Medios de Cultivo-5 Marzo 2007
Medios de Cultivo-5 Marzo 2007
Medios de Cultivo-5 Marzo 2007
MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCION
acetato Fotoheterotrofos
Alg. bacterias
a) Macroelementos (g/l):
• Fuente de carbono: puede ser CO2 ó compuestos carbonados
orgánicos. Se utilizan en la construcción de innumerables
moléculas necesarias para la célula. Los hidratos de carbono
se consideran fuente de carbono y energía por excelencia
en los quimioorganotrofos. Los más comunes son:
- hexosas como glucosa, fructosa, galactosa;
- pentosas como arabinosa, xilosa, ramnosa;
- disacáridos como lactosa, sacarosa, maltosa;
- trisacáridos como rafinosa;
- polisacáridos como almidón, glucógeno;
- alcoholes como glicerol, sorbitol, manitol; y
- glucósidos como salicina, y esculina.
• Fuente de nitrógeno: muchos organismos son autotrofos
respecto de la fuente de nitrógeno y pueden crecer utilizando
moléculas sencillas como NO3-, NH3 ó N2. El nitrógeno es
metabolizado para proveer proteínas, ácidos nucleicos y
polímeros de pared. Otros microorganismos pueden incorporar
nitrógeno en forma de aminoácidos, bases púricas o
pirimídicas.
** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, el
aporte de nitrógeno es realizado por las peptonas, que son
los productos de la hidrólisis ácida o enzimática de proteínas
de origen animal o vegetal (carne, soja, caseína, gelatina,
harina de maíz y girasol). Esos productos de hidrólisis pueden
tener longitud variable, desde aminoácidos, hasta dipéptidos,
tripéptidos, polipéptidos, albumosas, proteosas.
La hidrólisis ácida puede ser realizada con HCl ó H2SO4 y
presenta las siguientes desventajas:
- el triptofano se destruye
- se pierde el 10% de vitaminas presentes
- desaparecen casi completamente los polipéptidos
Se prefiere la hidrólisis enzimática que emplea diferentes
proteasas actuando a pH específicos, ej. papaína a pH 6.5,
tripsina a pH 8.5, pepsina a pH 2.
Las peptonas son fuente de nitrógeno y, en ausencia de
hidratos de carbono en el medio de cultivo complejo,
cumplen la función de fuente de carbono y energía. Aportan
vitaminas del grupo B, trazas de metales y fosfatos que dan
carácter “buffer” al medio.
Las peptonas de origen vegetal pueden aportar carbohidratos
fermentables.
• Fuente de fósforo: se suelen agregar fosfatos de sodio o
potasio que también confieren poder buffer al medio de cultivo
(pH cercano a 7). Si se agrega yema de huevo al medio de
cultivo, el aporte de P es realizado por los glicerofosfolípidos
de la yema. El fósforo se incorpora a ácidos nucleicos,
fosfolípidos, polímeros de membrana, ATP, y sustancias de
reserva (gránulos de volutina)
• Fuente de azufre: se adiciona como SO4=, cisterna o metionina.
En la célula se incorpora a aminoácidos y diferentes
coenzimas.
• Fuente de calcio, magnesio y potasio: potasio, calcio y
magnesio se adicionan como sales inorgánicas. Son cationes
que estabilizan macromoléculas aniónicas. K+ actúa como
coenzima y estabilizador de RNA. Mg2+ se integra a colorofila
en organismos fotosintéticos. Ca2+ abunda en esporas como
dipicolinato de calcio.
• Fuente de sodio: sodio contribuiría a equilibrar la presión
osmótica del medio extracelular. Es un catión requerido por
bacterias halofílicas. Se suele suministrar como NaCl.
2. Factores de crecimiento
Son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy
bajas concentraciones que no pueden ser sintetizados por la
célula que los necesita. Por esta razón, deben ser agregados al
medio de cultivo. Ej.: principalmente vitaminas del grupo B,
algunos aminoácidos, purinas, pirimidinas, ácidos grasos. Hay
ejemplos clásicos como los factores X y V (porfirinas) de la
sangre requeridos por la bacteria Haemophilus influenzae para
crecer. El suero fetal bovino, que aporta numerosos factores de
crecimiento, es imprescindible para el cultivo de células
animales.
