Control de Calidad de Medios de Cultivo

VICERRECTORIA DE INVESTIGACIONES,
INNOVACIN Y EXTENSIN
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INSTRUCTIVO PARA CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

MTODO ECOMTRICO
Describir la metodologa empleada para realizar el control de calidad a los medios de

cultivo destinados para los diversos anlisis microbiolgicos realizados por el laboratorio
de aguas y alimentos de la Universidad Tecnolgica de Pereira
1. CONTENIDO
El anlisis microbiolgico es una herramienta fundamental para el monitoreo y control de
calidad en los diversos procesos productivos , permitiendo determinar los focos de
contaminacin por los cuales se est generando un producto deficiente, adems de ser
clave para el manejo, monitoreo y control de sistemas en los cuales la inocuidad de los
productos sea uno de los principales objetivos; estos anlisis se realizan de manera
rutinaria en muchas empresas para determinar la aptitud en los productos generados.
Basados en la naturaleza del producto, se aplican diversos protocolos, los cuales
permitirn aislar microorganismos de inters, y que son comunes encontrar en este, si se
han presentado falencias en las etapas de procesamiento y elaboracin, pudiendo llegar
a ser nocivos para los consumidores; a razn de lo anterior, los resultados obtenidos del
anlisis microbiolgico son determinantes.
Conociendo la gran responsabilidad que tienen los laboratorios de microbiologa al dar un
dictamen final, se hace necesario realizar pruebas de verificacin que certifiquen el
perfecto estado de los equipos, materiales, y reactivos que se usan a la hora de ejecutar
dichos anlisis.
Para evaluar un medio de cultivo se realiza frecuentemente una tcnica llamada Mtodo
Ecomtrico, el cual fue descrito por
Mosselt et al., 1983, y que permite medir la
Productividad que es la capacidad de los medios de cultivo para favorecer el crecimiento

y desarrollo de un microorganismo, esta caracterstica se determina a travs de la
comparacin que se realiza entre el medio por evaluar y un medio control (Soler, 2006).
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Otro aspecto es la Selectividad referida a la resistencia que genera el medio de cultivo a

la colonizacin por microorganismos interferentes o indeseados ( Doyle, et al., 1997 ;
Villalobos et al.,2007)
Figura 1 Representacin grfica de marcaje y siembra en mtodo ecomtrico
Nota: Realizar el mismo procedimiento tanto para el medio prueba como el medio de
referencia, al
realizar esto se verifica la productividad del medio y, con el ensayo
del microorganismo interferente , se determinara la selectividad.
2. INFORMACION ANTES DE INICIAR EL PROCESO

Para llevar a cabo la prueba de control de calidad de medios de cultivo (Mtodo
Ecomtrico), se usa como medio de referencia, aquel medio de cultivo cuya composicin
sea muy completa y permita el crecimiento de un gran numero de microrganismos; tales
medios pueden ser: Agar tripticasa de soya, Agar BHI, Agar nutritivo, Agar Standard plate
Count.
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MTODO ECOMTRICO
Al momentos de incubar las pruebas tener en cuenta los requerimientos tales como
temperatura, atmsfera (Presencia o ausencia de oxgeno), tiempo de incubacin del
microorganismo prueba e interferente para as contar con resultados reales.
2.1.
Interferencias.
Se pueden presentar interferencias en la lectura final debido a la manipulacin de material

y reactivos no estriles o contaminacin por agentes presentes en la atmsfera. Influyen
tambin factores como la temperatura
y tiempo de incubacin, adems se
puede
presentar contaminacin de la muestra.

