Antibiotice definitie, clase, mecanisme de actiune

Definitii
Antibiotice (anti + bios = cu efecte nefavorabile) = grup heterogen de substane chimice, produse de microorganisme prin procese de biosintez, care omoar sau inhib creterea altor specii de microorganisme. Agenii chimioterapeutici = substane de sintez chimic, utilizate n tratamentul infeciilor produse de diferite microorganisme (bacterii, fungi microscopici i protozoare) ( P. Ehrlich -l904).

Definiia actuala=substane chimice obinute prin biosintez, semisintez sau prin sintez chimic, care, n concentraie mic inhib multiplicarea sau omoar microorganismele. = Substante antimicrobiene > 500 substane cu proprieti antibiotice identificate ~ l00 folosite in terapie Bacillus, Streptomyces, Micromonospora, Penicillium, Cephalosporium

Istoric
1. Producerea antibioticelor =mecanism ecologic de inhibiie a creterii altor microorganisme, cu care intr n competiie pentru resursele energetice.
antibioz (Pasteur, l877)

Gratia i Dath (1924) -filtratul acelular al culturii de actinomicete -actinomicetin. Fleming (l928)- penicilina Ernst Chain i Howard Florey (1939)- purificarea penicilinei, producia industrial n l943. R. Dubos (1939) -gramicidina i tirocidina (Bacillus brevis) S. Waksman (1944 - 1945) -streptomicina (Str. griseus) , propune denumirea de antibiotic=compus chimic produs de un microorganism, care la concentraie mic, inhib sau omoar alte microorganisme. 2. Substante de sinteza Ehrlich - para-rosanilina (tripanosomoza), sintetizeaza arsfenamina (salvarsan) (sifilis) Gelmo (1908) sintetizeaza sulfanilamida (sifilis). Eisenberg (1913) -azo-coloranii cu grupri sulfonamidice Domagk (1935)- prontosil (sulfonamide), cu spectru larg de actiune (1945-5488 derivai ai sulfanilamidei (sulfonamidei).

 Selectivitate ridicata Toxicitate scazuta Index terapeutic

Doza toxica/ Doza efectiva >>>

Actiune
Bactericida Bacteriostatica
Index terapeutic > Reducerea R la antibiotice bactericide Inhibarea sintezei proteinelor toxice reducerea severitatii simptomelor

 Terapia combinata
Previne emergenta tulpinilor R Tratament empiric temporar Sinergisme de actiune
Ex. peniciline si aminoglicozide NB: antagonism de actiune (peniciline si ATB bacteriostatice)

Clasificarea antibioticelor n funcie de structura chimic

Antibioticele -lactamice Molecula nativ (benzil-peniclina sau peniclina G) este alctuit din inelul -lactamic i inelul tiazolidinic. Antibiotice polipeptidice: bacitracina (produs de B. subtilis), tirocidina si gramicidina (sintetizat de B. brevis), cicloserina (produs de Streptomyces), actinomicina, polimixina (sintetizat de B. polymyxa). Antibioticele aminoglicozidice (Streptomyces, Micromonospora) Antibioticele poliketide (acetogenine) sunt substane naturale derivate din acizi poli--cetonici, care la rndul lor se formeaz din acetil-CoA i mai multe molecule de malonil-CoA, dup decarboxilare: griseofulvina (produs de Penicillium patulum), tetraciclina (sintetizat de Streptomyces). Antibioticele macrolide. Denumirea de macrolid desemneaz o structur chimic caracterizat prin prezena unui ciclu lactonic cu complexitate variabil, la care se ataeaz componenta glucidic Antibioticele steroidice au o structur chimic asemntoare colesterolului. Acidul fusidic (fusidina) este produs de fungii filamentoi din g. Fusarium. Antibioticele polienice se caracterizeaz prin prezena, n molecula lor, a unui anumit numr de legturi duble: nistatina, amfotericina B, candicidina (produse de membri ai g. Streptomyces), iar fumigalina este sintetizat de Aspergillus fumigatus. Antibiotice glicopeptidice: vancomicina i teicoplanina. Oxazolidinone: linezolid Antibiotice orfane ex. cloramfenicolul -un antibiotic simplu, sintetizat de Streptomyces sau obinut prin sintez chimic. Are un spectru larg de aciune: bacteriile Gram pozitive i Gram negative, dar i bacteriile parazite obligat intracelulare (chlamidii, rickettsii).

Clasificarea antibioticelor n funcie de mecanismele de aciune

-antibiotice ce acioneaz asupra sintezei componentelor chimice ale peretelui celular (penicilina, cefalosporina, bacitracina, cicloserina, fosfomicina); - antibiotice active asupra sintezei proteinelor bacteriene (aminoglicozide, cloramfenicol, tetraciclina, macrolide, streptogramina, lincosamide, linezolid); - antibiotice active asupra sintezei acizilor nucleici (rifamicina, novobiocina, quinolone); - antibiotice active asupra membranei celulare (polimixina, gramicidina, tirocidina, valinomicina, monensina ultimele dou nefolosite n clinica uman) -inhibitori competitivi ai sintezei metabolitilor esentiali (sulfonamide, trimetoprim)

Antibiotice ce acioneaz asupra sintezei componentelor chimice ale peretelui celular

Clasa de antibiotice -Lactaminele (Peniciline, Cefalosporine, Carbapenem, monobactami)

inta specific

Structura chimic

inhib ultima etap a sintezei peptidoglicanului, transpeptidarea, PLP/PBP (Penicilin Binding Protein); Transglicozilaze; Transpeptidaze; Carboxidaze.

HO

CH3 C ON

H3C S NH O COO
-

CH3

analogie structural cu dipeptidul terminal D - ala - D - ala

O R1 C H S N N O COOH cef alosporina R2

carbapenem

Bacitracina

Lipidul transportor al precursorilor nucleotidici

(peptid ciclic) mpiedic defosforilarea moleculei lipidice purttoare, ce transfer molecula de peptidoglican nou sintetizat, prin membrana celulei, n timpul sintezei peretelui celular. Toxicitate renala, nu se administreaz sistemic, se aplic local pentru tratamentul leziunilor tegumentare i ale membranelor mucoase.

Cicloserina

Inhibarea dipeptid- sintetazei

inhib competitiv formarea D-ala din L-ala (analog). relativ toxic tratamentul infeciilor cu M. tuberculosis, rezistent la alte medicamente.

Fosfomicina

inhibitor al piruviltransferazei blocheaz sinteza acidului N-acetilmuramic (analog fosfoenolpiruvat).

H C H3C C

PO3H2 O fosfomicina
HO HO OH

Vancomicina

blocarea creterii celulei, deoarece formeaz un complex cu D-ala-D-ala din peptidul mureinic.

CO2AA1 R1 R2 N+ R3 O HO NH NH O X2 O O OS2 O AA3 NH NH X1 O O NH O OS1 NH

vancomicina

X3

 Rezistena la antibioticele -lactamice: - sinteza -lactamazelor; - mutaiile PBP, reducerea afinitii de legare cu antibioticele lactamice; - nglobarea diminuat a antibioticelor datorat schimbrilor n structura peretelui sau activitii pompelor de eflux
Rezistenta la glicopeptide Modificarea tintei atb

Antibiotice care modific permeabilitatea membranei plasmatice

Polipepdide ciclice (Polimixina B, Polimixina E)

LPS membranei externe Fosfolipidele membranei externe/interne

Gramicidinele

Fosfolipide

Tirocidina

Fosfolipid

Polimixina -detergent cationic, cu afinitate pentru gruprile cationice ale membranei, pe care o fragmenteaz: aciune bactericid i selectivitatea fa de bacteriile Gram negative. Nu sunt active pe cocii Gram Este singurul antibiotic cu aciune bactericid asupra celulelor aflate n faza staionar. Polimixinele nu sunt absorbite dup administrare oral sau tegumentar, nu difuzeaz semnificativ n esuturi Nu sunt eficiente fa de infeciile sistemice difuze sau ale organelor parenhimatoase profunde. Tratamentul infeciilor localizate : rni, arsuri, mucoase ale tractului intestinal, cavitatea pleural, spaiul dural, grefe. Eficien n tratamentul infeciilor meningeale, pulmonare i ale tractului urinar. Polimixinele se asociaz frecvent cu alte antibiotice Sterilizarea tractului digestiv

Antibioticele polienice (nistatin, amfotericina B)

Formeaz complexe cu sterolii din structura membranei plasmatice cu pierderea permeabilitii selective, pierderea ionilor de K+ i Mg2+ i diminuarea ratei sintezei proteinelor i a ARN. Nu sunt active fa de bacterii, deoarece membrana lor nu conine steroli, dar inhib creterea micoplasmelor

se utilizeaz n tratamentul micozelor.

