INGINERIE GENETICĂ

INTRODUCERE

Ingineria genetică, denumită şi modificarea genetică, este

manipularea directă a genomului unui organism utilizând tehnologia ADN
recombinant şi biotehnologia. După izolarea şi copierea materialului
genetic de interes (folosind metodele de clonare moleculară pentru a
genera o secvenţă de ADN), sau după sinteza unei secvenţe de nucleotide
corespunzătoare unei gene de interes, ADN nou poate fi inserat în
genomul organismului gazdă.
Ingineria genetică poate fi realizată şi prin aşa numita “ţintire a
genei”, tehnică ce utilizează recombinarea omoloagă pentru “ştergerea”
unei gene dintr-un organism, pentru a îndepărta exoni, pentru a adăuga o
genă, sau pentru a introduce mutaţii punctiforme.
Indepărtarea unei gene dintr-un organism (knocking out) se poate
realiza şi prin folosirea unei nucleaze. De altfel, “editarea genomului”,
sau “editarea genomului cu nucleaze modificate prin inginerie” este un tip
de inginerie genetică ce permite inserția, înlocuirea sau îndepărtarea de
ADN într-un/dintr-un genom utilizând nucleaze modificate prin inginerie
moleculară, denumite și “foarfece moleculare”. Nucleazele creează ruperi
dublu-catenare în locațiile dorite dintr-un genom și provoacă acțiunea
mecanismelor celulare endogene de reparare a rupturilor induse, prin
procesele naturale de recombinare omoloagă și unirea neomoloagă a
capetelor.
Ingineria genetică implică utilizarea tehnicilor de recombinare a
acizilor nucleici (ADN sau ARN) pentru generarea de combinaţii noi ale
materialului genetic ereditar, urmată de incorporarea lui fie indirect, cu
ajutorul unui vector, fie direct, prin tehnicile de microinjecţie,
macroinjecţie, biolistică, electroporare, etc.
Un organism care a fost generat/produs prin inginerie genetică
este considerat a fi un organism modificat genetic (OMG).

3
 Alexandra Visoiu

Primele organisme modificate genetic au fost bacteriile (în anul

1973). In anul 1974 a fost generat primul şoarece modificat genetic.
Incepând din anul 1982 au fost comercializate bacterii producătoare de
insulină. In anul 1986 au fost realizate simultan în Franţa şi SUA primele
teste în câmp ale unei plante modificate prin inginerie genetică – tutunul
rezistent la erbicide. China a fost prima ţară care a comercializat plante
modificate genetic (transgenice), introducând în anul 1992 o varietate de
tutun rezistent la virusuri. În anul 1994 a începul comercializarea
produselor alimentare modificate genetic, primul astfel de produs fiind
tomatele “Flavr Savr”, conţinând o genă introdusă pentru a inhiba sinteza
etilenei şi în consecinţă pentru a bloca sau întârzia procesul de coacere.
In 1995 a fost aprobată introducerea în cultură (în SUA) a
cartofului Bt, care a devenit prima plantă agricolă/cultivată producătoare
de pesticide.
Tehnicile de inginerie genetică au fost aplicate în numeroase
domenii, incluzând agricultura, biotehnologia industrială, medicina,
protecţia mediului. Enzimele folosite în detergenţii de spălare şi produse
medicale cum sunt insulina şi hormonul uman de creştere sunt produse în
prezent în celule modificate genetic.
Enzimele produse de microorganisme modificate genetic sunt
utilizate în industria alimentară de peste 25 de ani. Exemple bine
cunoscute sunt utilizarea chimozinei pentru producerea brânzeturilor și a
pectinazelor pentru prelucrarea fructelor și producerea băuturilor
alcoolice.
Numărul proteinelor recombinate utilizate pentru cercetarea
academică și în aplicații terapeutice a crescut impresionant. In anul 2007
existau deja aproape 150 de astfel de proteine aprobate pentru utilizare
terapeutică, iar alte peste 500 se aflau în etapa de testare clinică. Este o
certitudine că numărul celor aprobate pentru utilizare terapeutică este în
prezent de ordinul sutelor, iar al celor testate clinic de ordinul miilor. Un
exemplu relevant al avantajelor pe care le prezintă utilizarea proteinelor
recombinate create prin tehnologia ADN recombinat este interferonul.
Producerea lui în celule modificate genetic de E. coli a redus costul de
producție la mai puțin de 10% din cel inițial și a îmbunătățit semnificativ
puritatea produsului.
In ultimele două decenii au fost produse, testate în câmp şi
introduse în cultură numeroase plante modificate genetic, majoritatea
conţinând gene introduse pentru a le asigura toleranţa la erbicide sau
protecţia faţă de atacul unor insecte dăunătoare. In anul 2009 erau

4
 INGINERIE GENETICĂ

cultivate 11 plante transgenice, pe sute de milioane de hectare, în 25 de

state ale lumii.

5
 Alexandra Visoiu

In anul 2015 au fost cultivate 29 plante transgenice (în ordine

alfabetică, Agrostis stolonifera, ardei gras, bumbac, cartof, cicoare,
dovleac, eucalipt, garoafă, grâu, in, lucernă, mazăre, măr, orez, papaya,
pepene verde, petunie, plop, porumb, prun, rapiţa argentiniană, rapiţa
poloneză, sfecla de zahăr, soia, tomate, trandafir, trestia de zahăr, tutun,
vinete) în 29 de state ale lumii.
In medicină, ingineria genetică a fost utilizată pentru a produce în
cantităţi mari insulină, hormonii umani de creştere, folistim (pentru
tratarea infertilităţii), albumină umană, anticorpi monoclonali, factori
antihemofilici, vaccinuri şi numeroase medicamente. Vaccinarea implică
în general injectarea de forme slabe, vii, omorâte sau inactivate ale
virusurilor sau toxinelor lor în persoanele ce trebuie imunizate. In
ultimele decenii au fost create virusuri modificate genetic care conferă
imunitate, dar cărora le lipsesc secvenţele infecţioase. Ingineria genetică
este utilizată pe scară din ce în ce mai largă pentru crearea de anticorpi
monoclonali umani. Recent s-au obţinut rezultate care dau speranţe că
ingineria genetică poate fi utilizată pentru tratarea anumitor forme de
cancer.
Ingineria genetică este utilizată pentru a crea animale model
pentru bolile genetice umane. Şoarecii sunt animalele modificate cel mai
adesea prin inginerie genetică pentru a crea modele pentru astfel de studii.
Ei sunt folosiţi în mod obişnuit pentru studiul cancerului (oncoşoareci),
obezităţii, bolilor de inimă, diabetului, artritei, abuzului de substanţe/
medicamente, anxietăţii, îmbătrânirii, bolii Parkinson, etc. Tratamentele
potenţiale pentru numeroase boli genetice umane sunt studiate pe astfel de
animale model.
Prin inginerie genetică a fost creaţi de asemenea porci modificaţi
genetic pentru creşterea succesului transplantului de organe la om
(xenotransplant).
Ingineria genetică are numeroase aplicaţii industriale. Folosind
tehnicile de inginerie genetică, microorganisme cum sunt bacteriile sau
drojdiile, sau celule din organisme multicelulare cum sunt insectele sau
mamiferele, pot fi transformate cu gene ce codifică sinteza unei proteine
utile, de exemplu o enzimă, pe care acestea o vor supraexprima. Prin
creşterea/cultivarea acestor celule în bioreactoare, folosind tehnicile de
fermentaţie industrială, pot fi produse cantităţi mari de proteină/enzimă.
Unele gene nu sunt exprimate eficient în celulele bacteriene şi de aceea
ele sunt introduse în celule de drojdii, insecte sau mamifere. Este cazul
aplicaţiilor ce au ca scop producerea insulinei, hormonului uman de
creştere, vaccinurilor, triptofanului, etc.

6
 INGINERIE GENETICĂ

Recent a devenit posibilă producerea de molecule complexe prin

reingineria extensivă a “mașinăriei” metabolice a drojdiilor sau
bacteriilor, transformându-le în fabrici chimice în miniatură, capabile să
realizeze o secvență lungă de reacții chimice proiectate cu un scop bine
definit. Aceasta necesită modificarea multor gene într-o singură tulpină.
Un exemplu relevant este tulpina de drojdie modificată prin inginerie
genetică pentru a produce acid artemisinic (compusul cu cea mai rapidă
acțiune dintre toate medicamentele folosite în prezent pentru tratamentul
malariei), care în mod normal este extras din planta Artemisia annua.
Crearea unei tulpini de drojdie care realizează reacțiile adecvate a fost
posibilă prin transferul de la Artemisia annua a genelor pentru patru
enzime metabolice și, de asemenea, prin modificarea altor câteva gene
native ale tulpinii respective de drojdie. Compania farmaceutică Sanofi
utilizează acum această tulpină de drojdie modificată genetic pentru a
produce acidul artemisinic acid pe scară industrială.
Crearea unei drojdii producătoare de opioide prin transferul într-o
aceeași tulpină de drojdie a 23 de gene diferite (incluzând gene de la
șobolan, bacterii, și trei specii diferite de Papaver), responsabile de
realizarea etapelor chimice necesare pentru metabolizarea glucidelor în
opioide, reflectă și mai concludent potențialul ingineriei genetice.
Această tulpină de drojdie este considerată una dintre cele mai
spectaculoase realizări obținute până în prezent prin inginerie genetică.
Alte aplicaţii implicând bacterii modificate prin tehnicile de
inginerie genetică sunt cele în care bacteriile realizează alte procese decât
cele ale ciclului lor natural, cum ar fi producerea de biocombustibili,
producerea de materiale plastice biodegradabile, curăţarea petelor de ulei,
a deşeurilor de carbon şi a altor deşeuri toxice, sau detectarea unor
poluanți în apă, inclusiv în apa potabilă.

7
 Alexandra Visoiu

Ingineria genetică are aplicaţii de mare importanţă în terapia

genică a unor boli umane prin înlocuirea genelor deficiente cu copii
funcţionale. Aceasta se poate realize în celulele somatice sau în celulele
germinale. Dacă gena este inserată în celulele ţesutului germinal, ea va fi
transmisă descendenţilor acelei persoane. Terapia genică implicând
utilizarea ingineriei genetice a fost deja folosită cu succes pentru tratarea
unor boli cum sunt imunodeficienţa severă combinată legată de X,
leucemia limfocitică cronică şi boala Parkinson.
In anul 2012, Glybera a devenit primul tratament prin terapie
genică (pentru restaurarea activității enzimei lipoprotein lipază la pacienții
cu deficiență de lipoprotein lipază, care suferă de pancreatită severă sau
multiplă) aprobat pentru utilizare clinică în Europa şi SUA.

2. TEHNOLOGIA ADN RECOMBINAT –

INGINERIA GENETICĂ
 
Moleculele de ADN recombinat (ADNr) sunt molecule de ADN
formate în laborator prin metode de recombinare genetică. Aceste
molecule conțin material genetic din surse diferite, fiind create secvențe
(de nucleotide) care altfel nu ar putea fi găsite în genom. De exemplu,
ADN din celulele plantelor poate fi combinat cu ADN bacterian, sau
ADN uman poate fi combinat cu ADN din celulele animale, vegetale sau
bacteriene. Deoarece conțin material genetic de la specii diferite,
moleculele de ADN recombinat sunt denumite uneori “ADN himeric”.
Producerea de ADN recombinat este posibilă deoarece moleculele
de ADN ale tuturor organismelor au aceeași structură chimică (Fig. 6).
Ele diferă numai prin secvența de nucleotide din această structură de
ansamblu identică. De asemenea, prin sinteză chimică pot fi create
secvențe de ADN care nu există în natură și care pot fi introduse
(incorporate) în moleculele recombinate.

8
 INGINERIE GENETICĂ

Tehnologia ADN recombinat și sinteza chimică a ADN permite

crearea oricărei secvențe de ADN, care poate fi introdusă în orice
organism viu.
Proteinele care pot rezulta din exprimarea (expresia) ADN
recombinat în celulele vii sunt denumite proteine recombinate. Lista
proteinelor generate prin exprimarea ADN recombinat, utilizând ingineria
biomoleculară, include printre altele hormonul uman de creștere, insulina
umană, hormonul foliculostimulant, eritropoetina și interferonul.
Introducerea în celulele unui organism gazdă a ADN recombinat
ce codifică o proteină, nu determină neapărat producerea proteinei
recombinate. Producerea acesteia necesită utilizarea unor vectori de
exprimare specializați și restructurarea semnificativă a secvenței
codificatoare străine.
Recombinarea ADN se deosebește de recombinarea genetică prin
aceea că prima este rezultatul folosirii unor metode și tehnici de laborator,
în timp ce ultima este un proces normal (natural) ce duce, în aproape orice
organism, la reamestecarea secvențelor existente de ADN.
Tehnologia ADN recombinat implică următoarele etape:

1) izolarea materialului genetic (ADN);

2) tăierea ADN la nivelul unor situsuri specifice;
3) amplificarea genei de interes utilizând reacția de polimerizare
în lanț (PCR);
4) pregătirea și introducerea ADN recombinat în celula/
organismul gazdă;
5) obținerea produsului genei străine.

