
0h 8h 24 h 48 h

Figura 15. Dinâmica da concentração de progesterona sérica observada em animais

avaliados a partir do momento D4, conforme dose de PGF2α utilizada (0%,
50% ou 100%).

3.2. EXPERIMENTO 2
Os valores de P para as variáveis analisadas, conforme efeitos principais e
interações, estão representados na Tabela 6.
 36

Tabela 6. Valores de P para cada variável analisada, conforme efeitos principais e interações.
Dia*
Dia* Dia* Dia* PGF2α*
Dia* Dia* PGF2α* Dia* PGF2α* Dose* PGF2α*
Variável Dia PGF2α Dose Tempo Dose* PGF2α* Dose* Dose*
PGF2α Dose Dose Tempo Tempo Tempo Dose*
PGF2α Tempo Tempo Tempo
Tempo
Imunomarcação
0,199 0,199 0,023 - 0,886 0,567 0,253 - - - 1,000 - - - -
CLG
Imunomarcação
<0,001 0,898 0,607 - 0,006 0,607 0,266 - - - 0,042 - - - -
CLP
Área CLG <0,001 0,035 0,006 - 0,604 0,353 0,003 - - - 0,003 - - - -
Área CLP <0,001 <0,001 0,805 - <0,001 <0,001 <0,001 - - - 0,102 - - - -
Progesterona
<0,001 0,971 0,516 <0,001 0,160 0,746 0,761 <0,001 0,714 0,543 0,282 0,702 0,283 0,646 0,105
(ng/ml)
Dia: dia do ciclo estral; PGF2: tipo de PGF2; Dose: dose de PGF2; Tempo: tempo após a administração dos tratamentos; CLG: células luteais
grandes; CLP: células luteais pequenas; Valores de p<0,05 são significativos.
 37

3.2.1. Atividade da caspase-3 por imunohistoquímica (imunomarcação)

Interação dia x PGF2 x dose
Após a administração dos agentes luteolíticos, o número de células luteais
pequenas positivas para imunomarcação para caspase-3 foi semelhante entre os
tratamentos, quando agrupados conforme o dia do ciclo estral (D4 ou D11; p > 0,05).
Entretanto, o CL de animais tratados com 100% da dose de dinoprost trometamina no
D11 exibiu maior número de células luteais pequenas imunomarcadas quando
comparado com o CL de todos os animais tratados no D4. Além disso, todos os
tratamentos no D11, exceto o CS 100%, apresentaram contagem superior destas
células comparado ao DT 100% no D4 (p<0,05; Figura 16).

Células Luteais Pequenas (imunomarcação) p= 0,042

16,00 Dia 4*CS 50%
13,00a
imunomarcadas/campo

14,00 9,73abc Dia 4*CS 100%

12,00 10,13abc
Dia 4*DT 50%
8,47abcd
no de células

10,00 7,93bcd
7,20cd Dia 4*DT 100%
5,67cd
8,00 4,93d Dia 11*CS 50%
6,00
Dia 11*CS 100%
4,00
Dia 11*DT 50%
2,00
Dia 11*DT 100%
0,00

Figura 16. Número de células luteais pequenas imunomarcadas por campo, conforme
interação entre o dia do ciclo estral, o tipo (CS: Cloprostenol Sódico; DT:
Dinoprost Trometamina) e a dose de PGF2α utilizados. Valores seguidos
por diferentes letras minúsculas são significantes.

Efeito de dose de PGF2α

Após a administração das diferentes doses de PGF2α avaliadas, foi observado
que o CL de animais tratados com 50% da dose dos agentes luteolíticos apresentaram
maior número de células luteais grandes positivas para imunomarcação para caspase-
3 quando comparados com CL de animais tratados com 100% da dose (p<0,05; Figura
17).
 38

Células Luteais Grandes (Imunomarcação) p= <0,001

1,4 1,05a

imunomarcadas/campo
1,2
1
no de células

0,8 0,52b 50%

0,6 100%
0,4
0,2
0

Figura 17. Número de células luteais grandes imunomarcadas por campo, conforme
fator dose de PGFα. Valores seguidos por diferentes letras minúsculas são
significantes.