Amfotericina B (Streptomyces nodosus). Leaga ergosterolul din membrana plasmatic a celulei fungice, a unor alge i a unor protozoare, dar i celulele umane (efecte secundare foarte frecvente i uneori severe), cu creterea permeabilitii membranei. Amfotericina B se absoarbe puin din tubul digestiv i de aceea se administreaz prin injectare intravenoas. Nistatinul (Micostatin) (Streptomyces noursei), mecanism de aciune similar cu al amfotericinei B. Se administreaz local pentru tratamentul infeciilor cu Candida. Nu se absoarbe din intestin i se administreaz oral, numai pentru tratamentul suprainfeciilor intestinale, adeseori sunt consecutive tratamentului cu antibiotice

Atb care inhiba sinteza proteica

Majoritatea bacteriostatice Selectivitate de actiune (ribosomi 70 S/ 80S)
toxicitate ribosomii 70S de la nivelul organitelor

Antibiotice care inhiba initierea sintezei proteice

30S
1 2 3 GTP Factori de initiere

1 3 2 GTP

f-met-tRNA mRNA spectinomicina

3

GDP + Pi
P A

50S
1 2 GTP

70S Complex de initiere

Aminoglicozide

30S Complex de initiere

Aminoglicozide (bactericide) streptomicina, kanamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, neomicina (preparate topice)
Se leaga la ARNr 16S blocheaza formarea complexului de intiere 30S (30S-mRNA-tRNA) similar spectinomicina determina cresterea afinitatii locusului A pentru t-RNA fara specificitate codon-anticodon. Destabilizeaza membrana bacteriana (structura policationica, interactioneaza cu LPS) Spectru larg de actiune (nu anaerobi, nu bacterii intracelulare) HOH2C Spectinomicina (Neisseria gonorrhoeae- tulp. R la beta-lactamice) O Rezistenta - frecventa HO HO Sinergisme- cu atb. beta-lactamice (pt anaerobi, enterococi). H3CHN O Efecte secundare -ototoxicitate, nefrotoxicitate i hipersensibilitate Avantaje: H HN C NH2 - activitatea bactericid este dependent de concentraie; NH - manifest efect postantibiotic; O HO - au o farmacocinetic relativ predictibil; OH H2N C HN - manifest efect sinergic cu antibioticele antiparietale HO NH Tratamentul streptomicina pacienilor neutropenici febrili infecii grave produse de microorganisme Gram negative (enterobacterii, Ps. aeruginosa). ITU eficiente, antibioticele administrate intravenos sunt excretate exclusiv pe cale renal.

OH CH3 H CHO O H

- aminoglicozid-acetil-transferaze (AAC)

- aminoglicozid-adenilil-transferaze (ANT) - aminoglicozid-fosfotransferaze (APH).

Oxazolidinone

clas unic de ageni antimicrobieni sintetici. necesitatea tratrii infeciilor produse de stafilococii rezisteni la meticilin, de pneumococii rezisteni la penicilin, de enterococii rezisteni la vancomicin. elimin riscul rezistenei ncruciate cu agenii antimicrobieni disponibili iniial utilizate n terapie ca inhibitori ai monoamin-oxidazei, pentru tratamentul depresiei blocheaz prima treapt a asamblrii ribosomilor- efect bactericid !!!! Concentraiile subinhibitorii de linezolid diminu producerea hemolizinei i coagulazei la S. aureus i inhib sinteza streptolizinei O i DN-azei la streptococi 2 compusi eperezolid i linezolid, cu activitate in vitro i toxicitate diminuat. Linezolid activ fa de N. gonorrhoeae, N. meningitidis, bacterii Gram pozitive anaerobe (grupul Bacteroides fragilis, in vitro fata de M. tuberculosis i Nocardia)

Atb care inhiba elongarea catenei polipeptidice

P A

Tetracicline

P A

Tu GTP GTP Ts

Tu GDP + Ts

Pi

Tu Ts

GDP

Cloramfenicol

Acid Fusidic

GDP + G

GTP

G GDP + P A

Pi

G GTP P A

Macrolide

Tetracicline (bacteriostatice) tetraciclina, minociclina, doxiciclina

H3C

OH

N(CH2) OH

Se leaga la ARN r 30 S Blocheaza legarea AA -ARNt la situsul Acceptor OH Unele interacioneaz cu membrana citoplasmatic (chelocardina, tiotetraciclina, anhidrotetraciclina) (caracter lipofil, interactiune cu ionii bivalenti???)

OH O OH O

CONH2

tetraciclina

Spectru larg de actiune (inclusiv bacterii intracelulare) active fa de protozoarele parazite: inhib Giardia intestinalis, Trichomonas vaginalis, Entamoeba histolytica, Plasmodium falciparum Administrare PO, se absorb uor din tubul digestiv i se distribuie larg n esuturi i fluide, cu excepia lichidului cefalorahidian. Efecte secundare - nivel scazut de toxicitate (distrugerea microbiotei intestinale, pigmentarea si afectarea tesutului osos si a smaltului dentar), administrarea in sarcina (deformarea oaselor cutiei craniene a fatului)

Mecanisme de rezistenta
frecventa (nu se utilizeaza in tratamentul primar al ITRI) - pompe de eflux, dependente de energie; - protecia ribosomilor prin intermediul proteinelor solubile (Streptococcus, Neisseria, Haemophilus, Bacteroides, Mycoplasma, Ureaplasma, Streptococcus, Staphylococcus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis, Clostridium perfringens, Streptomyces rimosus - inactivarea enzimatic (degradarea ox)

Macrolide (bacteriostatice) eritromicina, claritromicina, azitromicina, spiramicina

Inhiba translocatia Spectru de ativitate (bact. Gram pozitive, coci Gram negativi, ITR cu Chlamydia, micoplasme, Haemophilus, Legionella). Absena efectului asupra bacililor Gram negativi -incapacitatea de a difuza prin membrana extern, datorit caracterului hidrofob al moleculei lor Claritromicina- H. pylori, unele specii de Mycobacterium (M. intracellulare, M. avium, dar nu M. tuberculosis), infecii ale esuturilor moi inhib sinteza citochinelor proinflamatorii (TNF-, IL-6, IL-8, IL-12 i IFN-) concentraiile serice sCMI : - modificarea expresiei unor factori de virulen: adezine, toxine, exoenzime, motilitatea flagelar; - inducerea unor modificri structurale detectabile la microscopul electronic; - creterea sensibilitii la factorii serici litici (proteinele ce leag Fe, proteinele de faz acut, complementul, anticorpi naturali). - macrolidele se concentreaz n leucocite i pot fi astfel transportate la situsul infeciei, unde sunt parial eliberate.
CH3 H C 3 H3C N H3C HO H3C H3C O OH OH CH3 O OH O CH3 CH3 CH2CH3 O CH3 O O O CH3 OH OCH3

eritromicina

Rezistenta - frecventa scderea permeabilitii peretelui celular; - efluxul activ al atb; - modificarea mutaional a unei singure proteine a subunitii 50S; - modificarea ARNr 23S al subunitii 50S prin metilare (S. aureus, Str. pneumoniae, HP, E. coli). Metilazele sunt codificate de genele erm (erithromycin ribosome methylation); - inactivarea enzimatic a antibioticelor: enzimele care hidrolizeaz inelul lactonic al nucleului macrolid i fosfotransferazele care inactiveaz macrolidele prin fosforilarea gruprii 2-OH a glucidului aminat

Macrolide noi- ketolidetelitromicina

Afinitate fata de ribosomi de 10 ori mai mare dect eritromicina Activa fa de bacteriile aerobe Gram pozitive, patogenii respiratori atipici (Bordetella sp, Legionella sp., Chlamydia pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae), Clostridium sp., Peptostreptococcus sp. i Bacteroides sp. Inactiv fa de enterobacterii si Acinetobacter baumanii Se acumuleaz n celulele PMN i n macrofage, unde atinge concentraii de 130 i respectiv de 71 de ori mai mari dect n compartimentul extracelular. Din aceste celule, antibioticul este eliberat lent, ceea ce sugereaz c ele acioneaz ca vehicule de transport spre focarul infecios. Telitromicina este metabolizat n ficat. Metabolitul major (un alcool) este de 4-16 ori mai puin activ dect telitromicina i este eliminat n proporie de 80% pe cale digestiv. Excreia telitromicinei este aproape complet din urin, dup 24 de ore, iar n fecale, dup 72 de ore.

