Plaguicidas

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2 - PLAGUICIDAS
DEFINICIN:
Segn la OMS, un pesticida o plaguicida es cualquier sustancia o mezclas de sustancias, de carcter orgnico o inorgnico, que est
destinada a combatir insectos, caros, roedores y otras especies indeseables de plantas y animales que son perjudiciales para el hombre o
que interfieren de cualquier otra forma en la produccin, elaboracin, almacenamiento, transporte o comercializacin de alimentos,
produccin de alimentos, productos agrcolas, madera y productos de madera o alimentos para animales, tambin aquellos que pueden
administrarse a los animales para combatir insectos arcnidos u otras plagas en o sobre sus cuerpos.
CLASIFICACION: Segn la especie a combatir
INSECTICIDAS
MINERALES
MINERALES
Compuestos arsenicales
Compuestos fluorados
Azufre
Derivados del selenio
ORGANICOS DE
SINTESIS
Organofosforados
Organoclorados
Carbamatos
A BASE DE ACEITES
MINERALES
Aceites antracnicos
Aceites de petrleo
DE ORIGEN
VEGETAL
Nicotina
Piretrina
Rotenona
MINERALES
Sales de NH4
+
, Ca
++
, Cu
++
, Fe
+++
,
Mg
++
, K
+
, Na
+
, en forma de
sulfatos, nitratos, cloruros, cloratos.
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HERBICIDAS
ORGANICOS
Fitohormonas
Derivados de la urea
Triazinas y Diazinas
Derivados de los fenil sustituidos y
las quinoxalinas
Derivados de la oxiquinolena
Derivados de las tiadizinas y
tiadiazoles
OTROS
Parquat
Diquat
Piclorame
FUNGUICIDAS
MINERALES
Sales de cobre
Compuestos arsenicales
Aceites minerales
ORGANOMETALICOS Derivados rganomercuriales
ORGANICOS
Carbamatos y ditiocarbamatos
Derivados del benceno
Amicidas
Benzonitrilos
RODENTICIDAS
Derivados cumarnicos
Warfarinas
Sales de talio
Inorgnicos
El trmino plaguicida incluye tambin los siguientes tipos de sustancias: reguladores del crecimiento de las plantas, defoliantes,
desecantes, agentes para reducir la densidad de la fruta, agentes para evitar la cada prematura de la fruta y sustancias aplicadas a los
cultivos antes o despus de la cosecha, para proteger el producto contra el deterioro, durante el almacenamiento y transporte.
Desde el punto de vista de la toxicologa, es importante sealar que las formulaciones de plaguicidas adems del principio activo incluyen
sustancias transportadoras, diluyentes como agua o solventes orgnicos, aditivos e impurezas, que pueden tener potencial txico por si
mismas.
El anlisis de plaguicidas puede clasificarse en diversas reas:
-Forense
-Diagnstico de urgencia
-Control de poblaciones expuestas y no expuestas.
-Contaminacin ambiental.
Si el plaguicida fue causa de muerte, estar en alta concentracin, al igual que en una intoxicacin aguda grave. En las dos ltimas reas se
trabaja con muestras con niveles muy bajos de plaguicidas (menores de 0,1 ppm), se habla de residuos de plaguicidas. De todos ellos
estudiaremos los insecticidas organoclorados, organofosforados y carbamatos, por ser los ms utilizados actualmente y producir efectos
txicos muy caractersticos.

PROPIEDADES FISICOQUMICAS
Estas propiedades son las determinantes de su cintica ambiental. El aire, el agua, el suelo y los alimentos retienen gran parte de los
pesticidas y stos llegarn a los seres vivos.
Constituye un problema actual su persistencia en el medio ambiente, su concentracin y transformacin en organismos vivos.