Cómo surge la necesidad de un factor de crecimiento? La
capacidad de sintetizar un compuesto esencial está relacionada
con una secuencia de reacciones catalizadas por enzimas que se
completa satisfactoriamente. Cuando por alteraciones genéticas,
alguna enzima de la secuencia no puede ser sintetizada, la serie
de reacciones se bloquea en algún paso y no finaliza con éxito. El
compuesto que por esta razón dejó de sintetizarse, se convierte
en un factor de crecimiento.
** En ciertos medios de cultivo para quimioorganotrofos, los
factores de crecimiento pueden ser aportados por diversos
extractos:
-Extracto de carne: su función es ser complemento vitamínico de
las peptonas. Pero también aporta sustancias nitrogenadas
como: aminoácidos, bases púricas y pirimídicas, ácidos
orgánicos, creatina, xantina, hipoxantina, ácido úrico, urea, y
sustancias no nitrogenadas como glucógeno, fosfatos de
hexosas, ácido láctico, sales inorgánicas.
La calidad de este tipo de extracto varía con la carne empleada,
el tiempo y la temperatura de extracción.
-Extracto de levadura: se obtiene por autolisis o plasmolisis de
las células de levadura. Su función es ser suplemento vitamínico
de las peptonas, pero también aporta mezclas de aminoácidos y
péptidos, y carbohidratos.
-Extracto de malta: es un interesante sustituto del extracto de
levadura ya que posee adecuado contenido de vitaminas,
carbohidratos y aminoácidos. Es el extracto soluble en agua de la
malta de cebada.
3. Agentes solidificantes
Su agregado al medio de cultivo es opcional.
El más usado:
- el agar, es un polisacárido ácido derivado de algas marinas,
formado principalmente por galactosa con un grupo sulfato cada
10 a 50 restos. Suele contener sustancias nutritivas en pequeñas
concentraciones, y por esto no puede ser utilizado en medios de
composición química estrictamente definida destinados a
autotrofos. Se usa sin problemas en medios de cultivo complejos
para quimioorganotrofos.
Se agrega al 1.5-2% en medios de consistencia sólida normal, al
0.2-0.3% en medios semisólidos o blandos, al 5% en medios de
consistencia muy firme para detener el crecimiento de gérmenes
muy móviles, y al 0% cuando se preparan medios líquidos
(caldos).
Sus características:
- Funde a 80-100°C y permanece líquido hasta 50-55°C.
- A 45-55°C se pueden agregar suspensiones de células sin afectar
la viabilidad (supervivencia) de las mismas.
- Permanece sólido a 37°C, temperatura de incubación de la
mayoría de las bacterias patógenas del hombre.
- No es tóxico para las bacterias, ni es degradado por éstas.
- Utilizado al 1.5-2%, permite el aislamiento de colonias
(poblaciones de microorganismos derivadas de una única célula),
lo que resulta imposible en medios líquidos!
- Es transparente, lo que facilita la visualización de las colonias.
- Al solidificar, forma una trama suficientemente abierta para
permitir la difusión de los nutrientes del medio de cultivo en
todas direcciones, y suficientemente cerrada –según la
concentración empleada- para impedir la movilidad de los
microorganismos.
Otros solidificantes:
- Agarosa: es agar muy transparente libre de sulfatos. Se usa
intensamente para fines específicos en Inmunología y Biología
Molecular.
- Silicagel: es silicato diluido en HCl. Se emplea en medios de
cultivo para autotrofos, cuando debe excluirse materia orgánica
del medio de cultivo.
- Gelatina: es una proteína obtenida por hidrólisis del colágeno.
Fue el primer solidificante usado en Microbiología, pero es
degradado por la mayoría de las bacterias (lo comen, por lo que
el medio inicialmente sólido termina convertido en medio líquido)
y la temperatura de incubación no puede ser mayor a 22°C (es el
punto de fusión) con lo que cultivos sólidos a temperaturas más
altas resultan inviables.