2.1. IZOLAREA ADN

Izolarea (extracția) unor diferite tipuri de molecule de acizi

nucleici (ADN celular total din celule bacteriene, vegetale, animale,
umane; ADN plasmidial; ADN viral; ARN) constituie prima etapă a
tehnologiei ADN recombinat și respectiv a oricărei aplicații de inginerie
genetică. In funcţie de tipul de molecule de acizi nucleici şi de organismul
de origine au fost elaborate numeroase metode de izolare şi purificare.

2.1.1. Izolarea ADN total

Pentru izolarea de ADN total se utilizează fragmente de ţesuturi

(vegetale sau animale), culturi celulare, sau suspensii celulare. Indiferent

9
 Alexandra Visoiu

de tipul de celule utilizate în experimentele/lucrările de creare de ADN

recombinat și de inginerie genetică, este necesară liza acestora, proces
realizat prin metode variate (liza chimică în prezenţa unor soluţii alcaline
şi/sau a unor detergenţi; liza enzimatică cu ajutorul unor enzime specifice;
liza produsă prin procedee fizice: ultrasonicare, îngheţarea celulelor în
azot lichid, etc).
Protejarea ADN eliberat prin ruperea membranelor celulare de
acţiunea nucleazelor endogene se realizează, de regulă, prin folosirea unor
soluţii tampon ce conţin EDTA (reactiv ce leagă ionii de magneziu
făcându-i inaccesibili DN-azelor, ai căror cofactori sunt). De asemenea,
după îndepărtarea prin centrifugare a resturilor celulare, soluţia apoasă
obţinută este supusă unor tratamente suplimentare ce au drept scop
degradarea ARN (prin adăugarea RN-azei) sau a proteinelor contaminante
(prin folosirea unor proteaze, sau prin extracţie cu fenol). ADN este apoi
recuperat prin precipitare cu etanol (2 - 2.5 volume), în prezenţa unor
cationi monovalenţi (de exemplu, ioni de sodiu în concentraţie de 0.3 M)
şi apoi prin centrifugare. De regulă, ADN obţinut este redizolvat în
tampon, proces urmat de o nouă rundă de deproteinizare, ceea ce asigură
o puritate mai bună preparatului. Dacă este necesar un grad foarte ridicat
de puritate, soluţia de ADN este supusă ultracentrifugării (în gradient de
clorură de cesiu).
2.1.2. Izolarea ADN plasmidial

Izolarea selectivă a ADN plasmidial din celulele bacteriene şi

separarea lui de ADN cromozomial este posibilă datorită existenței unor
diferenţe importante între cele două tipuri de molecule. Astfel, ADN
cromozomial este reprezentat de molecule de dimensiuni mari, legate de
membrana plasmatică, el rămânând fixat de resturile celulare rezultate după
liza (spargerea) celulelor. Având dimensiuni mari, moleculele de ADN
cromozomial sunt linearizate şi fragmentate în cursul procesului de
extracţie, în timp ce ADN plasmidial este obţinut, în cea mai mare parte, sub
forma unor molecule circulare închise covalent (CIC). De asemenea, cele
două tipuri de molecule se comportă diferit în prezenţa unor detergenţi
(dodecil sulfat de sodiu, SDS), sau la concentraţii mari de săruri.
Expunerea la temperaturi ridicate sau tratarea cu soluţii cu pH
puternic alcalin (12.0 - 12.4) determină ruperea legăturilor de hidrogen
dintre cele două catene ale moleculelor de ADN, ducând la denaturarea
acestora. Datorită conformaţiei moleculare speciale (CIC), catenele de ADN
plasmidial denaturat se menţin alăturate, astfel că după răcire, respectiv
neutralizare, aceste molecule redobândesc configuraţia iniţială. In schimb,

10
 INGINERIE GENETICĂ

ADN cromozomial rămâne în stare denaturată, fiind eliminat în cea mai

mare parte după centrifugare. Moleculele ce contaminează soluţia de ADN
(ARN sau proteine) sunt eliminate prin tratamente similare celor menţionate
pentru ADN total, iar recuperarea ADN plasmidial se face tot prin
centrifugare, după precipitarea cu alcooli (alcool izopropilic sau alcool
etilic). Pentru o purificare înaltă a ADN plasmidial se poate utiliza
ultracentrifugarea în gradient în clorură de cesiu (CsCl), metodă ce permite
separarea nu numai a tipurilor diferite de molecule, ci şi a moleculelor de
ADN plasmidial cu conformaţii moleculare diferite.

2.1.3. Izolarea ADN viral

Izolarea ADN viral implică obţinerea unei culturi de celule ce

reprezintă gazda specifică a virusului de interes. De cele mai multe ori,
multiplicarea virală este însoţită de liza celulelor gazdă (aşa cum este
cazul bacteriofagilor litici), astfel că particulele virale pot fi obţinute din
lizatul celular prin precipitare (de exemplu, cu polietilenglicol), urmată de
centrifugare. Îndepărtarea capsidei virale se realizează prin tratament cu
fenol sau prin folosirea unor proteaze. ADN viral este recuperat, după
precipitare, prin centrifugare sau ultracentrifugare în gradient de CsCl.

2.2. IZOLAREA MOLECULELOR DE ARN

In anumite tipuri de experimente, în care nu este posibilă izolarea

genelor direct din moleculele de ADN, pentru izolarea fragmentelor de
ADN de interes este necesară utilizarea unor molecule de ARN care sunt
apoi convertite, prin reverstranscriere (transcriere inversă), la moleculele
de ADN corespunzătoare.
De regulă, metodele de izolare ale ARN permit obţinerea de ARN
total. Pentru purificarea unui anumit tip de ARN se folosesc metode
specifice, care exploatează anumite particularităţi ale moleculelor de
interes. De exemplu, purificarea ARNm, respectiv separarea acestui tip de
ARN din ARN total (în care sunt prezente și molecule de ARNr și ARNt)
se bazează pe exploatarea prezenței la capătul 3’ a unei “cozi” mono-
catenare poliA. Astfel, pentru purificarea ARNm se utilizează metoda
cromatografiei de afinitate pe o coloană cromatografică ce conţine o
umplutură specifică la care sunt legate “resturi” de poliT sau poliU.
Secvenţele poliT sau poliU interacţionează specific, pe bază de
complementaritate, cu coada poliA a ARNm, legând moleculele
respective. Eluarea moleculelor de interes se realizează cu ajutorul unor

11
 Alexandra Visoiu

soluţii tampon specifice, iar apoi ARNm este concentrat prin precipitare
cu etanol şi recuperat prin centrifugare.

2.4. SEPARAREA ȘI IDENTIFICAREA MOLECULELOR DE

ADN

Metoda standard de separare şi identificare a moleculelor de ADN

izolate dintr-un anumit organism este electroforeza în gel de agaroză
(Fig. 19). Principiul general al metodei constă în faptul că, la pH alcalin
sau neutru, acizii nucleici au sarcină negativă şi, prin urmare, dacă sunt
plasaţi într-un câmp electric, ei vor migra spre anod (+).
Atunci când dimensiunea fragmentelor de ADN este foarte mică
(sub 1.000 pb), separarea electroforetică se face în gel de poliacrilamidă,
a cărui concentraţie este aleasă în funcţie de mărimea moleculelor.
Indiferent de tipul de gel utilizat pentru separarea moleculelor de
ADN, pentru ca acestea să poată fi vizualizate, este necesar ca mai întâi
ele să fie colorate. Colorarea se realizează cu bromură de etidiu (EtBr), iar
vizualizarea benzilor de ADN se face prin expunerea gelului la radiaţii
UV (pe un transluminator), ele prezentând o fluorescenţă roz (Fig. 19).
Metoda electroforezei în gel de agaroză permite stabilirea dimensiunilor
moleculelor de ADN, precum şi a conformaţiei lor moleculare.
2.5. TĂIEREA ADN CU ENZIME DE RESTRICȚIE

Fragmentele de ADN sunt obţinute prin tratamentul probelor de

ADN cu endonucleaze de restricţie (enzime de restricţie, sau, simplu,
restrictaze). Acestea pot fi încadrate în trei clase (tipuri) majore, ale căror
caracteristici principale sunt prezentate în tabelul 1.
Enzimele de restricţie (ER) sunt endonucleaze bacteriene care taie
molecula de ADN la nivelul unor secvențe strict specifice, sau în
apropierea unor secvenţe de nucleotide pe care le recunosc specific,
denumite situsuri de recunoaştere sau situsuri de restricţie. Ca rezultat al
activității lor de tăiere (clivare) sunt generate fragmente de lungimi
variate; acestea sunt denumite fragmente de restricţie (FR).

Tabel 1. Clasele majore de endonucleaze de restricție (adaptat după Glick

și colab., 2010).
Clasa Abundența Situsul Modul de tăiere Utilitatea
(tipul) de recunoaștere în tehnologia
ADN

12
 INGINERIE GENETICĂ

recombinat

I Mai puțin Situsul de recunoaștere Taie ambele catene Neutile

comune decât este asimetric și este la o localizare
cele de tip II compus din două nespecifică,
porțiuni – una conținând la o distanță mai
3-4 nucleotide și o alta mare de 1.000 pb
conținând 4-5 nucleotide de situsul de
– separate de o secvență recunoaștere
spacer de 6-8 nucleotide
II Cele mai comune Situsul de recunoaștere, Taie ambele catene Foarte utile
compus din 4-8 pb, este la nivelul situsului
specific, de regulă de recunoaștere
palindromic (secvența
perechilor de baze în
orientarea 5’-3’ este
identică pe cele două
catene ale moleculei
de ADN)
III Rare Situsul de recunoaștere, Taie doar o catenă, Neutile
este compus din două la o distanță de 24-
secvențe separate, non- 26 pb în aval de
palindromice, cu capătul 3’ al
orientare inversă situsului de
recunoaștere

O caracteristică esenţială a enzimelor de restricţie o constituie

specificitatea acţiunii lor: o enzimă de restricţie îşi exercită activitatea
endonucleazică numai asupra unei anumite secvenţe nucleotidice (a cărei
lungime este cuprinsă între 4-8 p.b.) (Tabel 2) şi care este denumită situs
de recunoaştere sau de restricţie (SR).

Tabel 2. Exemple de enzime de restricţie şi situsurile lor de recunoaştere

şi clivare (http://en.wikipedia.org/wiki/Restriction_enzyme).

Secvenţa
Enzima Sursa de recunoaştere/ Modul de clivare
situsul de restricţie

5'GAATTC 5'---G AATTC---3'

EcoRI Escherichia coli
3'CTTAAG 3'---CTTAA G---5'

5'CCWGG 5'--- CCWGG---3'

EcoRII Escherichia coli
3'GGWCC 3'---GGWCC ---5'

Bacillus 5'GGATCC 5'---G GATCC---3'

BamHI
amyloliquefaciens 3'CCTAGG 3'---CCTAG G---5'

13
 Alexandra Visoiu

Secvenţa
Enzima Sursa de recunoaştere/ Modul de clivare
situsul de restricţie

Haemophilus 5'AAGCTT 5'---A AGCTT---3'

HindIII 3'---TTCGA A---5'
influenzae 3'TTCGAA

5'TCGA 5'---T CGA---3'

TaqI Thermus aquaticus
3'AGCT 3'---AGC T---5'

5'GCGGCCGC 5'---GC GGCCGC---3'

NotI Nocardia otitidis
3'CGCCGGCG 3'---CGCCGG CG---5'

Haemophilus 5'GANTC 5'---G ANTC---3'

HinFI
influenzae 3'CTNAG 3'---CTNA G---5'

5'GATC 5'--- GATC---3'

Sau3AI Staphylococcus aureus
3'CTAG 3'---CTAG ---5'

5'CAGCTG 5'---CAG CTG---3'

PvuII* Proteus vulgaris
3'GTCGAC 3'---GTC GAC---5'

5'CCCGGG 5'---CCC GGG---3'

SmaI* Serratia marcescens
3'GGGCCC 3'---GGG CCC---5'

Haemophilus 5'GGCC 5'---GG CC---3'

HaeIII*
aegyptius 3'CCGG 3'---CC GG---5'

5'AGCT 5'---AG CT---3'

AluI* Arthrobacter luteus
3'TCGA 3'---TC GA---5'

5'GATATC 5'---GAT ATC---3'

EcoRV* Escherichia coli
3'CTATAG 3'---CTA TAG---5'

5'GGTACC 5'---GGTAC C---3'