ORGANOFOSFORADO ORGANOCLORADO
Estabilidad Muy baja elevada
Persistencia baja alta
Efectos
bioacumulativo
no posee muy grande
Toxicidad aguda alta baja
Solubilidad en agua alta baja
Hidrofobicidad bajo alto
Costo alto bajo
Selectividad alta baja
ETIOLOGIA
ETIOLOGIA
Las intoxicaciones accidentales son generalmente de origen profesional, afectando al los obreros que trabajan en la preparacin de los
insecticidas o a los peones rurales durante o inmediatamente despus de la aplicacin en cultivos.
Las intoxicaciones alimentarias se deben al consumo de alimentos tratados impropiamente con pesticidas. Las intoxicaciones casuales
se deben generalmente a confusiones, manejo imprudente y falta de vigilancia de los nios.
Las intoxicaciones suicidas y criminales se han hecho ms frecuentes debido a su alta toxicidad y fcil adquisicin.

PLAGUICIDAS ORGANOCLORADOS
Desde el punto de vista estructural, constituyen un grupo de sustancias, muy heterogneo, teniendo en comn la presencia de estructuras
monocclicas o policclicas con distinto nmero de sustituyentes cloro.
Incluyen varios grupos:
a) Grupo de los Ciclodienos:Aldrn y su epxido, el Dieldrn, Mirex
b) Grupo del DDT (dicloro-difenil-tricloroetano): p-p-DDT, o-p-DDT, p-p-Metoxiclor.
c) Grupo del Hexaclorociclohexano (HCH) y Hexaclorobenceno(HCB): HCH, -HCH, HCB.
d) Grupo de los indenos clorados: hepatacloro, a-Clordano.
e) Grupo de los terpenos clorados: Toxafeno.
Absorcin
Por va digestiva principalmente; a travs de la piel cuando estn en solventes lipdicos y a travs de la va respiratoria por su aplicacin en
forma de pulverizaciones.
Mecanismo de accin
Poseen accin neurotropa, aunque no se conoce bien el mecanismo sobre el sistema nervioso. A largo plazo, inducen las enzimas
microsomales hepticas. Son inductores en cantidades residuales, del orden de las que pueden estar acumuladas en el tejido adiposo.
En el hombre, al igual que en el medio ambiente, se degradan lentamente y se pudo determinar que tienen una gran afinidad por los tejidos
grasos. Estas cantidades acumuladas en grasas preocupan, pues por ejemplo, en el caso de adelgazamiento brusco pasan a la circulacin
general y producen sntomas de intoxicacin.
Preocupa tambin, porque pasan en cantidades considerables a la grasa de la leche. Los recin nacidos se pueden ir contaminando,
debido a los residuos de pesticida presentes en su alimento natural.
Muestras
La sangre es la muestra ms adecuada para la bsqueda de plaguicidas organoclorados ya que por su gran liposolubilidad rara vez
aparecen en orina. Se colectan 8-10 ml de sangre en tubo de centrfuga heparinizado.
Jugo gstrico: evitar el agregado de carbn vegetal . Conservar en la heladera.
Distintos tipos de alimentos, principalmente de origen vegetal, productos crneos y aguas. Los alimentos son considerados como la
principal va de acceso de los pesticidas organoclorados al organismo (80-90% del ingreso diario de plaguicidas segn Kaphalia, 1985).

PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS
Son sustancias biodegradables en la naturaleza, sin tendencia a acumularse en las grasas del organismo, pero con gran actividad
neurotxica que va a producir intoxicaciones agudas de gravedad. Son los insecticidas, junto con los carbamatos y piretroides, ms
ampliamente utilizados en la actualidad.
Sus estructuras qumicas derivan de la sustitucin por restos orgnicos en el fsforo pentavalente. Pueden clasificarse como:
a) Derivados de la molcula del cido fosfrico. Si los dos primeros oxhidrilos se esterifican con radicales alqulicos se obtienen los alquil-
fosfatos o alquil-pirofosfatos (ejemplo: dichlorvos) . Si dichos oxhidrilos se sustituyen por amidas se obtienen las fosforamidas (ejemplos:
metamidofs, acefato).
b) Derivados de la molcula del cido fosforotinico: De este cido derivarn a su vez numerosos steres tiofosfricos (ejemplo: paratin).
c) Derivados del cido fosforotiolotinico. (ejemplo: malatin).
d) Derivados del cido fosforotilico (ejemplos: malaoxn, demeton-S-metil.).