3.2.2. Análise morfométrica das células luteais

Interação dia x dose x PGF2
A área das células luteais grandes foi semelhante (p > 0,05) entre os animais
tratados no D11 do ciclo estral, independentemente da dose ou do agente luteolítico
avaliado. Já para animais tratados no D4, foi observado que fêmeas tratadas com CS
100% apresentaram células luteais grandes com área inferior à das fêmeas tratadas
com CS 50% e DT 100% (p < 0,05; Figura 18). Comparando o efeito dos tratamentos
nos diferentes momentos, foi observado que animais tratados com CS 50% e DT
100% no D4 apresentaram células luteais grandes com área superior (p < 0,05) à de
todos os animais tratados no D11 (Figura 18). Animais tratados com DT 50% no D4
apresentaram área de células luteais grandes semelhante (p ≥ 0,05) à daqueles
tratados com a mesma dose no D11 e superior (p < 0,05) à dos demais tratamentos
administrados no D11 (Figura 18). Animais tratados com CS 100% no D4
apresentaram área de células luteais grandes superior (p < 0,05) à daqueles tratados
com a mesma dose no D11 e semelhante (p ≥ 0,05) à dos demais tratamentos
administrados no D11 (Figura 18).
 39

p= 0,042
Células Luteais Grandes (Área)
3000 Dia 4*CS 50%
2492a
2460a 2328ab Dia 4*CS 100%
2500 2149bc 2055cd 2118bcd
1906d 1970cd Dia 4*DT 50%
2000
Dia 4*DT 100%
µm2

1500 Dia 11*CS 50%

1000 Dia 11*CS 100%

500 Dia 11*DT 50%

Dia 11*DT 100%
0

Figura 18. Área das células luteais grandes, conforme interação entre o dia do ciclo
estral, o tipo (CS: Cloprostenol Sódico; DT: Dinoprost Trometamina) e a
dose de PGF2α utilizados. Valores seguidos por diferentes letras
minúsculas são significantes.

Interação dia x PGF2

A área das células luteais pequenas foi superior em animais tratados com
cloprostenol sódico no momento D4 em comparação com os que receberam dinoprost
trometamina no mesmo momento e também com aqueles tratados no D11 (p < 0,05).
O uso de cloprostenol sódico e dinoprost trometamina influenciou de maneira
semelhante a área das células luteais pequenas no momento D11 (p > 0,05; Figura
19).

Células Luteais Pequenas (Área) p= <0,001

440

420 412a
Dia 4*CS
400
Dia 4*DT
µm2

380 366b
356b 354b Dia 11*CS
360
Dia 11*DT
340

320

Figura 19. Área das células luteais pequenas, conforme interação entre o dia do ciclo
estral e o tipo PGF2α utilizada (CS: Cloprostenol Sódico; DT: Dinoprost
Trometamina). Valores seguidos por diferentes letras minúsculas são
significantes.
 40

Interação dia x dose

A área das células luteais pequenas foi superior em animais tratados com 100%
da dose dos agentes luteolíticos no momento D4 em comparação com a área celular
de animais que receberam 50% da dose no D4 e também com aqueles tratados no
D11 (p < 0,05). O uso de 50% ou 100% da dose influenciou de maneira semelhante a
área das células luteais pequenas no momento D11 (p > 0,05; Figura 20).

Células Luteais Pequenas (Área) p= <0,001

410
400 393a

390 Dia 4*50%

376b
380 367b Dia 4*100%
µm2

370
353b Dia 11*50%
360
350 Dia 11*100%
340
330

Figura 20. Área das células luteais pequenas, conforme interação entre o dia do ciclo
estral e a dose de PGF2α utilizada. Valores seguidos por diferentes letras
minúsculas são significantes.

Interação PGF2α x dose

Animais tratados com 50% da dose de dinoprost trometamina apresentaram
menor área de células luteais pequenas (p < 0,05) quando comparados com animais
que receberam os demais tratamentos (dinoprost trometamina 100% e cloprostenol
sódico 50% e 100%). Não houve diferença para a área celular de animais tratados
com 100% da dose de cloprostenol sódico e dinoprost trometamina (p > 0,05; Figura
21).
 41

Células Luteais Pequenas (Área) p= <0,001

410
395a
400
390
373b 373b CS*50%
380
CS*100%
µm2

370
360 349c
DT*50%
350
DT*100%
340
330
320

Figura 21. Área das células luteais pequenas, conforme interação entre o tipo de
PGF2α (CS: Cloprostenol Sódico; DT: Dinoprost Trometamina) e a dose
utilizada. Valores seguidos por diferentes letras minúsculas são
significantes.