KpnI Klebsiella pneumoniae
3'CCATGG 3'---C CATGG---5'

5'CTGCAG 5'---CTGCA G---3'

PstI Providencia stuartii
3'GACGTC 3'---G ACGTC---5'

Streptomyces 5'GAGCTC 5'---GAGCT C---3'

SacI
achromogenes 3'CTCGAG 3'---C TCGAG---5'

5'GTCGAC 5'---G TCGAC---3'

SalI Streptomyces albus
3'CAGCTG 3'---CAGCT G---5'

Streptomyces 5'AGTACT 5'---AGT ACT---3'

ScaI*
caespitosus 3'TCATGA 3'---TCA TGA---5'

SpeI Sphaerotilus natans 5'ACTAGT 5'---A CTAGT---3'

14
 INGINERIE GENETICĂ

Secvenţa
Enzima Sursa de recunoaştere/ Modul de clivare
situsul de restricţie

3'TGATCA 3'---TGATC A---5'

Streptomyces 5'GCATGC 5'---GCATG C---3'

SphI
phaeochromogenes 3'CGTACG 3'---C GTACG---5'

Streptomyces 5'AGGCCT 5'---AGG CCT---3'

StuI*
tubercidicus 3'TCCGGA 3'---TCC GGA---5'

5'TCTAGA 5'---T CTAGA---3'

XbaI Xanthomonas badrii
3'AGATCT 3'---AGATC T---5'

Legendă:
* = Nomenclatura: prima literă indică genul bacteriei; a doua literă şi eventual
a
treia indică specia; a treia literă indică suşa; cifra indică numărul de ordine.
** = Capete drepte
N = C sau G sau T sau A; W = A sau T

Tehnica digestiei cu ER face posibilă izolarea oricărei regiuni

genomice. Cele câteva sute de ER care sunt disponibile în prezent pot fi
utilizate în diferite combinaţii pentru obţinerea fragmentului dorit.
Lungimea şi implicit, numărul fragmentelor depind în mare măsură de
dimensiunile situsului de restricţie: cu cât acesta este mai mic, cu atât
frecvenţa lui în genom va fi mai mare.

Fig. 17. Tăierea moleculei de ADN de către enzima de restricţie EcoRI.

15
 Alexandra Visoiu

Majoritatea enzimelor de restricţie recunosc doar o secvenţă scurtă

de baze (Tabel 2), formată de regulă din patru până la şase perechi de
nucleotide (de exemplu, enzima EcoRI, izolată de la Escherichia coli, taie
molecula de ADN oriunde întâlneşte secvenţa de nucleotide GAATTC -
care reprezintă aşadar situsul de recunoaştere al acestei enzime). Există
însă şi enzime de restricţie ce recunosc specific secvenţe de opt perechi
de nucleotide (de exemplu NotI, izolată de la Nocardia otitidis). Enzima
se leagă de ADN la nivelul acestor secvenţe sau în apropierea lor şi
determină o rupere în fiecare catenă a moleculei (Fig. 17), producând
grupări 3′-OH şi 5′-P în fiecare poziţie.
Enzimele de restricţie au câteva caracteristici importante:
1. Secvenţele de la situsul de restricţie recunoscute de majoritatea
restrictazelor sunt palindroame (secvenţe identice, indiferent
de ordinea citirii lor). De exemplu, enzima de restricţie EcoRV
recunoaşte secvenţa palindromică
5′-GATATC-3′
3′-CTATAG-5′
2. Majoritatea enzimelor de restricţie recunosc un singur situs de
restricţie.
3. Situsul de restricţie este recunoscut indiferent de sursa ADN.
4. Deoarece majoritatea enzimelor recunosc secvenţa dintr-un
situs unic de restricţie, numărul de tăieri în ADN la un anumit
organism este determinat de numărul de situsuri de restricţie
cu secvenţa respectivă, prezente la acel organism.
Fragmentul de ADN produs de de tăierea la nivelul a două situsuri
adiacente este denumit fragment de restricţie. O moleculă de ADN va fi
tăiată de o enzimă de restricţie în numeroase fragmente de restricţie de
mărimi diferite. De exemplu, o moleculă de ADN de la Escherichia coli,
care conţine 4.7 x 106 perechi de baze, este tăiată în câteva sute, până la
câteva mii de fragmente, iar ADN genomic nuclear de la om este tăiat în
mai mult de 1 milion de fragmente.

16
 INGINERIE GENETICĂ

Sursa
Amestec
de curent
de molecule
de ADN
de lungimi
diferite

Gel

Sursa
de curent

Fragmente lungi

Fragmente scurte

Fig. 18. Separarea fragmentelor de ADN prin electroforeză în gel

de agaroză (http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch20/
electrophoresis.html).

Fragmentele de restricţie sunt de obicei suficient de scurte pentru a

putea fi separate prin electroforeză (Fig. 18).
Ca o consecinţă a specificităţii de secvenţă, o anumită enzimă de
restricţie produce un set unic de fragmente pentru o anumită moleculă de
ADN. O altă enzimă va produce prin tăierea aceleeaşi molecule un set de
fragmente diferit.
O hartă arătând situsurile unice de tăiere a ADN de la un anumit
organism de către o anumită enzimă de restricţie, este denumită hartă de
restricţie.

17
 Alexandra Visoiu

Fig. 19. Benzi electroforetice conţinând fragmente de ADN de lungimi

diferite (http://en.wikipedia.org/wiki/File:Gel_electrophoresis_2.jpg).

Familia de fragmente produsă de o singură enzimă poate fi

analizată cu uşurinţă prin electroforeza în gel a ADN supus digestiei cu
respectiva enzimă (Fig. 19), iar fragmentele particulare de ADN pot fi
izolate prin decuparea regiunilor din gel conţinând fragmentul de interes
şi apoi extracţia ADN din blocul de gel decupat. Aceste fragmente pot fi
folosite în variatele aplicaţii practice de analiză moleculară şi inginerie
genetică.
Enzimele de restricție sunt utilizate pentru a realiza inserția de
gene în plasmidele vector (pentru clonarea genelor, experimentele de
expresie a proteinelor, sau pentru transferul mediat de gene la plante).
Pentru o utilizare optimă, plasmidele care sunt folosite în mod obișnuit
pentru clonare genică sunt modificate pentru a include o secvență scurtă
de legare multiplă (secvență polylinker), denumită ‘situs de clonare
multiplu’ (multiple cloning site, MCS), bogată în secvențe (mai scurte) de
recunoaștere pentru enzimele de restricție (Fig. 26).
Aceasta permite flexibilitate atunci când sunt inserate fragmente
de gene în plasmida vector; situsurile de restricție conținute în mod
natural în interiorul genelor influențează alegerea endonucleazei pentru
digestia ADN, întrucât este necesară evitarea restricției ADN dorit (de
interes) când se taie în mod intenționat capetele ADN. Pentru clonarea
unui fragment de genă într-un vector, atât ADN plasmidial cât și insertul
genic sunt tăiate în mod obișnuit cu aceiași enzimă de restricție, iar apoi
sunt ‘lipite’ cu ajutorul unei enzime denumită ADN ligază.

18
 INGINERIE GENETICĂ

2.5.2. Separarea şi identificarea fragmentelor de restricţie

Tehnica Southern blotting

Fragmentele de restricţie care rezultă din digestia cu enzime de

restricţie pot fi separate prin metoda electroforezei în gel de agaroză.
Moleculele ADN au o încărcătură electrică negativă, datorită grupărilor
fosfat din scheletul glucidofosforic; prin urmare, ele vor migra către anod,
rata deplasării fiind invers proporţională cu greutatea lor moleculară.
Analiza structurii şi conţinutului genetic al fragmentelor rezultate
prin digestie cu enzime de restricţie se realizează prin metoda marcării
radioactive a ADN, cunoscută sub numele de Southern blotting.
Se procedează la denaturarea chimică a fragmentelor ADN incluse
în gel, după care monocatenele sunt transferate prin capilaritate pe o
membrană de nailon sau de nitroceluloză (blotting = pătare, amprentare);
se obţine atfel o replică a modelului de benzi din gelul de agaroză.
Moleculele ADN de pe membrană sunt expuse unor probe ADN sau ARN
marcate radioactiv, complementare cu secvenţa urmărită. Probele vor
forma complexe dublu-catenare stabile în zonele membranei în care se
află secvenţele omoloage. Sediul hibridizării e detectat autoradiografic.
ADN detectat poate fi o singură genă, sau un segment mai mare
dintr-un genom.
Transferul Southern poate fi utilizat și pentru clonarea pe baza
omologiei, pornind de la secvența de aminoacizi a produsului proteic al
genei țintă. În acest scop, sunt proiectate oligonucleotide având secvență
similară cu secvența țintă. Aceste oligonucleotide sunt sintetizate chimic,
marcate radioactiv și utilizate pentru a examina o bibliotecă ADN sau o
altă colecție de fragmente clonate de ADN. Secvențele care hibridizează
cu sonda de hibridizare sunt analizate apoi, de exemplu, pentru a obține
întreaga secvență a unei gene țintă.

2.6. CLONAREA MOLECULARĂ

19
 Alexandra Visoiu

Clonarea moleculară reprezintă procesul de construire a unor

molecule de ADN hibride (ADN recombinat) prin inserția (asamblarea)
de secvențe de nucleotide conținând informaţie genetică străină într-un
vector adecvat, capabil să se replice independent. (Watson, 2007).
Termenul de clonare se referă la faptul că metodele utilizate
implică replicarea unei molecule și producerea unei populații de celule cu
molecule de ADN identice.
Clonarea moleculară utilizează, în general, secvențe de ADN din
organisme diferite: specia care este sursa ADN ce trebuie (ce se dorește a
fi) clonat, și specia care va servi ca organism gazdă pentru replicarea
ADN recombinat.
Într-un experiment de clonare moleculară convențională, ADN ce
trebuie clonat este obținut (extras, izolat) de la un organism de interes și
apoi tratat cu enzime de restricție pentru a genera fragmente mai mici.
Aceste fragmente sunt apoi combinate cu un vector ADN pentru a genera
molecule de ADN recombinate. ADN recombinat este apoi introdus într-
un organism gazdă (de regulă, o tulpină de Escherichia coli ușor de
crescut). Aceasta va genera o populație de organisme în care moleculele
de ADN recombinat sunt replicate odată cu ADN-ul gazdei. Deoarece
conțin fragmente de ADN străin, acestea sunt microorganisme modificate
genetic sau transgenice. Acest proces este avantajat de faptul că o
(singură) celulă bacteriană poate fi indusă să primească și să replice o
singură moleculă de ADN recombinat. Această celulă poate fi
multiplicată exponențial pentru a genera o populație foarte mare de celule
bacteriene, fiecare dintre ele conținând copii ale moleculei originale de
ADN recombinat. De aceea, atât populația bacteriană care rezultă, cât și
moleculele de ADN recombinat, sunt considerate ca fiind clone.
Se consideră că “ADN recombinat” se referă la moleculele de
ADN, pe când “clonarea moleculară” se referă la metodele experimentale
utilizate pentru asamblarea lor.
In experimentele standard de clonare moleculară, clonarea oricărui
fragment de ADN implică în mod esențial șapte etape: (1) alegerea
organismului gazdă și a vectorului de clonare; (2) Pregătirea vectorului
ADN; (3) Pregătirea ADN ce urmează a fi clonat; (4) Crearea de ADN
recombinat; (5) Introducerea ADN recombinat în organismul gazdă;
(6) Selecția organismelor ce conțin ADN recombinat; (7) Selecția
(screening-ul) clonelor ce conțin insertul de ADN dorit (gena de interes)
și exprimă caracteristica codificată de acesta.
2.6.1. Vectori utilizaţi pentru clonare

20
 INGINERIE GENETICĂ

Vectorii reprezintă molecule de ADN în interiorul cărora se

introduc fragmentele de ADN de studiat (ADN pasager, heterolog), ce
poate fi de origine pro- sau eucariotă. Vectorii pot fi clasificaţi în funcţie
de diferite criterii:

a) în funcție de posibilitatea studierii exprimării fragmentelor de

ADN pasager, vectorii se împart în:
- vectori de clonare, care nu au în structură secvenţe de tip
promotor şi, de aceea, permit doar clonarea unor fragmente de
ADN pasager, dar nu şi analiza exprimării acestora;
- vectori de exprimare (implicit şi de clonare), care au în
structură secvenţe de tip promotor, permiţând atât clonarea, cât
şi analiza exprimării fragmentului clonat.
b) în funcție de structura şi modul de funcţionare, vectorii se
împart în:
- vectori plasmidiali (care sunt derivaţi din, şi au structură de
plasmide);
- vectori virali (care sunt derivaţi din, şi au structura de genom
viral);
- vectori hibrizi - fagimide (care au structură hibridă, de genom
de fag filamentos şi de plasmid)
- cosmide (care au structură hibridă, de genom de fag λ şi de
plasmid).

