BAZA GENETICA MOLECULARA A SINDROAMELOR TALASEMICE

Asist. Univ. Dr. Rodica Talmaci

SINDROAMELE TALASEMICE

CANTITATIVE

HEMOGLOBINOPATII

CALITATIVE

HEMOGLOBINE ANORMALE

CE SUNT SINDROAMELE TALASEMICE ?

Talasemiile reprezinta un grup de boli genetice, caracterizate prin scaderea cantitatii de hemoglobina. Sediul hemoglobinei se afla in eritrocite. Daca hemoglobina este scazuta eritrocitele sunt mai mici si mai goale. Este ceea ce se numeste anemie hipocroma si microcitara.

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/chr11.html

BAZA GENETICA MOLECULARA A TALASEMIEI

Molecula integrala de hemoglobina este un tetramer 22.
Lanturile polipeptidice -globinice sunt sintetizate de gena -globinica (11p15).

Clusterul de gene -globinice

Lanturile polipeptidice -globinice sintetizate de genele -globinice (16p13).

sunt

Clusterul de gene -globinice

Reprezentarea schematic a genelor globinice

Mutatii produse in aceste gene determina aparitia talasemiilor. In prezent, in gena -globinei, se cunosc aproape 300 de mutaii ce determina transformarea in gene talasemice.

CLASIFICAREA GENETICA A TALASEMIILOR

IN FUNCTIE DE GENA AFECTATA:
1. .-TALASEMIE 2. .-TALASEMIE 3. .-TALASEMIE 4. .-TALASEMIE

CE ESTE -TALASEMIA ?
DEFECTE GENETICE IN GENELE -GLOBINICE PRODUC -TALASEMIA

Cromozomii 11

MUTATII CE DETERMINA - TALASEMIA

CONTROL GENEI -GLOBINEI

MUTATII IN PROMOTORUL GENEI -GLOBINA

CCACACCC -108 CCTCACCC -93 -76 CCAAT

ATAAAA -31

-globina

T G

G G C G

EROARE DE SPLICING IN GENA GLOBINEI: IVS I -110 situs acceptor nou

ADN ARNm
IVS1 +110 G>A

ADN
ARNm

MANIFESTARILE FENOTIPICE (CLINICE) IN -TALASEMIE

FORMELE HETEROZIGOTE DE TALASEMIE: Talasemia minima/silentioasa ++/ N Talasemia minora +/N sau 0/N FORMELE HOMOZIGOTE DE TALASEMIE: Talasemia intermediara +/+ sau 0/+ Talasemia major 0/0

Cariotip normal, 46, XY

Heterozigot

Heterozigot compus = Dublu heterozigot

Homozigot

Daca ambii parinti sunt purtatori de gena -globinica defecta exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa se nasca un copil cu talasemie majora sau anemie Cooley.

Exista o variabilitate foarte mare in ceea ce inseamna severitatea acestor boli talasemice, astfel delimitarea intre TALASEMIA MAJORA si TALASEMIA INTERMEDIA poate creea confuzie. De aceea, in acest caz este absolut necesara investigarea prin metode de genetica moleculara.

Fenotip -talasemie majora

CE ESTE -TALASEMIA ?
DEFECTE GENETICE IN GENELE -GLOBINICE PRODUC -TALASEMIA

Cromozomii 16

Daca o persoana are o singura gena -globinica defecta (din cele patru), aceasta nu va avea nici un fel de manifestare clinica. Aceasta situatie se numeste conditie de purtator silentios de -talasemie. Diagnosticul este pus numai prin teste genetice si este mai curand un diagnostic deductiv la o persoana aparent sanatoasa care are un copil cu -talasemie. Daca persoana are doua gene -globinice defecte, atunci diagnosticul va fi de -talasemie minora. De regula, nu exista manifestari clinice, iar in hemograma aceasta va avea o anemie usoara hipocroma microcitara. De obicei, pacientul este gresit diagnosticat cu anemie prin lipsa de fier. Diagnosticul corect implica mai multa experienta din partea hematologului, deoarece inclusiv electroforeza de hemoglobina este normala. Genele alfa defecte pot fi situate pe acelasi cromozom (pozitie cis) sau pe fiecare cromozom din pereche (pozitie trans). Daca un parinte are -talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (situate pe acelasi cromozom), iar celalat parinte are conditia de purtator silentios (o singura gena este defecta), exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa se nasca un copil cu trei gene -talasemice defecte, adica boala Hb H. Daca ambii parinti au -talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (pe acelasi cromozom) exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa apara -talasemia majora, in care toate genele -globinice sunt defecte, adica Hemoglobina Bart Hidrops Fetalis si produsul de conceptie nu este viabil si va muri in uter.