Cloramfenicol, Lincomicina, Clindamicina (bacteriostatice)

Se leaga la subunitatea 50S Inhiba activitatea peptidil transferazei Spectru de activitate - Cf larg, utilizare reduse, in infectii grave (tratamentul meningitei, febrei tifoide); Linco, Cli- ingust Resistenta - frecventa, enzime inactivatoare (CAT), permeabilitate redusa, pompe de eflux Efecte secundare- Cf- toxicitate medulara (supresia activitatii meduvei osoase)
CH3 N

O
CH3 HO C H

C H O2N C NH C

CHCl2

H7C3

CO NH C H HO O OH S CH3 OH

CH2OH
CH3 H CH2 C CH3 O H CH3 CO CH3 CH2 CH C CH3

lincomicina

OH H

cloramfenicol
HO

Acidul fusidic (bacteriostatic)

Inhiba factorul de elongare (EF-G) si eliberarea sa din complexul EFG/GDP Spectru de activitate Coci Gram-+
HO

CH3

acid fusidic

Mupirocina (acidul pseudomonic A)

Mupirocina este cel mai eficient agent local utilizat pentru eradicarea strii de purttor nazal de S. aureus rezistent la meticilin (MRSA). Mupirocina este analogul structural al izoleucinei i se leag competitiv de izoleucil-ARNt sintetaz, blocnd astfel sinteza proteinelor.

Rezistena la mupirocin- mutaii in gena IRS(izoleucil ARNtsintetaz).

Antibiotice care interfera cu sinteza acizilor nucleici

Atb care inhiba sinteza ADN Quinolone (bactericide)

acid nalidixic, ciprofloxacin, ofloxacin, norfloxacin, levofloxacin, lomefloxacin, sparfloxacin
Spectru de activitate Coci Gram-poz. si ITU Ciprofloxacina- efect bactericid rapid de 90% in l9 minute ITR, ITU, gonoree, diaree cu ETEC, Campylobacter jejuni, Shigella, M. tuberculosis. Medicamentele antiacide (Maloox) si ionii bivalenti blocheaz absorbia ciprofloxacinei Se leaga la subunitatea A a ADN-girazei Rezistenta frecventa pentru NAL, in crestere pentru CIP
modificri ale enzimelor int alterri care limiteaz accesul medicamentelor la int activitatea pompelor de efux

Quinolone (4-quinolone) primele substane antimicrobiene obinute pe cale sintetic, nucleul quinolinic

Acid nalidixic

Norfloxacin

Ciprofloxacin

Ofloxacin

Pefloxacin

Enoxacin

Amifloxacin

Flerofloxacin

Lomefloxacin

Temafloxacin

Tosufloxacin

PD 127, 391

Atb care inhiba sinteza ARNm Rifampina, Rifamicina, Rifampicina, Rifabutin (bactericide)
Se leaga la ARN polimeraza dependenta de ADN si inhiba sinteza mRNA. Spectru larg de actiune (NB- tratamentul TBC) Rezistenta- frecventa, se recomanda terapia combinata

HC

CH3

rifampicina

Novobiocina -inhib ARN-polimeraza dependent de ADN si actioneaza si asupra subunitii B a ADN-girazei (topoizomeraza II) CH OO OH C care produce i menine starea supraspiralizat a ADN.
3 3

CH3 O O OH HN CO CH CH2 C CH3 CH3

CH3

NH2COO

OH

OH

Griseofulvina -inhib replicarea ADN, consecutiv interferenei cu polimerizarea nucleotidelor purinice.

tratamentul infeciilor fungice superficiale. inhib creterea fungilor micelieni, dar nu este activ fa de bacterii sau levuri. Nu influeneaz creterea fungilor cu perei celulozici, dar inhib creterea fungilor care conin chitin. Griseofulvina influeneaz celulele fungice prin contact direct: creterea hifelor aeriene nu este modificat. Concentraiile mici produc rsucirea hifelor, ramificarea extensiv, micorarea distanei dintre pereii transversali, creterea diametrului. La concentraii mari de antibiotic, modificrile de cretere se amplific i hifele se rup.

novobiocina

Actinomicina D (Dactinomicina) - inhib replicarea i transcrierea. Gruparea aromatic se intercaleaz n dublul helix al ADN, la perechile GC, iar peptidul ciclic rmne la suprafa.

Inhibitori ai sintezei metabolitilor esentiali =Antimetaboliti

Inhibitori ai sintezei acidului folic

acid p-aminobenzoic + Pteridina Sulfonamide Pteridin sintetaza

Acid dihidropteroic

Trimetoprimsulfametoxazol= cotrimoxazol

Dihidrofolat sintetaza Acid Dihidrofolic Trimetoprim Dihidrofolat reductaza

Acid tetrahidrofolic Timidina Purine Metionine

Clasa de ageni chimioterapeutici

inta specific

Structura chimic

Sulfonamide

Inhibarea dihidropteroid sintetazei (DHPS)

H2N sulf onamide

SO2NH2

Diaminopirimidina (Trimetoprim)

Inhibarea dihidrofolat reductazei

N H2N N

NH2

OCH3

CH2

OCH3

Nitroimidazoli

Interfer cu biosinteza timinei (produc ruperi ale moleculei de ADN) Bacterii anaerobe, microaerofile, Helicobacter pylori, Gardnerella vaginalis

trimetoprim

OCH3

O2N

CH3

CH2 CH2OH metronidazol

Nitrofurani (Nitrofurantoil)

Interfer cu biosinteza timinei (produc ruperi ale moleculei de ADN).

C O2N O H2C nitrofurantoil C O CH N N NH

Acid Folic

Sulfonamide, Sulfone (bacteriostatice)

Analogi ai APAB- inhiba sinteza acidului DHP Spectru larg- Gram-, Gram +; tratamentul infectiilor cu Nocardia si ITU Rezistenta- frecventa, se recomanda terapia combinata cu trimetropim

Trimetoprim, Metotrexat, Pirimetamina (bacteriostatica)

Analogi ai APAB- inhiba sinteza acidului THP Spectru larg- Gram-, Gram +; tratamentul infectiilor cu Nocardia si ITU Rezistenta- frecventa, se recomanda terapia combinata cu sulfamide Rezistenta la TMP/sulfonamide= cromosomala /plasmidiala sinteaza unei DHFR mai puin sensibil la trimetoprim supraproducia DHFR mutaii ale genei structurale a DHFR

Antibiotice tuberculostatice

Acidul para-aminosalicilic (PAS)

(bacteriostatic)
Mod de actiune- inhibarea sintezei DHP Specific pt. Mycobacterium tuberculosis

Dapsone (bacteriostatic)
Mod de actiune- inhibarea sintezei DHP Specific pentru Mycobacterium leprae

Structura molecular a Dapsone

Structura molecular a APAS (acid paraaminosalicilic)

Izoniazida (INH) (bacteriostatic)

Inhiba sinteza acizilor micolici. Tratamentul TBC Rezistenta- mutatii in gena pentru sinteza catalazei

Structura molecular a izoniazidei

Structura molecular a piridoxinei (vitamina B6)

Etambutol (bacteriostatic)

Mecanisme de actiune inhib arabinozil-transferaza, enzim implicat n biosinteza arabinogalactanului i lipoarabinomananului. inhiba metabolismul ARN i sinteza fosfolipidelor, transferul acizilor micolici la arabinogalactanul legat de peretele celular mureinic, sinteza spermidinei i treapta timpurie de conversie a glucozei n monozaharidele utilizate pentru sinteza polizaharidelor parietale (arabinogalactan, arabinomanan) i a peptidoglicanului.
Rezistenta- mecanism necunoscut

Pirazinamida (bacteriostatic)
Pirazinamida - derivat sintetic al nicotinamidei. Mecanism de aciune- necunoscut Rezistenta-partial explicata prin pierderea enzimei pirazinamidaza ce metabolizeaz pirazinamida la acidul pirazinoic, intermediarul activ antibacterian.

Etionamida

derivat al acidului izonicotinic inhibiia sintezei acizilor micolici (celulele de M. tuberculosis i pierd acidorezistena in vitro) activ fa de M. tuberculosis i alte micobacterii.

