Tehnici experimentale moderne de studiu in biofizica: tehnica voltage-clamp: msurarea curenilor electrici transmembranari si tehnica patch-clamp de studiere a canalelor

ionice
Studiul proprietatilor electrice pasive ale membranelor celulare constituie obiectul a numeroase cercetari de biofizica si biochimie. Este stiut faptul ca membrana celulei vii prezinta proprietati electrice pasive (rezistenta, respectiv conductanta si capacitate, ori impedanta, daca ne referim la comportarea in curent alternativ). Ca structura vie, membrana celulara constituie un sistem coloidal macromolecular coerent, ce presupune o faza dispersanta proprie (mediu de dispersie propriu) prin care particulele incarcate electric se pot misca realizand un transport de sarcini. Particularitatile mediului de dispersie, precum si sarcinile fixe proprii fazei dispersate (biomoleculele) conditioneaza acest transport prin membrana, reliefand ceea ce numim conductanta membranei. Structura trilamerara a acesteia, pe de alta parte, cu stratul lipidic intermediar caracterizat printr-o constanta dielectrica inalta, joaca un rol important in mentinerea separarii sarcinilor pe cele doua fete ale membranei intocmai ca dielectricul unui condensator. Fluctuatiile valorilor acestor parametri ai membranei (rezistenta si capacitate) in diferite conditii sau stari functionale intervin in mare masura in determinarea manifestarilor complexe care au loc la nivelul acesteia. Circuitul echivalent al unei membrane tipice este redat in Figura 1.

Figura 1 Circuitul echivalent al unei membrane celulare Capacitatea membranei (Cm) este determinata de proprietatile dieletrice ale membranei in ansamblu (stratul bilipidic) si este independenta de variatiile locale de permeabilitate date de canalele ionice. Rezistenta membranei (Rm) reprezinta proteinele transmembranere (canalele ionice) prin care ionii pot traversa membrana. Spre deosebire de capacitatea membranei, rezistenta este dependenta de potentialul transmembranar si de timp. In celulele excitabile semnalele electrice sunt purtate in primul rand de curentii ionici transmembranari, care provoaca modificarea tensiunii transmembranare. Miscarea acestor ioni este guvernata de legile fizicii. Sursa de energie a miscarilor ionice este gradientul de concentratie de o parte si de alta a membranei, care este mentinut de pompele 1

ionice. Acest gradient de concentratie stabileste un potential electrochimic prin membrana care dirijeaza miscarea ionica conform legilor difuziei si a driftului electric. Deoarece ionii sunt dispusi inegal pe cele doua parti ale membranei, acestia tind sa difuzeze conform gradientului de concentratie spre mediul cu concentratie scazuta. In acelasi timp miscarea ionilor, fiind incarcati electric, este influentata de campul electric transmembranar. Diferenta de potential transmembranar pentru care forta termodinamica de difuzie si forta electrica sunt egale este denumita potential de echilibru si este diferit pentru fiecare ion. La acest potential, curentul net transmembranar al ionului respectiv este zero. Cu alte cuvinte, in absenta oricarui stimul extern sau a unor modificari metabolice sau biochimice, orice celula excitabila se gaseste intr-o stare de stationaritate caracterizata de o valoare cuasi-nula a curentului electric total ce traverseaza membrana si implicit a unei diferente de potential celular de repaus constanta in timp (potential de repaus). Daca aceasta celula este stimulata cu un semnal extern (factor fizic sau chimic) se modifica potentialul de repaus (alterarea distributiilor de sarcini electrice intra si extra celulare). Procesul de stimulare poate fi excitator (depolarizarea membranei celulare) sau inhibitor (potentialul celular devine mai mare decat potentialul de repaus). Metoda voltage-clamp In incercarea lor de a explica fenomenologic initierea si propararea unui potential de actiune in lungul membranei celulare excitabile, Hodgkin si Huxley au pornit de la observatia ca aparitia unei depolarizari membranare propagabile sau aparitia unui potential de actiune, este insotita de scaderea dramatica a impedantei membranare si apartia unor fluxuri ionice transmembranare. Cei doi au utilizat o metoda revolutionara in electrofiziologie, denumita tehnica voltajului fixat (voltage-clamp). Astfel se masoara curentii electrici transmembranari ce apar ca urmare a depolarizarii membranare locale, in conditiile in care diferenta de potential Figura 2. Reprezentarea electrica transmembranar nu se modifica in timp, simplificata de mentinere a diferentei de ramanand fixata la o valoare aleasa de experimentator. Se pot inregistra curentii potential transmembranar fixata ionici ce apar in raspuns la depolarizari membranare de diferite amlitudini, si deci, proprietatile complete ale acestor curenti, dependenta lor de timp si de potential pot fi descifrate usor. In Figura 2 este prezentata una din schemele echivalente ale unui circuit electronic de mentinere a voltajului fixat. Un circuit de masurare a curentilor transmembranari in conditii de voltaj fixat utilizeaza o bucla de reactie feed-back negativa ce mentine diferenta de potential transmembranara constanta. Atunci cand comutatorul C este in pozitia deschis, elementul de circuit A1 masoara diferenta de potential intre mediul intern si extern al celulei, cu ajutorul electrodului VE. Daca acest comutator este inchis, prin intermediul