3.2.3. Concentrações séricas de progesterona

Interação dia x tempo
A administração dos agentes luteolíticos avaliados causou redução da
concentração sérica de progesterona entre 0 h e 24 h, independentemente do dia de
realização do tratamento (p<0,05; Figura 22).

p= <0,001
Progesterona Sérica
3,50
3,00 3,13a

2,50
ng/mL

2,00
Dia 4
1,50
Dia 11
1,00 0,91a
0,50 0,29b
0,20b
0,00
0h 24 h

Figura 22. Dinâmica da concentração de progesterona sérica, conforme interação

entre dia do ciclo estral e o tempo após administração dos tratamentos.
Valores para o mesmo dia (Dia 4 e Dia 11) seguidos por diferentes letras
minúsculas são significantes.

4. DISCUSSÃO
Os achados no presente estudo corroboram com parte do que há disponível na
literatura sobre a redução de doses de diferentes princípios ativos de PGF2 em
diferentes momentos do ciclo estral. Contudo, o principal resultado encontrado no
 42

presente trabalho se refere a diferenças morfológicas e da atividade de caspase-3

entre células luteínicas pequenas e grandes quando submetidas a estes tratamentos.
Em concordância com o previamente relatado em ovelhas [19] e em vacas
leiteiras [20], os princípios ativos não diferiram quanto à eficiência luteolítica referente
aos achados ultrassonográficos ou de dosagem de progesterona em fêmeas bovinas
de corte. Contudo, evidenciou-se que ambos agentes luteolíticos quando
administrados no D11 foram eficientes em reduzir as dimensões luteais (avaliações
ultrassonográficas) entre 0 h e 96 h, caracterizando o processo de luteólise estrutural,
fato que não ocorreu aos animais tratados no D4. Com relação ao efeito das diferentes
doses dos agentes luteolíticos avaliados, foi observado que o uso de 50% ou 100%
da dose recomendada causou redução semelhante das dimensões luteais, diferente
do demonstrado por Castro Ferraz Júnior et al. (2016) [21], avaliando diferentes doses
de dinoprost (12,5; 25,0 ou 50,0 mg) em vacas de corte nos momentos D5 e D7 do
ciclo estral. Diversos trabalhos avaliaram o uso e o efeito de diferentes doses de
PGF2α [12-14, 19, 22-24], demonstrando que a redução de dose dos agentes
luteolíticos é uma alternativa viável que pode ser adotada no manejo reprodutivo. O
presente trabalho demonstrou que o uso de 50% da dose convencional, garantiu
resultados semelhantes ao uso de 100% da dose. Esse fato demonstra que o uso de
metade da dose convencional de cloprostenol sódico (250 µg) e de dinoprost
trometamina (12,5 mg) pode ser uma alternativa eficaz de induzir luteólise em fases
responsivas do CL em fêmeas bovinas de corte.
Além da luteólise estrutural, observou-se luteólise funcional (queda nas
concentrações de progesterona) em animais tratados no D11, sendo que o uso de
50% ou 100% da dose recomendada foi igualmente eficaz em promover valores
menores que 1 ng/ml em até 24 h após o tratamento. Já no D4, os animais do
Experimento 1 tratados com 50% ou 100% da dose dos ativos avaliados apresentaram
redução e posterior aumento, ao menos numéricos, na concentração sérica de
progesterona entre 0 h e 48 h. Para os animais avaliados no Experimento 2, foi
observada redução na concentração sérica de progesterona entre 0 h e 24 h, tanto
para animais tratados no D4, quanto para animais tratados em D11.
A diminuição das dimensões luteais é causada pela morte celular, apoptose e
degeneração do tecido luteal [25, 26] e, como consequência, há queda nas
concentrações de progesterona. Conjuntamente, os dados do presente estudo estão
em concordância com outros relatos descritos na literatura, demonstrando a eficácia
de tratamentos luteolíticos administrados apenas em fases responsivas do CL [10, 12,
19, 21, 22] e ausência de luteólise estrutural e funcional completa quando o tratamento
é administrado na fase inicial do ciclo estral [10, 12, 21, 22, 24, 27-29], sugerindo que
nesta fase há ocorrência de luteólise parcial [11, 12, 21]. No entanto, como no
presente estudo a concentração de progesterona foi mensurada até 24 h (experimento
1) ou 48 h (experimento 2) após o tratamento, não foi possível registrar a retomada
na produção esteroidogênica para alguns grupos de tratamento.
 43

