Genetica Talasemii
Genetica Talasemii
Genetica Talasemii
SINDROAMELE TALASEMICE
CANTITATIVE
HEMOGLOBINOPATII
CALITATIVE
HEMOGLOBINE ANORMALE
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/chr11.html
sunt
Mutatii produse in aceste gene determina aparitia talasemiilor. In prezent, in gena -globinei, se cunosc aproape 300 de mutaii ce determina transformarea in gene talasemice.
CE ESTE -TALASEMIA ?
DEFECTE GENETICE IN GENELE -GLOBINICE PRODUC -TALASEMIA
Cromozomii 11
ATAAAA -31
-globina
T G
G G C G
ADN
ARNm
Heterozigot
Homozigot
Daca ambii parinti sunt purtatori de gena -globinica defecta exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa se nasca un copil cu talasemie majora sau anemie Cooley.
Exista o variabilitate foarte mare in ceea ce inseamna severitatea acestor boli talasemice, astfel delimitarea intre TALASEMIA MAJORA si TALASEMIA INTERMEDIA poate creea confuzie. De aceea, in acest caz este absolut necesara investigarea prin metode de genetica moleculara.
CE ESTE -TALASEMIA ?
DEFECTE GENETICE IN GENELE -GLOBINICE PRODUC -TALASEMIA
Cromozomii 16
Daca o persoana are o singura gena -globinica defecta (din cele patru), aceasta nu va avea nici un fel de manifestare clinica. Aceasta situatie se numeste conditie de purtator silentios de -talasemie. Diagnosticul este pus numai prin teste genetice si este mai curand un diagnostic deductiv la o persoana aparent sanatoasa care are un copil cu -talasemie. Daca persoana are doua gene -globinice defecte, atunci diagnosticul va fi de -talasemie minora. De regula, nu exista manifestari clinice, iar in hemograma aceasta va avea o anemie usoara hipocroma microcitara. De obicei, pacientul este gresit diagnosticat cu anemie prin lipsa de fier. Diagnosticul corect implica mai multa experienta din partea hematologului, deoarece inclusiv electroforeza de hemoglobina este normala. Genele alfa defecte pot fi situate pe acelasi cromozom (pozitie cis) sau pe fiecare cromozom din pereche (pozitie trans). Daca un parinte are -talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (situate pe acelasi cromozom), iar celalat parinte are conditia de purtator silentios (o singura gena este defecta), exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa se nasca un copil cu trei gene -talasemice defecte, adica boala Hb H. Daca ambii parinti au -talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (pe acelasi cromozom) exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa apara -talasemia majora, in care toate genele -globinice sunt defecte, adica Hemoglobina Bart Hidrops Fetalis si produsul de conceptie nu este viabil si va muri in uter.
Daca ambii parinti au -talasemie minora cu genele defecte in pozitie trans (pe cromozomi diferiti) copiii lor vor mosteni talasemie minora.
Daca un parinte are -talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (situate pe acelasi cromozom), iar celalat parinte are conditia de purtator silentios (o singura gena este defecta), exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa se nasca un copil cu trei gene -talasemice defecte, adica boala Hb H.
Daca ambii parinti au -talasemie minora cu genele defecte in pozitie cis (pe acelasi cromozom) exista riscul de 25% ca la fiecare sarcina sa apara talasemia majora, in care toate genele -globinice sunt defecte, adica Hemoglobina Bart - Hidrops Fetalis si produsul de conceptie nu este viabil si va muri in uter.
VARIANTE TALASEMICE
-TALASEMIA Conditia de -talasemie rezulta prin reducerea sintezei lanturilor - si -globinice si se caracterizeaza printr-o cantitate crescuta de Hb F, un nivel de Hb A2 normal sau scazut si un indice MCV scazut. Gena -globina, ce controleaza productia de lanturi - este localizata foarte aproape de gena - pe cromozomul 11. Daca o gena este indepartata din cromozom in urma unei deletii, atunci si cealalta gena poate fi afectata. In functie de deletia produsa in cromozomi, se pot distinge: Macedonia Sicilia Lepore -talasemia homozigota este similara cu -talasemia, dar simptomele sunt mai usoare. Majoritatea pacientilor supravietuiesc pana la viata adulta cu necesitati minime de transfuzie. -talasemia heterozigota este similara cu -talasemia minora, dar simptomele tind sa fie mai putin severe.