2.6.1.1. Vectori de clonare plasmidiali

Proprietăţile plasmidelor ca vectori de clonare

Pentru a putea fi folosite ca vectori de clonare (Fig. 20),

plasmidele necesită o serie de caracteristici:

a) să nu conţină gene tra, deci să nu genereze proces de

conjugare bacteriană şi, în consecință, să nu fie auto-
transmisibile. Această caracteristică este esenţială atât, pentru
diversele etape de cercetare, cât şi pentru securitatea
cercetătorului (foarte mulţi vectori de clonare plasmidiali
prezintă ca markeri de selecție gene de rezistență la antibiotice,
iar dacă vectorii ar fi autotransferabili ar exista/creşte riscul ca
gene de antibio-rezistență să ajungă în diverse microorganisme
patogene).

21
 Alexandra Visoiu

b) să conţină situsuri unice pentru un număr cât mai mare de

endonucleaze de restricţie (la acest nivel se efectuează inserția
ADN pasager).
c) situsul de inserţie să nu fie localizat în genele implicate în
replicarea şi partiţia plasmidului.
d) să prezinte markeri genetici absenţi în celula receptoare.
e) să aibă o greutate moleculară mică, pentru a fi uşor de izolat şi
de manipulat.
f) să prezinte cât mai multe copii per celulă.

Primul plasmid natural care a fost folosit în experimente de

clonare genetică este plasmidul ColE1 de la Escherichia coli. Acest
plasmid are o greutate moleculară de 4.6 x 10 6 Da, este neconjugativ,
produce colicina E1 şi conferă gazdei imunitate la această colicină.
Selecţia celulelor transformate (care au primit plasmidul) pe baza acestui
marker (imunitatea la colicină) este o tehnică dificilă şi reprezintă un
dezavantaj al folosirii acestui plasmid în experimentele de clonare
genetică. Pe de altă parte, plasmidul ColE1 poartă şi gene mob care îi
conferă capacitatea de transfer în trans, în prezenţa unui alt conjugon.
Ca urmare, există riscul diseminării necontrolate a plasmidului ColE1
recombinat.
Ulterior au fost folosite alte plasmide naturale, cum sunt pSC101
şi pRS2124, care datorită genei de rezistenţă la tetraciclină şi, respectiv,
rezistenţă la ampicilină, permit o selecţie mai uşoară a transformanţilor.

Marker de selecție Promotor

Situs 5’
pentru primer
Situs de restricție

Gena inserată

Situs de restricție
Situs 3’
pentru primer

Genă de rezistență
la antibiotic

Originea replicării - ori

22
 INGINERIE GENETICĂ

Fig. 20. Schema generală a unui vector plasmidial

(http://blog.addgene.org/plasmids-101-what-is-a-plasmid).

Eficiența scăzută a clonării realizate cu plasmide naturale a impus

construcţia unor plasmide artificiale, destinate exclusiv experimentelor de
clonare. Seria plasmidelor artificiale utilizate ca vectori de clonare include
în prezent (în ordine alfabetică) pACYC, pANT, pAT, pBluescript, pBR,
pBS, pDNA, pDNR, pEF-GFP, pGreen, pEZ, pFC, pFN, pGEM, pHSG,
pJAZZ, pJET, pJW, pKF, pMAL, pMiniT, pNEB, pSMART, pSP,
pSpark, pSTV, pUC 18/19, pUC118/119, etc.
Hărțile vectorilor plasmidiali folosiți în mod curent în lucrările
de clonare genică pot fi găsite pe site-ul http://www.snapgene.com/
resources/plasmid_files/basic_cloning_vectors/.

Vectorii pBR322 / 325 / 327 / 328

pBR322 (Fig. 22) este un vector plasmidial cu o lungime de 4361

bp (2.6 x 106 Da). Acest vector, denumit după creatorii lui (Bolivar și
Rodriguez) are o origine de replicare relaxată, a cărei activitate nu este
strâns legată de diviziunea celulară. De aceea, numărul de molecule de
plasmid per celulă este foarte mare (Brown, 2010).
Deoarece în construcţia lui (Fig. 21) s-au folosit genele de
replicare plasmidială din ColE1, acest vector desfăşoară o replicare pe
acelaşi model cu ColE1.

23
 Alexandra Visoiu

Fragment recircularizat

Rearanjare

Originile pBR322

Fig. 21. Manipulările implicate de construirea vectorului plasmidial

pBR322 (Brown, 2010).

Vectorul pBR322 are 2 markeri genetici - două gene de rezistenţă

la ampicilină şi, respectiv, la tetraciclină, ce sunt transcrise în direcţie
inversă una de cealaltă.
În genomul pBR322 există situsuri unice de clivare (tăiere) pentru
peste 40 de enzime de restricție. Situsurile țintă pentru 11 dintre aceste
enzime se găsesc în cadrul genei TcR, iar în cadrul promotorului acestei
gene se găsesc situsuri de restricție pentru încă două restrictaze. Situsuri
unice de restricție pentru alte 6 enzime (endonucleaze de restricție) se
găsesc în gena ApR (Brown, 2010). Clonarea în pBR322, care poate fi
făcută cu ajutorul oricăreia dintre aceste 19 enzime, va determina
inactivarea inserțională fie a markerului ApR, fie a markerului TcR.

24
 INGINERIE GENETICĂ

Fig. 22. Schema vectorului pBR322 (http://www.snapgene.com/

resources/ plasmid_files/basic_cloning_vectors/pBR322/).

Situsurile de restricţie importante pentru experimentele de clonare

sunt: PstI (în gena Apr), HindIII, BamHI, SalI (în gena Tcr).

Strategia de clonare în vectorul pBR322 şi derivaţii săi

Inserția ADN pasager – construcţia vectorului recombinat

ADN pasager va fi inserat într-unul din situsurile de restricţie din

cele două gene de antibiorezistență (Apr, Tcr). Pentru realizarea inserției,
ambele molecule (vector şi ADN pasager) se supun digestiei cu o aceeaşi
enzimă de restricţie, ceea ce va conduce la obţinerea de capete
complementare; se amestecă cele două tipuri de molecule (în anumite
proporţii molare) astfel digerate (în prealabil, vectorul linearizat este tratat
cu fosfatază alcalină pentru a evita recircularizarea lui); apoi, se adaugă şi
o ADN ligază (de E. coli sau de T4, în funcţie de tipul de capete obţinute

25
 Alexandra Visoiu

- netede sau coezive) ce va reface legăturile fosfodiesterice, rezultând

vectorul recombinat.
În funcţie de endonucleaza de restricţie folosită la digestie,
vectorul pBR322 recombinat va avea una din cele două gene de rezistenţă
(Tcr sau Apr) inactivă. Prin această inactivare inserţională pot fi deosebite
moleculele de vector nerecombinat, fără ADN pasager (Apr Tcr), de
moleculele de vector recombinat, cu ADN pasager inserat (Apr Tcs sau
Aps Tcr).

Propagarea vectorului recombinat în tulpini de E. coli şi selecția

celulelor transformate

Vectorul recombinat se introduce (prin tehnici de transformare

genetică in vitro) într-o tulpină bacteriană ce trebuie să prezinte
sensibilitate la ambele antibiotice (Aps Tcs). Celulele transformate vor
prezenta fenotip Apr Tcs sau Aps Tcr (Fig. 23).
În ultimii ani, principalele tendinţe în construcţia vectorilor
plasmidiali sunt:

1) reducerea la maximum a dimensiunii vectorilor şi mărirea

capacităţii lor de a accepta ADN heterolog;
2) creşterea numărului de situsuri de restricţie şi distribuirea lor
într-un cluster = MultiCloning Site (MCS) sau PolyCloning
Site (PCS);
3) încorporarea în vectori a unor secvenţe ce permit identificarea
celulelor cu vectori recombinaţi prin teste cât mai simple şi
mai rapide: selecţie directă (sisteme ce permit numai creşterea
clonelor recombinate) sau selecţie prin teste histochimice;
4) introducerea în vectori a unor secvenţe ce permit generarea de
molecule monocatenare necesare tehnicilor de secvenţiere sau
de construcţie de sonde ADN;
5) introducerea în vectori a unor secvenţe de tip promotori,
terminatori, intensificatori (enhancers), ce permit transcrierea
in vitro a ADN clonat (pasager).

26
 INGINERIE GENETICĂ

(a) Colonii pe mediu cu ampicilină

(b) Placare replică (replica plating)

bloc de lemn

Atinge suprafața Colonii tetR

Colonii pe mediu Mediu cu tetraciclină incubare

cu penicilină
(c) coloniile amp tet cresc pe mediul cu tetraciclină
R R

Poziția recombinanților ampRtetS

Nerecombinanți ampRtetR

Fig. 23. Selecția (screening-ul) celulelor bacteriene purtătoare de vectori

pBR322 recombinați. (a) Celulele sunt inoculate pe plăci agarizate
conținând ampicilină (amp): toate celulele transformate vor produce
colonii. (b) Coloniile sunt placate ca replici pe plăci agarizate conținând
tetraciclină (tet). (c) Coloniile care cresc pe mediu cu tetraciclină sunt
ampRtetR și prin urmare nerecombinate. Coloniile de recombinanți
(ampRtetS) nu cresc, dar poziția lor pe plăcile cu ampicilină este acum
cunoscută (Brown, 2010).

In practică, transformanții sunt selectați pe baza rezistenței lor la

ampicilină și apoi placați ca replici pe mediu agarizat conținând
tetraciclină pentru identificarea celor care sunt sensibili la acest antibiotic
(Fig. 23).

27
 Alexandra Visoiu

Vectorii pUC 18/19

pUC18 și pUC19 (Fig. 26 și 27), construiți la University of

California, sunt vectori exclusiv de clonare, cu o dimensiune de 2.686 pb
(2.69 kb), ce nu permit şi exprimarea ADN clonat.
Aceşti vectori au regiunea ori din ColE1, cu diferenţa că a fost
îndepărtată gena rop. În consecință, aceşti vectori sunt prezenţi în mod
obişnuit într-un număr foarte mare de copii per celulă şi prezintă un
potenţial crescut de amplificare prin tratament cu cloramfenicol.
Vectorii pUC18 și pUC19 au două tipuri de markeri genetici:

1) gena Apr - caracter pe care se bazează selecţia iniţială

(screening-ul) a celulelor ce poartă vector;
2) gena lacZ′ - o genă defectivă ce exprimă doar capătul NH 2-
terminal al β-galactozidazei; această genă incompletă este
capabilă de complementaţie intra-alelică cu o altă formă
defectivă a genei lacZ′ (ce codifică capătul COOH– terminal al
β-galactozidazei) dintr-o gazdă bacteriană adecvată. În urma
procesului de complementaţie, tulpina bacteriană defectivă,
dar purtătoare a vectorului nerecombinat, este capabilă să
refacă integral β-galactozidaza. Sub inducţia IPTG (isopropil-
tio-β-D-galactozid, care este un inductor al genei lacZ), o
asemenea tulpină formează colonii albastre pe un mediu ce
conține X-gal (5-Br-4-Cl-3-indolil-β-D-galactozid).

Inserţia unui ADN heterolog în situsul de policlonare (MCS, PCS)

- care este inclus în promotorul lui lacZ′ - determină imposibilitatea
exprimării genei lacZ′ şi, de aceea, gena lacZ defectivă din cromozomul
gazdei nu mai este complementată de cea din vectorul recombinat. Ca
urmare, nu se mai formează β-galactozidaza activă care să scindeze
complexul X-gal, cu formarea compusului indolic albastru. Coloniile ce
poartă vectorul recombinat au culoarea albă. Aceasta este cea mai folosită
variantă histochimică de selecție a clonelor recombinate.
Vectorii pUC18/19 reprezintă prima familie de vectori de clonare
la care situsurile pentru endonucleazele de restricţie au fost grupate într-o
singură zonă a vectorului, denumită situs multiplu de clonare / situs de
policlonare (MCS = MultiCloning Site; PCS = PolyCloning Site).
În pUC18/19, MCS conține situsuri pentru 10 endonucleaze de
restricţie şi pentru 3 enzime izoschizomere.

28
 INGINERIE GENETICĂ

Fig. 26. Vectorul pUC18 (http://www.snapgene.com/resources/plasmid_

files/basic_cloning_vectors/pUC18/).

Fig. 27. Vectorul pUC 19 (http://www.snapgene.com/resources/plasmid_

files/basic_cloning_vectors/pUC19/).

29
 Alexandra Visoiu

În pUC19, MCS este în orientare inversă faţă de pUC18. Clonarea

în acest situs determină o inactivare inserțională (o genă din vector nu se
mai exprimă), diferenţa faţă de vectorii de clonare anteriori (pBR322,
pBR325) constând în posibilitatea identificării rapide, directe, a clonelor
recombinate, pe baza diferenţei de culoare dintre colonii (colonii albastre
= celule ce poartă vector nerecombinat; colonii albe = celule ce poartă
vector recombinat).

