UNIVERSIDAD ANDRES BELLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

LABORATORIO DE BIOLOGA CELULAR BIO-131

INTRODUCCIN AL TRABAJO DE LABORATORIO

El laboratorio no es un lugar peligroso, siempre y cuando se acte en l de manera responsable y cuidadosa. Para esto, es importante tener en cuenta ciertas medidas de orden que se aplican en todos los laboratorios y por sobre todo un buen uso del sentido comn. De esta forma, es necesario recordar algunos principios bsicos generales: 1. El mesn de trabajo debe estar siempre libre de efectos personales tales como abrigos, carteras y libros, entre otros, que entorpezcan el trabajo y que, adems, puedan daarse por el contacto con reactivos qumicos, agua o calor; 2. Los reactivos qumicos a utilizar deben ser manipulados con precaucin, de acuerdo a sus caractersticas. Est estrictamente prohibido pipetear directamente con la boca soluciones altamente alcalinas, cidos concentrados o material biolgico de riesgo. Si la va de desecho de estas soluciones es el desage del laboratorio (previa indicacin del profesor responsable del trabajo prctico), hacer correr abundante agua de manera simultnea para reducir el dao que estas soluciones fuertes pudieran ocasionar a las tuberas. Tener en cuenta que hay soluciones tales como el H2SO4 que reaccionan violentamente con el agua, por lo tanto se debe proceder con sumo cuidado; 3. Si usted est manipulando sustancias inflamables, asegrese antes de destapar el frasco que no existan llamas abiertas ni material incandescente en las proximidades de su lugar de trabajo; 4. Si usted calienta una sustancia en un tubo de ensayo, no apunte la boca del tubo en direccin de alguna persona. Una ebullicin violenta de la solucin podra quemar a dicha persona; 5. Cuando trabaje con sustancias txicas voltiles debe hacerlo bajo una campana de extraccin. Recuerde que un gas o vapor nocivo no siempre es perceptible por el olor; 6. Los materiales de desecho no solubles (papel filtro usado, fsforos, corchos deteriorados, etc.) deben tirarse al basurero o recipiente destinado para esta funcin, jams dentro del desage del laboratorio; y 7. Al trmino de cada sesin experimental, el mesn de trabajo y sus alrededores deben quedar limpios y secos. Todos los reactivos e implementos utilizados deben ser guardados en sus sitios respectivos. Asegrese siempre que las llaves de gas y agua estn correctamente cerradas. Objetivo del trabajo Prctico: El objetivo de este trabajo es el reconocimiento del material de laboratorio y la preparacin de soluciones lquidos utilizando el material de vidrio y equipos.

MATERIAL DE LABORATORIO

I. Material volumtrico Durante el trabajo de laboratorio, en muchas oportunidades es necesario medir con exactitud volmenes de lquidos para la correcta ejecucin del paso experimental. Para ello, existen diversos tipos de materiales volumtricos. Por lo tanto, es necesario conocer los diferentes tipos de materiales y tener claro cul utilizar en cada ocasin. Cabe sealar que la precisin de la medida con estos materiales puede verse alterada. Considerando que la mayora de los materiales volumtricos que se usan en el laboratorio estn hechos en vidrio, y teniendo en cuenta que este material puede dilatarse o contraerse segn la temperatura a la que est expuesto, se ha establecido un estndar convencional de 20 C para material de laboratorio destinado a medir volmenes. La graduacin de los utensilios considera dos tipos de posibilidades: un aforo para contener y un aforo para entregar volmenes determinados. El nivel de los lquidos se estima por el aforo, que se define como la tangente horizontal al menisco inferior del lquido. Para realizar la medida, el nivel del lquido debe encontrarse frente al ojo del observador en posicin vertical. Mientras ms estrecho sea el dimetro donde se realiza el aforo ste ser ms exacto.

FIGURA N1: Diagrama representativo de la estimacin de un aforo.

A continuacin se describen los elementos ms usados en la medicin de volmenes en el laboratorio: 1. Probetas: son cilindros verticales graduados, provistos de una base hexagonal. Sus capacidades normalmente son de 25, 50, 100, 250, 1000 y 2000ml. El aforo est previsto para entregar volmenes. Debido a que su dimetro interior es amplio, las probetas sirven slo para mediciones aproximadas de volmenes. La graduacin de una probeta est en relacin a su capacidad, as la ms grande tiene una graduacin de 5 a 10ml por cada divisin, en cambio las ms pequeas pueden tener hasta 1/10 de ml;

Probeta de 100 ml.

