Bioactivity Screening and Genomic Analysis

Reveals Deep-Sea
Fish Microbiome Isolates as Sources of Novel
Antimicrobials
Shona Uniacke-Lowe , Fergus W. J. Collins , Colin Hill 1,2 and R. Paul Ross ,
Mar. Drugs 2023, 21, 444.

報告者：周宗佑
指導教授：楊鉅文 教授
報告日期： 2024.04.30

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Introduction

2
 introduction
• 深海涵蓋 95% 的海洋體積，深度超過
10,000 米。低溫、水壓、無光的環境

• 僅 0.001% 被探索

• 蛋白質通常溫度活性高

• 具有特殊的氨基酸結構，增加耐高壓性

• 具有特殊的抗菌基因

3
introduction
細菌素
細菌核糖體產生的抗菌蛋白，會攻擊特定病源
Bacteriocins
菌，可分為兩類。

抗病原性、高耐熱性、可以進行生物工程以及
生產具有高附加價值的代謝物，正逐漸成為抗
生素的替代品。

對目標細菌具有專一性。

Lactococcin_972
4
• Class I Bacteriocins ( Lantibiotics or Lanthipeptides ):

• Class I 具有蘭氨酸，通常是線性的肽鏈加上特定的修飾基團 ( LanM ) 。

• 作用機制：破壞目標細胞的細胞膜結構，進而殺死目標。

• Class II Bacteriocins ( Non-Lanthionine-Containing Bacteriocins ):

• Class II 不具有蘭氨酸，根據結構及功能不同可分為四類。

• （ Class IIa ） pediocin-like

• （ Class IIb ）雙肽細菌素

• （ Class IIc ）環狀 / 循環細菌素

• （ Class IId ）單肽細菌素

• 作用機制：包括破壞細胞膜、阻礙細胞壁合成以及抑制蛋白質合成。 5
合成方式

• Class I （後翻譯修飾）：蛋白質合成後，通過後續的修飾過程
( 例如切割、磷酸化、糖基化 ) 來生成細菌素。

• Class II （前翻譯修飾）：細菌素的合成和修飾過程通常在蛋白質
合成的同時進行。

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Meterials and methods

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Materials and methods
• 實驗的魚是從紐芬蘭的外海採集，深度範圍 850 米到 1000 米。
• 提取皮膚和腸道樣本，塗抹於 BD DifcoTM Marine Agar 2216
（ MA ， Becton Drive ， NJ ， US ），並於 4°C 培養三週。
• 挑選出 374 個菌落，在 35% 的甘油中 -80°C 冷凍保存。

Anoplogaster cornuta 角高體金眼鯛

8
 apristurus sp. 光尾鯊屬
bathysaurus ferox 深海蜥魚

Malacosteus niger 黑柔骨魚

centroscymnus coelolepis 葡萄牙白斑角鯊

notacanthus chemnitzii 灰背棘魚

simenchelys parasitica 寄生鰻

alepocephalus bairdii 貝氏黑頭魚 9

• 對 374 支菌株進行了對 L.bulgaricus LMG 6901 的初步篩選 ( 65
支菌株被篩選並做二次測試 ) 。
• 觀測樣本內的菌種多樣性。
10
L. bulgaricus
• 對多種細菌素敏感，為評估抗菌性的理想指示菌種。

• 在食品工業中廣泛應用，對抗菌活性評估有實際應用價值。

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二次評估 65 支菌株對 Lactobacillus bulgaricus 的抗菌性
• 菌塗抹於 MA （ BHI ， Oxoid ， Basingstoke ， UK ）及三菌素大豆
瓊脂（ mTSA ， +0.5 g/L NaCl ， Oxoid ） 5°C 培養 2 週，然後在各
培養基表面加入 0.8% 瓊脂和 0.25% 的 Difco MRS （ mMRS ，
+0.5 g/L 胱氨酸）混合的的 L. bulgaricus 培養物。
• 隔夜培養後，測量其抑制距離，分成四種記錄結果：
1. + （ 0.5–2.5 mm ）
2. ++ （ 2.6–5 mm ）
3. +++ （ 5.1–10 mm ）
4. ++++ （ >10 mm ）

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指示菌種的抑菌測試
• 將菌株塗抹於 MA 培養基，在 5°C （ ±1°C ）培養 2 週，並在
對應的培養基中，以相同方法操作表 5 中列出的指示細菌。

• 測量抑制距離。

13
14
• 從樣本提取 gDNA （ gene DNA ），使用 GeneJET 基因組 DNA 純化套件
（ Thermo Scientific ）並進行全基因組測序
• 電腦篩選（ in silico screening ）尋找 RiPP 基因和生物合成基因簇
（ PBGCs ），使用 BAGEL4 、 AntiSmash 及 RiPP-miner 軟體進行 。
• 把可能的細菌素基因簇標記，並分析其肽前體 / 核心肽段（ protein
precursor ）
15
• ABRi-cate 進行抗藥性基因檢測。
Results

