3.

CULTIVAREA MICROORGANISMELOR PATOGENE IN LABORATOR

3.1. MEDII DE CULTURĂ – NOŢIUNI GENERALE

Pentru a putea fi studiate în laborator microorganismele sunt cultivate pe medii de cultură şi

în anumite condiţii optime de cultivare, care se stabilesc, de regulă, pe cale experimentală.
Mediul de cultură (mediul nutritiv) reprezintă un substrat care favorizează dezvoltarea
microorganismelor, fiind obţinut prin amestecarea mai multor substanţe cu proprietăţi şi
compoziţie specifice.
Mediile nutritive sunt utilizate la izolarea, înmulţirea şi conservarea timp îndelungat a
microorganismelor, precum şi pentru studierea proprietăţilor lor (caractere de cultură, proprietăţi
biochimice) în vederea identificării taxonomice.
Compoziţia chimică a unui mediu de cultură este dependentă de tipul de microorganism
cultivat şi de capacitatea lui de biosinteză. De aceea, nu există o reţetă care să răspundă
necesităţilor nutritive ale tuturor microorganismelor, dar în practică se folosesc cu succes mediile
uzuale, medii de bază care constituie suportul nutritiv pentru creşterea unui număr mare de
germeni.
În prezent există şi se comercializează o serie de medii de cultură deshidratate, care sunt
ambalate în flacoane sau direct in cutii Petri sterile ce conţin membrane filtrante cu grilaj (pentru
a facilita numărarea microorganismelor) şi care înainte de utilizare trebuie rehidratate cu de apă
distilată sterilă.
Mediile cromogene/fluorogene contin un substrat legat de o substanta
cromogena/fluorogena iar clivarea acestei legaturi datorita enzimelor microbiene determina o
reactie de culoare/fluorogena. Populatia microbiana tinta contine sistemul enzimatic ce
metabolizeaza substratul si elibereaza substanta cromogena, fapt care determina o modificare a
culorii/fluorescentei mediului sau a culturii microbiene. Aceste medii sunt folosite in mod uzual
pentru enumerarea, detectia si identificarea prezumtiva a unor specii microbiene provenite din
probe clinice, probe de apa, mediu sau alimente.
Un mediu de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
 Să asigure microorganismelor cultivate cantităţile optime de
apă şi de substanţe nutritive specifice, care pot avea rol de sursă de carbon şi energie, sursă de
azot, săruri minerale sau factori de creştere.
- Sursa de carbon şi energie necesară reacţiilor de biosinteză, creşterii şi multiplicării
microorganismelor este reprezentată de compuşi organici (polizaharide, proteine, lipide)
şi anorganici.
- Sursa de azot este necesară biosintezei celulare de proteine şi acizi nucleici.
Microorganismele utilizează surse de azot organic (proteine, peptone, aminoacizi) sau
compuşi anorganici cu azot (azotaţi, azotiţi).
- Sărurile minerale: sunt necesare în cantităţi mici şi au rolul de a menţine echilibrul ionic
al celulei. Aceste substanţe trebuie să asigure microorganismelor câteva elemente chimice
necesare dezvoltării normale, ca de exemplu: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, Co2+.
 - Factorii de creştere (purinele şi pirimidinele, aminoacizii şi vitaminele): sunt necesari
în cantităţi mici acelor tulpini microbiene, numite tulpini auxotrofe, care sunt incapabile
să îi sintetizeze pornind de la substanţele cu rol de sursă de carbon sau azot.
 Să ofere condiţii optime de aerare, umiditate şi să aibă un
anumit grad de alcalinitate sau aciditate, în funcţie de necesităţile microorganismului cultivat.
 Să fie steril şi să fie repartizat în recipiente sterile care să
asigure menţinerea sterilităţii şi protecţia faţă de lumină.