.Fusobacterium Blood agar + neomycin + vancomycin Blood agar + rifampicin Blood agar + vancomycin + methylene blue Blood agar + vancomycin + crystal violet . Anaerobic cocci Blood agar + neomycin (100 ~g/ml) . C. difficile C.~.F.A. medium (Cycloserine Cefoxitin Fructose, egg yolk) . B. fragilis BBE agar (Bacteroides Bile Aesculin)

Testarea sensibilitatii la antibiotice a microroganismelor de interes medical

ANTIBIOGRA MA

Mediu de cultur
pH--7,2 - 7,4- aminozide, macrolide, fenicoli. Umiditatea Concentraia n timidin sau timin >- reducerea sensib. la sulfamide i trimetoprim, Enterococcus faecalis ATCC 29212, diam. >/= 20 mm. Concentraia n cationi divaleni: ->( de Ca2+ i Mg2+) -reducerea diametrelor aminozide (testate pentru P. aeruginosa) -< zone de inhibiie prea mari - ionii de Zn influeneaz activitatea carbapenemelor

Inocul
etalonul 0,5 Mc Farland : 0,5ml Mg Cl2 sol 1% (10 g/l) + 95,5 ml H2SO4 1% (10 ml/ l); ~(D.O.) 0,08 - 0,1 la 625 nm

Citirea i interpretarea diametrelor zonelor de inhibitie

CONTROLUL CALITATII NCCLS/CLSI

- rigla precisa
- citire- perpendicular pe axa optic; - trebuie verificat daca interpretrile (S, I, R) corespund diametrelor masurate; - trebuie evitate erorile prin confuzia diferitelor tabele de citire

Tulpini de referin
Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 35219, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus ATCC 43300, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Haemophilus influenzae ATCC 49766, Neisseria gonorrhoae ATTC 49226, Neisseria gonorrhoae ATTC 49226, Streptococcus pneumoniae ATCC 49619.

Discurile de antibiotice - Termen de valabilitate - ncarctura coresp. -pastrare la -20 oC; -aplicatorul ncrcat cu antibiotice trebuie pstrat la + 4 oC; - discurile umede sau n contact direct cu gheaa, sau care au fost conservate la temperatura ambiant nu trebuie utilizate; - cartuele trebuie scoase din frigider sau congelator cu 1-2 h nainte de utilizare

Mecanismele moleculare ale rezistenei microoganismelor la antibiotice

Mecanismele moleculare ale rezistenei mediat de gene plasmidiale sau cromosomale, la diferite antibiotice (dup Brock, 2003)
Antibiotic Penicilina, carbenicilina, etc. Mecanismul de aciune ampicilina, Hidroliza mediat de -lactamaz Microrrganisme Stafilococi, enterococi (rareori), Enterobacteriacee, pseudomonade, Bacteroides sp. Enterobacterii, pseudomonade Stafilococi, enterobacterii, pseudomonade, Bacteroides Stafilococi, enterococi, streptococi, enterobacterii, pseudomonade, Bacteroides Stafilococi, enterococi, enterobacterii, pseudomonade

Oxacilina, meticilina, etc. Cefalosporine

Tetracicline

Hidroliz prin -lactamaze -lactamaz

Blocarea permeabilitii

Aminoglicozide : Streptomicina Neomicina Kanamicina Tobramicina Amikacin Macrolide- Lincinoide : Eritromicina Clindamicina Trimetoprim Sulfonamide

Acetilare Fosforilare Adenilare

Alterarea ARN 23S

Stafilococi, enterococi, streptococi, Bacteroides

Fosfomicina Vancomicina

Alterarea DFHR (Dihidrofolat Stafilococi, enterobacteriacee reductaza) Alterarea Tetrahidropteroic- Stafilococi, enterococi, sintetaza streptococi, enterobacterii, pseudomonade, ? Stafilococi, enterobacterii, Sinteza unei poteine noi Enterococi

CLSI 2009
Grup A- panel de rutina Grup B- raportare selectiva (izolatul este R la antibioticele de clasa A, pacientul este alergic, nu tolereaza atb de cls A, CGIII la BGN izolati din LCR, SXT pentru izolatele urinare, infectii polimicrobiene, infectii generalizate etc Grup C atb suplimentare/alternative (R la atb primare spitale cu rate crescute de R, alergii, intoleranta, izolate speciale- Cloramfenicol - Salmonella extraint.) Grup O atb care nu se testeaza in rutina, dar care sunt eficiente in infectiile cu diferiti agenti patogeni Grup U nitrofurantoin, qinolone- prelevate ITU Inv Atb care nu sunt aprobate FDA

Categorii clinice S, I (concentratii active in diferite organe, doze >> CMI), R, NS

QA/QC
Pattern de sensibilitate corespunzator speciei S la CGIII >CGII si CGI Izolate S la atb pentru care nu s-a evidentiat mec de R (Streptococcus si Vanco)

Atb active in vitro- inactive in vivo

Klebsiella, E. coli, P. mirabilis -ESBL+
Aztreonam, Pen, Cefalosp

Salmonella /Shigella
cefamicine, CG I, CGII, aminoglicozide Pentru izolatele intestinale numai Amp, SXT, fluoroquinolone se testeaza de rutina, pentru cele extraintestinale C,

MR S. aureus
toate betalactamicele

Yersinia
Beta-lactamice

Enterococcus
aminoglicozide, cefalosporine, clinadamicina, SXT

Nu se testeaza izolate din LCR pentru: CG I, CGII (excep. CFM i.v.), atb p.o., clinda, macrolide, tetracicline, quinolone

FENOTIPURI DE REZISTENTA LA BACILII GRAM-NEGATIVI FERMENTATIVI

Rezistenta naturala la beta-lactami: mecanism enzimatic (producere de betalactamaze) non enzimatic (impermeabilitate, afinitate redusa pentru PLP)

BGN natural rezistenti la: peniciline de spectru ingust (G, V)impermeabilitate peniciline M- oxacilina- slaba afinitate +impermeabilitate 5 fenotipuri de rezistenta naturala:

* sinergism ** absenta sinergismului cu inhibitor de beta-lactamaza

 Fenotip Grup 1= Sensibilitate Diminuata La Cefalosporine De Gen. I (Producerea De Cefalosporinaza Tip Ampc) Fenotip Grup II- Penicilinaza Cromosomala De Nivel Scazut, Sensibila La Acidul Clavulanic Grup 3- CEFALOSPORINAZA INDUCTIBILA CROMOSOMALA AMP C, De Clasa A (Sensib. La Inhib. ) Sau Clasa C (Rezist. La Inhib.), Inductibila De FOX, AMC, Sau IMP, Sensibilitate Diminuata La IMP GRUP IV, V- PENICILINAZA DE NIVEL SCAZUT, Sensibilitate Diminuata La Cefalosporinele Din Clasa I Si II, BETALACTAMAZA DE SPECTRU LARG SENSIBILA LA INHIBITORI, Sinergisme Putin Vizibile

Bacili Gram-negativi non-fermentativi Cefalosporinaza slab inductibila Rezistenta de nivel scazut la aztreonam si latamoxef

a, sinergism; b, sensibilitate buna ( >35mm); c, sensibilitate la sulbactam AMX; AMC; FOX, TIC;

FENOTIPURI DE REZISTENTA DOBANDITA LA BACILII GRAMNEGATIVI DE IMPORTANTA MEDICALA

HIPERPRODUCERE DE BETA-LACTAMAZA CROMOSOMALA CLASA A

HIPERPRODUCERE DE BETA-LACTAMAZA CROMOSOMALA CLASA C SENSIBILA LA CLOXACILINA (INCORPORARE IN MEDIU- 200-300 MG)
CEFALOSPORINAZA CROMOSOMALA HIPERPRODUSA +DEFECT DE IMPERMEABILITATE (PIERDEREA PORINELOR) R CGIII, FARA SINERGISM, R IMP CEFALOSPORINAZE MUTANTE (BLSE CASE) MODIFICAREA AFINITATII PENTRU TINTA =R CGIV PENICILINAZE TRANSFERABILE (TRA+) -TEM, SHV , PSE (CLASA A)- R TIC,S TCC, OXACILINAZE (CLASA D) HIPERPRODUCERE CEFALOSPORINAZE (AMPC) + PENICILINAZE TEM-SINERGISM, S CGIV CEFALOSPORINAZE TRANSFERABILE - REZISTENTA DOBINDITA LA CEFALOSPORINE GEN. III, FARA SINERGISME- K. PNEUMONIAE, K. OXYTOCA, SALMONELLA SPP. PROTEUS MIRABILIS, SENSIB. CONSERVATA LA CEFALOSPORINE GEN. IV SI IMIPENEM SPECTRUL DE REZISTENTA- SIMILAR CU CASE (CEFALOSPORINAZA CROMOZOMALA HIPERPRODUSA), INSA SPRE DEOSEBIRE DE ACEASTA, ESTE DOAR IN MOD EXCEPTIONAL INDUCTIBILA

7. BLSE (afinitate > tinta- extindere spectru)

PENICILINAZE MUTANTE (CLASA A)K. pneumoniae, E. coli, P. Mirabilis, Salmonella spp. teste de sinergism ALTE BLSE TRANSFERABILE (K. pneumoniae, E. coli, P. mirabilis, Salmonella spp., Pseudomonas aeuginosa , Acinetobacter baumannii : cfotaximaza (CTX-M), ceftazidimaza, BES-1, GES-1, SFO-1, PER-1 (clasa A) sau Oxa -11 (clasa D).

