Cas12a

Cas12a
Cas12a
식별자
기호.?
인터프로IPR027620

Cas12a(CRISPR 관련 단백질 12a, 이전에 Cpf1로 알려짐)는 일부 박테리아에서 CRISPR 시스템의 일부를 형성하는 RNA 유도 핵산가수분해효소이며, 과학자들이 DNA를 [1][2]수정하기 위해 사용한다.그것은 바이러스의 유전 물질을 파괴하여 세포와 군체를 바이러스 감염으로부터 보호하는 박테리아 면역 메커니즘의 일부로서 유래한다.Cas12a와 다른 CRISPR 관련 핵산 분해 효소는 가이드 RNA의 사용이 이 작용을 매우 선택적으로 만든다는 점에서 독특하다; 그들은 특정 뉴클레오티드의 배열에 인접해 있을 때만 DNA를 절단한다.그것이 유래한 유기체에서, 이 안내 RNA는 이전에 [3]세포를 감염시킨 바이러스의 게놈 조각의 복사본입니다.

이것은 더 잘 알려진 CRISPR/[2]Cas9 시스템과 유사하게 DNA나 RNA의 고도로 표적화된 변형을 만드는 데 사용될 수 있기 때문에 연구자들에게 관심이 있다.Cas12a는 더 작고 단순하며 tracrRNA가 필요하지 않으며 절단 부위에 뭉툭하지 않고 스틱엔드를 만드는 것이 Cas9과 구별됩니다.이러한 차이와 기타 차이 때문에 특정 응용 프로그램에 더 적합할 수 있습니다.CRISPR/Cas12a는 기초연구에 사용되는 것 외에 유전병 치료 및 유전자 [2]구동 구현에 응용될 수 있습니다.

묘사

검출

CRISPR/Cas12a는 유망한 DNA 조각에 대한 박테리아 유전자 배열의 공개 데이터베이스를 검색하여 발견되었습니다.생물 정보학을 통한 CRISPR 시스템 단백질로서의 식별, 명칭 및 검출을 위한 숨겨진 마르코프 모델(HMM)은 2012년 단백질 패밀리 TIGRFAMS 데이터베이스 공개에서 제공되었다.Cas12a는 많은 세균종에서 나타난다.유전체 편집 도구로 개발된 궁극의 Cas12a 핵산가수분해효소는 유전체를 가지고 [4]있는 것으로 알려진 최초의 16종 중 하나에서 추출되었다.Acidaminoccus와 Lachnospiraceae의 두 후보 효소는 인간 [2]세포에서 효율적인 게놈 편집 활성을 나타낸다.

황색포도상구균에서 나온 Cas9의 작은 버전은 Cas12a의 [4]잠재적 대안이다.

분류

CRISPR-Cas 시스템은 다음 두 가지 클래스로 구분됩니다.Class 1은 기능성 핵산가수분해효소(CRNA)를 구축하기 위해 여러 Cas 단백질을 사용하는 반면 Class 2 CRISPR 시스템은 crRNA와 함께 단일 Cas 단백질만 사용합니다.이 분류에서 Cas12a는 1,300개의 아미노산 [1]단백질을 포함하는 Class II, Type V CRISPR/Cas 시스템으로 식별되었다.

이름.

CRISPR(Clustered Regularly Interspaceed Short Palindromic Repeats)은 타겟팅과 관련된 불변 DNA 배열의 특징에 따라 명명되었습니다.Cas12a는 원래 CRISPR의 줄임말로서 Cpf1로 알려졌으며, 두 가지 박테리아 속인 Prevotella와 Francisella가 나타난다.Cas(CRISPR 관련) 단백질의 이름을 보다 폭넓게 합리화하여 2015년에 염기서열 [1]호몰로지에 대응한 후 이름이 바뀌었다.

구조.

Cas12a 궤적은 혼합 알파/베타 도메인, RuvC-I에 이은 나선 영역, RuvC-II 및 아연 핑거 유사 [5]도메인을 포함합니다.Cas12a 단백질은 Cas9의 RuvC 도메인과 유사한 RuvC 유사 핵산가수분해효소 도메인을 가진다.또, Cas12a는 HNH핵산가수분해효소 도메인을 가지지 않고, Cas12a의 N말단에는 Cas9의 [1]알파 나선 인식엽을 가지지 않는다.