elementului de circuit A2 putem controla direct valoarea diferentei de potential transmembranar. Astfel pentru a excita local celula de studiat, este suficient sa se modifice controlabil valoarea potentialului Vcomanda. In cazul in care Vcomanda este ales astfel incat sa depolarizeze celula, prin membrana celulara se va stabili curentul ionic Iionic. Pentru exemplificare, am presupus ca acest curent ionic circula din interiorul spre exteriorul celulei. Din considerente fizice elementare, trecerea unui curent ionic prin membrana celulara ar avea drept rezultat modificarea diferentei de potential transmembranara, asa cum se intampla in cazul voltajului nefixat. Consecinta fireasca a acestei modificari de potential transmembranar ar fi ca, in ceea ce priveste elementul de circuit A2, diferenta de potential intre intrarile sale ar fi diferita de zero. Prin constructie insa circuitele integrate operationale isi modifica proprietatile la iesire astfel incat printr-o bucla de feed-back pastreaza neschimbata diferenta de potential intre cele doua intrari si egala cu zero. Cu alte cuvinte, elementul de circuit A2 va injecta in celula un curent electric prin intermediul electrodului CE, cu o astfel de cinetica incat sa compenseze exact curentul ionic care iese din celula (Ifeed-back), si deci diferenta de potential intre mediul intra- si extracelular sa ramana neschimbata (Vcomanda). Un asemenea circuit masoara indirect curentul ionic ce se stabileste prin membrana celulara.

Figura 3. Treapta de potential si curentul de membrana in experimentul voltage clamp

Figura 4. Trepte de potential fixat si curentii ionici corespunzatori in experimentul voltage clamp

In urma unor astfel de experimente se obtine variatia curentilor transmembranari prezentata in Figura 3. Din aceasta figura se observa ca atunci cand diferenta de potential dintre mediul intra- si cel extracelular se schimba brusc de la valoarea de repaus -65mV la circa +20mV cu o treapta de 85mV, apare un curent ionic care la inceput este spre interiorul celulei, iar dupa 2ms se schimba spre exterior tinzand asiptotic la valoarea 2mA/cm2. In seria celor cinci curbe din Figura 4 corespunzand la cele cinci trepte de potential intre 95 si 143 mV se observa ca sunt doua componente: una timpurie si una tardiva. Curentul timpuriu este dirijat spre interiorul celulei la valori mici ale treptei de potential, dar odata cresterea acestor trepte amplitudinea acestui curent scade si dispare complet la treapta de 117mV. Cealalta componenta, este intotdeauna spre exetriorul celulei si creste monoton tinzand asimptotic catre o valoare limita. Aceasta limita creste ca o funtie a treptei de potential. Daca potentialul de repaus este -65mV, treapta de +117mV duce la un potential de membrana de +52mV. Stiind ca potentialul de echilibru al ionilor de sodiu este de +50mV, se poate afirma ca, componenta timpurie a curentului este data de ionii de sodiu caci ea se reduce la zero la valoarea potentialului de echilibru al sodiului fiind dirijata spre interior cand Vm este mai mic decat potentialul respectiv si spre exterior in caz contrar. Cealalta componenta este data de ionii de potasiu.