Mecanismo de accin
Los insecticidas organofosforados actan combinndose con gran afinidad con cierto tipo de esterasas, con la consecuencia de su
inactivacin. Esta reaccin, en el contexto de la fisiologa de sus funciones, es irrevesible. Los oxofosforados (enlces P=O) son fuertemente
inhibidores, mientras que los tiofosforados (P=S) no son fuertemente inhibidores y necesitarn de una biotransformacin a la forma oxo para
actuar como inhibidores.
En particular, la inhibicin de las colinesterasas es la que va a derivar en los sntomas y signos de la intoxicacin aguda. El papel fisiolgico
de la colinesterasa consiste en la hidrlisis de la acetilcolina, mediador qumico en la transmisin del impulso nervioso. Se acumulan as
grandes cantidades de acetilcolina en las sinapsis.
Existen dos tipos de colinesterasas: la colinesterasa verdadera, presente en eritrocitos y tejido nervioso y la pseudocolinesterasa presente
en suero o plasma.
Ambas enzimas son inhibidas por los compuestos organofosforados, pero la eritrocitaria es la que mejor refleja el estado de inhibicin de la
colinesterasa del sistema nervioso, por lo que se utiliza para evaluar el estado de intoxicacin aguda de un paciente. Por otro lado, la
colinesterasa plasmtica o pseudocolinesterasa es la que ms tarda en regenerarse, por lo que se utiliza en la evaluacin de la exposicin
crnica a organofosforados.
Absorcin:
Los steres fosforados se absorben fcilmente a travs de la piel y ms rpidamente por va digestiva. La absorcin respiratoria es casi
instantnea.
Muestras
La muestra mas utilizada para la determinacin de organofosforados y sus metabolitos es orina de 24 hs, colectada en envase de vidrio y
conservada en heladera.
Tambin, como ndice de la intoxicacin, puede determinarse la actividad de las colinesterasas sanguneas: plamtica o eritrocitaria.
La determinacin de residuos se realiza, por un lado, en distintos tipos de alimentos, principalmente de origen vegetal, productos crneos y
aguas de bebida, y por otro lado en muestras ambientales como aguas superficiales y suelos.
CARBAMATOS
Forman parte de una gran familia de plaguicidas entre los que se hallan herbicidas, fungicidas e insecticidas. Todos ellos derivan del cido
carbmico:
Se los divide en tres grupos:
1-N-metil carbamatos: uno de los hidrgenos del grupo amino es reemplazado por un grupo metilo (ejemplos: Aldicarb, Carbaryl,
Carbofuran).
2-N,N, dimetil Carbamato: ambos hidrgenos del grupo amino son reemplazados por grupos metilos (ejemplos: Isolan, Pirolan).
3-N-fenil Carbamatos: un grupo fenilo sustituye a uno de los hidrgenos del grupo amino.
Mecanismo de accin
Es equivalente al mecanismo de accin de los organofosforados, unindose a las colinesterasas e inactivndolas. Pero sta unin es
reversible espontneamente en menos de una hora, de manera que en el curso de una intoxicacin aguda por carbamatos se manifiestan
los mismos signos y sntomas de la intoxicacin por organofosforados pero con un curso ms rpido hacia la recuperacin.
Muestras
Se los encuentra en orina de 24 hs. Tambin se los halla en distintos tipos de alimentos contaminados, principalmente de origen vegetal.

INVESTIGACION DE PLAGUICIDAS
CONSIDERACIONES GENERALES
Los plaguicidas deben aislarse de los materiales en los que se encuentran para su investigacin. Los extractos deben someterse a una
purificacin antes de investigarlos y/o determinarlos cuantitativamente. La identificacin se realiza por CGL o TLC. La CGL permite alcanzar
ms bajos lmites de deteccin , sobre todo con detectores especficos para cada clase de pesticida (OC, OP ).