Strategia de clonare în vectorii pUC18/19 şi derivaţii săi

Inserţia ADN heterolog în situsul de policlonare se realizează prin

aceleaşi etape ca şi în cazul vectorilor anteriori:

a) digestia vectorului şi a ADN heterolog cu aceeaşi restrictază

(endonuclează de restricţie), sau cu enzime izoschizomere,
amestecarea fragmentelor şi, respectiv, adăugarea unei ADN-
ligaze;
b) introducerea vectorului recombinat în tulpini bacteriene
adecvate (care au pe cromozom o genă lacZ defectivă ce
complementează gena lacZ′.

Selectarea clonelor celulare cu vector recombinat se realizează în

două etape: (1) cultivarea pe mediu cu Ap şi screeningul clonelor ce
poartă vector (Apr); (2) cultivarea acestor clone celulare pe mediu cu
IPTG şi X-gal (Fig. 29) şi selecţia coloniilor bacteriene ce poartă vector
recombinat (= colonii albe).

Colonie albastră = nerecombinat

Agar + X-gal + IPTG
Colonie albă = recombinat

Fig. 29. Selecția celulelor bacteriene conținând recombinanți pUC18 pe

plăci agarizate conținând X-gal și IPTG (colonii albastre = este sintetizată
β-galactozidază, X-gal → se formează compusul indolic albastru; colonii
albe = nu este sintetizată β-galactozidază, X-gal → nu se formează
compusul indolic albastru) (Brown, 2010).

30
 INGINERIE GENETICĂ

2.6.1.3. Vectori de clonare hibrizi de tip fagimide

Fagimidele sunt vectori hibrizi ce combină caractere de plasmide

cu caractere de fagi filamentoşi.
Caracterele de plasmide: au o origine a replicării din ColE1,
segment ce asigură replicarea de tip cerc rotativ şi menţinerea vectorului
în forma plasmidială; au o genă de rezistenţă la antibiotic, caracter
selectabil în tulpinile bacteriene ce poartă acest vector.
Caractere de fag filamentos: au regiunea intergenică majoră
(IG 1) dintr-un fag filamentos. Această regiune conţine toate secvenţele
necesare în cis pentru întreaga replicare a vectorului pe modelul replicării
fagilor filamentoși şi pentru morfogeneza particulelor virale.
Datorită acestor caractere duale, fagimidele pot fi propagate şi
menţinute în forma plasmidială în tulpină bacteriană gazdă atunci când
aceasta este cultivată în condiţii obişnuite, standard. Când celulele gazdă
sunt infectate cu un fag filamentos helper, atunci modul de replicare a
vectorului se schimbă sub acţiunea produsului genei II (endonucleaza II)
codificat de virusul helper. Acest produs interacționează cu regiunea
intergenică din vector, iniţiind replicarea pe modelul fagilor filamentoşi şi
generând astfel monocatene ADN ce vor fi apoi clivate, circularizate şi
împachetate în particule fagice. ADN monocatenar purificat din aceste
particule în experimente de secvenţiere sau pentru obţinerea de sonde
ADN monocatenar. In prezent, în asemenea experimente, se folosesc ca
virusuri helper virusuri cu genom modificat prin manipulări genetice,
astfel încât nu pot genera propriile particule fagice şi au gena II mutantă
ce acţionează mai bine pe IG din fagimid, decât pe IG propriu.
Vectori de clonare de tip fagimide folosiți frecvent pentru clonarea
genelor sunt pUC118/119 şi pBluescript.

Vectorii pUC 118/119

Vectorii pUC118/119 (Fig. 36 și 37) au fost construiți prin inserția

regiunii intergenice (IG region) a fagului ADN M13 în plasmidele pUC18
/ pUC19 (Fig. 36 și 37), cu scopul de a permite obținerea ușoară de ADN
monocatenar (single stranded). Mărimea acestor doi vectori este de 3.162
pb (mai mare decât a vectorilor pUC18 și respectiv pUC19, din care au
derivat, datorită inserției regiunii intergenice M13).

31
 Alexandra Visoiu

Fig. 36. Hărțile vectorilor pUC18 și pUC118 (derivat din pUC18).

Legendă: Amp = gena de rezistență la ampicilină; pMB1 ori = origine de
replicare pMB1; Plac = promotorul genei lacZ’; MCS = situs de clonare
multiplă; lacZ = gena raportor lacZ ce codifică enzima beta-
galactozidaza; LacR binding site = situs de legare LacR; M13 IG =
regiunea intergenică a M13 pentru producerea de ADN monocatenar
(http://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloni
ng_vectors.html).

32
 INGINERIE GENETICĂ

Fig. 37. Hărțile vectorilor pUC19 și pUC119 (http://www.mobitec.com/

cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html).

Ca orice alți vectori hibrizi din categoria fagimidelor, aceşti

vectori au două origini de replicare: una (ori-ColE1) care generează
replicare de tip plasmidial, şi una (dintr-un fag filamentos, oriM13 sau f1)
care generează replicare de tip fag filamentos, adică generează
monocatene. Monocatenele sunt ulterior folosite în experimentele de
secvenţiere ADN, sau ca sonde ADN monocatenar.

33
 Alexandra Visoiu

ADN clonat în fagii filamentoşi s-a dovedit a fi instabil în timp

(cu cât este mai mare fragmentul, cu atât mai instabil), suferind deleţii şi
rearanjamente. Astfel, avantajul major al fagimidelor este acela că oferă
posibilitatea păstrării ADN heterolog inclus într-un ADN circular şi, în
consecință, ADN clonat este mult mai stabil (nu se produc deleții,
rearanjamente). Pe de altă parte, pUC118/119 pot accepta ADN heterolog
mult mai mare decât pUC18/19. Ca şi pUC18/19, varianta 118/119 au
ori-ColE1 fără gena rop. Poartă gena Apr pentru screeningul clonelor
transformate şi gena lacZ′ pentru selecţia histochimică a clonelor
recombinate.
Situsul MCS este inclus în promotorul genei lacZ′ (Plac) şi,
ca urmare, clonarea va bloca transcrierea genei lacZ′.

Strategia de clonare în vectorii pUC 118/119

Inserția ADN heterolog în vector se realizează după aceleaşi etape

ca şi la vectorii prezentaţi anterior.
Introducerea vectorului recombinat în celule bacteriene se
efectuează tot prin tehnici de transformare genetică microbiană.
Screeningul şi selecţia clonelor recombinate se efectuează în acelaşi mod
ca şi în cazul vectorilor pUC18/19.

Vectorii pBluescript

Vectorii din seria pBluescript (Fig. 38) sunt vectori de tip

fagimide, multifuncţionali, construiţi pentru a simpifica clonarea
moleculară şi analiza genetică. Acești vectori oferă următoarele avantaje:
clonare multiplă în MCS/PCS (Tabel 3); selecție histochimică a clonelor
recombinate (colonii albe); transcriere in vitro a ADN heterolog, mediată
de promotorii T3 şi T7; obţinere de monocatene ADN; exprimarea de
proteine de fuziune (cu β-galactozidază).

Situsul MCS

Regiunea de clonare multiplă (policlonare) din pBluescript conţine

situsuri pentru 20 de endonucleaze de restricţie: SacI, BstXI, SacII, NotI,
EagI, XbaI, SpeI, BamHI, SmaI, PstI, EcoRI, EcoRV, HindIII, ClaI, SalI,
AccI, HincII, XhoI, ApaI, DraII, KpnI, oferind astfel posibilitatea
utilizării unui set larg de enzime pentru clonare. Există diverse variante de
vectori pBluescript - SK, KS (Fig. 38) – funcţie de orientarea situsurilor

34
 INGINERIE GENETICĂ

de restricţie (SacI → KpnI sau KpnI → SacI). Regiunea este încadrată de

promotorii T3 şi T7 şi întreg acest complex este flancat de câte un situs
pentru endonucleaza de restricţie BssHII (situs extrem de rar în
genomuri), cu ajutorul căreia poate fi, deci, excizat.

Fig. 38. Vectorul pBluescript KS (+) (https://www.snapgene.com/

resources/plasmid_files/image_consortium_plasmids/pBluescript_KS(+)/)
.

Situsul de policlonare este încadrat de promotorii T3 şi T7 care

permit desfăşurarea unui proces de transcriere in vitro (Fig. 38). Din
multitudinea de promotori disponibili la bacterii şi bacteriofagi au fost
aleşi aceşti 2 promotori din fagii T3 şi, respectiv, T7, datorită faptului că
ei sunt recunoscuţi foarte specific de ARN polimeraza cognată, astfel
încât se elimină riscul ca aceasta enzimă să desfăşoare proces de
transcriere de la alt promotor. Acești 2 promotori se găsesc în orientare
inversă unul faţă de celălalt şi, ca atare, ADN heterolog clonat poate fi
transcris pe oricare din cele 2 catene, funcţie de orientarea pe care o are în
molecula de vector recombinat. Procesul de transcriere in vitro permite
obţinerea de molecule ARN ce pot fi apoi folosite ca sonde moleculare în
experimente de hibridizare moleculară. Pe de altă parte, după transcriere

35
 Alexandra Visoiu

in vitro poate fi realizat şi un proces de traducere in vitro, ceea ce conduce

la obținerea de proteine care pot fi ulterior analizate.
După clonarea în MCS, vectorul recombinat (care se află în formă
de cerc covalent închis) se introduce, prin transformare genetică, în celule
bacteriene.

2.6.1.5. Vectori de clonare hibrizi de tip cosmide

Cosmidele sunt vectori de clonare hibrizi, cu mărimea de

aproximativ 5 kb, ce conţin ADN plasmidial şi unul sau două situsuri cos
din genomul fagului λ
Spre deosebire de plasmide, cosmidele pot fi împachetate în
capsidele fagilor, ceea ce permite transferul genelor străine în, sau între
celule prin transducție (fagică). Aceasta oferă un avantaj important,
deoarece plasmidele devin instabile după inserția unei anumite cantități
de ADN, mărimea crescută a moleculei determinând recombinarea.
Transducția fagică este posibilă datorită “capetelor coezive”, denumite
(în biologia moleculară și ingineria genetică) situsuri cos.
Cosmidele sunt similare vectorilor derivați din fagul lambda (λ),
diferența constând în faptul că, exceptând secvența cos, toate genele
lambda au fost îndepărtate. Insertul acceptat de cosmide este mult mai
mare decât în cazul vectorilor derivaţi din fagul λ (aproximativ 24 kb).
Deoarece conțin secvenţa ori din plasmidul ColE1 şi gena de
rezistenţă la ampicilină (ampR/Apr), cosmidele se pot replica şi menţine în
celula bacteriană în forma pasmidială (cerc covalent închis) şi permit
selecţia transformanţilor pe mediu cu ampicilină. Situsul cos permite
împachetarea in vitro a vectorului recombinat (obținere de particule fagice
mature) şi, implicit, propagarea sa prin transducţie sau transfecţie. Dintre
cele două forme moleculare, plasmidă şi “genom fagic”, cea de-a doua
formă este cea care permite menţinerea și propagarea stabilă a unui ADN
heterolog de dimensiuni mari.
In cosmida liniarizată, ADN străin este ligat în situsurile adecvate
de clonare flancate de secvențele cosmidei. După infectarea celulelor de
E. coli, cosmida se recircularizează și datorită prezenței markerului (sau
markerilor) de rezistență la antibiotic(e), celulele bacteriene purtând
cosmida recombinată pot fi izolate. Cosmidele se pot recombina cu alte
plasmide, deoarece conțin secvențe omoloage (Redei, 2008).
Vectori de tip cosmide permit clonarea unor fragmente mari de
ADN genomic, de 35-50 kb, făcând astfel posibilă propagarea unor gene
eucariote în întregime într-o singură moleculă de ADN recombinant.

36
 INGINERIE GENETICĂ

Cosmide pentru propagarea ADN heterolog eucariot în E. coli

Asemenea cosmide au o singură secvenţa de control al replicării,

ori din ColE1, permiţând astfel replicarea doar în celulă bacteriană.

Cosmida pJB8

Acest vector (Fig. 40) are 5.4 kb şi conţine următoarele secvenţe:

- origine de replicare (ori) din plasmida ColE1, care îi permite

replicarea de tip plasmidial în celule de E. coli
- gena de rezistenţă la ampicilină (Apr) ce reprezintă markerul de
selecţie a transformanţilor pe mediu cu acest antibiotic
- situsul cos (derivat din vectorul Charon 4A), care permite
împachetarea vectorului recombinat în particule fagice mature
- regiunea MCS care conţine situsuri pentru 4 endonucleaze de
restricţie (BamHI, EcoRI, ClaI, HindIII).