16
• 大多數樣本來自 N. chemnitzii 和 C. coelolepis
• 其中有 63% 樣本的樣本來自皮膚

圖二 . 共 65 組樣
本

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表一 . 抑制結果
二次評估後 65 株中有 36 株對
L. bulgaricus LMG 6901 具有抗菌性。

• 樣本來源和魚種按數字編號：
1. A.cornuta
2. Apristurus sp.
3. B.ferox
4. C.coelolepis
5. M.niger
6. N.chemnitzii
7. A.bairdii
抑制活性
• + （ 0.5–2.5 mm ）
• ++ （ 2.6–5 mm ）
• +++ （ 5.1–10 mm ）
• - （無抑制）

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圖三 . 菌種多樣性

• A ( 門 ) ： Pseudomonadota ，佔 72.3%
• B ( 綱 ) ： Gammaproteobacteria 佔最多，其次是 Bacilli 16.9% （ Bacillota 門）、 Actinomycetia 9.2%
（ Actinomycetota 門）。
• C ( 目 ) ： Alteromonadales 交替單胞菌 49.2% 、 Pseudomonadales 假單胞菌目 20% 和 Bacillales 16.9% 。
• D E ( 科、屬 ) ： Pseudoalteromonas 假交替單胞菌屬 51.9% （ Pseudoalteromonadaceae 科），其次是
Psychrobacter 嗜冷菌屬 21.5% （ Moraxellaceae 科）、 Planococcus 動性球菌屬 12.4 % 。 19
抑制測試
22 種指示菌有 13 種被抑制（見圖五）。
• Planococcus 和 Arthrobacter sp. 對同屬指示菌表現出較好的抑制效果。
• Pseudoalteromonas sp. APC 3221 、 APC 3224 具有最廣泛的抑制性。
• Arthrobacter sp. 對李斯特菌表現出最好的抑制效果
• 革蘭氏陰性菌皆沒有被抑制。

圖四 .

20
圖五 .

21
抗菌肽篩選
• BAGEL4 軟體預測出 19 個 AOI ( area on interest ) 。
• 14 個 I 類乳酸菌素、 2 個 II 類細菌素和 3 個較小分子的抗菌蛋白
質。

圖六 .
22
表
2.

23
 圖七 .

• AntiSMASH 識別可能的 PBGCs

( 結果以每個屬的總百分比和每種
PBGC 類型的計數給出 ) 。

• 36 個基因組中都發現了
PBGCs ，其中 RiPP-like 和 NRPS
最多

• 萜烯 BGCs 的存在說明為何在圖 圖四 .
四中能觀察到橙色 ( Planococcus
屬會生產萜烯 / 類胡蘿蔔素 ) 。

24
 表三 .

AntiSMASH 計算結果
許多 RiPP-like PBGCs 缺乏可識別的
基因，可能是基於相似的基序的細菌
素或 RiPP 存在。
• None 表示找不到類似的基因
• % sim 表示相似度
• nd 表示沒有數據 ( 相似度太低 )

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• 基於已確定存在核心肽段 / BGC ( 生物合成基因 ) ，篩選出最有
潛力的三組 PBGCs ：
1. Arthrobacter APC 3897 中的環狀細菌素

2. Planococcus sp. 中類似 cerecidin 的蘭胺肽

3. Curtobacterium APC 4022 中類似 lactococcin 972 的肽段。

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Class I LanM-Group Bacteriocins (Lanthipeptides)
• Planococcus sp. 的 APC 3900 、 4015 和 4016 的編碼序列完全相同，對應到
一種類似 cerecidin （ B. cereus ）的細菌素。

• 此基因簇有兩個細菌素生產基因、一個大型修飾蛋白（類似 LanM ）、一個

輸送蛋白、一個調節蛋白、一個蛋白酶和 ATP 結合 /ABC 輸送蛋白。

圖八 A .

27
 • 使用 RiPPMiner 對比 Planococcus 核心肽段序列最相似的細菌素序列的 MSA
• 兩個肽段分別標記為 Pep1 和 Pep2 ，通過 RiPPMiner 的序列相似性查詢，最相似結果
是 cerecidin A1-6 和 cerecidin A7 ，相似度分別為 54.29% 和 55.71% 。

圖 8B

28
• Pep1 和 Pep2 與 cerecidin 的 LanM 共享 45.49% 的相似度，可能就是
Planococcus 分離株的 LanM 蛋白。
• 表明 Planococcus 的肽段是 I 類細菌素

使用 EMBOSS Needle 生成的成對比圖

29
 Class IIc ( Circular ) Bacteriocin
• Arthrobacter APC 3897 的環狀細菌素基因簇測序出十個肽段，一個核
心肽段、一個運輸 / 切割蛋白、一個 DUF95 類蛋白、三個 ATP 結
合 / 運輸蛋白、一個免疫蛋白和三個功能未知的蛋白