Figura 5 Masurarea curentilor de sodiu si potasiu

In Figura 5 (B) este redata curba curentului membranar total. Curba din Figura 5C reprezinta curentul transmembranar masurat dupa reducerea concentratiei extracelulare a ionilor de sodiu, astfel ca treapta de potential fixat este tocmai 50mV, adica potentialul de echilibru pentru sodiu. Deci este vorba de curentul de potasiu. Prin scaderea curbei (C) din curba (B) se obtine curba (D) care reprezinta curentul de sodiu in conditiile initiale. Metoda patch-clamp Pentru elucidarea fenomenelor care guverneaza activarea si inactivarea canalelor ionice este necesar sa se lucreze pe o zona cat mai restransa de membrana, masurandu-se fluxurile ionice corespunzatoare unui numar cat mai mic de canale ionice (ideal unul singur). Cercetatorii germani E. Neher si B. Sakmann au ajuns sa izoleze o suprafata foarte mica de membrana la contactul cu microelectrodul de masura (diametrul de 1m). Ei au reusit sa realizeze un contact foarte strans intre membrana celulara si terminatia micropipetei - electrod. Astfel, aceasta tehnica ofera posibilitatea masurarii curentului electric mediat de un singur canal ionic, deschizand noi perspective practice de a caracteriza procesele de permeatie si gating ale canalelor ionice. Se pot adapta mai multe configuratii de lucru a tehnicii patch-clamp: configuratia celula atasata\" (cell-attached) care permite inregistrarea unor curenti unitari care traverseaza fragmentul izolat sub pipeta; configuratia celula in intregime\" (whole cell) ofera posibilitatea de a face experiente de potential impus asupra unei celule individuale; configuratia interiorul spre exterior\" (inside-out) obtinuta prin excizia unui fragment de membrana, de o maniera ce face ca fata sa interna sa se afle scaldata in mediul de perfuzie; aceasta configuratie este obtinuta pornind de la configuratia celula atasata\" (cellattached); configuratia exteriorul spre exterior\" (outside-out), obtinuta pornind de la configuratia celula atasata\" permite studierea unui fragment de membrana a carei fata externa se afla scaldata de mediul de perfuzie. In 1992, la implinirea a 10 ani de cercetari cu tehnica patch-clamp, Petersen remarca faptul ca introducerea acestei metode a reprezentat o adevarata revolutie in electrofiziologie, devenind, in surprinzator de scurt timp, practic unica tehnica pentru investigarea proprietatilor electrice ale membranei celulare. Aceasta a permis pentru prima data inregistrarea unor curenti ionici membranari la nivelul unui singur canal ionic, in conditii in care atat gradientele ionice cat si voltajul transmembranar erau mentinute sub control. In paralel cu aparitia unor echipamente tot mai performante de inregistrare, noile tehnici de biologie moleculara si-au gasit rapid aplicare in studiile de electrofiziologie. Aplicarea acestei metode a permis progrese remarcabile in intelegerea unor mecanisme fiziopatologice si a unor aspecte de farmacodinamie. Diversitatea canalelor ionice a fost relevata de studiile efectuate in cele mai variate tipuri de tesuturi, inclusiv, in tesuturi neexcitabile. Proprietatile canalelor ionice au fost examinate, sub aspect farmacologic, dar si sub aspectul tipului de transfer al informatiei, la scara unei singure celule. Au aparut astfel concepte noi, ca, de exemplu, cel al canalelor ionice operate mecanic. S-au facut incercari de a integra intr-un tablou unitar datele obtinute in cele mai variate tipuri de experimente de patch-clamp, la nivelul unui singur tip de tesut. S-au incercat primele teoretizari asupra selectivitatii canalelor ionice sau asupra diversitatii lor, asupra cineticii de deschidere (sau oscilatie) a variatelor tipuri de canale ionice operate de

voltaj sau modulate de nucleotizi ciclici, asupra mecanismelor de interventie farmacologica asupra unora dintre aceste canale. Participarea unor defecte genetice la generarea unor disfunctii ale unor tipuri de canale ionice a fost studiata si urmata de incercari de a aplica, in scop medical, metode de terapie genica, cu scopul de a corecta aceste disfunctii. In Figura 6 este schematizata procedura de izolare a canalelor ionice membranare: in principiu, o pipeta speciala de sticla (pipeta patch-clamp), tratata termic special, cu diametrul la varf de 0.5-4m, este pusa in contact cu membrana celulara ce contine N canale ionice, fiecare avand o anumita probabilitate de deschidere si permite trecerea unui curent i. In conditii experimentale speciale se obtine situatia in care rezistenta electrica a mediului dintre varful pipetei si membrana Figura 6 celulara, ce separa portiunea (patch) de membrana ce contine canalul ionic de interes de mediul extern, devine de ordinul 5100G. In aceste conditii, daca aplicam inte mediul intern pipetei si cel extern o diferenta de potential, curentul electric (i) mediat de canalul ionic astfel izolat poate fi relativ usor de separat de zgomotele electrice externe si analizat. Din analiza unui semnal obtinut prin aceasta metoda (Figura 7) se poate obtine atat probabilitatea de deschidere a canalului ionic prin evaluarea diferentei dintre amplitudinea semnalului atunci cand canalul este inchis si deschis, cat si conductanta acestuia in anumite conditii fizice prin evaluarea timpului pe care semnalul il petrece in pozitia deschis.

Figura 7