2.2
Condiciones Ambientales.
Los cultivos de organismos infecciosos deben realizarse en cabina de flujo laminar

inoxidable y/o en un rea de trabajo previamente desinfectada. Las mesas de trabajo
deben ser superficies lisas fciles de limpiar y desinfectar. Evitar las corrientes de aire y
restringir el paso de personas ajenas a la prctica en dicha rea. Trabajar en el rea de
esterilidad que genera un Bactoincinerador.
3.
DESCRIPCIN DE MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
3.1.
Reactivos
Medio de referencia
Agar BHI o Tripticasa de Soya o Standard Plate Count.
Medio prueba
Depende de los medios a los que se les realice la prueba.
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3.2
Materiales
Cajas Petri pequeas con 20 ml de medio de cultivo.
Asa Calibrada.
Caldo BHI
3.3 Equipos
Bactoincinerador ; Marca Mc Cormick Scientific; Cdigo de inventario 315141.
Cuenta Colonias; Marca JP Selecta, s.a, Serial 0456452, Cdigo de inventario

310981.
Vortex Mixer, marca Labnet International, Inc; Cdigo de inventario; 313581
Autoclave; Marca CI Dental XRAY SAS. Automat 3400
Incubadora a 22 C; Marca Velp SCIENTIFICA. Cdigo de inventario 310209
Incubadora a 37 C; Marca Binder; Cdigo de inventario 308742
MANIPULACIN Y ALMACENAMIENTO
Asegurar de que la ventilacin sea la apropiada. No respirar el polvo. Evitar

contacto con piel y ojos.
Conservar el envase hermticamente cerrado en un lugar seco y bien ventilado.

Proteger contra la humedad.
IDENTIFICACIN DE LOS PELIGROS
Clasificacin de la sustancia o de la mezcla REGLAMENTO (CE) No 1272/2008

No peligroso
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Clasificacin de acuerdo con las Directivas de la UE 67/548/CEE 1999/45/CE
Elementos de la etiqueta
R22 - Nocivo por ingestin
R37 - Irrita las vas respiratorias.
H302 - Nocivo en caso de ingestin
H335 - Puede irritar las vas respiratorias
3.1.1 Residuos Generados.
Nombre
Muestra
Cdigo de
Cdigo de
Riesgos
Consejos de
colector
color
especficos
prudencia
Antes de descartar
Bolsa roja
-----
Biolgico
someter a
esterilizacin.
4.
PROCEDIMIENTO
4.1 Preparacin de Caldo BHI

Disolver 37 g (CM1135, Oxoid) en
1000 ml de agua destilada.
INICIO
FINAL
En caso de uso posterior

almacenar a 4C.
Disponer 6 ml en tubos de ensayo de

10 ml, cerrar los tubos
Esterilizar en autoclave a 121

C, 15 Libras de presin, 15
minutos
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4.2 Preparacin Agar Standard Plate Count

INICIO
Disolver 23,5 g de Agar Standard Plate

Count (OXOID,CM 0463) en 1L de agua
destilada.
Servir en cajas de Petri

previamente estriles
Conservar a 4C,
hasta su uso
Llevar a 50 C
Calentar ligeramente hasta observar

una completa disolucin del Agar
Esterilizar en autoclave a 121 C, 15

Libras de presin, 15 minutos
FINAL
4.3 Preparacin Agar Nutritivo
INICIO
Disolver 28 g de Agar Standard

Plate Count (OXOID,CM 0003) en
1L de agua destilada.
Servir en cajas de Petri

previamente estriles
Conservar a 4C, hasta

su uso
Llevar a 50 C
Calentar brevemente hasta

observar una completa disolucin
del Agar
Esterilizar en autoclave a 121 C, 15 Libras

de presin, 15 minutos
FINAL
4.4 Preparacin de inculo

INICIO
A partir de la cepa contenida en

caja de petri a 4C realizar un
repique a caldo BHI
Incubar a 37C/ 18-24 Horas
FINAL
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MTODO ECOMTRICO
Nota: Transcurrido el periodo de incubacin realizar la prueba, de lo contrario mantener

en refrigeracin (No por mucho tiempo, ya que el inoculo debe ser fresco)
4.5 Mtodo Ecomtrico

