REAL-TIME PCR

Silvia Dăscălescu
Medic rezident medicina de laborator
• Metoda de electie pt cuantificarea acizilor
nucleici datorita sensibilitatii si dinamicii.
• Amplificarea simultana si cuantificarea
template-ului ADN intr-o anumita proba prin
stabilirea numarului de copii prezente in faza
initiala, exponentiala a amplificarii; se
bazeaza pe generarea unui semnal
fluorescent.
• 3 segmente: background, faza exponentiala
(logarimtica sau liniara), de platou.
• in stadiile initiale ale reactiei PCR, atunci
cand reactivii sunt in exces si cand cantitatea
de produs amplificat este inca mica.
• metodele „end-point”:semicantitative,
consumatoare de timp; bazate pe detectia
unui fragment amplificat (banda de
amplificare) intr-o proba si nu pe masurarea
numarului de copii.
 “BACKGROUND NOISE”

• Linia de baza (baseline)= usoara modificare a

semnalului fluoresc.la inceputul reactiei (cicl. 3-
15); asociata cu fluorescenta de fundal
(background)
• Threshold (prag)= crestere semnificativa a
semnalului peste linia de baza
• Cycle threshold (Ct)= nr de cicl. la care semnalul
fluorescent depaseste “pragul”
 PRINCIPIUL RT-PCR

• Detectia unui fluorocrom si corelarea

semnalului fluorescent cu cantitatea de produs
PCR din reactie. Cele mai uzuale metode
fluorescente se impart in 2 categorii:
1. Detectia independenta de secventa
-SYBR Green I (Dye fluorescence)
-fluorophori care se intercaleaza specific si astfel
se leaga puternic la nivelul ADN dc, indiferent de
secventa acestora
- cost-eficienta
- cantit.mare de ADN dc=>legare
puternica=>cresterea intensitatii
-calibrarea realizata prin efectuarea unor
standarde ce contin cantitati cunoscute de ADN
dc.
II. Detectia dependenta de secventa
-SimpleProbe Probes: proba marcata cu fluoresceina
-Probe de hidroliza: tehnologia TaqMan, utilizand FAM, HEX sau
VIC
-probe oligonucleotidice care se hibridizeaza la nivelul secventei
complementare de la nivelul produsului tinta de PCR=>
detecteaza exclusiv acel produs specific. Formatul de probe:
hidroliza, hibridizare (HybProbe) sau probele single-labeled
(SimpleProbe). Aceste probe sunt cuplate la fluorofori care pot fi
masurati cu ajutorul instrumentului de RT-PCR ----
LightCycler®HybProbe
 
Principiul FRET
• transferul de energie de la un fluorofor donor catre unul
acceptor. Daca donorul si acceptorul se gasesc in imediata
vecinatate, excitarea donorului de catre lumina albastra
conduce la transfer de energie catre acceptor, care poate emite
lumina la o lungime de unda mai mare.
Hyb Probe:
• probele nu sunt alterate in timpul reactiei PCR.
• La sfarsitul amplificarii, ambele probe sunt intacte si
pot fi utilizate intr-o curba de topire ulterioara (de ex.
pentru detectia mutatiilor sau analiza SNP).
• Pentru design-ul primerilor si probelor de hibridizare
sunt disponibile software-uri. Aplicatii: Qpcr, detectia
mutatiilor (SNP).
Single probe
• o singura proba este necesara( comp.cu Hyb)
• modificarile semnalului fluorescent depind doar de
statusul de hibridizare specific al probei la secventa
tinta (cu SNP de interes)
 F O R M AT U L P R O B E I
DE HIDROLIZA
( TA Q M A N )

-teste 5’ nucleaze omogene, de vreme

ce o singura proba de hidroliza 3’, non-
extensibila, care este clivata in timpul
amplificarii PCR, este utilizata pentru a
detecta acumularea unei tinte ADN
specifice.
-contin un reporter fluorescent si un
quencher (suprima semnalul
fluorescent al reporterului)
-in proba clivata, reporter-ul nu mai
este stins si emite semnal fluorescent
cand este excitat.
-probele de hidroliza sunt digerate
in timpul PCR (spre deosebire de
HybProbe)
 DEZAVANTAJE

1) SYBR GREEN: semnale fals

pozitive (i.e.se poate lega si la
ADN dc non-specific)

2) Taqman: design dificil ( unele

probe au “quenching”ineficient),
costisitoare
 M E LT I N G C U RV E A N A LY S I S S I H I G H R E S O L U T I O N M E LT I N G ( H R M ) C U RV E