Daca ambii parinti au -talasemie minora cu genele defecte in pozitie trans (pe cromozomi diferiti) copiii lor vor mosteni talasemie minora.

Daca un parinte are -talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (situate pe acelasi cromozom), iar celalat parinte are conditia de purtator silentios (o singura gena este defecta), exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa se nasca un copil cu trei gene -talasemice defecte, adica boala Hb H.

Daca ambii parinti au -talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (pe acelasi cromozom) exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa apara talasemia majora, in care toate genele -globinice sunt defecte, adica Hemoglobina Bart - Hidrops Fetalis si produsul de conceptie nu este viabil si va muri in uter.

VARIANTE TALASEMICE
-TALASEMIA Conditia de -talasemie rezulta prin reducerea sintezei lanturilor - si -globinice si se caracterizeaza printr-o cantitate crescuta de Hb F, un nivel de Hb A2 normal sau scazut si un indice MCV scazut. Gena -globina, ce controleaza productia de lanturi - este localizata foarte aproape de gena - pe cromozomul 11. Daca o gena este indepartata din cromozom in urma unei deletii, atunci si cealalta gena poate fi afectata. In functie de deletia produsa in cromozomi, se pot distinge: Macedonia Sicilia Lepore -talasemia homozigota este similara cu -talasemia, dar simptomele sunt mai usoare. Majoritatea pacientilor supravietuiesc pana la viata adulta cu necesitati minime de transfuzie. -talasemia heterozigota este similara cu -talasemia minora, dar simptomele tind sa fie mai putin severe.

Hemoglobina LEPORE este un amestec in productia de lanturi non-. Capatul N-terminal al proteinei contine secventa aminoacidica a lantului -globinic, iar capatul C-terminal contine secventa aminoacidica a lantului globinic. Exista mai multe variante de Hb Lepore, in functie de lungimea segmentelor fuzionate: Washington, Hollandia, Baltimore. In Hb Lepore homozigota nu exista productie normala de lanturi -globinice sau -globinice. Aspectele clinice si hemograma sunt identice cu cele de -talasemie majora In Hb Lepore heterozigota aspectele clinice si de laborator sunt identice cu cele de -talasemie minora

DIAGNOSTICUL MOLECULAR IN TALASEMII

PRINCIPALII INDICI HEMATOLOGICI IN TALASEMIA HETEROZIGOTA

TESTELE DE GENETICA MOLECULARA IN TALASEMIE

STRATEGIA DE INVESTIGARE A MUTATIILOR TALASEMICE se refera la cautarea modificarilor produse in genele globinice normale ce au dus la transformarea lor in gene talasemice. -talasemiile si -talasemiile sunt consecinta unor deletii ale genelor globinice, in timp ce -talasemiile sunt produse ca rezultat al mutatiilor punctiforme aparute in ADN la nivelul acestor gene -globinice. In scopul identificarii mutatiilor -talasemice se procedeaza la urmatoarea etape:

Recoltarea de sange periferic extractie ADN din sange amplificare prin PCR a genelor de investigat
Prin metode de biologie moleculara se realizeaza identificarea mutatiilor produse la nivelul genelor de interes. Aceste metode ne indica exact mutatia produsa in gena studiata, fiind si metode de verificare, absolut necesare intr-un diagnostic molecular.

SINDROAMELE TALASEMICE

-talasemie -talasemie

-globina -globina

-talasemie
-talasemie -talasemie

-globina
-,-globina
-,-,-globina

SCHEMA DE REALIZARE A DIAGNOSTICULUI MOLECULAR

celula nucleata

EXTRACTIE ADN

ADN genomic

gena de interes

PCR cu primeri specifici DETECTIE prin electroforeza in gel de agaroza

>106 copii

EXTRACTIE ADN
ETAPE: 1. Liza celulara 2. Liza nucleara 3. Deproteinizare 4. Precipitare ADN 5. Purificare ADN 6. Obtinere ADN genomic concentrat inalt purificat

PRINCIPIUL PCR (Polymerase Chain Reaction)

Replicarea ADN semiconservativa

Principul PCR: Sinteza unei regiuni ADN prin refacerea structurii dublu catenare pe baza complementaritatii nucleotidelor: A (adenina) T (timina) G (guanina) C (citozina)