Se distinguen tres pasos fundamentales en su determinacin:
1- EXTRACCION del plaguicida de la matriz originaria y traspaso a una fase separable. La mayora de los plaguicidas se extraen de las
muestras con solventes como el ter de petrleo, acetonitrilo o acetona; o bien cloroformo o ter etlico en medio neutro o cido dependiendo
del plaguicida y del tipo de muestra.
MUESTRAS que pueden llegar al laboratorio:
-Biolgica: lavado gstrico, sangre, orina , vsceras.
-No biolgica: preparados (polvos, emulsiones, etc.), alimentos, agua, aire, suelo.
2- PURIFICACION del plaguicida (eliminacin de otras sustancias interferentes).Los mtodos de purificacin no son generales para los
distintos plaguicidas y algunos no lo son, siquiera para todos los plaguicidas de una misma familia. En general, los extractos pueden
purificarse por particin con solventes y/ o por cromatografa en columna de florisil, celite, slica gel, almina o carbn activado.
3- DETERMINACION Cualitativa y/o Cuantitativa (TLC y CGL). La identidad de un plaguicida debe confirmarse por un segundo mtodo. Por
ejemplo, si el plaguicida se ha reconocido por CGL podr efectuarse un TLC; una CGL empleando un detector selectivo para otro elemento
presente en el plaguicida; o bien una CGL con columnas recubiertas con fase(s) de polaridad diferente a las usadas en el primer anlisis; o
una CGL combinada con un espectrmetro de masas.
Para el dosaje de plaguicidas se requieren mtodos que los separen y detecten cuantitativamente, siendo el ms adecuado la CGL.
A- INVESTIGACIN DE PLAGUICIDAS EN FRUTAS Y VERDURAS
1- EXTRACCIN: tomar 50 gramos del vegetal elegido y se colocan en un homogeneizador (licuadora) junto con 100 ml de acetonitrilo y 5
gramos de celite, homogeneizar durante 2 minutos a gran velocidad. Filtrar por succin con papel de filtro poro medio y medir el volumen
obtenido: V1
Transferir la mitad de V1 a una ampolla de decantacin de 500 ml, agregar 20 ml de ter de petrleo (EP); agitar durante 1 o 2 minutos, luego
agregar 10 ml de sol. concentrada de ClNa y 100 ml de agua destilada.
Agitar vigorosamente durante 30-45 segundos. Retirar la fase acuosa. Lavar la fase EP con 20 ml de agua destilada dos veces. Filtrar la fase
EP por papel de poro medio que contenga sulfato de sodio anhidro y medir el volumen obtenido: V2.
Concentrar en plancha calefactora o en Bao de Mara (con mucho cuidado hasta 2 o 3 ml finales).En el residuo se identifican OC y OP por
TLC y/ o CG (en el residuo purificado).
2-PURIFICACIN: (Fase Estacionaria por Va Hmeda): tomar entre 3 y 5 gramos de florisil activado a 650C, 5 Hs. y luego mantenido a 130C
. Suspender en ter de petrleo. Agregar esa suspensin a la columna cromatogrfica poco a poco, de manera que se forme una lluvia fina
de Florisil, homogeneizando con golpes cuidadosos, hasta obtener una altura de 10 cm. Sobre el Florisil y operando de manera similar,
aadir sulfato de sodio anhidro llegando a una altura total de 12 cm.
Dejar eluir el EP hasta que slo sobrepase la fase estacionaria Florisil-sulfato de sodio en 2-3 mm. y sembrar la muestra. Dejar eluir hasta
unos pocos mm por encima del sulfato de sodio y comenzar con el agregado del eluyente elegido (al principio, el agregado se efecta con
pipeta , para no romper la fase estacionaria y luego se llena el reservorio). Se eluye a una velocidad de flujo de 5mm/ min o menor, con tres
fracciones de solvente de elucin de 100 ml cada una.