2. Matraces aforados: son botellas redondas de fondo plano, con cuello largo y estrecho y estn confeccionados en vidrio no apto para resistir cambios de temperatura .. Los matraces aforados estn previstos para contener volmenes con bastante exactitud, por lo que son usados para preparar soluciones en que es importante conocer la concentracin exacta de ellas. Estas soluciones pueden ser preparadas por dilucin de una cantidad conocida o medida de lquido, agregando agua (u otro solvente) hasta completar el volumen. Tambin los matraces aforados se emplean para preparar soluciones de una concentracin muy exacta por disolucin de una cantidad precisa de sustancia previamente pesada, completando finalmente el volumen hasta el aforo con agua u otro solvente segn sea el caso. Hay matraces aforados con capacidad para contener a 20C y con bastante exactitud desde 25 a 2000 ml de lquido o solucin. 3. Pipetas: se emplean para medir y entregar con precisin volmenes menores de lquidos y soluciones. Dado que las pipetas son tubos de seccin estrecha se logra una buena exactitud en la entrega de volmenes por este tipo de material. La abertura del tubo en el extremo superior (bucal) de la pipeta, es de borde muy parejo, ya que habitualmente se hace succin con la boca y se obstruye hermticamente la salida del lquido con ayuda de la yema del dedo ndice. El lquido succionado se mantiene dentro de la pipeta, en tanto no se permite la entrada de aire. Quitando parcialmente o totalmente el dedo de la abertura superior, se consigue el vaciado paulatino o rpido del contenido de la pipeta. La succin de lquidos corrosivos, txicos o de riesgo biolgico debe siempre realizarse con la ayuda de peras de goma o jeringas adaptables a la boca de la pipeta (llamadas propipetas) para evitar la posibilidad que estos materiales lleguen a la boca del usuario. El extremo aguzado permite la entrega del lquido gota a gota. Sin embargo, el orificio estrecho del extremo inferior est pensado de manera que no entre aire con facilidad mientras se transporta el lquido de un recipiente a otro. Existen pipetas de diferentes capacidades: 0,1; 0,2; 0,5; 1, 2, 5, 10 y 25ml. Generalmente, estn diferenciadas por un color en la graduacin. Ellas son capaces de entregar volmenes totales o parciales.

Matraz Aforado 500ml

Pipeta Graduada.

Pipeta Aforada.

Las pipetas aforadas se reconocen por presentar su parte central ms dilatada. Estas pipetas estn diseadas para entregar un volumen bien determinado, el cual est indicado en el cuerpo de ella. Este volumen puede estar delimitado por uno o dos aforos. Si son dos las marcas, el volumen indicado escurre cuando el menisco del lquido se mueve desde la marca superior a la marca inferior. Si es una sola marca (en el tubo superior), el volumen queda comprendido aquella marca y el extremo inferior de la pipeta (pipeta aforada). Al trmino del vaciamiento deben esperarse 15 segundos para que escurra todo el lquido que queda mojando las paredes de la pipeta;

4. Bureta: puede ser definida como una pipeta graduada y dotada de un mecanismo regulable para vaciarla. En el extremo inferior lleva intercalada una llave de vidrio o plstico inerte (tefln). Las graduaciones ms comunes de una bureta son 25 y 50ml, existiendo tambin microburetas de 1,5 y 10ml;

Bureta. 5. Matraces Erlenmeyer: son usados comnmente para efectuar titulaciones, reacciones y para calentar soluciones, ya que su forma cnica evita en gran parte la evaporacin. Tambin posee graduaciones, pero las medidas que se realizan con ellas son slo aproximadas . . Existen matraces Erlenmeyer de 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1000 y 2000ml;

Matraz Erlenmeyer.

6. Vaso de precipitados: se usa comnmente para preparar soluciones o efectuar reacciones. Estos vasos poseen graduaciones de 5, 10, 50,125, 250 hasta 2000 ml; sin embargo, hay que tener en cuenta que esta graduacin es slo aproximada y permite estimar volmenes, por lo tanto, no son aptos para preparar soluciones en las cuales se desee un cierto grado de exactitud. Vaso Precipitado.