Caz, ceftazidima; TIM, Timentin; CRO, ceftriaxona

Veb-1 A. boumannii

BLSE-BL de spectru larg/extins

DEFINITII Philippon et al. (1989)- BL cefalosporine de gen. a III-a codificate plasmidial, de tip TEM sau SHV care confera rezistenta la Medeiros (1991)- BL codificate plamidial care confera rezistenta la oxi-imino beta-lactami (ceftazidim, cefotaxim, aztreonam) (tip TEM, SHV, CTX-M- clasa A, AmpC clasa C, Imp-1- clasa B, Oxa-10- clasa D) 2007- BL plasmidiale sau transmise prin transpozoni sau integroni care confera rezistenta la numeroase betalactamice, inclusiv CGIII in general clasa A, detectate prin sinergisme intre CGIII si clavulanat. Exceptii: BL codificate cormozomal, slab exprimate, specifice Emergenta de noi beta-lactamaze

Standardul francez
screening=sinergism intre C3G si ATM si clavulanat pe placa

Probleme!!!!!!!!!!
Zona de sinergism= aspecte diferite in functie de specificitatea de substrat a enzimei

Philippon, 2005

Probleme!!!!!!!!!! sp. si A. Detectia sinergismelor mult mai dificila la Pseudomonas

bowmanii (asociere cu alte mecanisme de rezistenta- eflux, cefalosporine hiperproduse)

VEB-1 - P. aeruginosa

Acinetobacter boumannii

Confirmare =sinergism cu clavulanat

diminuarea valorii CMI cu 3 dilutii (microdilutii/E-Test ESBL)
cresterea diametrului de inhibitie cu 5 mm, in cazul utilizarii discurilor duble

Dificultati
inocul (K. oxytoca) impermeabilitate (K. oxytoca) sinteza BLSE atipice- tip CMT emergenta ESBL rezistente la inhibitori sau suprapunerea unei cefalosporinaze cromosomale, inductibile, rezistente la inhibitori

Solutii
Repetarea testelor de sinergism cu apropierea discurilor (fenotip CMT)

Utilizarea discurilor de C3G cu un inhibitor enzimatic de BLSE

Utilizarea discurilor de cefalosporine rezistente la actiunea BLSE (cefpiroma, cefepima)

9. CARBAPENEMAZE DOBINDITE DE CLASA B

IMP-1 -Pseudomonas aeruginosa. V (Verona) IM 1, 2 - P. aeruginosa. - rezistenta la peniciline (TIC, PIP), cefalosporine (CAZ, FEP), IMP, S ATM

VIM-2 (P. aeruginosa)

K. pneumoniae VIM-1, SHV-5!!!!!

Detectia carbapenemazelor

DETECTIA

20 l solutie de EDTA adaugata pe discul de cefalosporina

Enterobacteriile pot produce carbapenemaze care pot fi asociate cu producerea de ESBL!!!!

Rezistenta BGN la aminoglicozide

Fenotip salbatic- sensibile la toate aminoglicozidele Fenotipurile de rezisten dobndit ale enterobacteriilor la aminozide
Fenotip Enzime Gm(G) To(T) Nt Ak(A) Is(I) Specii implicate

AAC(3)-I

E.coli, P.mirabilis, K.pneumoniae, E. cloacae E. cloacae E.coli TOATE P.stuartii E.coli TOATE

A GT TA GTNt KTG KTANt

APH(3)-VI AAC(3)-VI ANT(4)-II AAC(2)-I AAC(3)-IV ANT(2)-I AAC(6)-I

S R S R R R S

S R R R R R R

S S S R R S R

R S R S S S R

R S R S S

Fenotipul 1: GM R-3-aminoacilacetiltrensferazei AAC; Fenotipul 2: GM-R, NET-R 2nucleotidiltransferaz ANT; Fenotipul 3: TOB-R, NET-R, AMK-R 6-aminoacilacetiltransferaz AAC.

S.marcescens E.coli, E.cloacae K. pneumoniae E. aerogenes TOATE

KTGNt KTGANt

AAC(3)-II Impermeabilitate Asociaie de enzime

R R R

R R R R TOATE R R R R TOATE Principalele fenotipuri de rezisten dobindita la aminozide la P. aeruginosa Fenotip

G GNt GT GNtT TntA GTNtA Eflux(30-40%)

Enzima
AAC(3)-I AAC(3) ANT(2)-I AAC(6)-II AAC(3)-II,IV,V AAC(6 )-I AAC(6)+ANT(2)-I

G
R R R R S R R

T
S S R R R R S

Nt
S R S R R R R

A
S S S S R R R

I
S S S S ? ? R

Rezistenta BGN la quinolone

Enterobacterii
Fenotipul 1: tulpini sensibile la toate quinolonele; Fenotipul 2: tulpini rezistente la acid nalidixic, dar sensibile la fluorquinolone; Fenotipul 3: tulpini cu sensibilitate diminuat la pefloxacin i la ofloxacin, dar sensibile la ciprofloxacin. Fenotipul 4: tulpini rezistente la toate quinolonele

Principalele fenotipuri de rezisten ale P. aeruginosa la quinolone

Fenotip I (salbatic) II III IV Eflux Nofloxacin S I R R R Pefloxacin S I R R S Ofloxacin Levofloxacin S I R R S Ciprofloxacin S S S R R

Staphylococcus aureus (MRSA)

In 2005 ~ 94,360 cazuri de infectii invazive cu MRSA, ~18,650 mortalitate (2007) mecA mecA = PBP2a = Oxa R Expresie heterogena tulpini mecA S/R Expresie omogena - tulpini mecA R

Expresie

heterogena tulpini mecA S/R

Expresie omogena tulpini mecA -R

 Coci Gram-pozitivi de importanta medicala

S. aureus

MRSA
Detectia Oxa R Disc difuzie cu cefoxitin (30 mcg) S. aureus sensibilitate comparabila cu discul Oxa SCN sensibilitate mai ridicata (mec A se exprima mai puternic in prez FOX) Citire cu lumina reflectata

R
S. aureus S. lugdunensis SCN 19* 24*

S
20** 25**

*Oxa R (toate beta-lactamicele R); ** Oxa S (se raporteaza rezultatul pentru alte beta-lactamice) Rezistenta la penicilina producerea de penicilinaze- testul la nitrocefin Pen- R, FOX-S R la toate penicilinele labile la penicilinaze, S la penicilinele stabile la penicilinaze (oxacilin, meticilin, dicloxacilin, nafcilin), la cefeme i carbapenemi, precum i la combinaiile dintre un beta-lactam i un inhibitor de beta-lactamaz

Contagiozitate Tratament: Vancomicina Linezolid Daptomicina -

MRSA

Trimetoprim/sulfametoxazol, gentamicina sau rifampicina = nu sunt agenti de prima alegere. Emergenta R la RIF = Foarte rapida = Nu se utilizeaza ca agent terapeutic unic VSSA (0.5 - 2 g/mL) VISA (4-8 g/mL) VRSA ( 16 g/mL) (achizitia genei vanA de catre S. aureus de la Enterococcus) (se detecteaza prin microdilutie in agar, mediu lichid, E-test) MIC >4 ug/mL = se trimite la laboratorul de referinta!!!!

Rezistenta la macrolide la S. aureus

Rezistenta inductibila la clindamicina (erm +)
Raportare clinda-R

Absenta antagonismului (msrA+)

Raportare clinda-S

15 - 26 mm

D
R R R R S

E 15 CC 2

Cli-2mcg/Ery15mcg
Se raporteaza: clindamycin erythromycin oxacillin penicillin vancomycin

Enterococcus spp.
Enterococii tractul intestinal uman si animal tractul genital feminin mediul extern Vancomicina = antibiotic frecvent utilizat in tratamentul infectiilor cu antibiotic vancomycin-resistant enterococci (VRE) mediul spitalicesc

Diferentierea la nivel de specie

Caractere de diferentiere Mobilitate Teste de pigmentogeneza. E. faecium si E. faecalis = imobile E. gallinarum si E. casseliflavus/E. flavescens = in general mobile E. casseliflavus/E. flavescens =pigment galben distinct Importanta pentru diferentierea rezistentei intrinseci (vanC) (netransferabila, infectii usoare, izolate) sau dobindite (vanA sau vanB) (transferabila).

Enterococcus gallinarum si E. casseliflavus/E. flavescens rezistenta intrinseca, de nivel scazut, la vancomicina. E. faecium si E. faecalis, E. raffinosus, E. avium, E. durans =rezistenta
dobindita (vanA, vanB, vanC, vanD, si vanE).