INICIO
Sembrar
previamente
los
microrganismos:
El de inters y el interferente
en caldo BHI e incubar durante
18-24 Horas a 37C.
(Por separado) para bacterias.
Con un asa calibrada de 0,1 ml tomar muestra del

cultivo y proceder a sembrar de acuerdo a la
secuencia de rotulado de la caja 1,2,3,4 sin volver a
tomar inculo, realizando estras en forma paralela a
las dibujadas en la base de la caja Petri, por ultimo
sembrar la lnea central (Ver Fig1).
Incubar a la temperatura,
atmsfera
y
tiempo
indicado, segn sea el
microorganismo
5.
Dividir la base de las cajas petri en cuatro

cuadrantes y marcar cada uno de estos como
1, 2, 3, 4, trazar cinco estras en cada uno de
ellos y una lnea en la interseccin de los
cuadrantes (Ver Fig 1).
Disponer el medio prueba y medio

control (en sus respectivas cajas ya
autoclavados
y esperar a que
solidifique.
Transcurrido el tiempo de
incubacin, realizar lectura de
resultados
CLCULOS Y RESULTADOS
Figura 1 Representacin grfica de marcaje y siembra en mtodo Ecomtrico
FIN
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Nota: Realizar el mismo procedimiento tanto para el medio de prueba como el medio de
referencia, al realizar esto se verifica la productividad del medio y, con el ensayo del
microorganismo interferente, se determinara la selectividad.
5.1 Lectura de resultados
Se considera vlida cualquier estra que tenga un crecimiento superior al 25% de la lnea
total, teniendo cada estra (Color Azul) un valor de 0,2 y la lnea central (Color Naranja) un
valor de 1, por lo tanto el valor mximo para crecimiento en este ensayo es de 5, y esto
es denominado ndice de Crecimiento Absoluto (ICA) (Tortora,1993 ; Mossel, 2003).
Por ello el Indice de Crecimiento Absoluto indica la productividad del medio de prueba,
para lo cual se considera que (Vase Tabla 1):
Tabla 1: Valores asignados para determinar la productividad de un medio de cultivo
ICA
4,5 - 5
2,5 - 4,5
< 2,5
PRODUCTIVIDAD
ALTA
MEDIA
POCA
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MTODO ECOMTRICO
NO
PRODUCTIVOS
El ICA permite determinar la selectividad del medio cuando se siembra en este, el

microorganismo interferente y para ello entre menos sea el valor del ICA mayor es la
selectividad del medio (Mossel et al., 1983).
Tabla 2: Valores asignados para determinar la selectividad de un medio de cultivo

ICA
4,5 - 5
SELECTIVIDAD
NO HAY
2,5 - 4,5
< 2,5
0
SELECTIVIDAD
BAJA
MEDIA
ALTA
Existe otro parmetro que se considera y es el Indice de Crecimiento Relativo (ICR) el

cual determina la capacidad que posee el medio de prueba para recuperar la flora,
respecto al medio de cutivo control (Mossel, 2003).
Se determina aplicando la siguiente frmula:
6.
DOCUMENTOS DE REFERENCIA
Doyle,M.P., Beuchat,L.R., Montville,T.J 1997. Food Microbiology : Fundamental and

frontiers. American Society For Microbiology Press.Washington D.C.
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Kornacki, J., Gurtler, J., Yan, Z. y Cooper, M. Evaluation of several modification of an