II. Equipamiento bsico de laboratorio: En la actualidad, el equipamiento de los laboratorios se ha ampliado de manera considerable con la invencin de nuevas tecnologas. No obstante, a continuacin se describirn instrumentos de uso general y bsico de un laboratorio comn: 1. Balanza de laboratorio: la unidad internacionalmente reconocida como patrn de peso es el kilogramo (kg). Sin embargo, comnmente en el laboratorio la unidad de peso ms usada es el gramo (g), as como el miligramo (mg) y el microgramo (ug) que son submltiplos del gramo. La balanza es un instrumento que sirve para medir la masa de los cuerpos por el peso, es decir, para determinar las veces que ellos contienen la unidad de masa llamada gramo. a) Balanza de precisin: se caracteriza por un sistema oscilante de una barra o cruz apoyada sobre una columna. Actualmente, a este tipo de balanza se le ha adicionado un sistema electrnico que registra la pesada. La capacidad de carga de las balanzas de precisin es generalmente hasta 500g y ms comnmente hasta 200g, con una exactitud de pesada al centsimo de gramo; Balanza analtica: es un instrumento de alta precisin empleada en la pesada de reactivos livianos (del orden de los miligramos). A pesar de que las balanzas analticas pueden presentar un variado tipo de diseos y aspectos exteriores, todas ellas se construyen basadas en los mismos principios. La base es de gran solidez y confiere estabilidad al instrumento evitando al mximo la posibilidad de vibraciones. La columna es un tubo por el cual se conduce el mando de arresto o bloqueo del sistema oscilante. La cruz esta hecha de una aleacin especial de aluminio u otro metal estable que no permita deformaciones por el peso variable que debe soportar.

b)

Balanza de precisin.

Balanza analtica.

APLICACIN DE CALOR Un recurso habitualmente usado en el laboratorio es la aplicacin de calor sobre muestras en orden a acelerar reacciones qumicas, esterilizar, secar, calcinar, etc. Con este fin se emplean materiales resistentes al calor tales como tubos de ensayo, matraces Erlenmeyer, crisoles, vasos de precipitados, balones, matraces de fondo redondo. A menudo, la principal fuente de calor utilizada en el laboratorio es el mechero Bunsen ... No obstante, tambin se pueden utilizar baos termorregulados para cuando la temperatura de calentamiento que se desea aplicar no sobrepase los 90 C. Estos en general funcionan con agua pero existen otros que emplean sustancias oleosas para alcanzar temperaturas superiores al punto de ebullicin del agua. El uso de resistencias elctricas en la generacin de calor es otro de los procedimientos comnmente usados en el laboratorio. Estos estn presentes en instrumentos tales como hornos, autoclaves, mantas, baos secos, etc. La principal ventaja que presentan los baos termorregulados y aquellos instrumentos que utilizan como fuente de calor resistencias elctricas es que son cmodos de trabajar, poseen exactitud en la regulacin trmica y son seguros en su manejo.

Mechero Bunsen.

Bao termorregulado.

APLICACIN DE FRO En ciertas ocasiones durante el trabajo de laboratorio es necesario la aplicacin de fro sobre ciertas muestras. Ello ayuda, por ejemplo, en la caracterizacin de sustancias puras por su punto de fusin, en la regulacin de reacciones qumicas y procesos enzimticos, solubilizacin o liquefaccin de gases, condensacin o retencin de vapores, cristalizacin y precipitacin, estabilizacin de material biolgico y liofilizacin, entre otros. Probablemente, en algunas sesiones de este curso prctico usted trabajar con material biolgico (tejidos, estructuras celulares, etc.), los cuales debern ser mantenidos en hielo. Esto tiene como objetivo la preservacin funcional de dichos materiales biolgicos. Hay que tener en cuenta que a temperaturas ms elevadas (temperatura ambiente o mayor) una gran variedad de funciones biolgicas se deterioran irreversiblemente.

PREPARACIN DE SOLUCIONES: CLCULO DE CONCENTRACIONES

Soluciones acuosas En una solucin acuosa se pueden distinguir dos componentes: el soluto y el solvente . Solvente es el componente que se encuentra en mayor proporcin y el soluto en menor proporcin. Para identificar una solucin no basta con indicar sus componentes, sino tambin es fundamental conocer la proporcin de stos en la solucin: SOLUTO + SOLVENTE = SOLUCION Expresiones de concentracin Concentraciones basadas en el volumen, concentraciones basadas en la cantidad de soluto disuelto por unidad de volumen, son las ms ampliamente utilizadas en el trabajo de laboratorio. Las expresiones ms usadas son: a) Molaridad (M): se define como el nmero de moles de soluto por litro de solucin. Para calcular M (molaridad) se necesita conocer el peso del soluto y su peso molecular (PM): n moles Molaridad (M) = Volumen en Litro de solucin.