Cas12a CRISPR-Cas 도메인 아키텍처는 Cas12a가 클래스 2, 타입 V CRISPR 시스템으로 분류되어 기능적으로 고유함을 보여줍니다.Cas12a의 위치는 Cas1, Cas2 및 Cas4 단백질을 II형 시스템보다 I형 및 III형과 더 유사하게 인코딩한다.데이터베이스 검색에 따르면 많은 세균 종에서 Cas12a 계열 [1]단백질이 풍부합니다.

기능하는 Cas12a는 tracrRNA를 필요로 하지 않기 때문에 crRNA만 필요합니다.이것은 Cas12a가 Cas9보다 작을 뿐만 아니라 더 작은 sgRNA 분자를 가지고 있기 [6]때문에 게놈 편집에 도움이 된다.

Cas12a-crRNA 복합체는 Cas9에 의해 표적이 된 G-리치 PAM과 대조적으로 프로토스페이서 인접 모티브(PAM) 5'-YTN-3'[7] (여기서 "Y"는 피리미딘[8], "N"은 모든 핵염기)의 식별에 의해 표적 DNA 또는 RNA를 절단한다.PAM 동정 후 Cas12a는 4~5개의 뉴클레오티드 오버행의 [5]끈적끈적한 말단 DNA 이중가닥 절단을 도입한다.

메커니즘

CRISPR/Cas12a 시스템은 Cas12a 효소와 표적 DNA를 절단하기 위해 이중 나선의 올바른 지점에 복합체를 찾아 배치하는 가이드 RNA로 구성됩니다. CRISPR/Cas12a 시스템 활동은 3단계로 [4]구성됩니다.

  • 적응: Cas1 및 Cas2 단백질은 DNA의 작은 조각이 CRISPR 배열에 적응하는 것을 용이하게 합니다.
  • crRNA의 형성: Cas 단백질을 유도하기 위해 성숙한 crRNA를 생성하는 pre-cr-RNA의 처리.
  • 간섭: Cas12a는 crRNA에 결합되어 표적 DNA 서열을 식별하고 절단하기 위한 2치 복합체를 형성합니다.
Cas-gRNA Mechanism.jpg

Cas9과Cas12a

Cas9은 DNA를 절단하기 위해 2개의 RNA 분자를 필요로 하는 반면 Cas12a는 1개가 필요하다.그 단백질들은 또한 연구자들에게 편집 장소를 선택할 때 더 많은 선택권을 주면서 다른 장소에서 DNA를 절단한다.Cas9은 DNA 분자의 양쪽 가닥을 같은 위치에서 절단하여 뭉툭한 끝을 남깁니다.Cas12a는 한쪽 스트랜드가 다른 쪽 스트랜드보다 길어 스틱엔드를 만듭니다끈적끈적한 끝부분은 DNA의 비호몰로지 말단 접합 또는 호몰로지 수복 시 둔탁한 끝부분과는 다른 특성을 가지며, 이는 Cas9에 [4]비해 유전자 삽입을 시도할 때 Cas12a에 특정한 장점을 부여한다.CRISPR/Cas9 시스템은 유전자를 효율적으로 비활성화할 수 있지만 유전자를 삽입하거나 녹인을 [3]발생시키는 것은 어렵다.Cas12a는 tracrRNA가 없으며 T가 풍부한 PAM을 사용하며 DNA DSB를 [6]통해 DNA를 절단합니다.

요약하면 Cas12a와 Cas9 시스템의 중요한 차이점은 다음과 같습니다.[9]

  • 서로 다른 PAM을 인식하여 새로운 타겟팅 가능성을 실현합니다.
  • Cas9에 의해 생성되는 무딘 단부가 아닌 4~5nt 길이의 스틱 단부를 생성하여 NHEJ 또는 HDR 중에 유전자 삽입 및 특이성을 향상시킵니다.
  • 타깃 DNA를 PAM에서 더 멀리, Cas9 절단 부위에서 더 멀리 절단하여 DNA를 절단할 수 있는 새로운 가능성을 제공합니다.
특징 Cas9 Cas12a
구조. 2개의 RNA 필요(또는 1개의 융합 전사(crRNA+tracr))RNA=gRNA) crRNA 1개 필요
절단 기구 뭉툭한 엔드 컷 시차적 엔드 컷
절단부위 인식 사이트 근방 인식 사이트에서 원위부
대상 사이트 G-Rich PAM T리치 PAM

기원.