El primer solvente de elucin es ter etlico al 6% en ter de petrleo, el segundo es ter etlico al 15% en ter de petrleo, y el tercero es
ter etlico al 50% en ter de petrleo.
Los plaguicidas se van eluyendo de acuerdo a la relacin de polaridades de estos dos solventes:
Fraccin del 6%:
Clorados: Aldrin, DDE, DDT, Heptacloro
Fosforados: Ethin
Fraccin del 15%:
Clorados: Dieldrin, Endrin
Fosforados: Metilparatin, Diazinn, Paratin
Fraccin del 50%:
Fosforados: Malatin
Concentrar cada fraccin hasta no ms de 2-3 ml. Este ser utilizado para sembrar en TLC o inyectar en un cromatgrafo gaseoso.
B-INVESTIGACIN DE PLAGUICIDAS EN ORINA, SANGRE Y LAVADO GASTRICO
1-EXTRACCION:
Se utilizan las columnas tipo EXTRELUT , rellenas con tierra silcea como soporte inerte.
Si la muestra a sembrar consiste en ORINA, se acidificarn 19 ml de la misma con 1 ml de solucin saturada de ACIDO TARTARICO (pH: 5-
6).
Si la muestra es PLASMA o SUERO se realiza una dilucin con agua destilada (4 ml de suero o plasma se llevan a 19,5 ml con agua
destilada) y se acidifica con 0,5 ml de solucin saturada de cido tartrico.
Si la muestra es LAVADO GASTRICO, se toman 9,5 del mismo y se llevan a 19 ml con agua destilada (si no se practica la dilucin , el lquido
taponara la columna por su alta densidad) y se acidifica con 1 ml de solucin saturada de cido tartrico.
Se realiza una primera elucin con ter de petrleo (E1). Se cambia el recipiente de recoleccin y se eluye ahora con ter etlico
obtenindose un segundo extracto (E2). Ambos extractos se concentran por evaporacin a Bao Mara.
En el primer extracto (E1), se aislarn los plaguicidas ORGANOCLORADOS. Para sembrarlo en TLC es necesario resuspender con Hexano.
En el segundo extracto (E2) se hallarn los ORGANOFOSFORADOS y CARBAMATOS. Para sembrarlo en TLC, es necesario resuspender en
una mezcla Tolueno: Propanol (1: 1).
C- INVESTIGACIN DE PLAGUICIDAS EN AGUAS
Se colocan 750 ml de agua (muestra) en una ampolla de decantacin de 1 litro. Se agrega 25 ml de n-hexano. Se agita vigorosamente
durante 1 minuto. Se separan las fases y se recoge la capa de n-hexano. Se efectan 2 extracciones ms con n-hexano y se renen los
extractos. Secar la fase orgnica con sulfato de sodio anhidro. Filtrar y concentrar a baja temperatura.
Generalmente se hallan trazas de plaguicidas en agua, por eso se parte de un gran volumen de muestra.
D- INVESTIGACIN DE PLAGUICIDAS EN VISCERAS. MTODO DE FASSI ADAPTADO.
1-EXTRACCION:
En un vaso de precipitados se colocan 50 gr. de papilla de vsceras, bien trituradas, se le agrega cido tartrico slido (como
desproteinizante) hasta pH cido y luego sulfato de sodio anhidro mezclando hasta consistencia pastosa. La mezcla se seca bajo una
corriente de aire caliente (secador de cabello).
El contenido del vaso se transvasa a un erlenmeyer con tapa esmerilada. El material se extrae con ter de petrleo (punto de ebullicin 40-
60C ) agregndolo hasta cubrir la papilla. Agitar enrgicamente durante 60 segundos, repitindose el proceso dos veces ms. Dejar en
reposo hasta una neta separacin de las fases. Reservar la fraccin etrea para la investigacin de plaguicidas.
2-PURIFICACION:
El extracto de ter de petrleo se trata con acetonitrilo saturado en ter de petrleo; se dispersa en agua (200 ml de agua destilada con 10 ml
de solucin saturada de ClNa); se extrae con 50 ml de ter de petrleo.