Tsai e Wiltbank (1998) [9] demonstraram que não há diferença na expressão

de RNAm de receptores de PGF2α em CL bovino no D4 ou D11 do ciclo estral, e que
a administração de tratamento luteolítico diminui a quantidade de RNAm de receptores
de PGF2α em ambos os momentos do ciclo estral, quando comparados a animais não
tratados. Sakamoto et al. (1995) [30] e Shirasuna et al. (2012) [31] também
demonstraram a presença de expressão de RNAm de receptores de PGF2α em CL
bovino no início do ciclo estral (3 a 5 dias), no entanto, os autores observaram
aumento de expressão com o avançar das fases do ciclo. Miyamoto et al. (2009) [32]
revisando o impacto dos processos hemodinâmicos no processo de formação e
regressão do CL, associam a maior resistência à luteólise com a presença de maiores
níveis da enzima catalisadora de PGF2α, 15-hydroxyprostaglandina dehydrogenase
(PGDH) no CL de início do ciclo. Esses achados podem explicar as diferenças
observadas na resposta luteolítica conforme a fase do ciclo estral que os tratamentos
foram administrados.
Com relação à expressão de RNAm codificador de ciclo-oxigenase-2 (COX-2),
Tsai e Wiltbank (1998) [9] observaram expressão de concentrações basais em
animais não tratados, em ambas as fases do ciclo (D4 e D11). Já em animais tratados
pode-se observar aumento da concentração de RNAm de COX-2 em CL de 11 dias e
diminuição significativa em CL de 4 dias. Com isso os autores citam que a
administração intramuscular de PGF2α (25 mg de dinoprost trometamina) em animais
no dia 4 do ciclo alcança o CL, se liga aos receptores de PGF2α, e inicia ao menos
em partes os eventos fisiológicos que induzem o processo luteolítico; contudo, uma
injeção simples de PGF2α não seria capaz de completar o processo de luteólise nesta
fase. Resultado semelhante foi observado por Nascimento et al. (2014) [11] que
relataram ausência de efeito luteolítico completo após administração de uma (25 mg)
ou duas doses (2 x 25 mg; 50 mg) de dinoprost trometamina em vacas holandesas
não lactantes tratadas na fase inicial do ciclo estral (D5). Os autores observaram que
animais tratados apresentaram menor concentração de progesterona que animais não
tratados nas primeiras 24 h após a administração do ativo, no entanto, no 15o do ciclo
estral todos os grupos tratados com dinoprost trometamina apresentavam
concentrações séricas de progesterona condizentes com CL funcionais. Os autores
ainda demonstraram por meio de avaliações ultrassonográficas que nenhum CL
regrediu completamente durante o período experimental e que não ocorreram novas
ovulações para que houvesse a formação de novos CL funcionais durante o ciclo
avaliado. Esses eventos podem explicar a semelhança observada entre a área de
células luteais grandes e pequenas de animais tratados nos momentos D4 e D11,
observada no experimento 2, uma vez que a administração de agentes luteolíticos na
fase inicial do ciclo estral é capaz de induzir um processo de luteólise parcial.
Ao observar os resultados obtidos para os diferentes modelos de análise da
vascularização do CL (subjetiva: escores de vascularização central e periférica;
objetiva: % de área vascularizada), pode-se observar que os valores foram afetados
 44

de maneira similar pelas variáveis analisadas. Os resultados evidenciaram respostas