Cas9 및 Cas12 엔도핵산가수분해효소 모두 궁극적으로 IS200/IS605족 트랜스포존의 TnpB 엔도핵산가수분해효소로부터 유래한다.아직 CRISPR 면역체계에 "길들여지지 않은" TnpB는 자체적으로 오메가RNA [10]템플릿 시스템을 사용하여 RNA 유도 분열을 수행할 수 있다.

도구들

가이드 RNA 설계를 포함하여 CRISPR을 사용할 때 목표 효율성 및 특이성에 영향을 미치는 여러 측면이 있습니다.가이드 RNA의 최적 설계를 위한 많은 디자인 모델과 CRISPR/Cas 소프트웨어 도구가 개발되었습니다.여기에는 SgRNA 디자이너, CRISPR MultiTargeter, SSFinder [11]등이 포함됩니다.또한 Cas12a [12]단백질을 검출하기 위해 상용 항체를 사용할 수 있다.

지적 재산.

CRISPR/Cas9은 지적 재산권 분쟁의 대상이 되지만 CRISPR/Cas12a는 동일한 [2]문제가 없습니다.

메모들

레퍼런스

  1. ^ a b c d e 마카로바, 키라 S 등"CRISPR-Cas 시스템의 최신 진화 분류"Nature Reviews Microbiology (2015년)
  2. ^ a b c d e "Even CRISPR". The Economist. ISSN 0013-0613. Retrieved 2016-05-03.
  3. ^ a b "CRISPR-Based Genetic Engineering Gets a Kick in the Cas". Meta Science News. 2015-09-29. Archived from the original on 2017-10-22. Retrieved 2016-05-03.
  4. ^ a b c d Ledford, Heidi (2015). "Alternative CRISPR system could improve genome editing". Nature. 526 (7571): 17. doi:10.1038/nature.2015.18432. PMID 26432219.
  5. ^ a b Zetsche, Bernd; Gootenberg, Jonathan S.; Abudayyeh, Omar O.; Slaymaker, Ian M.; Makarova, Kira S.; Essletzbichler, Patrick; Volz, Sara E.; Joung, Julia; van der Oost, John; Regev, Aviv; Koonin, Eugene V.; Zhang, Feng (October 2015). "Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System". Cell. 163 (3): 759–771. doi:10.1016/j.cell.2015.09.038. PMC 4638220. PMID 26422227.
  6. ^ a b "Cpf1 Moves in on Cas9 for Next-Gen CRISPR Genome Editing". epigenie.com. Retrieved 2016-05-03.
  7. ^ Fonfara I, Richter H, Bratovič M, Le Rhun A, Charpentier E (2016). "The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cas12a also processes precursor CRISPR RNA". Nature. 532 (7600): 517–521. doi:10.1038/nature17945. PMID 27096362.
  8. ^ "Nucleotide Codes, Amino Acid Codes, and Genetic Codes". KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes. July 15, 2014. Retrieved 2016-05-25.
  9. ^ Yamano, T.; Nishimasu, H.; Zetsche, B.; Hirano, H.; Slaymaker, I. M.; Li, Y.; Fedorova, I.; Nakane, T.; Makarova, K. S.; Koonin, E. V.; et al. (2016). "Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA". Cell. 165 (4): 949–962. doi:10.1016/j.cell.2016.04.003. PMC 4899970. PMID 27114038.
  10. ^ Altae-Tran, Han; Kannan, Soumya; Demircioglu, F. Esra; Oshiro, Rachel; Nety, Suchita P.; McKay, Luke J.; Dlakić, Mensur; Inskeep, William P.; Makarova, Kira S.; Macrae, Rhiannon K.; Koonin, Eugene V.; Zhang, Feng (9 September 2021). "The widespread IS200/605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases". Science. doi:10.1126/science.abj6856.
  11. ^ Graham, Daniel B.; Root, David E. (2015-01-01). "Resources for the design of CRISPR gene editing experiments". Genome Biology. 16: 260. doi:10.1186/s13059-015-0823-x. ISSN 1474-760X. PMC 4661947. PMID 26612492.
  12. ^ "Anti-CPF1 antibody (GTX133301) GeneTex". www.genetex.com. Retrieved 2020-10-30.