Fig. 40. Harta cosmidei pJB8

(http://www.biovisualtech.com/bvplasmid/pJB8.jpg).

37
 Alexandra Visoiu

2.6.1.6. Vectori de clonare în drojdii

Drojdia Saccharomyces cerevisiae este unul dintre cele mai

importante organisme în biotehnologie și ingineria genetică. Crearea
(construcția) de vectori de clonare pentru drojdii a fost stimulată de
descoperirea unei plasmide care este prezentă în majoritatea tulpinilor de
S. cerevisiae. Plasmida de 2 µm (așa cum este denumită) este una dintre
foarte puținele plasmide existente în celulele eucariotice (Brown, 2006). 
Importanța acestor vectori este dată de faptul că celulele de drojdie
sunt mult mai ușor de crescut și manipulat decât celulele vegetale și
animale. In acest context, trebuie menționat și faptul că, la drojdii,
mecanismele biochimice și de reglare celulară sunt similare sau identice
celor de la eucariotele superioare. Mai mult, în genomul celulelor de
drojdii există multe gene omoloage genelor umane, cum sunt, de
exemplu, cele implicate în diviziunea celulară. De aceea, drojdiile
constituie un sistem foarte adecvat pentru studiul structurii și funcțiilor
produșilor genelor eucariotice.
Există 5 tipuri diferite de vectori de clonare derivați din drojdii:
(1) plasmida de 2 µm; (2) plasmidele epizomale (YEp); (3) plasmidele
integrative (YIp); plasmidele replicative (); (5) cromozomii artificiali de
drojdie (YAC).
Caracteristicile diferitelor plasmide din drojdii, utilizate ca vectori
de clonare sunt prezentate în Tabelul 10.

Tabel 10. Caracteristicile diferitelor plasmide din drojdii, utilizate ca

vectori de clonare (Brown, 2006).
Vectorul Frecvența de Numărul Dezavantaje Avantaje
transformare de copii
per
celulă

YIp 102 transformanți 1 1. Frecvență scăzută de 1. Dintre toți vectorii, asigură

per µg ADN transformare; cea mai stabilă menținere a
2. Poate fi recuperat din genelor clonate
drojdii numai prin tăierea 2. O plasmidă Yip integrată se
ADN cu endonucleaze de comportă ca un marker
restricție care nu taie genetic obișnuit, de exemplu,
vectorul original un heterozigot diploid pentru
conținând gena clonată o plasmidă integrată segregă
plasmida în mod Mendelian
3. Poate fi folosit pentru a
introduce deleții, inversii și
transpoziții

38
 INGINERIE GENETICĂ

YEp 103-105 25-200 Recombinanți noi 1. Recuperare ușoară din

transformanți generați in vivo prin celulele de drojdie
per µg ADN recombinare cu plasmida 2. Număr mare de copii
de 2 µm endogenă 3. Frecvență ridicată de
transformare
4. Foarte utili pentru studiile
de complementație

YRp 104 transformanți 1-20 Instabilitatea 1. Recuperare ușoară din

per µg ADN transformanților celulele de drojdie
2. Număr mare de copii.
Numărul de copii este însă
mai mic decât acela al
vectorilor Yep, dar această
caracteristică poate fi utilă
dacă este clonată o genă a
cărui produs este dăunător
celulei atunci când este produs
în exces
3. Frecvență ridicată de
transformare
4. Foarte utili pentru studiile
de complementație
5. Se pot integra în cromozom

YCp 104 transformanți 1-2 Numărul mic de copii 1. Număr mic de copii,
per µg ADN face recuperarea din caracteristică utilă atunci când
drojdii mai dificilă decât produsel genei clonate este
aceea a vectorilor Yep dăunător pentru celulă
sau YRp
2. Frecvență ridicată de
transformare
3. Foarte utili pentru studiile
de complementație
4. Manifestă segregare de tip
Mendelian
YAC 1-2 Dificil de cartat prin 1. Sistem de clonare de
tehnicile standard capacitate ridicată, permițând
clonarea moleculelor de ADN
mai mari de 40 kb
Pot amplifica molecule mari
de ADN într-un fond genetic
simplu

Plasmida de 2 µm

Plasmida de 2 µm (Fig. 43) este o bază excelentă pentru un vector

de clonare. Are o mărime de 6 kb și un număr mare de copii per celulă
(între 70 și 200).
Această plasmidă se replică utilizând o origine plasmidială, câteva
enzime furnizate de celula gazdă, și proteinele codificate de genele REP1
și REP2, purtate de plasmidă.

39
 Alexandra Visoiu

Totuși, utilizarea plasmidei de 2 µm ca vector de clonare nu este

posibilă fără un marker de selecție. În acest scop, se utilizează o genă
normală de drojdie, în general una care codifică o enzimă implicată în
biosinteza aminoacizilor. Un exemplu este gena LEU2, care codifică 
β-isopropil-malat dehidrogenaza, una dintre enzimele implicate în
conversia acidului piruvic în leucină.
Pentru a utiliza LEU2 ca marker de selecție, este necesar un tip
special de organism gazdă. Acesta trebuie să fie un mutant auxotrofic care
conține o genă LEU2 nefuncțională.
O astfel de drojdie - leu2 este incapabilă să sintetizeze leucina și
poate supraviețui numai dacă acest aminoacid este adăugat ca nutrient în
(sau conținut de) mediul de creștere. Selecția este posibilă deoarece
transformanții conțin o o copie a genei LEU2 originară din plasmidă și
de aceea sunt capabili să crească în absența aminoacidului. Într-un
experiment de clonare, celulele sunt inoculate pe mediu minimal, care nu
conține aminoacizi. Numai celulele transformate sunt capabile să
supraviețuiască și să formeze colonii, fiind astfel ușor de diferențiat/
identificat.

Fig. 43. Harta plasmidei de 2 µm (Brown, 2010).

Plasmidele epizomale de drojdie 

40
 INGINERIE GENETICĂ

Plasmidele epizomale de drojdie (yeast episomal plasmids - YEp)

au fost construite pentru prima dată de Beggs (1978) prin recombinarea
unui vector de clonare în E. coli  cu plasmida 2 µm de la drojdie.
Termenul “epizomal” indică faptul că YEp se poate replica ca o
plasmidă independentă, dar implică și faptul că se poate produce
integrarea într-unul din cromozomii din celulele de drojdie. Integrarea are
loc deoarece gena purtată de vector ca marker de selecție este foarte
asemănătoare (similară) cu versiunea mutantă a genei prezente în ADN
cromozomial de drojdie.
Una dintre plasmidele epizomale construite pentru experimentele
de clonare în celulele de drojdie este YEp13 (Fig. 44), care are o mărime
de 10.7 kb și un număr de copii de 50-100 per celulă.

ADN de la pBR322

ADN de la plasmida
de 2 µm
ADN cromozomial
de drojdie

Fig. 44. Harta plasmidei epizomale de drojdie Yep13 (Brown, 2010).

YEp are cea mai ridicată frecvență de transformare, furnizând

între 10.000 și 100.000 celule transformate per μg.

Plasmidele integrative de drojdie 

Plasmidele integrative de drojdie (yeast integrative plasmids -

YIp) sunt în mod esențial plasmide bacteriene ce poartă o genă de
drojdie. YIp se găsește într-o singură copie per celulă și are o frecvență de
transformare mai mică de 1.000 transformanți per μg.

41
 Alexandra Visoiu

Fig. 45. Harta plasmidei integrative YIp5 (Brown, 2010).

Un exemplu de Yip este YIp5 (Fig. 45), care este în fapt pBR322
în care s-a inserat gena URA3. Această genă codifică orotidin-5′-fosfat
decarboxilaza și este utilizată ca marker de selecție. YIp nu se poate
replica ca o plasmidă, deoarece nu conține nicio parte a plasmidei de
2 μm, și depinde pentru supraviețuirea ei de integrarea în ADN
cromozomial de drojdie.

Plasmidele replicative de drojdie  

Plasmidele replicative de drojdie (yeast replicative plasmids -

YRp) au fost construite inițial de Struhl și colab. (1979), care au izolat
fragmentele de ADN cromozomial ce conțin secvențele care permit
vectorilor de E. coli să se replice în celulele de drojdie.  
YRp sunt capabile să se multiplice ca plasmidele independente,
deoarece ele poartă o secvență de ADN cromozomial care include o
origine de replicare. Originile de replicare sunt localizate foarte aproape
de câteva gene de drojdie, incluzând una sau două gene ce pot fi utilizate
ca marker de selecție.  
YRp se găsesc în număr de 5-100 per celulă și se caracterizează
printr-o frecvență destul de ridicată de transformare, respectiv între 1.000
și 10.000 transformanți per μg (Brown, 2010).
Una dintre plasmidele replicative utilizate în experimentele de
clonare este YRp7 (Fig. 46). Această plasmidă este construită din
pBR322 plus gena TRP1 de drojdie. Gena TRP1 este localizată adiacent
unei origini de replicare cromozomială și este implicată în biosinteza
triptofanului. Fragmentul de ADN de drojdie prezent în YRp7 conține atât
TRP1, cât și originea de replicare.

42
 INGINERIE GENETICĂ

Fig. 46. Harta plasmidei replicative de drojdie YRp7 (Brown, 2010).

2.6.2. Cromozomii artificiali de drojdie

Cromozomul artificial de drojdie (yeast artificial chromosome -

YAC) este o moleculă de ADN uman modificată prin inginerie
moleculară și utilizată pentru clonarea de secvențe de ADN în celulele de
drojdie. În YAC pot fi inserate segmente din ADN-ul unui organism, cu o
mărime de până la un milion de perechi de baze. YAC cu secvențele de
ADN inserate sunt introduși apoi în celulele de drojdie. Odată cu creșterea
și diviziunea lor, celulele de drojdie amplifică ADN din YAC.
Principalele caracteristici ale YAC sunt:

1) Segmentul mare de ADN (>100 kb) este legat între cele două
brațe. Fiecare braț se termină cu o telomeră de drojdie, așa
încât produsul genic poate fi stabilizat în celula de drojdie. În
mod interesant, cromozomii artificiali de drojdie mai mari
(lungi) sunt mai stabili decât cei mai scurți, ceea ce
favorizează clonarea de segmente mari de ADN.
2) Un braț conține o secvență de replicare autonomă (ARS), un
centromer (CEN) și un marker de selecție (trp1). Celălalt braț
conține un al doilea marker de selecție (ura3).
3) Inserția ADN în situsul de clonare inactivează o mutație
exprimată în ADN-ul vectorului și apar colonii de celule de
drojdie roșii.
4) Transformanții sunt identificați pe baza culorii roșii a
coloniilor care cresc din celulele de drojdie care sunt mutante
pentru trp1 și ura3. În acest fel este confirmată primirea de
către celulă a unui cromozom artificial cu ambele telomere
(datorită complementării celor două mutante), precum și faptul

43
 Alexandra Visoiu

că respectivul cromozom artificial conține insertul de ADN

(deoarece celulele sunt roșii).

Unul dintre cromozomii artificiali de drojdie folosit în

experimentele de clonare este pYAC3 (Fig. 47). Acest “cromozom”, cu o
mărime de 11.446 perechi de baze, este în mod esențial o plasmidă
pBR322 în care au fost inserate mai multe gene de drojdie. Două dintre
aceste gene, URA3 și TRP1, au mai fost utilizate ca markeri de selecție în
YIp5 (Fig. 45) și respectiv YRp7 (Fig. 46). Ca în YRp7, fragmentul de
ADN care poartă TRP1 conține de asemenea o origine de replicare, însă
în pYAC3 acest fragment este mărit, pentru a include secvența denumită
CEN4 (ADN din regiunea centromerică a cromozomului 4).

44
 INGINERIE GENETICĂ

(a) pYAC3

(b) strategia de clonare cu pYAC3

digestie cu enzimele de restricție

BamHI și SnaBI

brațul stâng brațul drept

ligare cu insertul ADN

având capete drepte

se inseră ADN

Fig. 47. (a) Harta cromozomului artificial de drojdie pYAC3; (b) strategia
de clonare utilizând vectorul pYAC3 (Brown, 2006).

Fragmentul TRP1 - origine de replicare - CEN4 conține așadar

două dintre cele trei componente ale cromozomului artificial. Cea de a
treia componentă - telomerele - este furnizată de cele două secvențe
denumite TEL (Fig. 47). Acestea nu sunt în sine secvențe telomerice
complete, dar odată ajunse în nucleul celulei de drojdie acționează ca
secvențele de la care pornește construcția telomerelor.
O ultimă componentă a pYAC3 este SUP4, un marker de selecție
în care este inserat ADN în cursul experimentului de clonare.  