Fenotipuri de rezistenta la vancomicina

E. faecium = rezistenta de nivel inalt la vancomicina= vanA CMI Van (>128 g/ml) CMI Tec (>16 g/ml)

E. faecium = rezistenta de nivel scazut la

vancomicina= vanB
CMI Van (16 - 64 g/ml) Tec S (CMI <1 g/ml).

E. faecium = rezistenta de nivel mediu la

vancomicina= vanD
CMI Van (64 - 128 g/ml) CMI Tec (4-8 g/ml) E. gallinarum , E. casseliflavus/E. flavescens =van C CMI Van (2 - 16 g/ml).

Enterococii S la Pen= sunt sensibili la AMP, AMX, AMS, AMC, PIP, PTZ Enterococii sensibili la AMP nu pot fi declarati Pen S.

Screening VRE la purtatori

Producerea de beta-lactamaza decelata prin testul hidrolizei nitrocefinului. Control de calitate - BL - S.aureus 25923 BL-+ Haemophilus influenzae 35056
R Pen= R la peniciline , amino-, carboxi-, ureidopeniciline Cefalosporinele, aminoglicozidele, clindamicina, SXT= nu sunt active in vivo Detectarea sinergismelor intre Amp, Pen, Vanco si aminoglicozide (conc. inalta)

-comensal in naso-faringe -transmitere interumana -infectii ORL, pneumonie, meningite, bacteriemii, septicemii, endocardite -rezistenta la antibiotice (40% din tulpinile izolate din infectii invaziveEARSS) (monorezistente/multirezistente~3:1)

Streptococcus pneumoniae=pneumococ

Colonii de tip S

Colonii de tip M

Colonii cu centrul invaginat= autoliza

Testul pozitivitatii la bila (+10% deoxicolat Na).

Sensibilitatea la Optochin

Antibiograma

Aspectul Gram (diplococi capsulati)

Metoda difuzimetrica
Oxa >20 mm (MIC <O.O6 ug/mL)= S la Pen, AMC, AMP-Sulbactam, cefaclor, cefepim, cefotaxim, ceftriaxon, cefuroxime, imipenem, ertapenem, loracarbef, meropenem (Aceste antibiotice nu se testeaza!!!!) Oxa < 19 mm (se testeaza Pen si CRO/CTX/MEM) Nu se raporteaza Pen-R sau Pen-I doar pe baza diametrului la oxa!!!!!!!!! Tulpinile Pen si CGIII R se trimit la laboratorul de referinta Pentru tulpinile izolate din LCR se testeaza CMI Pen si CRO/CTX/MEM) Rezistenta la Vanco, Linezolid nu a fost raportata Se repeta identificarea Se testeaza CMI ( 1.0 =S) Se pastreaza izolatul Nu se mai extrapoleaza rezultatele pentru fluorochinolone (se testeaza gatifloxacin, levofloxacin, moxifloxacin)- Detectia tulpinilor R se realizeaza la nivel de laborator

Tetracicline, eritromicina, clorampenicol, biseptol, penicilina (disc de Oxa), cefalosporina

Streptococcus sp.

Aglutinare

Absenta cresterii la 6%NaCl

Testul PYR- pirolidonil aril amidazasepara enterococii (PYR +) de streptoccocii de grup D (PYR-)

Hidrolizeaza esculina

ANTIBIOGRAMA
Pen-S= S la Amp, Amx, Amc, ampi-Sulbactam, cefaclor, cefazolin, cefepim, cetotaxim, ceftriaxon, cefuroxim, cefalotin, imipenem, loracarbef, meronem Rezistenta inductibila si constitutiva la macrolide (testul dublei difuzii Cli-Ery) Streptococcus de grup B- prelevate anovaginale, test prenatal (sunt sensibili la Amp, Pen, Cefazolin, poate prezenta R la Cli si Eryse vor testa in vederea realizarii tratamentului).

Haemophylus influenzae - satelitism

Haemophylus influenzae

IZOLAREA SI IDENTIFICAREA BACTERIILOR ANAEROBE

Prelevate cu risc hemocultura
lichid de punctie (pleurala, pericardica, articulara) abces pulmonar: in masura in care prelevatul a fost realizat corect, fara contaminare buco-dentara osteite peritonite abcese craniene abcese abdominale si ginecologice

Semne evocatoare
miros urat al probei prezenta de gaz in leziune supuratie (abces submaxilar sau cervical, pleurezii purulente, peritonite, abcese ale sferei genitale) microbiota abundenta si polimorfa, asocieri de bacili si coci G- si G+

1. Infectii cu Clostridium secretoare de toxine. a. toxi-infectii: C tetani, C perfringens, C difficile). b. intoxicatii (Clostridum botulinum) 2.Infectii mixte: se dezvolta in vecinatatea mucoaselor. Strict anaerobii sunt asociati cu alte bacterii, putand da complicatii, infectii la distanta.

Microbiota
Microbiota vaginala
Lactobacillus +++ Prevotella bivia Prevotella pigmentees Prevotella disiens Peptostrptococcus ssp. bucala Prevotella pigmentes Porphyromonas ssp Prevotella grup oral Fusobacterium nucleatum Peptostrptococcus ssp. Eubacterium spp Actinomyces spp. Anaerobi din microbiota normala

Piele Propionibacterium acnes +++ Peptostrptococcus ssp.

Microbiota intestinala Bacterioides grup fragilis +++ Bilophila wadworthia Peptostrptococcus ssp. Clostridium spp Bifidobacterium spp Eubacterium spp

Supuratii abdominale

Puroi ginecologic

Pneumonie ab ingestis

Abcese pulmonare Pleurezii purulrnte

+ +

Cap si gat

Tesuturi moi

Bacterioides fragilis Bacterioides fragilis Prevotella bivia Prevotella oralis Porphyromonas spp Fusobacterium nucleatum Fusobacterium necrophorum Peptostreptococcus spp grup

+++ ++

(+) (+) (+)

(+) (+)

+ +

+++

/ / /

+ + +

+++ (+) ++

+++ (+) +++

++ + ++

+ ++ /

++

++

++

++

++

++

Actinomyces spp
Clostridium perfringens

/
++

++
/

+
+

++
/

++
0

(+)
+

Diagnosticul de laborator
Medii de cultura pentru bacili G- : mediu Schaedler cu sange si cu vancomicina (7,5 mg/l) si neomicina (75mg/l) (Bacterioides grup fragilis, Prevotella, Fusobacterium. pentru bacteriile G+ si Porphyromonas.- geloza Columbia cu sange si feniletilalcool (4,2g/100ml) pentru Clostridium: TSN, geloza cu galbenus de ou si neomicina, Columbia cu sange, cicloserina, si cefoxitina pentru C difficile. bulion anaerob repicat dupa 48-72 de ore pe geloza selectiva. Incubare in conditii de anaerobioza Identificarea prezumtiva-determinarea genului bacterian al majoritatii anaerobilor (suficient!!!!).

- studiul mobilitatii intre lama si lamela in contrast de faza - coloratia Gram - testul oxidazei si catalazei - cresterea in prezenta de antibiotice (kanamicina, colistin, vancomicina) si inhibitori (bila, verde briliant) - Gentamicina DD (10 ~g) si Metronidazol DD (5 ~g) diferentierea anaerobilor stricti ( S Metro) de facultativ anaerobi sau microaerofili (S Genta) - studiul fermentatiei zaharurilor: producere de indol, gelatinaza, cu ajutorul minigaleriilor -studiul caracteristicilor enzimatice cu ajutorul galeriilor de identificare rapida Bacteriile cel mai frecvent izolate prin aceste metode simple sunt: Bacterioides fragilis, Bacterioides ureolyticus, Prevotella melanimogenica, Prevotella bivia, Fusobacterium nucleatum, F. necrophorum, Porphyromonas gingivalis, Bilophila wadsworthia, Clostridium perfringens, C difficile, Propionibacterium acnes, Actinomyces meyeei.
Identificare definitiva cromatografie in faza gazoasa, biologie moleculara

 Fusobacterium nucleatum, Actinomyces, Clostridium perfringens morfologie caracteristica. Pleomorfism

Clostridium -Gram-negativ , cu morfologie similara cu Eubacterium /Propionibacterium. Bacteroides sp. Cu vacuole confundati cu forme sporulate vacuoles Formele cocobacilare de Eubacterium se aseamana cu cocii anaerobi

Veillonella poate aparea Grampoz B. melaninogenicus, B. corrodens si E. lentum morfologie de coci

Testul cu KOH (3%) string test = pt diferentiere Gram +/Gram -

Testul -LACTAMAZEI
Diferentierea Bacteroides fragilis (confera R la cefalosporine, iar la B.melaninogenicus la peniciline (testul nitrocefinei)

Testul CAMP
Identificarea prezumptiva a C. perfringens in prezenta de S. agalactiae

Imunufluorescenta
Diferentierea C. septicum/ C. chauvoei/ C. novyi/ C. tetani / 3 grupuri de C. botulinum: ABF/CD/E B. fragilis, B. thetaitaomicron, B. vulgatus, B. ovatus, B. distasonis, B. melaninogenicus, B. melaninogenicus, B. asaccharolyticus, B. intermedius.