como ausência de alteração, apenas redução numérica, da vascularização tecidual
em animais avaliados a partir do momento D4 do ciclo estral, com exceção para
vascularização periférica de animais tratados com 100% da dose, para os quais os
valores médios dos momentos 72 h e 96 h foram menores que 0 h. Para animais
tratados no momento D11, foi observada redução da vascularização tecidual do CL,
independentemente do ativo e da dose utilizados. Acosta et al. (2002) [10] observaram
resultado semelhante ao apresentado neste trabalho, demonstrando redução da área
vascularizada do CL para animais tratados com 500 µg de cloprostenol na fase
luteínica intermediária (diestro), bem como ausência de alteração da área
vascularizada para animais tratados na fase luteínica inicial (metaestro). Ginther et al.
(2007) [23], avaliando o fluxo sanguíneo do CL de animais submetidos a diferentes
tratamentos luteolíticos, observaram que a administração de 500 µg de cloprostenol e
de 25 mg de dinoprost foi eficiente em reduzir a área vascularizada do CL. Trevisol et
al. (2015) [12] avaliando o efeito de doses luteolíticas (2 x 500 µg) e subluteolíticas
(83,33 µg) de cloprostenol sódico observaram redução da área vascularizada do CL
para animais tratados com 2 x 500 µg de cloprostenol e área vascularizada constante
para animais tratados com 83,33 µg do ativo.
O resultado observado para os métodos de avaliação de vascularização do CL
corrobora com o observado por Viana et al. (2013) [33] que, revisando o uso da
ultrassonografia doppler na avaliação ovariana, citam a existência de boa correlação
entre métodos objetivos e subjetivos para avaliação do fluxo sanguíneo do CL. Ghetti
et al. (2012) [34] também observaram forte correlação entre métodos objetivos e
subjetivos para avaliação da vascularização de folículos pré-ovulatórios de bovinos.
Não foi encontrado nenhum trabalho avaliando a ação dos agentes luteolíticos
sobre a vascularização central, no entanto, Miyamoto et al. (2009) [32] relatam que
uma dose luteolítica de PGF2α induz aumento agudo, entre 30 minutos e 2 h após o
tratamento, de fluxo sanguíneo periférico do CL responsivo ao tratamento, juntamente
com aumento da expressão de óxido nítrico (NOS), no entanto, esse efeito não é
observado no fluxo sanguíneo central do CL. Logo após esse aumento de fluxo
sanguíneo periférico, observa-se drástica supressão na expressão de fator de
crescimento endotelial (VEGF), coincidentemente com o aumento de Endotelina 1,
Angiotensina II e PGF2α luteal, dando início a uma severa vasoconstrição, reduzindo
o suprimento sanguíneo, acelerando a cascata luteolítica.
Contudo, há também alguns estudos demonstrando diferenças pontuais na
resposta luteolítica após o uso dos referidos fármacos, como o de Stevenson e Phatak
(2010) [7], que observaram que a administração de 25 mg de dinoprost foi mais
eficiente que 500 µg de cloprostenol em reduzir a concentração de progesterona em
vacas leiteiras submetidas a programa de inseminação artificial em tempo fixo. No
entanto, esse efeito não influenciou a taxa de concepção aos 30-36 dias, que foi igual
entre os dois tratamentos.
 45