Hemoglobina LEPORE este un amestec in productia de lanturi non-. Capatul N-terminal al proteinei contine secventa aminoacidica a lantului -globinic, iar capatul C-terminal contine secventa aminoacidica a lantului globinic. Exista mai multe variante de Hb Lepore, in functie de lungimea segmentelor fuzionate: Washington, Hollandia, Baltimore. In Hb Lepore homozigota nu exista productie normala de lanturi -globinice sau -globinice. Aspectele clinice si hemograma sunt identice cu cele de -talasemie majora In Hb Lepore heterozigota aspectele clinice si de laborator sunt identice cu cele de -talasemie minora
Recoltarea de sange periferic extractie ADN din sange amplificare prin PCR a genelor de investigat
Prin metode de biologie moleculara se realizeaza identificarea mutatiilor produse la nivelul genelor de interes. Aceste metode ne indica exact mutatia produsa in gena studiata, fiind si metode de verificare, absolut necesare intr-un diagnostic molecular.
SINDROAMELE TALASEMICE
-talasemie -talasemie
-globina -globina
-talasemie
-talasemie -talasemie
-globina
-,-globina
-,-,-globina
EXTRACTIE ADN
ADN genomic
gena de interes
EXTRACTIE ADN
ETAPE: 1. Liza celulara 2. Liza nucleara 3. Deproteinizare 4. Precipitare ADN 5. Purificare ADN 6. Obtinere ADN genomic concentrat inalt purificat
Principul PCR: Sinteza unei regiuni ADN prin refacerea structurii dublu catenare pe baza complementaritatii nucleotidelor: A (adenina) T (timina) G (guanina) C (citozina)
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html
gena de interes
3 ETAPE:
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html
gena de interes
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html
gena de interes
ADN (template) Amestec tampon PCR: Tris-HCl, KCl, (NH4)2SO4, MgCl2 Primer F (forward) - secventa scurta de ADN care se imperecheaza cu o portiune complementara dintr-o catena ADN si formeaza un capat 3-OH liber la care se ataseaza ADN-polimeraza si incepe sinteza unui lant ADN nou Primer R (reverse) Nucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) ADN polimeraza (Taq DNA polynerase)
AMPLIFICAREA EXPONENTIALA
GENA -GLOBINA
Intr-o prima etapa se amplifica seriat 5 fragmente ce compun intreaga gena -globinica
DGGE
Gena -globinei a fost mprit n 5 fragmente diferite (Fr. F, Fr. I, Fr. II, Fr. III, Fr. IV), ce acoper ntreaga regiunea de codificare i secveele de flancare 5' i 3'.
350 pb
Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunile negre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5 UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3
Cele mai frecvente mutaii identificate n fragmentul F: Mutatia 87 (C-G) - ++ Polimorfismul +20 (C-T) lincat cu mutaia IVS II-745 (C-G) - + Polimorfismul cd2 (C-T) Fr. F Fr. F
cd 2/N -87/N
N/N +20/N
N/N -87/N
N/N
DGGE
250 pb
Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunile negre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5 UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3.