Sistemele microtest

Metode de testare a sensibilitatii

Dilutie in agar
Brucella agar suplimentat cu vit. K si 5% singe de oaie, incubare 48 h

Microdilutii in mediu lichid 48h

Neadecvata pt fastidiosi Fusobacterium, Bilophila, Peptostreptococcus, Porphyromonas, culturi pigmentate de Bacteroides) si pt metronidazol

Elutie bulion- disc (disc cu Atb plasat in bulion + cultura microbiana) E-Test

Metoda standard Dilutia Atb in agar

M-anaerobioza

AMX 0,125g/ml

AMX 32 g/ml

AMP 16g/ml

AMP 64g/ml

M-aerobioza IMP 0,125g/ml IMP 0,3g/ml GM 19,7 g/ml GM 128 g/ml

Elutia antibioticului in mediu lichid

Bacteroides fragilis 21

TZP

LEV

DA

IMP CTX

FOX AMC AMX

AMC

AMX

TZP

AN

GM

CC

CIP

IMP

FOX

Bifidobacterium ssp.36
R AMC AMX E TZP D AN C GM CC CIP IMP R FOX

Actinomyces naeslundii 50

METODA DISC DIFUZIMETRICA DIFICULTATI DE CITIRE A DIAMETRELOR

BHI + tioglicolat, 0,8%

Mediu Thioglicolat 0,8%

Mediu Muller-Hinton

Bacteroides fragilis

Bacteroides ovatus

Probleme ????

Metoda I

Metoda II

Metoda III

Sensibilitatea la antibiotice
Bacterioides grup fragilis multirezistente, secretoare de -lactamaze, altele sunt rezistente la metronidazol.
Bacterioides grup fragililis Amoxiclina, amoxicilina+acid clavulanic, cefoxitin, cefotaxim, imipenem, clindamicina, metronidazol

Alti bacili Gram- (Prevotella, Fusobacterium)

Amoxiclina, amoxicilina+acid metronidazol

clavulanic,

Coci Gram+ si bacili Gram+ nesporulati (Propionibacterium, Actinomyces) Clostridium

Penicilina, metronidazol, vancomicina, ofloxacin (pentru Propionibacterium) Ampicilina, amoxicilina+acid clavulanic, metronidazol, vancomicina, clindamicina

CONCLUZIE
Citirea atenta a antibiogramei Alegerea judicioasa a discurilor Ordonarea corespunzatoare a discurilor pe placa Cunoasterea fenotipurilor de rezistenta naturala si dobindita

Permite
Detectarea rapida la nivelul laboratorului a unui nou fenotip de rezistenta la antibioticele beta-lactamice asociat cu producerea uneia sau mai multor beta-lactamaze emergente

Clasificarea clinica a infectiilor fungice

Infectii superficiale- cutanate, ale scalpului si /sau unghiilor- dermatofiti Infectii subcutanate consecutive unor traumatisme, implica tesutul subcutanat, vasele limfatice, tesuturile adiacente Infectii sistemice- gama variabila de la infectii subclinice pina la boli grave grave, debilitante, agentii adesea distributie geografica Infectii oportuniste (produse de comensali sau saprofiti la organisme imunodeprimate)

Fungi monomorfi de importanta clinica

CANDIDA ALBICANS si CANDIDA sp. * * * * CANDIDA (TORULOSPIS) GLABRATA * * * * CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS * * * * * GEOTRICHUM sp. * * * * * TRICHOSPORON sp. * * * * * SACCHAROMYCES sp. * * * * * HANSENULA ANOMALA

Candidozele
Majoritatea infectiilor sunt endogene- colonizarea pielii si mucoaselor (candidoze orale,vaginale, colonizare pulmonara, bronsite cronice, bronhopneumonii, endocardite, septicemii asociate dispozitivelor proteice, ITU (C. glabrata)

Pseudohife si blastoconidiicol. Lactofenol anilin blue

Cresterea pe Sabauroud (agar dextroza) la 48h

Colonii cu extensii caracteristice, filiforme si tuburi germinative (2-3 h incubare in ser sau plasma)- suspiciune de Candida albicans. .

Agar cu must de malt

Preparat de Candida albicans pe agar cu must de malt

-Producere de clamidospori sferici pe partea laterala sau la virful pseudohifelor , uneori grupati in agregate

Identificare biochimica cu ajutorul Api ID32C.

Alte specii de Candida

Candida kefyr (pseudotropicalis): infectii asociate dispozitivelor protetice Candida krusei: ITU, ITR in granulopatii medicamentoase, posttransplant medular Candida tropicalis: infectii invazive la pacientii cu malignitati Candida lusitaniae: infectii oportuniste nosocomiale. Candida parapsilosis: fungemii asociate dispozitivelor protetice, endocardite, endofalite post chirurgie oculara Candida (Torulopsis) glabrata: ITU, fungemii asociate dispozitivelor protetice.

Morfologia pe agar cornmeal

Candida tropicalis: conidii dispuse de-a lungul hifelor Candida kefyr: conidia in logs in a stream arrangement. LL: Candida parapsilosis: colonii satelite de tip paianjen. RL: Candida kruzei: conidii eliptice din hife ramificate.

Indicatiile antifungigramei
Nu este examen de rutina La cererea medicului Testarea de noi agenti Izolate din cavitati sterile Noi specii Esec terapeutic

Se testeaza
Izolatele de Candida spp. din situri sterile fata de fluconazol C. albicans la pacienti cu infectii cronice inainte de administrarea fluconazolului Toate speciile non C. albicans (exceptie C. krusei ) Izolatele mucoase de Candida spp. La pacienti cu esec terapeutic cu azoli Izolate din situri profunde, mai ales non-albicans Candida la cererea medicului: se testeaza fluconazol si mai rar itraconazol sau 5-FC

Pattern-uri de susceptibilitate
C. albicans In general S la Amphotericin, Fluconazol, Itraconazol si 5FC R sau S diminuata la Fluconazol: C. glabrata, C. krusei (R), Rhodotorula rubra (R) and some C. tropicalis R amfotericina Candida lusitaniae Trichosporon sp. R Itraconazol C. glabrata, C. tropicalis Saccharomyces sp and Rhodotorula sp.

Metode
Macrodilutii (NCCLS M27-A pentru alti agenti antigfungici in afara de fluconazol si voriconazol) Microdilutii Disc difuzie (CLSI (NCCLS document M 27) Subcommittee on Antifungal Susceptibility Testingdoar pentru Candida sp. la fluconazol si voriconazol) E-test Dilutii in agar

Metodologie- microdilutii
Prepararea inoculului (5 colonii din cultura de 24 48 h pe mediu SAB suspendate in SF 0.85%, 0.5 McFarland - 5 x 102 -2.5 x 103 UFC/ml ) Control de calitate M-27A CLSI Candida parapsilosis ATCC 22019
CMI (game CMI mici medii)

Candida krusei ATCC 6258

CMI (game CMI mari)

Metodologie Microdilutii
NCCLS M27-A Mediu RPMI-1640 Inocul: 100 ul suspensie 0.5 McFarland inoculata in microplaci cu dilutii de antifungic Incubare: 35 C; 48 hr. C. neoformans - 72 hr Cea mai mica concentratie la care nu se mai observa crestere microbiana (pentru amfotericina, 80% reducere a turbiditatii pentru azoli si 5-FC)

Interpretive Guidelines for In Vitro Susceptibility Testing of Candida Species: CLSI

Antifungal Agent -- Susceptible (S) -- Susceptible-dose dependent (S-DD) a-- Intermediate (I)b -- Resistant (R) - Non-susceptible (NS) Anidulafunginc <2 Caspofunginc Fluconazoled Flucytosinee Itraconazolef

<=2 <=2 <=8 <=4 <=0.125 -

>2 >2

16- 32

>64 >=32 >=1

0.25 0.5

8 16

Micafunginc
Voriconazolec

<=2
<=1

=>4

>2

Shown are the breakpoints (ug/mL) for Candida species against the indicated agents. If MICs are measured using a scale that yields results falling between categories, the next higher category is implied. Thus, an isolate with a fluconazole MIC of 12.5 ug/mL would be placed in the S-DD category. Susceptibility is dependent on achieving the maximum possible blood level. For fluconazole, doses as high as 400 mg/day may be required; for itraconazole, serum levels of >0.5 ug/mL may be required for optimal response.