Na análise microscópica das células luteínicas grandes e pequenas ocorrida no

presente estudo, pode-se verificar algumas diferenças entre estes tipos celulares e as
respostas aos tratamentos impostos. Com relação à área das células luteínicas, nas
grandes observou-se melhor resposta luteolítica (menor área) quando 100% do
cloprostenol sódico foi utilizado no diestro. Já nas pequenas, a melhor resposta foi
obtida com ambos fármacos, independente da dose, quando administrada também no
diestro. Quanto à imunolocalização da caspase-3, maior quantidade de células
luteínicas grandes imunomarcadas foram observadas quando 50% da dose foi
administrada, independente do fármaco. Nas células pequenas, o melhor resultado
(maior número de células imunomarcadas) foi alcançado quando 100% de dinoprost
trometamina foi administrado no diestro. Korzekwa et al. (2014) [35] avaliaram a
influência de análogos de PGF2α, incluindo cloprostenol e dinoprost, sobre células
luteais bovinas e na contratilidade da artéria ovariana in vitro. Os pesquisadores
observaram que o cloprostenol foi mais eficaz em reduzir a função secretora de
progesterona, a viabilidade celular, além de aumentar a fragmentação de DNA no
núcleo celular, enquanto que o dinoprost exerceu efeito semelhante à PGF2α natural
para esses parâmetros avaliados. Com relação a contratilidade da artéria uterina, os
ativos apresentaram efeito semelhante. Os dados observados pelos autores citados,
em conjunto com o que foi observado no presente trabalho, demostram que os ativos
podem agir de maneira diferente, sem, no entanto, haver diferença na indução de
luteólise.
Com relação à atividade da enzima caspase-3, altamente relacionada ao
processo de apoptose, Korzekwa et al. (2014) [35] demonstraram que cloprostenol
sódico e dinoprost trometamina induziram de maneira semelhante a atividade dessa
enzima em células luteais bovinas cultivadas in vitro. Resultado semelhante foi
observado no experimento 2 deste trabalho, no qual não foram demonstradas
diferenças no número de células luteais grandes e pequenas imunomarcadas para
caspase-3 após o uso dos dois agentes luteolíticos. Com relação ao uso de doses
reduzidas de PGF2α na indução de luteólise, no presente trabalho demonstrou-se que
a utilização de 50% da dose foi mais eficiente em induzir a atividade da caspase-3 em
células luteais grandes em comparação ao uso de 100% da dose. Esse fato indica
que o uso de 50% da dose de PGF2α pode ser uma alternativa eficaz na indução de
luteólise, uma vez que segundo Stocco et al. (2007) [36], células luteais grandes
produzem entre 2 e 40 vezes mais progesterona que células luteais pequenas.

5. CONCLUSÕES
A principal diferença observada após a administração de cloprostenol sódico e
dinoprost trometamina ocorreu no efeito exercido pelos ativos sobre as células luteais
grandes e pequenas. As dimensões luteais, a vascularização do CL e os níveis séricos
de progesterona foram afetados de maneira semelhante após a administração dos
ativos avaliados. A administração dos agentes luteolíticos em D4 (metaestro) foi capaz
 46

de induzir ao menos luteólise parcial, demonstrada pela diminuição da concentração

sérica de progesterona, redução da área de células luteais, indução da atividade da
caspase-3, além de redução numérica nas dimensões luteais (ultrassonografia) e na
vascularização do CL. Já a administração no D11 (diestro) foi eficiente em induzir
luteólise completa, provocando redução da concentração de progesterona, das
dimensões (ultrassonografia e morfometria) e da vascularização luteais, além de
indução da atividade de caspase-3. Demonstrou-se também a capacidade luteolítica
do uso de 50% da dose de cloprostenol sódico e de dinoprost trometamina, quando
administradas no diestro (D11).

Agradecimentos
Os autores agradecem à Ourofino Saúde Animal por todo o auxílio
disponibilizado durante o desenvolvimento do trabalho.

Conflito de interesses
Os autores declaram não haver conflito de interesses.

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 50

7. APÊNDICE

ANEXO I - ESCORES DE VASCULARIZAÇÃO CENTRAL E PERIFÉRICA DO CL

Durante as avaliações realizadas não foram observados CLs com escore 4 para
vascularização periférica e escores 3 e 4 para vascularização central.

A B C

D E F

Imagens ilustrativas de CLs apresentando diferentes escores de vascularização

central e periférica: A - vascularização central escore 0 e vascularização periférica
escore 0; B - vascularização central escore 0 e vascularização periférica escore 1; C
- vascularização central escore 1 e vascularização periférica escore 1; D -
vascularização central escore 1 e vascularização periférica escore 2; E -
vascularização central escore 2 e vascularização periférica escore 2; F -
vascularização central escore 2 e vascularização periférica escore 3.
 51

ANEXO II – AVALIAÇÃO DE CÉLULAS IMUNOMARCADAS

Imagens ilustrativas demonstrando exemplos de células luteais com imunomarcação

positiva (ponta das setas amarelas) e negativa (ponta das setas brancas) para
caspase-3.