45
 Alexandra Visoiu

Dacă au mărimea adecvată, cromozomii artificiali de drojdie se

comportă ca cromozomii existenți în mod natural, având o stabilitate
comparabilă cu a acestora.
Mărimea fragmentelor de ADN străin care pot fi inserate și
clonate într-un cromozom artificial de drojdie (YAC) poate fi de până la
10 megabaze.

2.6.3. Cromozomii artificiali bacterieni

Cromozomii bacterieni artificiali (bacterial artificial chromosomes

- BAC) au fost creați/construiți pentru a putea insera secvențe de ADN
mult mai mari decât cele ce pot fi inserate într-o plasmidă (She, 2004).
Vectorii BAC (Fig. 48) au fost creați inițial dintr-o parte a unei plasmide
neobișnuite prezente în unele bacterii, denumită plasmida F’. În această
plasmidă (care permite unei bacterii să inițieze, în condiții de stres, un
proces de transfer al genomului ei într-o altă bacterie) se pot insera
secvențe de ADN de la alte bacterii, cu o mărime de până la un milion de
perechi de baze. De asemenea, F’ are origini de replicare, iar bacteriile
posedă un mecanism de control al modului în care F’ este copiat.
Vectorii BAC au capacitatea de a conține până la 350 kb de
ADN și au toate mecanismele/instrumentele necesare pentru ca un vector
să funcționeze adecvat, cum sunt originile de replicare, genele de
rezistență la antibiotice și situsuri convenabile unde clona de ADN se
poate insera.
Mai recent, vectorii BAC au fost modificați pentru a deveni mai
convenabili de utilizat și, de asemenea, mai utili în situații speciale. Pe
lângă gena de rezistență la un antibiotic, care a fost adăgată pentru a
identifica bacteriile transfectate, s-a adăugat o genă ce permite bacteriilor
să transforme substanța incoloră X-gal/IPTG în albastru. Gena
schimbătoare de culoare, denumită lacZ, este despicată atunci când clona
de ADN este incorporată/inserată în vector, astfel încât devine posibil să
se constate nu numai dacă o bacterie a fost transfectată, ci și dacă bacteria
a fost transfectată cu vectorul conținând insertul de ADN, sau doar cu
vectorul (fără insert). Reamintim că dacă vectorul a incorporat în mod
adecvat clona de ADN, acesta își pierde capacitatea de a schimba culoarea
X-gal/IPTG în albastru (Fig. 49).
O modificare similară este introducerea genei sacB, care codifică
o proteină denumită levanzaharoză. Această proteină transformă zaharoza
în levan, o substanță toxică pentru bacterii. În același mod, bacteriile
crescute/cultivate pe medii cu zaharoză vor muri dacă sacB nu este

46
 INGINERIE GENETICĂ

despicată de către insertul ADN. Dacă vectorul poartă un insert ADN,

gena sacB este despicată și nu se va produce levanzaharoza, astfel că
bacteriile supraviețuiesc pe mediul cu zaharoză. Teoretic, doar bacteriile
transfectate cu un vector conținând insertul ADN vor fi capabile să
crească și să formeze colonii (Fig. 49).

Plasmida bacteriană

Gena de interes

Fig. 48. Cromozomul bacterian artificial (BAC) este o moleculă de ADN

construită prin inginerie moleculară, utilizată pentru a clona secvențe de
ADN în celulele bacteriene (de exemplu, în E. coli). În BAC pot fi
inserate segmente de 100.000 până la circa 300.000 perechi de baze din
ADN-ul unui organism. Cromozomii bacterieni artificiali cu ADN străin
inserat sunt reintroduși în celulele bacteriene. Odată cu creșterea și
diviziunea (multiplicarea) celulelor bacteriene are loc amplificarea ADN
conținut de BAC, care ulterior poate fi izolat și secvențiat (http://www.
genome.gov/Glossary/resources/bac_bacterial_artificial_chromosome.pdf

47
 Alexandra Visoiu

2.7. Vectori pentru transferul de gene în celulele vegetale

Construcția de vectori de clonare pentru plante (superioare) a

început în anii 80, iar utilizarea lor a dus deja la crearea a sute de plante
modificate genetic (transgenice).
Vectorii utilizați pe scară largă pentru clonare și exprimarea
genelor clonate în celulele plantelor superioare sunt plasmidele Ti de la
bacteria Agrobacterium tumefaciens (Herrera-Estrella și colab., 1983;
Hooykaas și Schilperoort, 1992). În cazuri speciale, în locul plasmidelor
Ti se pot utiliza ca vectori plasmidele Ri de la Agrobacterium rhizogenes
(Chilton și colab., 1982; Cardarelli și colab., 1987), sau unele virusuri
(virusul mozaicului tutunului - TMV; virusul X al cartofului - PVX;
virusul mozaicului lucernei - AMV; virusul mozaicului plantelor de
mazăre furajeră - CPMV) (Gleba și colab., 2008).

2.7.1. Vectori de cointegrare

Vectorii de cointegrare (sau vectorii cis) sunt derivați din

plasmidele Ti rezidente în tulpinile de Agrobacterium tumefaciens de tip
sălbatic, din care au fost îndepărtate genele onc localizate în regiunea
ADN-T. In unele cazuri, acestea au fost înlocuite cu o secvență specifică
de ADN având o regiune de omologie cu un mic vector de clonare capabil
de replicare numai în celulele de Escherichia coli. Acest sistem de vectori
este dependent de cointegrarea în Agrobacterium tumefaciens a regiunilor
omoloage de pe plasmida Ti modificată (helper vir) și de pe un vector mic
de clonare rezident în E. coli (vector intermediar), care conține o genă
marker de selecție având capacitatea de a funcționa în celulele plantelor,
și situsuri unice pentru integrarea de ADN străin. Vectorul intermediar
conținând secvențele de ADN străin este introdus în mod obișnuit în
Agrobacterium prin conjugare și, utilizând selecția adecvată, pot fi
obținuți transconjuganți în care ADN străin a fost integrat stabil în
interiorul ADN-T, ca rezultat al recombinării omoloage (Fig. 50).
In unii vectori, cum sunt pGV3850, ambele secvențe de flancare a
ADN-T (LB și RB) sunt pe plasmida modificată.
In vectori cum sunt pGV2260, secvențele de flancare sunt pe
vectorul intermediar, pe când în pTiBS3-SE secvența de flancare dreapta
(right border, RB) este conținută de vectorul intermediar, iar secvența de
flancare stânga a ADN-T (left border, LB) este conținută de plasmida
helper vir.

48
 INGINERIE GENETICĂ

Recombinare

Vectorul intermediar
(conține secvențele ADN-T)

Recombinare omoloagă
în cadrul secvențelor pBR322

Insertul ADN

Vector de cointegrare
(pTi)

Fig. 50. Reprezentarea diagramatică a recombinării omoloage între

plasmida Ti dezarmată (lipsită de genele oncogene) și vectorul
intermediar (recombinat) conținând insertul de ADN (gena de interes)
pentru a produce un vector cointegrativ. Legendă: LB și RB – granițele
stânga și respectiv dreapta ale ADN-T; neo – gena pentru enzima
neomicin fosfotransferază; kanr – gena de rezistență la kanamicină; ampr –
gena de rezistență la ampicilină; nos – gena pentru nopalin sintetază)
(http://nptel.ac.in/ courses/102103016/module3/lec23/1.html).

49
 Alexandra Visoiu

Indiferent de poziția inițială a secvențelor de flancare de 25 pb

(LB și RB), rezultatul cointegrării este inserția secvențelor de ADN străin
între secvențele LB și RB ale ADN-T, în plasmida modificată. Astfel,
tulpinile de A. tumefaciens conținând acest tip de vectori transferă ADN-T
în genomul plantelor pe care le infectează ca rezultat al funcționării
regiunii vir în cis.

2.7.2. Vectorii binari

Un sistem binar constă dintr-o plasmidă binară și o plasmidă

helper, utilizate împreună pentru a produce plante modificate genetic.
Termenul “binar” se referă la divizarea funcției de interes în două
părți, separate, pe două plasmide diferite. Astfel, în sistemul binar, 
ADN-T și genele vir sunt localizate pe repliconi separați.
ADN-T este localizat pe vectorul binar (regiunea non ADN-T a
acestui vector conținând originea/originile de replicare care pot funcționa
atât în E. coli cât și în A. tumefaciens, și genele de rezistență la antibiotic
utilizate în selecția pentru prezența vectorului binar în bacterii. Repliconul
ce conține genele vir este cunoscut sub denumirea de vir helper. Tulpinile
de Agrobacterium care poartă acest replicon și regiunea ADN-T (din care
au fost îndepărtate oncogenele care ar putea fi transferate celulelor unei
plante) sunt considerate dezarmate.
Plasmida helper conține genele vir originare din plasmida Ti de la
Agrobacterium tumefaciens. Aceste gene codifică sinteza unei serii de
proteine care taie plasmida binară la nivelul secvențelor de nucleotide ale
graniței stânga (LB) și graniței dreapta (RB), și facilitează transducția
ADN-T în celulele plantei gazdă. Plasmida helper conține de asemenea
un marker de selecție în celulele bacteriene și o origine de replicare (ori).
Plasmidele helper utilizate cel mai adesea sunt EHA101 și EHA105. In
EHA101, gena nptII introdusă în locul ADN-T necesită ca plasmidele
binare introduse în aceeași celulă bacteriană să codifice rezistența la un alt
antibiotic decât kanamicina. EHA105 a fost generată din EHA101 prin
deleția situs-direcționată a genei de rezistență la kanamicină și, în
consecință, este foarte utilă atunci când se dorește utilizarea kanamicinei
ca marker de selecție.
Vectorii binari (sau vectorii trans) au la bază plasmidele care se
pot replica atât în Escherichia coli, cât și în Agrobacterium tumefaciens,
și care conțin secvențele de flancare de 25 pb (LB și RB) ale ADN-T.

50
 INGINERIE GENETICĂ

2.8. Vectori pentru transferul de gene în celulele animale

Pentru transferul de gene în celulele animale au fost dezvoltate

numeroase sisteme de vectori virali. Acestea diferă mai mult sau mai
puțin dependent de organismul și/sau tipul de celule țintă.
Pentru transferul in vitro, ex vivo și in vivo de gene străine în
celulele umane, majoritatea vectorilor virali au derivat din virusurile ADN
sau ARN murine sau umane, dependent de posibilitatea și ușurința
manipulării genomurilor virale pentru crearea de vectori virali
recombinați (Walther și Stein, 2000). Vectorii utilizați în mod obișnuit au
fost creați din retrovirusuri, lentivirusuri, adenovirusuri, virusurile herpes
simplex și virusurile adeno-asociate (Tabel 11 și Fig. 54), datorită
cunoașterii detaliate a genomurilor lor, a caracteristicilor lor valoroase în
ceea ce privește capacitatea de infectare a celulelor țintă (infectivitatea),
accesibilității liniilor celulare helper pentru producerea de stocuri de virus
recombinat pentru infectarea celulelor țintă. Mai recent, pentru transferul
de gene în celulele animale (în primul rând, pentru aplicațiile din
domeniul terapiei genice) au fost create și testate multe alte sisteme de
vectori virali, derivate din virusul vaccinia, citomegalovirusul uman,
virusul Epstein-Barr, poxivirusuri, etc. De asemenea, au fost creați vectori
sintetici, bazați pe policationi (Fig. 55).

Vectorii retrovirali

Vectorii retrovirali sunt sisteme eficiente pentru introducerea de

gene străine în celulele țintă. O dovadă este faptul că circa 40% din
protocolurile clinice de terapie genică sunt realizate utilizând pentru
transferul de gene particule retrovirale recombinate.
Vectorii retrovirali sunt derivați din virusuri ARN ce posedă ca principală
caracteristică transcrierea inversă a genomului viral ARN într-o moleculă
dublu catenară de ADN viral, care este apoi inserată în ADN-ul celulei
gazdă.
Membrii acestei clase de virusuri ARN sunt virusurile leucemiei
murine (MuLV) și lentivirusurile, care sunt utilizate în mod extensiv
pentru ingineria moleculară a vectorilor virali.
Avantajele vectorilor retrovirali sunt determinate de
caracteristicile lor de integrare stabilă în genomul gazdă, infecțiozitatea
particulelor virale recombinate pentru o varietate largă de tipuri celulare
țintă și capacitatea de a insera și a purta gene străine cu o mărime
rezonabilă (Tabel 11).

51
 Alexandra Visoiu

Vectori virali Vectori sintetici

Membrana celulară

Fig. 54. Reprezentarea schematică a transferului de gene în celulele

mamaliene utilizând vectori virali (retrovirusuri, adenovirusuri, virusuri
adeno-asociate) și vectori sintetici (http://www.vision-research.eu/index.
php?id=906).

