ChIP-seq
ChIP-seq, ou imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento, é uma técnica usada para investigar de forma ampla proteínas de ligação ao DNA, modificações de histonas ou nucleossomos [1]. Este método permite identificar locais de ligação proteína-DNA in vivo em escala genômica [2]. Ao combinar o ChIP com o sequenciamento de DNA de alto rendimento, identificam-se os sítios de ligação das proteínas associadas à cromatina, fornecendo informações sobre a regulação da transcrição gênica em células eucarióticas [3] e definindo regulons bacterianos [2].
ChIP-seq tornou-se o principal método para investigar os efeitos dos fatores de transcrição em todo o genoma[4]. É comumente combinado com análise de microarranjos (ChIP) ou sequenciamento de nova geração para traçar a distribuição das proteínas de ligação ao DNA em todo o genoma [5]. A técnica, quando combinada com microarranjos e sequenciamento de segunda geração, é fundamental para responder perguntas sobre os sítios de ligação de proteínas ao longo do genoma [6].
Usos
[editar | editar código-fonte]O principal uso de ChIP-seq é investigar o efeito de fatores de transcrição e outras proteínas de ligação ao DNA para um dado fenótipo. [7] Determinar como as proteínas se ligam ao DNA e como suas estruturas regulam a expressão do gene é essencial para a plena compreensão de muitos processos biológicos e estados de doença. Estas informações epigenéticas são complementares para o genótipo e análise de expressão por sequencimanento de RNA. ChIP-seq é uma alternativa para ChIP-chip, que requer uma matriz de hibridação e necessariamente introduz um viés, pois uma matriz é restrito a um número fixo de sondas.
Sítios específicos de DNA em interação física direta com fatores de transcrição e outras proteínas podem ser isoladas por imunoprecipitação da cromatina. Através de ChIP é produzida uma biblioteca de sítios de DNA alvo ligados a uma proteína de interesse in vivo. Análises do sequenciamento massivamente paralelo são utilizadas em conjunto com bases de dados de genomas completos para analisar o padrão de interação de qualquer proteína com o DNA, [8] ou o padrão de qualquer modificação epigenética da cromatina. Isso pode ser aplicado para o conjunto "ChIP'ável" de proteínas e modificações, tais como fatores de transcrição, polimerases e maquinário de transcrição, proteínas estruturais, modificações proteicas, e de modificações do DNA.[9]
Metodologia
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Imunoprecipitação cromatina (ChIP)
[editar | editar código-fonte]A imunoprecipitação por cromatina é um método utilizado para a acumulação específica de sequências de DNA curtas associadas à proteína de interesse em células vivas células vivas.[10] Um procedimento típico inclui as seguintes etapas:
- Formação de ligações cruzadas reversíveis entre DNA e proteínas interagindo com ele;
- Isolamento de DNA e clivagem em fragmentos por ultra-sonografia ou endonucleases;
- Precipitação por anticorpos específicos contra a proteína de interesse;
- Destruição de ligações cruzadas entre proteína e DNA, purificação de DNA.
Como resultado, é possível identificar especificamente os fragmentos de DNA com os quais a proteína em estudo estava ligada.
Essa técnica tem várias limitações. Portanto, geralmente para a ChIP, é necessário um número significativo de células (cerca de 10 milhões), o que dificulta a utilização desse método em organismos modelo pequenos e também limita o número de experimentos que podem ser realizados com uma amostra valiosa. Um número de métodos foi desenvolvido para superar esta limitação, por exemplo Nano-ChIP-seq [11]
Referências
[editar | editar código-fonte]- ↑ Park, Peter J. (outubro de 2009). «ChIP–seq: advantages and challenges of a maturing technology». Nature Reviews Genetics (em inglês) (10): 669–680. ISSN 1471-0056. PMC PMC3191340
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- ↑ Joshi, Anagha; Hannah, Rebecca; Diamanti, Evangelia; Göttgens, Berthold (abril de 2013). «Gene set control analysis predicts hematopoietic control mechanisms from genome-wide transcription factor binding data». Experimental Hematology (4): 354–366.e14. ISSN 0301-472X. PMC PMC3630327 Verifique
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- ↑ Aleksic, Jelena; Russell, Steven (12 de novembro de 2009). «ChIPing away at the genome: the new frontier travel guide». Molecular BioSystems (em inglês) (12): 1421–1428. ISSN 1742-2051. doi:10.1039/B906179G. Consultado em 12 de maio de 2024
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- ↑ Johnson, D. S., A. Mortazavi, R. M. Myers, and B. Wold. “Genome-Wide Mapping of in Vivo Protein-DNA Interactions.” Science 316, no. 5830 (June 8, 2007): 1497–1502. https://doi.org/10.1126/science.1141319.
- ↑ http://www.illumina.com/Documents/products/datasheets/datasheet_chip_sequence.pdf
- ↑ Kaboord, Barbara, and Maria Perr. “Isolation of Proteins and Protein Complexes by Immunoprecipitation.” Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.) 424 (2008): 349–64. https://doi.org/10.1007/978-1-60327-064-9_27.
- ↑ Adli, Mazhar, and Bradley E Bernstein. “Whole-Genome Chromatin Profiling from Limited Numbers of Cells Using Nano-ChIP-Seq.” Nature Protocols 6, no. 10 (October 2011): 1656–68. https://doi.org/10.1038/nprot.2011.402.