• Termocicloarele destinate RT-PCR pot monitoriza

modificarile de fluorescenta din timpul modificarilor de
temperatura. Astfel, etapele de annealing si denaturare
pot fi urmarite in timp real (“melting curve analysis” -
analiza curbei de topire). Sunt utilizati fie coloranti
pentru ADN dublu catenar , fie probe oligonucleotidice
specifice unei secvente si pot fi adaugate la sfarsitul
reactiei PCR.
• SYBR Green I :pt. a determina daca produsul PCR dorit
nu este contaminat cu produsi non-specifici. Molecula de
ADN dc prezinta o temperatura de topire (Tm) –
caracteristica (50% ADN ds si 50% ss). In timpul unui
astfel de test, amestecul de reactie este incalzit incet pana
la 95 C=> topirea ADN. Cand temperatura atinge punctul
Tm, apare o scadere brusca a fluorescentei SYBR Green
I.
• HRM: fluorocromi non-specifici pentru secventa tintei se
leaga la secventa de ADN dublu catenar intr-o maniera de
saturare (saturating manner)=> semnale foarte uniforme,
precise, in timpul analizei curbei de topire (SNP, ADN
heteroduplex/homoduplex)
Multiple peaks= amplificarea non specifica,
dimer primer
 G E N O T I PA R E A C U P R O B E H Y B P R O B E S I S Y B P R O B E S I D E T E C T I A S N P

HybProbe: oligonucleotidul probei HybProbe hibridizeaza cu o parte a secventei tinta care nu are mutatii;
aceasta proba functioneaza ca o ancora. Celalalt oligonucleotid HybProbe (mutation or detection probe) se
intinde peste situsul de mutatie si are o Tm cu aproximativ 50 C mai mica decat a Tm a probei ancora. Pe
masura ce temperatura creste, proba de mutatie mai scurta se disociaza prima. Atunci cand se intampla asta, cei
doi fluorocromi nu mai sunt in proximitate si semnalul de fluorescenta scade. Deoarece Tm a hibridului proba-
tinta depinde nu doar de lungimea si continutul GC al probei, dar si de gradul de homologie care caracterizeaza
hibridul, probele legate perfect se separa la o Tm mai mare decat cele care se leaga la un ADN care contine un
mismatch destabilizator.

Monitorizarea probelor marcate fluorescent pe masura ce se topesc si se desprind de secventa tinta. Atunci
cand analiza curbei de topire este utilizata pentru a monitoriza topirea duplexurilor scurte, cum ar fi hibrizii
dintre HybProbe sau probele SimpleProbe, testul poate identifica chiar si o singura alterare a unei baze din
amplicon( detectia SNP,genotipare)
 U N I V E R S A L L I B R A RY

• 165 probe de RT-PCR dublu marcate si pre-validate

• pot cuantifica orice transcript din transcriptoamele umane, murine, de sobolan, primate, Drosophila, C. elegans
si Arabidopsis.
• seturile specifice de specie pot detecta 95-99% dintre transcripturile organismului respectiv (lungime de 8-9
nucleotide a probelor din acest sistem).
Probe mai scurte decat probele clasice de hidroliza (25-35 de nucleotide)
• este inclus LNA (Locked Nucleic Acid) – un analog de stabilizare a duplexului ADN(mentinerea specificit., Tm
si compatibilit. impuse de probele de hibridizare)
• Datorita secventei scurte, proba se poate lega la aproape 7000 de transcripturi, in timp ce fiecare transcript este
detectat de catre circa 16 probe diferite.
• un singur transcript este detectat intr-un anumit test PCR, specificitatea fiind asigurata de setul de primeri ai
reactiei PCR.
• www.universalprobelibrary.com.
 RT- P C R C U A N T I F I C A R E

-absoluta (conc exprimata in valoare

absoluta); curba standard calculata cu
ajutorul unor probe standard externe cu
concentratii cunoscute pt determinarea
conc moleculelor tinta din produsul
investigat (microbiologie, virusologie)

-relativa: raport tinta/gena de

referinta(nivel de expresie al mARN)
 BIBLIOGRAFIE

• https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/migration/en/filelibrary/n
ucleic-acid-amplification-expression-profiling/pdfs.par.65119.file.dat/essentials
%20of%20real%20time%20pcr.pdf

• https://www.thermofisher.com/ro/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-ti
me-pcr-learning-center/real-time-pcr-basics/real-time-vs-digital-vs-traditional-
pcr.html

• https://www.gene-quantification.de/real-time-pcr-handbook-life-technologies-u
pdate-flr.pdf