ecometric tecnique for assessment of media perfonrmance. Journal of Food Protection,
2003, 66 (9), 1727-32.
Michanie, S. Comparacin de tres mtodos empleados para la calidad de
medios de cultivo slidos. Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana, 1992, 3, 311-7.
Mossel, D.A.A. Microbiologa de los alimentos, 2 edicin, Acribia, Zaragoza,Espaa,
2003, 703.
Mosselt, D. A. A., Rees, M .G., Bonants- V AN laarhoven, A., Ligtenberg-Merk, T. H. y
Werdle, M. 1983. Quality assurance of selective culture media for bacteria, moulds and
yeasts: an attempt at standardization at the international level. Journal of Applied
Bacterioioqy,54: 313-327.
Romero,M.L 2005. Validacin secundaria del mtodo de siembra en placa profunda para
aerbios mesfilos,hongos y levaduras, y ausencia/presencia de Salmonella sp., en
muestras de alimentos bajo el contexto de la norma ISO NTC 17025. Trabajo de grado.
Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad Javeriana, Departamento de Microbiologa.
Bogot, Colombia.
Soler J.P. 2006. Validacin secundaria de nmero ms probable y recuento en placa para
coliformes totales y termotolerantes en muestras de ensalada y arroz basado en la norma
ISO NTC 17025. Trabajo de grado. Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad
Javeriana, Departamento de Microbiologa. Bogot, Colombia.
Thermo
SCIENTIFIC,
Oxoid
Microbiology
Products,
Disponible
(on
line)
http://www.oxoid.com/UK/blue/prod_detail/prod_detail.asp?pr=CM0463&c=UK&lang=EN
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Thermo
SCIENTIFIC,
Oxoid
Microbiology
Products,
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Thermo
SCIENTIFIC,
Oxoid
Microbiology
Products,
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Tortora,G.J.1993. Introduccin a la Microbiologa. Editorial Acribia S.A. Zaragoza,Espaa.
Villalobos, A., Calderon, L., Figueroa, C., Fierro, J. G., Otalora,R., Alvarez, B. et al. 2007.
Evaluacion por mtodo ecometrico de agar obtenido de algas rojas colombianas.
Universitas Scientiarum, 12 (III): 57-65.
.
Elaborado por:
Revisado por:
Aprobado por:
Personal UTP
Jefe de Calidad
Director del Laboratorio de Anlisis

de Aguas y Alimentos
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Describir la metodologa empleada para realizar el control de calidad a los medios de

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Productividad que es la capacidad de los medios de cultivo para favorecer el crecimiento

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Otro aspecto es la Selectividad referida a la resistencia que genera el medio de cultivo a

realizar esto se verifica la productividad del medio y, con el ensayo

del microorganismo interferente , se determinara la selectividad.

2. INFORMACION ANTES DE INICIAR EL PROCESO

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Se pueden presentar interferencias en la lectura final debido a la manipulacin de material

y tiempo de incubacin, adems se

presentar contaminacin de la muestra.

Los cultivos de organismos infecciosos deben realizarse en cabina de flujo laminar

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Vortex Mixer, marca Labnet International, Inc; Cdigo de inventario; 313581

Autoclave; Marca CI Dental XRAY SAS. Automat 3400

Incubadora a 22 C; Marca Velp SCIENTIFICA. Cdigo de inventario 310209

Incubadora a 37 C; Marca Binder; Cdigo de inventario 308742

Asegurar de que la ventilacin sea la apropiada. No respirar el polvo. Evitar

Conservar el envase hermticamente cerrado en un lugar seco y bien ventilado.

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Clasificacin de acuerdo con las Directivas de la UE 67/548/CEE 1999/45/CE

3.1.1 Residuos Generados.

4.1 Preparacin de Caldo BHI

En caso de uso posterior

Disponer 6 ml en tubos de ensayo de

Esterilizar en autoclave a 121

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4.2 Preparacin Agar Standard Plate Count

Disolver 23,5 g de Agar Standard Plate

Servir en cajas de Petri

Calentar ligeramente hasta observar

Esterilizar en autoclave a 121 C, 15

4.3 Preparacin Agar Nutritivo

Disolver 28 g de Agar Standard

Servir en cajas de Petri

Conservar a 4C, hasta

Calentar brevemente hasta

Esterilizar en autoclave a 121 C, 15 Libras

4.4 Preparacin de inculo

A partir de la cepa contenida en

Incubar a 37C/ 18-24 Horas

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Nota: Transcurrido el periodo de incubacin realizar la prueba, de lo contrario mantener

4.5 Mtodo Ecomtrico

Con un asa calibrada de 0,1 ml tomar muestra del

Dividir la base de las cajas petri en cuatro

Disponer el medio prueba y medio

Figura 1 Representacin grfica de marcaje y siembra en mtodo Ecomtrico

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El ICA permite determinar la selectividad del medio cuando se siembra en este, el

Tabla 2: Valores asignados para determinar la selectividad de un medio de cultivo