La prepararea unui mediu de cultură se parcurg următoarele etape:

 cântărirea ingredientelor conform reţetei (cu ajutorul balanţei analitice şi farmaceutice),
dizolvarea şi omogenizarea acestora în jumătate din cantitatea de apă, după care se adaugă restul
de apă;
 determinarea pH-ului şi corectarea acestuia, dacă este cazul;
o Determinarea pH prin metoda colorimetrică implică folosirea indicatorilor de pH
(de exemplu: albastru bromtimol, metil-orange, roşu de metil, fenoftaleină) sau
hârtia de pH.
o Determinarea pH prin metoda electrometrică foloseşte pH-metrul, care măsoară
diferenţa de potenţial electric generat de diferenţa de concentraţie a ionilor de
hidrogen între cei doi electrozi.
 filtrarea mediului de cultură pentru a îndepărta eventualele precipitate şi recorectarea pH-
ului (dacă este cazul);
 sterilizarea se realizează după o metodă adecvată compoziţiei mediului (pentru
majoritatea mediilor prin autoclavare la 121°C, timp de 15-20 de minute, iar în cazul mediilor ce
conţin zaharuri prin autoclavare la 110°C, timp de 10-15 minute sau prin filtrare sterilizantă);
 ajustarea pH-ului;
 repartizarea mediului nutritiv în recipienţi sterili (eprubete, flacoane Erlenmayer sau plăci
Petri) care pot fi păstraţi câteva săptămâni la 4°C;
 înainte de folosirea mediilor se realizează un control al sterilităţii prin incubare timp de
24 de ore la 37°C sau la temperatura camerei.
În laboratoarele cu volum mare de lucru (laboratoare de cercetare, medicale, de analiză şi
control a produselor alimentare) se folosesc aparate pentru prepararea şi repartizarea mediilor de
cultură, care sunt construite din materiale autoclavabile şi permit repartizarea unor volume
exacte de mediu (Figura 3.1.).

3.2. CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURĂ

Diversitatea compoziţiei mediilor de cultură impune realizarea unei clasificări care să ţină
cont de mai multe criterii:
1. După consistenţă:
  medii lichide;
 medii semisolide;
 medii solide.

(a)

(b)

Fig. 3.1. Aparatul pentru prepararea şi repartizarea mediilor de cultură (a) şi

utilizarea acestuia (b)
1-Prepararea mediului de cultură; 2-Omogenizarea mediului cu ajutorul unui agitator
magnetic; 3-Sterilizarea prin autoclavare; 4-Fixarea aparatului pe o placă-termostat, care
împiedică solidificarea mediilor cu agar; 5-Repartizarea unor volume exacte de mediu în
plăcile Petri sau în eprubete; 6-Pe măsură ce mediul se consumă se apasă pistonul pentru
menţinerea unei presiuni corespunzătoare.

Mediile solide se subclasifică în:

 medii solide propriu-zise, care sunt în stare solidă prin însăşi componenţa lor, cum
sunt cele preparate din seminţe, fragmente de tulpină, tuberculi, rădăcini etc. (de exemplu:
mediul cu cartof care se repartizează în tuburi Roux);
  medii solidificate cu ajutorul gelatinei, silicagelului sau agarului. Agarul este cel mai
utilizat agent de solidificare a mediilor, deoarece nu este metabolizat de către microorganisme,
nu modifică pH-ul mediului şi are proprietatea că la 40°C se prezintă sub formă de gel, iar la
100°C sub formă lichidă;
2. După provenienţă:
 medii naturale: medii care conţin produse obţinute din surse naturale (de exemplu:
mediul cu lapte, cu must de malţ);
 medii sintetice: medii care au o compoziţie chimică bine definită (spre exemplu mediul
Czapek-Dox) ;
 medii artificiale: medii care conţin ingrediente cu compoziţie chimică nedefinită (de
exemplu, extracte organice din levuri, extracte vegetale sau animale, sange). Serul si
sangele se adauga cand mediul are 500C. Se aduga 5 - 10% sange si 0.2% anticoagulant
(citrat de sodiu) sau se folosesc produse comerciale;
3. După compoziţie:
 medii minimale: utilizate la cultivarea microorganismelor cu necesităţi nutriţionale
scăzute;
 medii complexe: folosite la cultivarea şi conservarea germenilor care necesită numeroşi
factori de creştere (în această categorie intră majoritatea mediilor de cultivare a
germenilor patogeni);
4. După scopul utilizării:
 medii uzuale simple: sunt folosite curent în laborator pentru izolarea şi obţinerea de
culturi microbiene pure (spre exemplu: bulionul nutritiv, apa peptonată, geloza simplă);
 medii speciale: care pot fi de mai multe tipuri şi sunt folosite în scopuri bine precizate.
Din categoria mediilor speciale fac parte:
 mediile de conservare sau de menţinere – sunt destinate conservării timp îndelungat a
microorganismelor (mediul geloză simplă pentru bacterii, mediul YPG (Yeast Peptone Glucose)
pentru drojdii şi mediile Sabouraud şi Czapek-Dox pentru fungi);
 mediile de transport – care permit supravieţuirea tulpinilor microbiene ce nu pot fi
însămânţate imediat după recoltare (de exemplu mediul Amies, mediul Amies cu carbune,
mediul Carry-Blair, mediul Stuart, mediul Stuart cu carbune);
 mediile selective – conţin unul sau mai mulţi agenţi inhibitori (coloranţi, antibiotice,
săruri biliare) care au scopul de a limita multiplicarea anumitor microorganisme dintr-un amestec
de mai multe specii microbiene (de exemplu, un mediu ce conţine cristal violet - 1/500.000
inhibă dezvoltarea microorganismelor Gram-pozitive);
 mediile de îmbogăţire – prin compoziţia lor oferă condiţii preferenţiale de creştere
anumitor specii bacteriene, care se pot înmulţi şi dezvolta mai rapid decât microorganismele din
asociaţie. Există mai multe procedee care favorizează creşterea numărului de celule din specia de
interes dintr-o proba, cum ar fi: tramentele termice (de exemplu, incalzirea probelor la 800C,
timp de 30 minute pentru a izola bacterii patogene sporulate Bacillus cereus, Clostridium
botulinum) pH-ul selectiv al mediului, anumite substanţe nutritive din mediu (de exemplu,
mediul bulion cu selenit este folosit la îmbogăţirea probelor pentru izolare de Salmonella sp.),
etc.;
  mediile de diagnostic diferenţial – care, prin compoziţia lor, evidenţiază anumite
particularităţi metabolice, caracteristice unei specii de microorganisme (spre exemplu, mediul
agar-sange pentru a diferentia microorganismele hemolitice care lizeaza hematiile);
 mediile selective si diferenţiale – medii care conţin agenti selectivi si diferentiali (de
exemplu, mediul MSA contine manitol si sare pentru selectie si indicator rosu-fenol pentru
diferentiere; mediul bulion cu triptoza si lauril sulfat LST pentru identificarea prezumtiva a
bacteriilor coliforme din apa si probe de alimente contine agent selectiv lauril sulfat impotriva
non-coliformilor, lactoza care permite diferentierea coliformilor ce fermenteaza lactoza cu
producere de gaz si triptoza, clorura de sodiu care imbunatatesc balanta osmotica, asigura
cresterea celulelor si formarea gazului ).
5. După prezenţa sau absenţa oxigenului:
 medii pentru cultivarea microorganisme aerobe;
 medii pentru cultivarea microorganisme anaerobe (de exemplu, mediul Veillon care se
repartizează în tuburi Weinberg). Mediile pentru anaerobi pot avea aceeaşi compoziţie ca
şi mediile pentru aerobi, dar li se adaugă substanţe cu efect reducător (acid ascorbic,
cisteină, fragmente proaspete de organe vegetale sau animale, boabe de orez în curs de
germinare, boabe de strugure, bucăţi de ridiche, ficat, splină, tioglicolat de sodiu).