Una solucin 1M: contiene 1 mol de soluto por litro de solucin; contiene el nmero de Avogador* de molculas de soluto por litro de solucin. *Nmero de Avogadro: nmero de molculas por gramo-mol; nmero de tomos por gramotomo; nmero de iones por gramo-in; 6,023 x 1023. Peso del soluto (gramos) n moles = Peso molecular (PM) Una vez preparada una solucin, esta se puede mantener como solucin stock y a partir de ella se pueden prepara diluciones necesarias, debido a que el nmero de moles no se altera al diluir una muestra, por lo tanto se establece que: Ci Vi = Cf Vf Donde la concentracin inicial (Ci) debe tener la misma unidad que la concentracin final (Cf) y el volumen inicial (Vi) debe tener la misma unidad que el volumen final (Vf).

Soluciones ms diluidas en general se expresan en trminos de milimolaridad (mM), micromolaridad (M), u otras, donde: 1 mmol = 10-3 moles 1 mol = 10-6 moles 1 nmol = 0,001 mol = 10-9 moles 1 pmol = 0,001 nmol = 10-12 moles De esta manera: 1 mM = 10-3 M =1 mmol/litro =1 mol/ml 1M =10-6 M =1mol/litro =1nmol/ml 1nM =10-9 M =1nmol/litro =1pmol/ml

Tabla 1: Tabla de conversiones de masa.

Nombre Tonelada kilogramo hectogramo decagramo gramo decigramo centigramo miligramo

Abreviatura Tm kg hg dag g dg cg mg

Equivalente en kilogramos 1000 kg 1 kg 0.1 kg 0.01 kg 0.001 kg 0.0001 kg 0.00001 kg 0.000001 kg

Equivalente en gramos 1000000 g 1000 g 100 g 10 g 1g 0.1 g 0.01 g 0.001 g

b) Normalidad (N): se define como el nmero de equivalente de soluto por litro de solucin. Para calcular N se necesita conocer el peso del soluto disuelto y su peso equivalente (PE). N= Peso soluto (gramos) PM n PE

Por lo tanto N = M n Donde n es: c) Nmero de H+ o OH- reemplazables por la molcula para cidos o bases respectivamente; o Nmero de electrones perdidos o ganados por molcula para agentes oxidantes y reductores. % peso/volumen (% p/v): se refiere al peso en gramos de un soluto en 100 ml de solucin. Depende slo del peso de la sustancia y del volumen en que est disuelta. Para soluciones diluidas se puede expresar como: % p/v = Peso del soluto (grs.) Volumen de solucin. d) 100

% peso/peso (%p/p): se refiere al peso en gramos de un soluto por 100 gramos de solucin. La concentracin de la mayora de los cidos comerciales vienen dadas en %p/p. % p/p = peso del soluto (grs.) Volumen de solucin 100

e)

% volumen/volumen (%v/v): se refiere al volumen en ml de un soluto por 100 ml de solucin. Hay que tener en cuenta que las unidades de volumen del soluto y de la disolucin han de ser las mismas. % v/v = peso del soluto (grs.) Volumen de solucin 100

f) Molalidad: se define como el nmero de moles de soluto por 1000 gramos de solvente. Esta expresin de concentracin es usada en ciertos clculos fsico-qumicos, principalmente. La concentracin expresada de esta manera se hace independiente de la temperatura. Dado que la temperatura afecta el volumen de una solucin, la concentracin de sta se ver afectada cuando la expresin de concentracin usada est basada en el volumen. Para soluciones diluidas, la situacin es similar a lo descrito anteriormente en el caso de la expresin de molaridad. m = moles de soluto. Kilogramo de solvente.