Probleme
Detectia R Amphotericina la C. albicans Testarea sensibilitatii la C. neoformans Realizarea de baze de date si profiluri de sensibilitate in diferite unitati Interpretarea datelor de sensibilitate pentru candidoze non-orofaringiene si pentru ale specii non- C. albicans

Voriconazol
-- Aspergiloza invaziva Infectii grave cu Fusarium si Scedosporium sp,(P. boydii) la pacienti refractari sau intoleranti la terapie Neaprobat FDA pentru neutropenia febrila si infectii cu Candida
Spectru de activitate

Candida sp. C. albicans, C. krusei, C. tropicalis, C. glabrata R la fluconazol (CMI mai mari la tulpinile rezistente)

Mai activ decit ampho, 5-FC, itraconazol si fluconazol; activitate buna fata de C. krusei

Echinocandine: Caspofungin
Spectru de activitate
Candida sp.
C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis C. krusei, C. parapsilosis, C. lusitaniae Mai putin activ fata de C. guilliermondii Activ fata de tulpinile S sau R la azoli Nu este activ fata de Cryptococcus

neoformans

Sensibilitatea tulpinilor izolate in infectii invazive Candida albicans Candida glabrata Candida parapsilosis Candida tropicalis Candida lusitaniae 51% - 73% 22.2% 9.6% 4.4% 1.2%

toate C. albicans S la Fluconazol 82% din izolatele de C. glabrata S diminuata la Fluconazol Sensibile la Voriconazol si Caspofungin

Recomandari
Fluconazol tratament empiric al fungemiilor cu Candida la pacienti care nu au primit tratamente profilactice cu azoli Testarea sensibilitatii- necesitate minimala

E-test

Sensititre Yeast-One Assay metoda altenativa foarte buna

 In infectiile fungice, se trateaza pacientul

Indepartarea dispozitivelor protetice. Drenajul abceselor, tratarea imunosupresiei

Corelarea clinicopatologica cu proprietatile farmacologice ale antifungicului este esentiala

Recomandari clinice
Antibiograma inutil
cnd tulpina izolat nu poate fi considerat responsabil de infecia care a determinat prelevarea, ex. microorganism comensal sau contaminant, i.e. streptococi orali sau Haemophilus parainfluenzae n expectoraii, Bacillus ntr-o singur hemocultur); cnd numarul de UFC/ml este inferior pragului semnificativ (urina i expectorai); dac tulpina izolat patogen face parte dintre speciile sensibile n mod obinuit la tratamentul de referin Str. pyogenes cnd nu exist nici o corelaie in vitro-in vivo (ex. Legionella); n infeciile cutanate pentru care tratamentul este local sau chirurgical.

Antibiograma practicat n acord cu clinicianul

daca o bacterie comensal este izolat de la un pacient imunodeprimat;

n prelevatele plurimicrobiene care conin specii aerobe/anaerobe

Fenotip grup 1= sensibilitate diminuata la cefalosporine de gen. I (producerea de cefalosporinaza tip AmpC)

E. coli

E. hermanii

48 h

Shigella flexneri/dysenteriae

Proteus mirabilis

R colistin

Salmonella thyphimurium

S. thyphi

Fenotip grup II- penicilinaza cromosomala de nivel scazut,

sensibila la acidul clavulanic

Citrobacter koseri (C. diversus, Levinea spp.)

Klebsiella oxytoca

Klebsiella pneumoniae

Grup 3- CEFALOSPORINAZA INDUCTIBILA CROMOSOMALA AMP C, de clasa A (sensib. la inhib. ) sau clasa C (rezist. la inhib.), inductibila de FOX, AMC, sau IMP, sensibilitate diminuata la IMP

Providencia (Proteus) rettgeri

Citrobacter freundii

Serratia marcescens

Morganella morganii

Hafnia halvei

GRUP V- PENICILINAZA DE NIVEL SCAZUT, sensibilitate diminuata la cefalosporinele din clasa I si II, BETALACTAMAZA DE SPECTRU LARG SENSIBILA LA INHIBITORI, sinergisme putin vizibile

Citrobacter sedlakii

Enterobacter cloacae

Proteus penneri

Proteus vulgaris

Serratia fonticola

Kluyvera ascorbata

Acinetobacter boumannii

Acinetobacter lwofii (rar) Alcaligenes faecalis

Achromobacter (alcaligenes) xyloxydans/ Bordetella bronchiseptica

Burkholderia cepacia

B. pseudomallei- penicilinaza de nivel scazut

Chryseobacterium indologenes penicilinaza de nivel inalt + Metalo-betalactamaza de clasa B, rezistenta la inhibitori

Chryseobacterium meningosepticumBLSE non-inductibila, clasa A + carbapenemaza clasa B

Ochrobactrum antropibeta-lactamaza de clasa C, alte mecanisme inca nedescoperite

PSEUDOMONAS AERUGINOSA beta-lactamaza inductibila cromosomala de clasa C + eflux

Pseudomonas stutzeri beta-lactamaza inductibila cromosomala de clasa A

Ralstonia pickettii Rezistenta de nivel scazut la peniciline oxacilinaza inductibila cromosomala

Stenotrophomonas maltophilia -lactamaza cromosomala inductibila de clasa B (imipenemaza) si de clasa A

1. HIPERPRODUCERE DE BETA-LACTAMAZA CROMOSOMALA clasa A

Klebsiella penumoniae

Citrobacter koseri

Klebsiella oxytoca

Kluyvera ascorbata

Proteus vulgaris

Serratia fonticola

2. HIPERPRODUCERE DE BETA-LACTAMAZA CROMOSOMALA clasa C sensibila la cloxacilina (incorporare in mediu- 200-300 mg)

E. coli

Enterobacter cloacae

Morganella morganii

Serratia marcescens

Pseudomonas aeruginosa

3. Cefalosporinaza cromosomala hiperprodusa +defect de

impermeabilitate (pierderea porinelor) R CGIII, fara sinergism, R IMP

Cloxacilina

Enterobacter cloacae

Pseudomonas aeruginosa pierderea porinei D2

4. Cefalosporinaze mutante (BLSE CASE) modificarea afinitatii pentru tinta =R CGIV

5. Penicilinaze transferabile (Tra+) -TEM, SHV , PSE (clasa A)- R TIC,S TCC, Oxacilinaze (clasa D)

E. coli -TEM

Enterobacter aerogenes

P.aer. Oxa-4

P.aer.
PSE

6 HIPERPRODUCERE CEFALOSPORINAZE (AmpC) + PENICILINAZE TEM-sinergism, S CGIV

Enterobacter cloacae

Acinetobacter boumannii

DETECTIA BETA-LACTAMAZELOR DE SPECTRU LARG SAU SPECTRU EXTINS Recomandarile standardelor americane: -screening- disc difuzie sau CMI pentru cefalosporine CGIII - carbapeneme (CAZ, CPD, ATM, CTX, CRO)

Fenotipuri de tulpini de E. coli producatoare de beta-lactamaze de spectru larg

Solutii Sinergism slab= Refacerea antibiogramei cu un inocul mai

dens

Solutii
Inactivarea cefalosporinazei prin includerea cloxacilinei in mediu

Cloxacilina

E. coli CASE +BLSE CASE = rezistente la inhibitori si

Solutii
TESTE CU INHIBITORI SPECIALI CASE TIP CLOXACILINA 100 / 200 g, Ro 48-1220 (10 ou 20 g), BRL42715 (10 ou 20 g)

8. Enzime tranferabile tip TRI/IRT (afinitate< beta-latamice)/CMT (fenotip ESBL/IRT)

E. coli- fenotip salbaticfenotip IRT

Apropierea discurilor

E. coli -(complex mutant TEM)- Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae- sensib. diminuata la peniciline, inclusiv cele antipseudomonade, cefalosporine, incl. gen. IV, sinergism foarte slab cu inhibitori de beta-lactamaze

9. Cefalosporinaze transferabile
Rezistenta dobindita la cefalosporine gen. III, fara sinergisme- K. pneumoniae, K. oxytoca, Salmonella spp. Proteus mirabilis, sensib. Conservata la cefalosporine gen. IV si imipenem Spectrul de rezistenta- similar cu CASE (cefalosporinaza cromozomala hiperprodusa), insa spre deosebire de aceasta, este doar in mod exceptional inductibila

E. coli

Salmonella sp.