3.3. CULTIVAREA MICROORGANISMELOR PATOGENE IN

LABORATOR

Cultivarea microorganismelor se referă la asigurarea pentru o cultură microbiană a

condiţiilor optime de dezvoltare, dintre care cele mai importante sunt:
 disponibilitatea substanţelor nutritive
 conditii de aerare (Tabel 3.1);

Tabel 3.1. Distributia microorganismelor patogene in functie de conditiile de aerare

Conditii de aerare Microorganisme
Atmosfera normala Majoritatea patogenilor
2.5-10% CO2 Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinomyces viscosus, Brucella sp.,
Campylobacter jejuni, C. fetus (optim 6% O2, 10%CO2, 84%N2),
Dermatophilus congolensis (izolat primar), Francisella tularensis,
Haemophilus sp., Taylorella equigenitalis;

Anaerob Actinomyces bovis, Bacteroides sp., Campylobacter mucosalis,

Clostridium sp., Eubacterium sp., Fusobacterium sp., Peptostreptococcus
sp., Serpulina hyodsenteriae

 temperatura optimă de dezvoltare (Tabel 3.2);

Tabel 3.2. Distributia microorganismelor patogene in functie de temperatura optima de

dezvoltare
 Temperatura de incubare Microorganisme/scop
0
4C Imbogatire la rece a tulpinilor de Listeria monocytogenes (din
probe de creier), Yersinia enterocolitica si Y. pseudotuberculosis
(din probe fecale);
250C Se cultiva drojdiile si majoritatea fungi filamentosi dermatofiti
0
28-30 C Creste Leptospira interrogans serovar
0
37 C Se cultiva majoritatea bacteriilor patogene si fungul dermatofit
Trichophyton verrucosum
0
42 C Creste Campylobacter jejuni

 timpul de incubare (Tabel 3.3).

Tabel 3.3. Distributia microorganismelor patogene in functie de timpul de incubare

Timp de incubare Microorganisme

24 – 48 ore Majoritatea bacteriilor
48-72 ore Bacterii inoculate pe medii selective
4-6 zile Brucella sp., Campylobacter sp., Nocardia sp., Mycoplasma sp., fungi
care cresc repede
2-3 saptamani Mycobacterium avium si majoritatea dermatofitilor (Tricophyton
verrucosum pana la 5 saptamani)
3-8 saptamani M. bovis
4-16 saptamani M. paratuberculosis

 domeniul de pH optim;
 viteza de agitare.

Bacteriile care nu cresc pe medii uzuale de laborator (Chlamydia sp., B. piliformis, unele
mycobacterii) se cultiva pe oua sau culturi celulare selectate.
Tabel 3.4. Medii utilizate in microbiologia medical-veterinara:
Mediu Utilizare Substrat/ Indicator Inhibitor Observatii
sursa de pH
carbon
Geloza Mediu nutritiv de - -
simpla/ baza pentru bacterii
Bulion
nutritiv
TSA/TSB Mediu nutritiv de - - Colonii de P.
Tryptic soy baza pentru bacterii aeruginosa
agar/ Tryptic (albastru), E.
broth faecalis (alb) si S.
aureus (galben)

Sabouraud Mediu pentru fungi Glucoza - - Variante Sabouraud

(Czapek- cu cicloheximida si
Dox) cloramfenicol pentru
fungi dermatofiti,
Sabouraud cu ulei de
masline pentru drojdii
lipofile
Colonii de Candida
albicans
 Agar- Cresc majoritatea Celule rosii - - Serul si sangele se
sange bacteriilor patogene ale adauga cand mediul
sangelui are 500C. Se aduga 5-
10% sange si 0.2%
(arata
anticoagulant (citrat
hemoliza) de sodiu) sau se
folosesc produse
comerciale.
Colonii beta-
hemolitice de S.
aureus
Agar- Mediul imbogatire Celule rosii - - Sangele devine
ciocolat pentru lizate ciocolatiu la
Haemophilus sp. si pentru a temperatura de 70-
Pneumococcus sp. elimina 800C
factorii X Colonii de H.
si V influenzae

