"CUESTIONES DE APLICACIN PCR" Leccin 1 1.

Porque se fai preciso unha accin quelante sobre os ins metlicos da mostra durante o paso de lise en ebulicin a 100C? Que pasara se non se usa un axente quelante como a matriz InstaGene? El agente quelante sirve para formar complejos con iones metalicos pesados, evitando as la degradacin del adn. Si no usaramos el agente quelante, se degradara el adn. 2.Que parte das clulas se precisa para facer PCR? Necesitamos la parte de la clula que contenga el ADN, es decir, el ncleo. 3.Que estructuras precisamos romper para liberar o ADN celular? las estructuras del citoplasma y liberar al medio su contenido. 4.Porque pensas que hai que manter o ADN xunto coa matriz InstaGene despois de ferver as mostras? Para que no se degrade el adn. Leccin 2 1.Porque se precisa un cebador para cada unha das cadeas do segmento de ADN a amplificar? Un cebador es una cadena de cido nuclico o de una molcula relacionada que sirve como punto de partida para la replicacin del ADN. Es una secuencia corta de cido nucleico que contiene un grupo 3'hidroxilo libre que forma pares de bases con una hebra molde complementaria y

acta como punto de inicio para la adicin de nucletidos con el fin de copiar la hebra molde. Se necesita un partidor porque la mayora de ADN polimerasas, no pueden empezar a sintetizar una nueva cadena de ADN de la nada, sino que solo pueden aadir a un hilo de nucletidos preexistente. Se necesitan dos para la reaccin de PCR, uno en el extremo 3' y el otro complementario para la otra hebra. Son de aproximadamente 20 nucletidos, porque es la cantidad necesaria para que de manera probable coincida en un sitio de la cadena de ADN. 2.Porque a Taq ADN-polimerasa se chama as? La Taq DNA polimerasa es la enzima que Thermus aquaticus emplea para la replicacin del ADN, Thermus aquaticus, denominada tambin Thermophilus aquaticus, es una bacteria termfila que vive en la proximidad de las fuentes de agua caliente. 3.- Porque hai nucletidos na master-mix? Cita o resto de compoentes da master-mix e indica a funcin de cada un deles. Porque uno de los componentes de la master-mix es el cebador. La master-mix est compuesta de los siguientes reactivos ADN polimerasa Taq (0,06 U/l) nucletidos solucin de magnesio 25 mM tampn de reaccin 2,5x Master Taq. 4.Describe os tres pasos principais de cada ciclo de amplificacin por PCR e indica a qu temperaturas ocorre cada un deles. El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos (desnaturalizacin, alineamiento y elongacion) a diferentes temperaturas. La PCR comn se realiza con ciclos que tienen tres pasos de

temperatura. En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra la forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga la hebra, como tambin del largo de la misma. En segundo lugar, se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40 segundos, permitiendo as el alineamiento. Por ltimo, se produce una etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado. 5.Explica porqu a lonxitude precisa do ADN diana non amplificada ata o terceiro ciclo. Podes facelo apoindote nun esquema grfico ou debuxo. El ADN diana es el ADN que se desea amplificar, tambin se le llama ADN molde. Su cantidad y calidad son factores determinantes de la eficacia de la reaccin. En la tercera fase, denominada extensin o elongacin de la cadena, acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de la ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de mxima actividad est en 75-80 C (comnmente 72 C). El tiempo de extensin depende

tanto de la ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su temperatura ptima, la polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un minuto. Leccin 3 1.Cal a diferencia entre un intrn e un exn? Los exones son las regiones de un gen que no son separadas durante el proceso de splicing y, por tanto, se mantienen en el ARN mensajero maduro. En los genes que codifican una protena, son los exones los que contienen la informacin para producir la protena codificada en el gen. En estos casos, cada exn codifica una porcin especfica de la protena completa, de manera que el conjunto de exones forma la regin codificante del gen. Por otra parte, un intrn es es una regin del ADN que debe ser eliminada del transcrito primario de ARN, a diferencia de los exones que son regiones que codifican para una determinada protena. Los intrones son comunes en todos los tipos de ARN eucariota, especialmente en los ARN mensajeros (ARNm), adems pueden encontrarse en algunos ARNt y ARNr de procariotas. 2.Porque os dous posibles productos da PCR difiren en 300pb? Los cebadores amplifican un fragmento de 641pb en la regin PV92. Algunos individuos contienen una secuencia Alu de 300pb en esta regin do cromosoma 16, y en estos individuos la amplificacin produce fragmentos de 941pb. Ya que luego, la diferencia de 300pb se debe a la insercin de la secuencia Alu. 3.Porque os fragmentos mis pequenos se desprazan mis lonxe na electroforese?

