Real Time PCR
Real Time PCR
Real Time PCR
Silvia Dăscălescu
Medic rezident medicina de laborator
• Metoda de electie pt cuantificarea acizilor
nucleici datorita sensibilitatii si dinamicii.
• Amplificarea simultana si cuantificarea
template-ului ADN intr-o anumita proba prin
stabilirea numarului de copii prezente in faza
initiala, exponentiala a amplificarii; se
bazeaza pe generarea unui semnal
fluorescent.
• 3 segmente: background, faza exponentiala
(logarimtica sau liniara), de platou.
• in stadiile initiale ale reactiei PCR, atunci
cand reactivii sunt in exces si cand cantitatea
de produs amplificat este inca mica.
• metodele „end-point”:semicantitative,
consumatoare de timp; bazate pe detectia
unui fragment amplificat (banda de
amplificare) intr-o proba si nu pe masurarea
numarului de copii.
“BACKGROUND NOISE”
HybProbe: oligonucleotidul probei HybProbe hibridizeaza cu o parte a secventei tinta care nu are mutatii;
aceasta proba functioneaza ca o ancora. Celalalt oligonucleotid HybProbe (mutation or detection probe) se
intinde peste situsul de mutatie si are o Tm cu aproximativ 50 C mai mica decat a Tm a probei ancora. Pe
masura ce temperatura creste, proba de mutatie mai scurta se disociaza prima. Atunci cand se intampla asta, cei
doi fluorocromi nu mai sunt in proximitate si semnalul de fluorescenta scade. Deoarece Tm a hibridului proba-
tinta depinde nu doar de lungimea si continutul GC al probei, dar si de gradul de homologie care caracterizeaza
hibridul, probele legate perfect se separa la o Tm mai mare decat cele care se leaga la un ADN care contine un
mismatch destabilizator.
Monitorizarea probelor marcate fluorescent pe masura ce se topesc si se desprind de secventa tinta. Atunci
cand analiza curbei de topire este utilizata pentru a monitoriza topirea duplexurilor scurte, cum ar fi hibrizii
dintre HybProbe sau probele SimpleProbe, testul poate identifica chiar si o singura alterare a unei baze din
amplicon( detectia SNP,genotipare)
U N I V E R S A L L I B R A RY
• https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/en/filelibrary/n
ucleic-acid-amplification-expression-profiling/pdfs.par.65119.file.dat/essentials
%20of%20real%20time%20pcr.pdf
• https://www.thermofisher.com/ro/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-ti
me-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/real-time-vs-digital-vs-traditional-
pcr.html
• https://www.gene-quantification.de/real-time-pcr-handbook-life-technologies-u
pdate-flr.pdf