MSA Mediul selectiv Manitol Rosu- Sare Indica fermentatia

Manitol-sare- pentru fenol manitolului (prin
agar Staphylococcus sp. acidifiere determina o
(Chapman) schimbare a culorii
mediului din rosu/roz
in galben)
Colonii S. aureus
manitol-pozitive
Edwards Mediul selectiv Esculina, - Cristal Indica hidroliza
pentru streptococi celule rosii violet, esculinei si hemoliza
ale thiosulfat Colonii S. agalactiae
sangelui
Gundel-Tietz Mediu selectiv agar-sange, - - Indica reducerea
pentru cistina, teluritului de potasiu
Corynebacterium telurit
sp.

MacConkey Izolare Lactoza Rosu Saruri Bacterii lactozo-

Enterobacteriaceae neutru biliare pozitive apar rosii cu
si unele bacterii halou opac roz (E.
coli - rosii, non-
Gram-negative
mucoide;
Enterobacter
aerogenes - roz-rosii,
mucoide) iar cele
lactozo-negative
(Salmonella sp.,
Shigella sp. Proteus
sp.) - incolore,
transparente/opace
Colonii E. coli si S.
enterica
 Istrati- Mediu diferential Lactoza Albastru - Bacterii lactozo-
Meitert pentru de pozitive E. coli -
Enterobacteriaceae bromtimol galbene, opace;
Shigella sp. - verzi,
transparente;
Salmonella sp. -
verzi-albastre;
Proteus sp. - verzi-
albastre cu centrul
negru, neinvaziv;
Pseudomonas sp. -
albastre;
XLD agar Izolare/ Xiloza, Rosu Saruri Coloniile de Shigella
Xilose-lisine- diferentiere tulpini lactoza, fenol biliare sp. - rosii;
deoxycholate de Salmonela sp. si sucroza, Salmonella sp.– rosii,
cu centrul coloniei
agar Shigella sp. lizina si
este negru (H2S)
detectie Colonii de
H2S Salmonella sp. (rosu,
negru), Shigella sp.
(rosu), coliformi
(galben-portocaliu),
Proteus sp. (roz)
ADCL agar Izolare Salmonella Lactoza, Rosu Deoxicholat Colonii S. enterica
Deoxycholate sp./diferentiere fata citrat de fenol lactozo-negative,
citrate de Proteus sp. (care sodiu si H2S pozitive (negru)
si lactozo-pozitive
lactose agar este inhibat) feric,
(roz)
detectie
H2S
 EMB agar Izolare si Lactoza, Eosin, - E. coli formeaza
Eosin identificare albastru colonii negre lucioase
methylene prezumtiva E. coli de metilen cu halou metalic;
blue agar si Candida albicans Candida albicans
/ diferentiere colonii plumoase spre
bacterii lactozo- deosebire de alte
pozitive (E. coli) specii de Candida sp.
fata de lactozo- Colonii de E. coli
negative
(Salmonella sp.)
Cetrimide Izolare Cetrimide, Ps. aeruginosa
agar Pseudomonas agent formeaza colonii
aeruginosa inhibitor albastre,
pentru alte fluorescente
bacterii, care (uneori)
mareste Colonii de
producerea Ps. aeruginosa
de pigment
(piocianina,
fluoresceina)
Lowenstein- Mediu pentru Ou - Verde
Jensen Mycobacterium sp. malachit

Bromcrezol- Mediu pentru Lapte praf Brom- -

purpur- diferentiere specii crezol
lapte-glucoza de Trichophyton si purpur
agar Microsporum
persicolor

Sursa imaginilor: Wikipedia, http://www.bacteriainphotos.com, www.tgw1916.net