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT PCR

ADN genomic

gena de interes

3 ETAPE:

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT PCR

ADN genomic

gena de interes

3 ETAPE: 1. Denaturare 90-95oC 1 min

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

REACTIA DE POLIMERIZARE IN LANT PCR

ADN genomic

gena de interes

3 ETAPE: 1. Denaturare 90-95oC 1 min

20-30 cicluri

2. Alinierea primerilor 55-65oC - 0,5 min 3. Polimerizare 72oC 2 min

Amestec de reactie PCR:

ADN (template) Amestec tampon PCR: Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, MgCl2 Primer F (forward) - secventa scurta de ADN care se imperecheaza cu o portiune complementara dintr-o catena ADN si formeaza un capat 3-OH liber la care se ataseaza ADN-polimeraza si incepe sinteza unui lant ADN nou Primer R (reverse) Nucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) ADN polimeraza (Taq DNA polynerase)

AMPLIFICAREA EXPONENTIALA

DETECTIE PRIN ELECTROFOREZA IN GEL DE AGAROZA

VERIFICAREA IN GEL DE AGAROZA A FRAGMENTELOR DE ADN AMPLIFICATE

GENA -GLOBINA

METODE DE IDENTIFICARE A MUTATIILOR -TALASEMICE

ELECTROFOREZA IN GEL CU GRADIENT DE DENATURARE (DGGE) AMPLIFICARE SPECIFICA A ALELELOR MUTANTE (ARMS-PCR) ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICTIE IN FRAGMENTE DE AMPLIFICARE PCR (PCR-RFLP) Amplificarea fragmentelor genice -globinice urmata de restrictie enzimatica

Amplificare seriata a fragmentelor -globinice: Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV

Electroforeza fragmentelor F, I, II, III, IV in gel de poliacrilamida

Electroforeza in gel de agaroza

Electroforeza in gel de agaroza

METODE DE IDENTIFICARE A MUTAIILOR -TALASEMICE

ELECTROFOREZA N GEL CU GRADIENT DE DENATURARE (DGGE) Amplificare seriat a fragmentelor -globinice: Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV AMPLIFICARE SPECIFIC A ALELELOR MUTANTE (ARMS-PCR) ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICIE N FRAGMENTE DE AMPLIFICARE PCR (PCR-RFLP) Amplificarea fragmentelor genice -globinice urmat de restricie enzimatic

Electroforeza fragmentelor F, I, II, III, IV n gel de poliacrilamid cu gradient de denaturare

Electroforeza n gel de agaroz

Electroforeza n gel de agaroz

ELECTROFOREZA N GEL CU GRADIENT DENATURANT (DGGE)

Se arealizeaza scanarea intreagii gene -globinice pentru a identificarea mutatiilor.

Intr-o prima etapa se amplifica seriat 5 fragmente ce compun intreaga gena -globinica

In urmatoarea etapa se realizeaza electroforeza fragmentelor amplificate in DGGE.

In functie de modelul electroforetic obtinut avem informatia despre prezenta sau absenta unei mutatii in fragmentul analizat si locul genic al mutatiei. Daca utilizam probe control, prin compararea modelelor electroforetice, obtinem informatia privind mutatia exacta.

DGGE
Gena -globinei a fost mprit n 5 fragmente diferite (Fr. F, Fr. I, Fr. II, Fr. III, Fr. IV), ce acoper ntreaga regiunea de codificare i secveele de flancare 5' i 3'.
350 pb

Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunile negre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5 UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3

Cele mai frecvente mutaii identificate n fragmentul F: Mutatia 87 (C-G) - ++ Polimorfismul +20 (C-T) lincat cu mutaia IVS II-745 (C-G) - + Polimorfismul cd2 (C-T) Fr. F Fr. F

cd 2/N -87/N

N/N +20/N

N/N +20/N +20/+20 cd2/N -101/N N/N

N/N -87/N

N/N

cd 2/N -87/N N/N cd2/N +20/N N/N

N/N -101/N N/N cd2/N cd2/N cd2/N cd2/cd2 N/N

DGGE
250 pb

Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunile negre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5 UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3.

Cele mai frecvente mutaii identificate in fragmentul I: cd 6 (-A) - 0 Polimorfismul +20 (C-T) lincat cu mutaia IVS II-745 (C-G) - + Polimorfismul cd 2 (C-T)
Fr.I

Fr. I
N/N +20/+20 cd 6/N N/N +20/N N/N + 20/N N/N cd 2/N N/N cd 5/N

+20/+20 +20/N cd 2/N cd2/N

N/N

cd2/N cd6/N

DGGE

370 pb

Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunile negre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5 UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3

Cele mai frecvente mutatii identificate infragmentul II: IVS I-1 (G-A) - 0 IVS I-6 (T-C) - + IVS I-110 (G-A) - + cd 39 (C-T) - + Fr. II

Fr. II
Cd 39/N N/N cd 39/N N/N IVS I-1/N IVS I-1/N

Fr. II

IVS I-110/N N/N

IVS I-110/ cd39/N IVS I-110/N IVS I-6/N cd 39/N IVS I-110 IVS I-110/N N/N N/N cd 39/N N/N IVS I-110/N

DGGE
420 pb

300 pb

Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunile negre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5 UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3.