Dezavantajele vectorilor retrovirali sunt instabilitatea unora dintre

ei, posibila mutageneză inserțională prin integrarea lor randomizată în
ADN-ul celulelor gazdă, și necesitatea diviziunii celulare pentru
integrarea vectorilor retrovirali derivați din MuLV, care face anumite
tipuri celulare refractare la infecția virală. In plus, pentru aplicațiile
clinice, exprimarea genei terapeutice (introdusă de retrovirusul
recombinat) rămâne încă nesatisfăcătoare. Cu toate aceste dezavantaje,
vectorii retrovirali vor rămâne sistemul de transfer de gene cel mai
adecvat pentru majoritatea aplicațiilor de terapie genică.

Vectorii lentivirali

Virusul imunodeficienței umane (HIV), cunoscut ca fiind cauza

sindromului imunodeficienței dobândite umane, este un lentivirus. Acest

52
 INGINERIE GENETICĂ

tip de retrovirus are anumite caracteristici/proprietăți de interes pentru

crearea de vectori virali utilizabili pentru clonarea și transferul de gene în
celulele umane. Una dintre aceste caracteristici este capacitatea HIV de a
infecta și de a se integra în celulele care nu se divid, caracteristici ce
lipsesc vectorilor derivați din virusul leucemiei murine. Datorită acestei
capacități, lentivirusurile pot ajunge în nucleu fără să implice mitoza.
Utilizarea vectorilor bazați pe HIV exploatează această caracteristică, ei
fiind foarte utili pentru dirijarea/introducerea de gene străine în țesuturilor
ale căror celule nu se divid și în populațiile de celule diferențiate, cum
sunt cele nervoase, musculare, hematopoetice, etc.
Pentru realizarea transferului de gene în condiții de securitate și
într-o gamă extinsă de tipuri de celule (altele decât celulele lor țintă în
mod natural) în aceeași manieră în care se realizează prin utilizarea altor
vectori retrovirali, genomul HIV a fost reproiectat într-o măsură
importantă din punct de vedere genetic. Vectorii bazați pe HIV au fost
testați pentru eficiența transferului de gene și pentru siguranța utilizării lor
(pentru a exclude posibila reconstituire a capacității de replicare
patogenică în pacienții competenți pentru HIV). In acest scop, au fost
puse la punct sisteme de exprimare tranzientă, pentru producerea de
particule lentivirale recombinate, în care genele pentru sinteza învelișului
viral sunt localizate pe două plasmide separate, în timp ce vectorul
lentiviral poartă transgena. Mai mult, secvențele ce codifică proteinele
virale accesorii (vif, vpr, vpu, nef) au fost deletate pentru a preveni orice
interferență a acestor proteine lentivirale cu controlul ciclului celular în
celulele recipient.
Transferul genei reporter pentru β-galactosidază sau luciferază
utilizând vectori derivați din HIV-1 a demonstrat că macrofagele
diferențiate și, de asemenea, neuronii pot fi infectate în mod efectiv
in vitro și in vivo (Naldini și colab., 1996). Totuși, complexitatea
genomului HIV și mecanismele de reglare a replicării virale determină
temeri în ceea ce privește utilizarea în condiții de securitate maximă a
vectorilor lentivirali. Acestea privesc potențialul de dereglare a creșterii
celulare, mutageneza și recombinarea, care ar putea avea un impact
dramatic asupra potențialului de utilizare clinică a acestor vectori.

Vectorii virali ADN

Spre deosebire de retrovirusuri, virusurile ADN conțin în genomul

viral ADN monocatenar sau dublu catenar. Din punct de vedere al
utilizării ca vectori pentru transferul de gene, cele mai importante virusuri

53
 Alexandra Visoiu

ADN sunt adenovirusul, virusul adeno-asociat (AAV) și virusul herpes

simplex (HSV). Aceste virusuri sunt utilizate în mod extensiv pentru
construirea de vectori datorită capacității lor mari de împachetare, gamei
largi de celule țintă pentru infecție, eficienței infecției virale și a
transferului de gene (Tabel 11).
Mai recent, alte câteva virusuri ADN au devenit interesante pentru
construirea de vectori virali, cum sunt virusul Epstein-Barr, virusul
vaccinia, sau parvovirusurile.

Vectorii adenovirali

Adenovirusurile sunt virusuri ADN necapsulate, icozaedrice, ale

căror molecule de ADN liniar dublu catenar au o mărime de circa 36 kb.
Pe baza proprietăților lor de hemaglutinare pot fi distinse peste 50 de
serotipuri (Pereyra și Hereñu, 2013), care au fost încadrate în 6 subgrupe
(A-F). Tipurile de adenovirus cel mai bine caracterizate sunt tipul 2 (Ad2)
și tipul 5 (Ad5), care sunt membrii ai subgrupei C. Aceste serotipuri
virale au fost utilizate pentru crearea prin inginerie moleculară a primilor
vectori adenovirali, deoarece s-a descoperit că ele nu sunt asociate cu boli
umane severe și prin urmare sunt adecvate pentru aplicațiile in vivo
(Douglas, 2004; Tatsis și Ertl, 2004).
Modificările genomului adenoviral se bazează pe deleția genei
timpurii 1 (early gene 1, E1A) pentru a crea vectori incapabili de replicare
și cu spațiu suficient pentru inserții de gene, deoarece gena E1A este
esențială pentru replicarea virusului. In această primă generație de vectori
adenovirali, pe lângă deleția genei E1A, au fost realizate deleții parțiale
ale genelor E1B și E3, pentru a crea mai mult spațiu pentru inserția de
gene străine. Transgenele ADN sunt introduse în regiunile E1, E3 ale
genomului adenoviral. Capacitatea de împachetare a acestor vectori
adenovirali este de 7 până la 8 kb, care probabil nu este capacitatea
maximă de inserție.
Pentru generarea de particule virale infecțioase, sunt necesare
celule helper, care furnizează (în trans) proteina esențială E1A pentru
încapsularea eficientă a virusului. In acest scop se utilizează linia celulară
293 derivată din rinichi uman, în care a fost inserată stabil gena E1A și
care, prin urmare, poate asigura producerea stocurilor de virus
recombinat. Celulele din linia 293 sunt în mod deosebit adecvate și
datorită faptului că sunt ușor de transfectat și produc titruri virale ridicate.
Utilizând aceste sisteme pot fi obținute titruri virale de 10 10 cfu/ml, ceea
ce reprezintă un mare avantaj față de vectorii retrovirali, întrucât astfel de

54
 INGINERIE GENETICĂ

titruri asigură transferul eficient al genei in vivo. Mai mult, vectorii

adenovirali au un tropism celular larg și pot infecta celulele care nu se
divid.
Dezavantajul vectorilor adenovirali este starea lor epizomală în
celula gazdă, care permite doar exprimarea tranzientă a genei străine
(de exemplu, a genei terapeutice). In plus, exprimarea proteinei virale E2
provoacă reacții inflamatorii și toxicitate, ceea ce limitează aplicarea
repetată a vectorilor adenovirali și astfel determină reținere față de
utilizarea lor pentru terapia genică în scopul corectării unor gene ce
cauzează boli ereditare.
S-a demonstrat că nivelul restant de replicare virală al vectorilor
din prima generație induce răspunsuri imune dependente de CD4+ și
CD8+, care conduc la o durată redusă a exprimării transgenei in vivo.
Pentru a împiedica reacțiile imunogenice după transferul transgenei, a fost
proiectată o nouă generație de vectori adenovirali (a doua generație),
din care au fost eliminate funcțiile genei E2A. In plus, acești vectori sunt
modificați și prin mutația sau deleția genei virale E4 (Yang și colab.,
1994; Dedieu și colab., 1997). Vectorii din a doua generație necesită linii
celulare helper care pot asigura funcția genei E4, necesară pentru reglarea
transcripției, tranziția de la exprimarea timpurie a genei virale la cea
târzie, transportul ARNm, replicarea ADN viral, întreruperea exprimării
genelor gazdei și asamblarea virionilor.
Mai recent, au fost creați vectori adenovirali defectivi, la care au
fost îndepărtate toate regiunile codificatoare ale virusului, fiind păstrate
doar repetițiile inversate terminale (inverted terminal repeats, ITR) și
secvențele psi de împachetare. Astfel de vectori adenovirali au fost
utilizați cu succes pentru exprimarea versiunii integrale a genei pentru
distrofină (implicată în apariția distrofiei musculare) și a genei reglatoare
a conductanței transmembranare – CFTR (implicată în apariția fibrozei
chistice). Avantajul acestor vectori este acela că sunt mai puțin
imunogenici și produc titruri virale ridicate în linia celulară 293.
In prezent sunt investigate multe strategii pentru combinarea
avantajelor vectorilor adenovirali cu imunogenicitatea redusă și nivelul
ridicat de exprimare, și de durată lungă, a transgenelor. Astfel, au fost
proiectați vectori himerici cum sunt cei adenovirus-AAV sau adenovirus-
retrovirus pentru a realiza integrarea virală în ADN-ul celulelor gazdă în
asociere cu o infecțiozitate ridicată și un nivel ridicat al exprimării
transgenei (Bischoff și colab., 1996).
Crearea de sisteme de vectori himerici adenovirus-retrovirus are
ca scop combinarea capacității vectorilor adenovirali de a infecta eficient

55
 Alexandra Visoiu

celulele țintă in vitro și in vivo, și capacitatea retrovirusurilor de a se

integra stabil în genomul gazdă, care este asociată cu exprimarea de lungă
durată (Bilbao și colab., 1997). Vectorul himeric conține funcțiile de
împachetare retrovirală (gag, pol, env și psi) și repetițiile lungi terminale
(LTR) ale vectorului retroviral, și secvența transgenei inserată în regiunea
E1 a adenovirusului. Celulele țintă pot fi infectate în mod eficient cu
aceste himere, care apoi produc in situ copii ale vectorului retroviral, ce
vor infecta celulele învecinate. Acest proces duce la integrarea și
exprimarea de lungă durată a transgenei.
Valoarea vectorilor himerici de acest fel este limitată de faptul că
numai celulele învecinate care se divid pot fi infectate în mod eficient de
către particulele retrovirale nou formate. Totuși, vectorii himerici sunt
sisteme promițătoare pentru introducerea de gene în celulele mamaliene
și în special pentru aplicațiile de terapie genică.

Vectorii derivați din virusurile adeno-asociate

Virusurile adeno-asociate (AAV) sunt virusuri cu genom ADN

monocatenar, încadrate în familia Parvovirusurilor. Gama de tipuri
celulare ce pot fi infectate de AAV este largă. Deși majoritatea populației
umane este seropozitivă pentru AAV, nu au fost observate modificări
patologice determinate de infecția cu acest virus.
AAV conține 2 gene, rep și cap, ce codifică polipeptide esențiale
pentru replicarea și încapsularea virusului. Cele 2 gene sunt flancate de
repetiții inversate terminale (ITR) virale.
AAV necesită un adenovirus sau un virus herpes pentru replicarea
virală și au nevoie de stimulare de către, de exemplu, proteinele
adenovirale E1 și E4. Mai mult, pentru o infecție productivă, AAV
necesită proteinele adenovirale E1B și E4. Proteina adenovirală E4 joacă
de asemenea un rol crucial în sinteza celei de a doua catene a ADN în
AAV. Acest proces este important pentru conversia genomului mono-
catenar al AAV într-o moleculă de ADN dublu catenară, competentă
pentru transcripție (Fisher și colab., 1996).
Imposibilitatea renunțării complete la virusurile helper reprezintă
un obstacol în aplicarea pe scară largă a vectorilor AAV recombinați
pentru transferul de gene în celulele mamaliene, de exemplu, pentru
terapia genică.
Spre deosebire de adenovirusuri, AAV au imunogenicitate
scăzută, ceea ce este important pentru utilizarea vectorilor AAV
recombinați în terapia genetică umană. Pentru construirea de vectori

56
 INGINERIE GENETICĂ

bazați pe AAV recombinat, genele rep și cap sunt înlocuite cu genele

terapeutice și promotorii interni care reglează exprimarea transgenei.
AAV are însă o capacitate limitată de inserție de ADN străin, cuprinsă
între 4.1 și 4.9 kb (Dong și colab., 1996).
S-a raportat că vectorii AAV recombinat sunt adecvați pentru
transferul in vitro și in vivo de gene în celulele musculare, celulele
progenitoare hematopoetice, neuroni, celulele fotoreceptoare și celulele
hepatice (Zhou și colab., 1994; Kaplitt și colab., 1994; Ali și colab., 1996;
Nakai și colab., 1998). De altfel, sunt în curs de desfășurare studii
preclinice de terapie genică bazată pe utilizarea vectorilor AAV
recombinați, pentru beta-talasemie, anemia falciformă, anemia Fanconi,
boala granulomatoasă cronică, boala Gaucher, boala Parkinson, fibroza
chistică și leucodistrofia metacromatică.

57