Si el extracto est impuro se toma con Celite 545 , mezclando cuidadosamente y eliminando el solvente en corriente de aire, hasta que no
queden partculas aglomeradas.
Se prepara una columna (de 0,8 x 16 cm) taponndola con algodn y colocando en ella la muestra absorbida en el Celite a travs de un
embudo y compactando el polvo tanto como sea posible con una varilla.
Se prepara una segunda columna (de 1,4 x 16 cm) con llave, llenndola con ter de petrleo, empujando con una varilla de vidrio un tapn de
algodn hasta el fondo. Posteriormente se agregan 5 g de almina y luego 5 g de Florisil , cubriendo finalmente con una capa de arena de 2
a 2,5 cm de espesor, drenndose el solvente , hasta que el nivel del mismo alcance la parte inferior de la capa de arena.
Se inserta el extremo inferior de la columna de 0,8 cm en el extremo superior de la columna de 1,4 cm. La columna pequea que contiene
los plaguicidas se eluye con 3-4 ml de dimetilsulfxido (DMSO) aplicando presin positiva.
Abriendo la llave de la columna grande se permite la entrada del DMSO en el Florisil, retirndose luego la columna superior y comenzando la
elucin con 100 ml de ter de petrleo. Recoger el eludo en un vaso de precipitado y evaporar suavemente.

DETERMINACION CUALI / CUANTITATIVA DE OC, OP Y CARBAMATOS.
a)-IDENTIFICACIN DE ORGANOCLORADOS POR TLC
Se usa esta metodologa cuando se sospecha una alta concentracin de plaguicida en la muestra. Sembrar la muestra (el extracto etreo
purificado) y patrones en una placa de slica G (9 gramos de slica G: 18 ml de agua).
Fase Fija: slica gel G activada a 120C durante 2 Hs.
Fase Mvil: n Hexano:Acetona (9:1)
Testigos: DDT, Gamexane
Desarrollar hasta llegar el frente de solvente a 10 cm.
Revelado: Difenilamina al 0.2% en etanol absoluto.
Rociar y exponer a UV entre 20 -60 minutos. Determinar los Rf caractersticos de las muestras y patrones. Se detectan concentraciones del
orden de los microgramos.
b)-IDENTIFICACIN DE ORGANOFOSFORADOS POR TLC
Fase fija: slica gel G activada a 120C durante 2 Hs.
Fase Mvil: n Hexano:Acetona (8:2)
Testigos: Paratin, Malatin
Revelado 1: Cloruro de paladio al 0.5% en HCl al 10%
Rociar y calentar a 80 C durante 20 minutos. Aparecen manchas pardas para fosforados. Determinar los Rf y caracterizar las manchas
halladas en funcin de los patrones.
Revelado 2: Inhibidor de la Colinesterasa. Una vez corrida la placa , se la expone a vapores de bromo dentro de una cuba. El bromo oxidar
el azufre de la molcula de OP a oxgeno.
En hgado tambin ocurre una oxidacin del plaguicida por oxidasas microsomales hepticas, aumentando su potencial txico.
Luego de exponer la placa al aire para evaporar el exceso de bromo que interfiere en el resto de la reaccin , se hace una aspersin con la
enzima Colinesterasa y se lleva a estufa a 37C durante 30 minutos. La enzima se obtiene a partir de un homogenato de hgado (lugar donde
se sintetiza) o bien puede utilizarse suero o plasma fresco.
Luego de hacer la aspersin , la enzima ser inhibida en los sitios donde se encuentra el plaguicida. Para evidenciarlo se pulveriza con
acetato de alfa naftilo/ Fast Blue. El acetato de alfa naftilo es sustrato de la enzima y liberar naftol. Luego el naftol se copula con el Fast Blue
dando color lila donde la enzima es activa.
Donde la enzima es inhibida por el plaguicida no se produce la reaccin , quedando blanco. La placa se ver lila con manchas blancas.
Sensibilidad: 0,1 a 1 ng.