PROBLEMAS 1. Cuntos gramos de NaOH slido se requieren para preparar 500ml de una solucin 0,04M?. 2. Exprese la concentracin de la solucin preparada en: N y %p/v. 3. Cuntos mililitros (ml) de H2SO4 5M se requieren para preparar 1.500ml de una solucin de H2SO4 0,002M y 0,002N?. 4. Cuntos gr de Na2CO3 se requieren para prepara 400ml de una disolucin 0,8M? 5. Determine la Molaridad de 500 ml de una disolucin que contiene 24g de CuSO4? 6. Determine la molalidad de una disolucin formada disolviendo 3,5g de NaCl en 120 ml de agua? 7. Si usted dispone de varias soluciones concentradas: NaCl 3M, KCl 1M, MgCl2 1M, CaCl2 0,1M. A partir de stas, indique cuantos ml de cada una de ellas son necesarios para preparar soluciones a las siguientes concentraciones: NaCl 0,137mM, KCl 2,68mM, MgCl2 0,5mM, CaCl2 0,9mM. 8. Calcule la cantidad de soluto que se necesita para las soluciones que se indican (nota: los pesos moleculares obtngalos de la tabla peridica): a) b) c) d) e) NaOH 2M, 1000ml LiCl 0,5M, 500ml CH3-COOH 0,07M, 10 litros NaCl 25mM, 100ml CaCl2 0,2M, 10ml

9. Qu cantidad de moles de glucosa existen en los siguientes volmenes de solucin 0,012 M?. a) 150ml b) 1ml c) 104 ml d) 100ml 10. Si usted disuelve 170mg de sacarosa en los siguientes volmenes, calcule la molaridad que obtendra: a) 700l b) 104 l c) 2 x 103 l d) 3 x 105 l e) 17 ml (Para determinar los pesos moleculares utilice la tabla peridica que se encuentra al final de la gua)

PARTE PRCTICA

Actividad N 1: Usted dispondr de una cierta cantidad de material de vidrio, el que usar durante su trabajo prctico. Cudelo y evite un tratamiento drstico o golpearlo. Su profesor le mostrar los distintos materiales de laboratorio y sus caractersticas. Adems, usted recibir instrucciones de cmo trabajar con dicho material: pipetas, tubos de ensayo, matraces, etc.

Actividad N 2: Preparacin de soluciones a) Preparacin de una solucin de NaCl 0,5M. Pese la cantidad necesaria y transfirala a un vaso de precipitado y agregue agua destilada. Con la ayuda de una bagueta (barra de vidrio) acelere la disolucin del NaCl en el agua. Enrase la solucin a su volumen final en un matraz aforado de 100 ml. b) A partir de la solucin antes preparada usted deber confeccionar tres diluciones de tal manera que queden a 15%, 1% y 0,15M, respectivamente. Vace la solucin concentrada en un vaso de precipitados limpio y seco. Tome las alcuotas respectivas con una pipeta volumtrica y vace en matraces aforados de 100 ml cada uno. Complete el volumen con agua hasta el aforo.

Actividad N 3: Durante este curso prctico en varias oportunidades usted usar una variedad de medios fisiolgicos en los cuales tanto clulas como estructuras celulares (mitocondrias, ncleos, etc.) se encontrarn en condiciones ptimas. NaCl 0,1M KCl 0,01M MgSO4 ,002M CaCl2 1mM Glucosa 0,01% A partir de las soluciones que le entregar su profesor, calcule y prepare 500ml de este medio salino. Sea cuidadoso tanto en los clculos como en la preparacin de su medio salino. Recuerde que cualquier error puede literalmente matar su material biolgico y en el futuro daar sus experimentos. Consulte si tiene dudas. Bibliografa:
Qumica 9a. ed. Chang, Raymond; 2007. Petrucci, Ralph H;2003.

Qumica general 8a. ed.

Materiales de laboratorio. Microscopa I Materiales por grupo (3 alumnos por grupo)

4 Matraces de aforo 100 ml. 1 esptula metlica. 1 embudo. 1 matraz Erlenmeyer 250 ml. 2 vasos de precipitado de 100 ml. 1 vaso de precipitado de 50 ml. 1 piceta. 1 pipeta graduada de 1, 5 y 10 ml. 1 pipeta aforada d2 2 ml. 1 probeta de 100 ml. 1 porpipeta de 2ml y 10 ml. 1 marcador. 1 bagueta de vidrio. Material para el grupo curso. 2 balanzas. NaCl.

Tabla 2: Tabla de conversiones universal para medidas.

Tabla 3: Tabla Peridica de los Elementos.