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Reveals Deep-Sea
Fish Microbiome Isolates as Sources of Novel
Antimicrobials
Shona Uniacke-Lowe , Fergus W. J. Collins , Colin Hill 1,2 and R. Paul Ross ,
Mar. Drugs 2023, 21, 444.
報告者:周宗佑
指導教授:楊鉅文 教授
報告日期: 2024.04.30
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Introduction
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introduction
• 深海涵蓋 95% 的海洋體積,深度超過
10,000 米。低溫、水壓、無光的環境
• 僅 0.001% 被探索
• 蛋白質通常溫度活性高
• 具有特殊的氨基酸結構,增加耐高壓性
• 具有特殊的抗菌基因
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introduction
細菌素
細菌核糖體產生的抗菌蛋白,會攻擊特定病源
Bacteriocins
菌,可分為兩類。
抗病原性、高耐熱性、可以進行生物工程以及
生產具有高附加價值的代謝物,正逐漸成為抗
生素的替代品。
對目標細菌具有專一性。
Lactococcin_972
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• Class I Bacteriocins ( Lantibiotics or Lanthipeptides ):
• 作用機制:破壞目標細胞的細胞膜結構,進而殺死目標。
• Class II 不具有蘭氨酸,根據結構及功能不同可分為四類。
• 作用機制:包括破壞細胞膜、阻礙細胞壁合成以及抑制蛋白質合成。 5
合成方式
• Class I (後翻譯修飾):蛋白質合成後,通過後續的修飾過程
( 例如切割、磷酸化、糖基化 ) 來生成細菌素。
• Class II (前翻譯修飾):細菌素的合成和修飾過程通常在蛋白質
合成的同時進行。
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Meterials and methods
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Materials and methods
• 實驗的魚是從紐芬蘭的外海採集,深度範圍 850 米到 1000 米。
• 提取皮膚和腸道樣本,塗抹於 BD DifcoTM Marine Agar 2216
( MA , Becton Drive , NJ , US ),並於 4°C 培養三週。
• 挑選出 374 個菌落,在 35% 的甘油中 -80°C 冷凍保存。
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apristurus sp. 光尾鯊屬
bathysaurus ferox 深海蜥魚
• 在食品工業中廣泛應用,對抗菌活性評估有實際應用價值。
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二次評估 65 支菌株對 Lactobacillus bulgaricus 的抗菌性
• 菌塗抹於 MA ( BHI , Oxoid , Basingstoke , UK )及三菌素大豆
瓊脂( mTSA , +0.5 g/L NaCl , Oxoid ) 5°C 培養 2 週,然後在各
培養基表面加入 0.8% 瓊脂和 0.25% 的 Difco MRS ( mMRS ,
+0.5 g/L 胱氨酸)混合的的 L. bulgaricus 培養物。
• 隔夜培養後,測量其抑制距離,分成四種記錄結果:
1. + ( 0.5–2.5 mm )
2. ++ ( 2.6–5 mm )
3. +++ ( 5.1–10 mm )
4. ++++ ( >10 mm )
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指示菌種的抑菌測試
• 將菌株塗抹於 MA 培養基,在 5°C ( ±1°C )培養 2 週,並在
對應的培養基中,以相同方法操作表 5 中列出的指示細菌。
• 測量抑制距離。
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• 從樣本提取 gDNA ( gene DNA ),使用 GeneJET 基因組 DNA 純化套件
( Thermo Scientific )並進行全基因組測序
• 電腦篩選( in silico screening )尋找 RiPP 基因和生物合成基因簇
( PBGCs ),使用 BAGEL4 、 AntiSmash 及 RiPP-miner 軟體進行 。
• 把可能的細菌素基因簇標記,並分析其肽前體 / 核心肽段( protein
precursor )
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• ABRi-cate 進行抗藥性基因檢測。
Results
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• 大多數樣本來自 N. chemnitzii 和 C. coelolepis
• 其中有 63% 樣本的樣本來自皮膚
圖二 . 共 65 組樣
本
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表一 . 抑制結果
二次評估後 65 株中有 36 株對
L. bulgaricus LMG 6901 具有抗菌性。
• 樣本來源和魚種按數字編號:
1. A.cornuta
2. Apristurus sp.
3. B.ferox
4. C.coelolepis
5. M.niger
6. N.chemnitzii
7. A.bairdii
抑制活性
• + ( 0.5–2.5 mm )
• ++ ( 2.6–5 mm )
• +++ ( 5.1–10 mm )
• - (無抑制)
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圖三 . 菌種多樣性
• A ( 門 ) : Pseudomonadota ,佔 72.3%
• B ( 綱 ) : Gammaproteobacteria 佔最多,其次是 Bacilli 16.9% ( Bacillota 門)、 Actinomycetia 9.2%
( Actinomycetota 門)。
• C ( 目 ) : Alteromonadales 交替單胞菌 49.2% 、 Pseudomonadales 假單胞菌目 20% 和 Bacillales 16.9% 。
• D E ( 科、屬 ) : Pseudoalteromonas 假交替單胞菌屬 51.9% ( Pseudoalteromonadaceae 科),其次是
Psychrobacter 嗜冷菌屬 21.5% ( Moraxellaceae 科)、 Planococcus 動性球菌屬 12.4 % 。 19
抑制測試
22 種指示菌有 13 種被抑制(見圖五)。
• Planococcus 和 Arthrobacter sp. 對同屬指示菌表現出較好的抑制效果。
• Pseudoalteromonas sp. APC 3221 、 APC 3224 具有最廣泛的抑制性。
• Arthrobacter sp. 對李斯特菌表現出最好的抑制效果
• 革蘭氏陰性菌皆沒有被抑制。
圖四 .