圖 9A

30
最相似的序列是來自 Enterococcus faecalis 的環狀細菌素 AS-48 ，與 APC
3897 肽段序列有 71.3% 的相似度。
圖 9B

31
Class IId Bacteriocins
• Curtobacterium sp. APC 4022 發現兩個位於不同 片段上的 PBGCs ，兩組結構皆類似 lactococcin
972 和 mutacin II 的肽段。

• 第一組標記為 Pep1 ，包括一個核心肽段、兩個 ATP 結合 /ABC 運輸蛋白和兩個功能未知蛋白。

• 第二組標記為 Pep2 ，包括一個核心肽段、一個未知功能蛋白、一個 ATP 結合 / ABC 運輸蛋白和

一個外切酶蛋白基因。

圖 10B

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• Pep1 和 Pep2 與 mutacin II 和 lactococcin 972 進行比對， Pep1 和 Pep2
之間的相似度為 20.97% 。
• Pep1 與 lactococcin 972 和 mutacin II 的相似性分別為 15.32% 和 12.4% 。
• Pep2 與 lactococcin 972 和 mutacin II 的相似性分別為 26% 和 15% 。

33
34
抗藥基因檢測
• 36 組中僅 Rhodococcus sp. APC 4022 檢測到抗藥性基因。
• 檢測到兩個與利福黴素 / 利福平抗藥性相關的基因：
(rif)iri 、 rpoB2
• 還檢測到 mtrA （編碼多重藥物外流蛋白）基因。
表 ABRicate 檢測結果
4.

35
Discussion

36
• 初步篩選中，有 36 個樣本保留了生物活性。其餘 29 株可能是因為其依賴外
部因素的誘導，自然環境中其他微生物代謝物。純化和移除這些代謝物會影響
它們的活性。

• 抑制實驗中，僅 13 株指示菌被抑制，只有 Planococcus sp. 和

Pseudoalteromonas APC 3221 、 3224 能抑制多種指示菌，特別對同屬菌株最有
效

• Arthrobacter APC 3897 對 Listeria sp. 最有效，表示其幾乎能專門對抗利斯特菌。

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• Planococcus APC 4015 和 APC 4016 表現出對幾種 G+ 指示菌的強效抗菌
性。

• Planococcus 具有兩組相似的預測基因簇， cerecidin 與其最相似。

• Cerecidin 有兩種變體， CerA1-6 和 CerA7 。這些序列還與 E. faecalis 的

cytolysin 具有一定的相似性。 Cerecidin 和 cytolysin 都有兩個切割位點。

• 這些切割位點可能也存在於 Planococcus 的肽段中，如圖 8B 中在 50 和

60 個殘基之間的同源區域所示。

38
• Arthrobacter APC 3897 被發現有 IIc 類細菌素的基因。

• 其肽段與 enterocin AS-48 最相似，後者是來自腸球菌的環狀細菌素。

• AS-48 對革蘭氏陽性菌最活躍，特別是李斯特菌種，這與觀察到的抑制測試
結果一致， PBGC 的結構也與 AS-48 相同。

• APC 3897 還被發現一種 DUF95 蛋白，此蛋白是環狀細菌素基因簇的特徵，

被認為參與這些肽的運輸和分泌。

39
• Curtobacterium APC 4022 僅在 mTSA 上對 L. bulgaricus 表現出抑制作用。

• APC 4022 有兩個獨立的基因簇，與 IId 類細菌素 lactococcin 972 和

mutacin II 有少量的相似度，尚不能認定為 IId 類細菌素 。

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• 僅 Rhodococcus APC 4022 具有抗藥性基因。

• RpoB2 ： RNA 聚合酶 β 亞基（ RpoB ） 的突變體。其突變可能使基因複製，第一

個基因產生對 rifamycin 敏感的 RpoB ，第二個基因產生抗藥變體。

• （ rif ） iri ：其製造一種使 rifampin 失去活性的單氧化酶，是常見的抗藥機制。

• mtrA ：一種多重藥物外排基因。

• 檢測到多個抗藥基因表明 APC 4022 可能有更多抗藥機制，在海洋環境中發現的

抗藥性基因大部分尚未被歸類，導致在深海樣本中準確識別抗藥性基因會更加困難。

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Conclusion

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• 實驗證實深海魚的皮膚和腸道微生物是可培養的，同時也是一個潛力豐富
的抗菌資源。

• 大部分抗菌表現好的菌株是假單胞菌屬，儘管一些抗菌性最好的屬於動性
球菌屬和放線菌屬。但也證明深海菌種也能抑制李斯特菌等食源性病原菌。

• 總的來說，這些菌株有多種抗菌分子，包括 I 型和 II 型細菌素、 LAP 、

sactipeptides 、 NRPSs 以及萜烯等等，其中可能含有未知的新型細菌素。

• 對探索極端環境微生物的抗菌性研究奠定了基礎。

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