Las molculas de ADN obtenidas por PCR (los productos de la PCR) se separan por electroforesis gracias a su carga negativa. Como el ADN est cargado negativamente, se mueve cara el electrodo positivo en una cmara de electroforesis. La agarosa acta como una tamiz separando las molculas en funcin de su tamao. Las molculas ms grandes se mueven despacio en el gel, mientras que las ms pequeas lo hacen ms rpido al enfrentarse a una resistencia menor por parte de la matriz que forma el gel de agarosa. 4.Que controis se usan neste experimento? Cal a importancia de usalos? Poderan terse usados outros? Los controles usados en esta prctica son muestras conocidas de homocigotos (+/+), de homocigotos (-/-) y de heterocigotos (+/-). Las bandas que resultan en la electroforesis de estas muestras conocidas corresponden a fragmentos de tamao (pb) conocido e se pueden usar para comparar con las bandas de muestras desconocidas Leccin 4 Lenda: 5:Bea; 6: Begoa; 7: Tania; 8: Javier; 9: Luca; 10: Alba; 11: Julia; 12: Manuel; 12+1: Sonia; 14: Fany; 15: Olivier; 16: Esther; 17: Antn; 18: Carlos; 19: Raquel; 20: Antonio. 1.Cal o teu xenotipo para a insercin ALU na rexin PV92 do teu cromosoma 16? 2.Cales son as frecuencias xenotpicas dos homocigotos (+/+), homocigotos (-/-) e heterocigotos (+/-) no grupo LACC2? Enche a seguinte tboa cos resultados: Genotipo Nmero Frecuencia

Homocigotos(+/+) 2 Heterocigotos(+/-) 1 Homocigotos(-/-) 8 Totales 11

0,18 0,09 0,73 1,00

3.Cal a frecuencia de cada alelo no grupo? Alelo Positivo Negativo Total Nmero Frecuencia 5 p= 0,23 17 9= 0,77 22 1,00

4.Na seguinte tboa estn os mesmos datos para unha mostra aleatoria dunha poboacin determinada calcula as frecuencias allicas para esa poboacin: Alelo Nmero Frecuenc ia 0,24 0,55 0,21 1,00 Frecuencia p= 0,52 q= 0,48 1,00

Homocig otos (+/ 2.422 +) Heterocig 5.528 oto (+/-) Homocig 2.050 otos (-/-) Totais: 10.000 Alelo Alelo + Alelo Total

Nmero 10372 9628 20000

5,Comparando os datos de LACC2 cos da poboacin do exemplo anterior, Pensas que tian que coincidir? A que pensas que se poden atribuir as diferencias ou semellanzas?

Deberan de coincidir, pero teniendo en cuenta que el nmero total de cigotos es muchto mayor en el ejemplo anterior, debemos adjudicar las diferencias a que la poblacin de LACC2 tiene un nmero de datos muy pequeo y las frecuencias no son comparables a las frecuencias reales obtenidas en una poblacin mayor. 6.Usando os valores p e q obtidos na cuestin 3, calcula p2, 2pq e q2. Se o resultado fora o mesmo que o que obtiveches na cuestin 2, a poboacin LACC2 dirase que est en equilibrio xentico de Hardy-Weinberg. Noutro caso, se as frecuencias xenotpicas son distintas, a que pensas que se pode deber a diferencia? p2= 0,0529 2pq= 0,4 q2=0,6 La diferencia se debe a que una poblacin tan pequea como es la de LACC2 no cumple las condiciones del equilibio gentico de Hardy-Weinberg. Una poblacin tan pequea no representa una poblacin en la que os cruzamientos al azar producen descendencias con iguales probabilidades de xito a lo largo de las generaciones. 7.Usando os valores p e q obtidos na cuestin 4, calcula p2, 2pq e q2. Correspndense os valores obtidos cos da tboa amosada no enunciado da cuestin 4? Supn esto que a poboacin hipottica dese exercicio est en equilibrio de HardyWeinberg? p2=0,27 2pq=0,5 q2=0,23

El equilibio gentico de Hardy-Weinberg es un modelo terico que supone un estado ideal en el que el apareamiento es al azar y donde no existen movimientos migratorios de individuos en ningn sentido, y est claro que por ese lado ninguna poblacin aleatoria lo cumple. Por otro lado, si comparamos estadsticamente las probabilidades obtenidas en el ejercicio 4 y las obtenidas

en este mismo ejercicio, y teniendo en cuenta que la poblacin de este ejercicio es una poblacin lo suficientemente grande como para comparar las frecuencias obtenidas con las "reales" debemos decir que los resultados son casi idnticos y que esta poblacin estadsticamente est en equilibrio gentico.

Lara Vzquez Fafin