Cele mai frecvente mutatii produse in fragmnetul IV: mutaia n semnalul de poliadenilare (AATAAA-AATGAA) - + mutatia +1480 (C-G) - + Fr. IV

Poli A cd+6/N (+1480)

poli A

METODE DE ANALIZ A MUTAIILOR -TALASEMICE

ELECTROFOREZA N GEL CU GRADIENT DE DENATURARE (DGGE) Amplificare seriat a fragmentelor -globinice: Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV AMPLIFICAREA SELECTIV A ALELELOR MUTANTE (ARMS-PCR) ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICIE N FRAGMENTE DE AMPLIFICARE PCR (PCR-RFLP) Amplificarea fragmentelor genice -globinice urmat de restricie enzimatic

Electroforeza fragmentelor F, I, II, III, IV n gel de poliacrilamid cu gradient de denaturare

Electroforeza n gel de agaroz

Electroforeza n gel de agaroz

AMPLIFICAREA SELECTIV A ALELELOR SPECIFICE

Metoda se aplica pentru identificarea mutaiilor punctiforme cunoscute. In amplificarea PCR se utilizeaza un primer care prezinta aceeasi secventa de nucleotide cu ADN matrita, cu exceptia nucleotidului terminal 3. Acesta este complementar cu nucleotidul modificat prin mutatie. Taq-polimeraza necesita o complementaritate perfecta a primerului la capatul 3' pentru a putea realiza polimerizarea. Astfel, alela dorita este intens amplificata. In cazul neamplificarii rezultatul este nepotrivirea dintre ADN matrita si oligonucleotidul primer. Pentru a confirma aceasta conditie, in amestecul de reactie se introduc 2 primeri control care amplifica un fragment de alta dimensiune.

Mutatia IVS I-110 (G-A)

Banda control de 861 pb Banda specific mutaiei IVS I110 de 390 pb

METODE DE ANALIZ A MUTAIILOR -TALASEMICE

ELECTROFOREZA N GEL CU GRADIENT DE DENATURARE (DGGE) Amplificare seriat a fragmentelor -globinice: Fr.F, Fr.I, Fr.II, Fr.III, Fr.IV AMPLIFICAREA SELECTIV A ALELELOR MUTANTE (ARMS-PCR) ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICIE N FRAGMENTE DE AMPLIFICARE PCR (PCR-RFLP) Amplificarea fragmentelor genice -globinice urmat de restricie enzimatic

Electroforeza fragmentelor F, I, II, III, IV n gel de poliacrilamid cu gradient de denaturare

Electroforeza n gel de agaroz

Electroforeza n gel de agaroz

ENZIME DE RESTICTIE

EcoRI (Escherichia coli)

ANALIZA SITUSULUI DE RESTRICIE PRIN METODA PCR - RFLP

Unele mutaii punctiforme pot crea sau desfiina un situs de restricie n secvena ADN. Aceste mutatii pot fi identificate prin analiza situsului de restricie. Prin stabilirea polimorfismului lungimii fragmentelor de restrictie ne dam seama daca s-a produs mutatia cautata.

SECVENTIEREA ADN
Metoda prin care se poate afla secventa in baze azotate a unui fragment ADN de interes

PARAMERII HEMATOLOGICI PRINCIPALI LA PURTATORII DE SI -TALASEMIE

IDENTIFICAREA DELEIILOR - Si TALASEMICE GENICE GLOBINICE PRIN METODA GAP-PCR

Metoda GAP-PCR se aplica in identificarea deletiilor genice mari. Metoda se bazeaza pe tehnica de amplificare PCR cu 3 primeri specifici pentru fiecare deletie. Acestia sunt utilizati in aceeasi reactie de amplificare, conducand la amplificarea unui singur produs specific deletiei si o banda control, de marime diferita, corespunzatoare alelei normale.