20
圖五 .
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抗菌肽篩選
• BAGEL4 軟體預測出 19 個 AOI ( area on interest ) 。
• 14 個 I 類乳酸菌素、 2 個 II 類細菌素和 3 個較小分子的抗菌蛋白
質。
圖六 .
22
表
2.
23
圖七 .
• 36 個基因組中都發現了
PBGCs ,其中 RiPP-like 和 NRPS
最多
• 萜烯 BGCs 的存在說明為何在圖 圖四 .
四中能觀察到橙色 ( Planococcus
屬會生產萜烯 / 類胡蘿蔔素 ) 。
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表三 .
AntiSMASH 計算結果
許多 RiPP-like PBGCs 缺乏可識別的
基因,可能是基於相似的基序的細菌
素或 RiPP 存在。
• None 表示找不到類似的基因
• % sim 表示相似度
• nd 表示沒有數據 ( 相似度太低 )
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• 基於已確定存在核心肽段 / BGC ( 生物合成基因 ) ,篩選出最有
潛力的三組 PBGCs :
1. Arthrobacter APC 3897 中的環狀細菌素
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Class I LanM-Group Bacteriocins (Lanthipeptides)
• Planococcus sp. 的 APC 3900 、 4015 和 4016 的編碼序列完全相同,對應到
一種類似 cerecidin ( B. cereus )的細菌素。
圖八 A .
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• 使用 RiPPMiner 對比 Planococcus 核心肽段序列最相似的細菌素序列的 MSA
• 兩個肽段分別標記為 Pep1 和 Pep2 ,通過 RiPPMiner 的序列相似性查詢,最相似結果
是 cerecidin A1-6 和 cerecidin A7 ,相似度分別為 54.29% 和 55.71% 。
圖 8B
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• Pep1 和 Pep2 與 cerecidin 的 LanM 共享 45.49% 的相似度,可能就是
Planococcus 分離株的 LanM 蛋白。
• 表明 Planococcus 的肽段是 I 類細菌素
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Class IIc ( Circular ) Bacteriocin
• Arthrobacter APC 3897 的環狀細菌素基因簇測序出十個肽段,一個核
心肽段、一個運輸 / 切割蛋白、一個 DUF95 類蛋白、三個 ATP 結
合 / 運輸蛋白、一個免疫蛋白和三個功能未知的蛋白
圖 9A
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最相似的序列是來自 Enterococcus faecalis 的環狀細菌素 AS-48 ,與 APC
3897 肽段序列有 71.3% 的相似度。
圖 9B
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Class IId Bacteriocins
• Curtobacterium sp. APC 4022 發現兩個位於不同 片段上的 PBGCs ,兩組結構皆類似 lactococcin
972 和 mutacin II 的肽段。
圖 10B
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• Pep1 和 Pep2 與 mutacin II 和 lactococcin 972 進行比對, Pep1 和 Pep2
之間的相似度為 20.97% 。
• Pep1 與 lactococcin 972 和 mutacin II 的相似性分別為 15.32% 和 12.4% 。
• Pep2 與 lactococcin 972 和 mutacin II 的相似性分別為 26% 和 15% 。
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抗藥基因檢測
• 36 組中僅 Rhodococcus sp. APC 4022 檢測到抗藥性基因。
• 檢測到兩個與利福黴素 / 利福平抗藥性相關的基因:
(rif)iri 、 rpoB2
• 還檢測到 mtrA (編碼多重藥物外流蛋白)基因。
表 ABRicate 檢測結果
4.
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Discussion
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• 初步篩選中,有 36 個樣本保留了生物活性。其餘 29 株可能是因為其依賴外
部因素的誘導,自然環境中其他微生物代謝物。純化和移除這些代謝物會影響
它們的活性。
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• Planococcus APC 4015 和 APC 4016 表現出對幾種 G+ 指示菌的強效抗菌
性。
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• Arthrobacter APC 3897 被發現有 IIc 類細菌素的基因。
• AS-48 對革蘭氏陽性菌最活躍,特別是李斯特菌種,這與觀察到的抑制測試
結果一致, PBGC 的結構也與 AS-48 相同。
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• Curtobacterium APC 4022 僅在 mTSA 上對 L. bulgaricus 表現出抑制作用。
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• 僅 Rhodococcus APC 4022 具有抗藥性基因。
• mtrA :一種多重藥物外排基因。
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Conclusion
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• 實驗證實深海魚的皮膚和腸道微生物是可培養的,同時也是一個潛力豐富
的抗菌資源。
• 大部分抗菌表現好的菌株是假單胞菌屬,儘管一些抗菌性最好的屬於動性
球菌屬和放線菌屬。但也證明深海菌種也能抑制李斯特菌等食源性病原菌。
• 對探索極端環境微生物的抗菌性研究奠定了基礎。
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