Cele mai frecvente mutaii identificate in fragmentul I: cd 6 (-A) - 0 Polimorfismul +20 (C-T) lincat cu mutaia IVS II-745 (C-G) - + Polimorfismul cd 2 (C-T)
Fr.I
Fr. I
N/N +20/+20 cd 6/N N/N +20/N N/N + 20/N N/N cd 2/N N/N cd 5/N
N/N
cd2/N cd6/N
DGGE
370 pb
Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunile negre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5 UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3
Cele mai frecvente mutatii identificate infragmentul II: IVS I-1 (G-A) - 0 IVS I-6 (T-C) - + IVS I-110 (G-A) - + cd 39 (C-T) - + Fr. II
Fr. II
Cd 39/N N/N cd 39/N N/N IVS I-1/N IVS I-1/N
Fr. II
IVS I-110/ cd39/N IVS I-110/N IVS I-6/N cd 39/N IVS I-110 IVS I-110/N N/N N/N cd 39/N N/N IVS I-110/N
DGGE
420 pb
300 pb
Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza n gel cu gradient denaturant. Poriunile negre reprezint exonii, iar poriunile albe intronii. 5 UTR i 3 UTR regiunile netranslate 5 i 3.
Cele mai frecvente mutatii produse in fragmnetul IV: mutaia n semnalul de poliadenilare (AATAAA-AATGAA) - + mutatia +1480 (C-G) - + Fr. IV
poli A
ENZIME DE RESTICTIE
SECVENTIEREA ADN
Metoda prin care se poate afla secventa in baze azotate a unui fragment ADN de interes
-talasemia
-talasemia
MED/N 3.7/N 0 MED-I (17,5 kb) / +(3.7 kb) = Boala Hb H /N
-talasemia
deleia Macedonia (11,5 kb) deleia Lepore
ANALIZA ADN
PRIMUL CAZ
SCANAREA GENICA PENTRU IDENTIFICARE DE MUTATII
250 pb
370 pb
Fragmente de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza in gel cu gradient denaturant.
Fragmentele de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza in gel cu gradient denaturant.
Alela Normala
Pattern-uri DGGE in fragmentul I. 1-ADN mama (N), 2-ADN tata (pozitiv), 3ADN bunic (pozitiv), 4-ADN fetal pozitiv pentru mutatia IVS II-745 (C-G), 5-ADN bunica (N).
Pattern-uri DGGE in fragmentul II. 1-ADN bunica (N), 2, 3-ADN fetal pozitiv pentru mutatia IVS I-110 (G-A), 4-ADN mama (pozitiv), 5-ADN control negativ.
REZULTATE
GENOTIP
FETUS MAMA TATAL BUNICUL PATERN BUNICA PATERNA Homozigot IVS I-110 (G-A) / IVS II-745 (C-G) heterozigot IVS I-110 (GA) / N heterozigot (C-G) / N heterozigot (C-G) / N Normal IVS IVS II-745 II-745
FENOTIP
.+/ + .+/ A .+/ A .+/ A .A/ A
AL DOILEA CAZ
SCANAREA GENICA PENTRU IDENTIFICARE DE MUTATII
250 pb
Fragmente de amplificare din gena -globinei pentru electroforeza in gel cu gradient denaturant.
4-ADN mama (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA + polimorfism cd 2 in trans), 5-ADN fetal din proba CVS, pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare homozigota, 6-ADN tata (pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare heterozigota, 7-ADN control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare heterozigota, 8-AND control pozitiv pentru mutatia cd 8 (-AA) in stare homozigota.
Alela normala
REZULTATE
GENOTIP
FETUS Homozigot cd 8 (-AA) / cd 8 (-AA)
FENOTIP
.0/ 0
MAMA TATA
.0/ A .0/ A
RESULTS
GENOTYPE
FETUS MOTHER FATHER FETUS MOTHER FATHER FETUS MOTHER FATHER Homozygot IVS I-110 (G-A) / IVS II-745 (C-G) heterozygot IVS I-110 (G-A) / N heterozygot IVS II-745 (C-G) / N Homozygot CD 8 (-AA) / CD 8 (-AA) heterozygot CD 8 (-AA)/N heterozygot CD 8 (-AA)/N Homozygot IVS I-110 (G-A) / IVS II-745 (C-G) Heterozygot IVS II-745 (C-G) / N Heterozygot IVS I-110 (G-A) / N
PHENOTYPE
.+/ + .+/ A .+/ A .0/0 .0/A .0/A .+/ 0 .+/ A .0/ A