- Albúmina de huevo, suero: a 80°C estas proteínas coagulan y
solidifican el medio de cultivo.
4. Agua
El agua representa una altísima proporción (80-90%) del peso
total de una célula y es fundamental para la realización de todos
los procesos metabólicos, funciones enzimáticas, solvatación de
materiales orgánicos e inorgánicos, donación de electrones para
organismos fotosintéticos. Los medios de cultivo se preparan en
el laboratorio con agua destilada lo que estandariza su
composición y asegura la ausencia de iones como Ca2+ y Mg2+
que pueden precipitar con fosfatos o generar reacciones
indeseables.
d) Por su función:
- Medios de enriquecimiento: son medios líquidos que sembrados
con poblaciones mixtas de microorganismos, favorecen la
multiplicación de ciertos grupos e inhiben el desarrollo de las especies
restantes. Para funcionar de esta manera incluyen compuestos
químicos específicos o requieren condiciones físicas especiales
(temperatura, pH).
Ej.: agua peptonada alcalina favorece el desarrollo de Vibrio cholerae
tolerante a pH alto e inhibe otros microorganismos presentes en la
misma muestra; caldo selenito contiene selenito de sodio que favorece
la proliferación de especies como Salmonella y Shigella pero inhibe
otras enterobacterias; caldo EC a 44.5°C, una temperatura que
favorece a Escherichia coli y no a otras bacterias.
- Medios selectivos: son medios sólidos que de manera
parecida a los anteriores, permiten el desarrollo de ciertos
microorganismos e impiden el desarrollo de otros. La selectividad se
logra alterando las condiciones físicas del medio de cultivo o agregando
compuestos químicos inhibidores. Ej:
- cambiando pH: para favorecer el desarrollo de Lactobacillus, un
género implicado en la producción de yogur, se puede agregar ácido
acético a los medios de cultivo para obtener un pH final de 5.4,
totalmente inadecuado para muchas bacterias acompañantes.
- altas concentraciones osmóticas: en agar manitol salado con una
concentración de NaCl de 7.5% muy pocas bacterias pueden crecer,
salvo las que presenten una elevada tolerancia a NaCl, como
Staphylococcus aureus
- agregando antisépticos: colorantes como verde brillante, cristal
violeta y eosina, se utilizan para inhibir gérmenes Gram positivos
mientras los Gram negativos desarrollan sin dificultad. Las sales biliares
se usan con el mismo propósito.
- agregando antibióticos: en Ingeniería Genética es práctica rutinaria
la inclusión de antibióticos (ampicilina, tetraciclina) en los medios de
cultivo para poner en evidencia la presencia de bacterias
genéticamente manipuladas. Estas células son resistentes a uno o más
antibióticos y pueden desarrollar en un medio que los incluye, mientras
las células acompañantes, sensibles a los antibióticos, no pueden
crecer. En Microbiología Clínica, se usan antibióticos de espectro de
acción reducido que inhiben o destruyen microorganismos cuyo estudio
no interesa, a la vez que no afectan los gérmenes que se están
investigando.
EJERCICIOS DE APLICACIÓN
1. Para un microorganismo fotoautotrofo mencione qué componentes
tendría en cuenta para diseñar un medio de cultivo químicamente
definido o sintético que incluye:
- fuente de carbono:
- fuente de energía:
- fuente de nitrógeno:
c) Medio BW3
K2HPO4 ……………... 0.25 g c.1. Mencione fuente
de carbono y fuente de nitrógeno
CO2 …………………… burbujeo constantec.2 Cuál sería la fuente
de energía?
MgSO4 ……………... 0.0375 g c.3. Por su consistencia y su
origen, cómo clasificaría este medio?
Na2MoO4…………... 2.5 x 10-3 g c.4. Para qué clase de
gérmenes –según fuente de C y de energía-
NaVO3 …………….. 1.24 x 10-4 g sería adecuado?
KNO3 …………………. 1 g
Agua destilada…… 1000 ml