deleia Macedonia (11,5 kb) -talasemia

MED-I/ MED-I/ 20,5/ MED-I/ 20,5/

0 MED-I (17,5 kb) / +(3.7 kb) = Boala Hb H

-talasemia

STUDIUL TALASEMIEI IN ROMANIA

SPECTRUL MUTATIILOR -TALASEMICE IDENTIFICATE IN ROMANIA

-talasemia
MED/N 3.7/N 0 MED-I (17,5 kb) / +(3.7 kb) = Boala Hb H /N

-talasemia
deleia Macedonia (11,5 kb) deleia Lepore

O NOUA MUTATIE IN SITUSUL CAP AL GENEI -GLOBINEI - MUTATIA CAP+3 (A-T)

TESTAREA PRENATALA PENTRU TALASEMIE

Pentru cuplurile la care diagnosticul de talasemie minora a fost pus la ambii parinti, dupa ce partenera a ramas insarcinata, se recomanda efectuarea testelor de genetica moleculara la fat pentru a identifica prezenta mutatiilor talasemice.
ADNul extras din lichid amniotic sau vilozitati coriale este analizat prin metodele moleculare pentru identificare i caracterizare de mutaii -talasemice prezente n genotip. Prin aceste metode se stabileste diagnosticul de homozigot (bolnav) sau heterozigot (purtator) al talasemiei, se identifica mutatia exacta prezenta la fat si se anticipeaza fenotipul sau. Probele de material fetal se obtin prin AMNIOCENTEZA sau prelevare de probe din VILOZITATILE CORIALE. Ambele pot fi efectuate numai in centre specializate sub control ecografic. Amniocenteza se efectueaza dupa saptamana a 15-a de sarcina prin recoltarea de 10-15 ml de lichid amniotic. Biopsia din vilozitatile coriale se poate efectua in saptamana 10-12 de sarcina prin recoltare de fragmente foarte mici de tesut cu origine fetala.

ANALIZA ADN

PRIMUL CAZ
SCANAREA GENICA PENTRU IDENTIFICARE DE MUTATII
250 pb

370 pb

Fragmente de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza in gel cu gradient denaturant.

Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza in gel cu gradient denaturant.

Allela IVS I-110 Allela IVS II-745 Alela Normala

Alela Normala

Pattern-uri DGGE in fragmentul I. 1-ADN mama (N), 2-ADN tata (pozitiv), 3ADN bunic (pozitiv), 4-ADN fetal pozitiv pentru mutatia IVS II-745 (C-G), 5-ADN bunica (N).

Pattern-uri DGGE in fragmentul II. 1-ADN bunica (N), 2, 3-ADN fetal pozitiv pentru mutatia IVS I-110 (G-A), 4-ADN mama (pozitiv), 5-ADN control negativ.

REZULTATE

GENOTIP
FETUS MAMA TATAL BUNICUL PATERN BUNICA PATERNA Homozigot IVS I-110 (G-A) / IVS II-745 (C-G) heterozigot IVS I-110 (GA) / N heterozigot (C-G) / N heterozigot (C-G) / N Normal IVS IVS II-745 II-745

FENOTIP
.+/ + .+/ A .+/ A .+/ A .A/ A

AL DOILEA CAZ
SCANAREA GENICA PENTRU IDENTIFICARE DE MUTATII
250 pb

Pattern-uri DGGE in fragmentul I.

1-ADN control negativ, 2-ADN fetal din proba de lichid amniotic (pozitivcontaminare), 3-ADN control pozitiv pentru polimorfism cd 2 in stare heterozigota,

Fragmente de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza in gel cu gradient denaturant.

4-ADN mama (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA + polimorfism cd 2 in trans), 5-ADN fetal din proba CVS, pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare homozigota, 6-ADN tata (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare heterozigota, 7-ADN control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare heterozigota, 8-AND control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare homozigota.
Alela normala

Alela patologica cd 8 (-AA)

REZULTATE

GENOTIP
FETUS Homozigot cd 8 (-AA) / cd 8 (-AA)

FENOTIP
.0/ 0

MAMA TATA

heterozigot cd 8 (-AA)/ N heterozigot cd 8 (-AA)/ N

.0/ A .0/ A

RESULTS

GENOTYPE
FETUS MOTHER FATHER FETUS MOTHER FATHER FETUS MOTHER FATHER Homozygot IVS I-110 (G-A) / IVS II-745 (C-G) heterozygot IVS I-110 (G-A) / N heterozygot IVS II-745 (C-G) / N Homozygot CD 8 (-AA) / CD 8 (-AA) heterozygot CD 8 (-AA)/N heterozygot CD 8 (-AA)/N Homozygot IVS I-110 (G-A) / IVS II-745 (C-G) Heterozygot IVS II-745 (C-G) / N Heterozygot IVS I-110 (G-A) / N

PHENOTYPE
.+/ + .+/ A .+/ A .0/0 .0/A .0/A .+/ 0 .+/ A .0/ A