Interferencias: fenotiazinas, cocana dan positiva la reaccin. Cuando da negativa se puede descartar la presencia de OP; si da positiva debe
confirmarse con otros revelados.
c)-IDENTIFICACION SIMULTANEA DE OP, OC Y CARBAMATOS POT TLC
Fase fija: slica gel G activada.
Fase Mvil: Ciclohexano:Hexano:Cloroformo:Acetona (4:4:1:1).
Testigos:
OCl: Heptacloro y Lindane
OF : Parathion y Malathion
Carbamatos: Furadan y Carbaryl.
Revelado: se lleva a cabo un revelado secuencial que consiste en:
1-Difenilamina alcohlica. Rociar y colocar la placa al sol durante 30 minutos. Los pesticidas organoclorados aprecern de color gris
verdoso.
2-KOH al 10% en agua. Calentar suavemente.
3-Tetrafluorborato de nitrobencenodiazonio en etanol con gotas de etilenglicol o propilenglicol. Los carbamatos aparecen azules o rosas.
4-Cloruro de Paladio 0,5% en HCl al 10%. Los organofosforados aparecen de color naranja.

REACTIVOS REVELADORES
Difenilamina al 0,2%
en Etanol:
0,2 gr de Difenilamina en 100 ml de Etanol.
PREPARAR EN EL MOMENTO.
Cloruro de Paladio al
0,5% en ClH al 10%:
0,5 gr de Cloruro de paladio se disuelven en
100 ml de ClH al 10 %.
Hidrxido de Potasio
al 10%:
10 gr de K(OH) en 100 ml de agua.
Tetrafluoroborato de
4-
se disuelven 25 mg de este reactivo en
etanol:etilenglicol (9:1). Se conoce
nitrobencenodiazonio: comercialmente como Fast red.
d)-IDENTIFICACIN de OC y OP en CGL
En la cromatografa gas- lquida la muestra se distribuye entre dos fases: una fija y una mvil. A travs de la fase fija (lquida), adsorbida
sobre un soporte inerte, circula la fase mvil (gas) transportando la muestra vaporizada.
Las molculas de la muestra tardarn cierto tiempo en recorrer la columna segn su polaridad con respecto a la fase fija.
Cuando circula el gas portador, se registrar una lnea de base. Cuando se inyecta la muestra y se detecta, aparecer un pico.
Del cromatograma se obtendr la siguiente informacin:
-Tiempo de retencin: es el tiempo que tarda en aparecer el pico, desde la inyeccin hasta la altura mxima del mismo.
-rea del pico: es proporcional a la concentracin de la muestra.
Para identificar una sustancia se debe pasar la muestra por distintas columnas, de diferente polaridad. Si en todas coincide el tiempo de
retencin de la muestra con el testigo, decimos que se trata de esa sustancia.
Se utilizan tres tipos de columnas:
OV
17
Fenil silicona
QF
1
-DC
2000
Trifloruro propil Metil silicona
DC
2000
Metil silicona
El flujo a travs de la columna debe ser constante y es necesario regularlo de modo que permita el intercambio y se reproduzca el tiempo de
retencin.
La cmara inyectora se encuentra a elevada temperatura, en ella se siembra la muestra, la cual es vaporizada y arrastrada por el gas carrier.
Ventajas: alta resolucin y gran sensibilidad. Detecta trazas.
Desventajas: es necesario la purificacin previa de la muestra, para poder inyectarla. Adems la muestra debe ser de bajo punto de
ebullicin para que se volatilice.
Conviene usar detectores que respondan a un nmero limitado de elementos o estructuras de modo de separar ms eficazmente el
plaguicida contaminante de las interferencias presentes en la muestra.
Para determinar OC se utiliza detector de captura de electrones. A medida que el gas portador (Nitrgeno) fluye a travs del detector, una
lmina de Ni radiactivo ioniza las molculas del gas y genera electrones. Estos se desplazan hacia el nodo lo cual produce una corriente de
fondo que se visualiza como la lnea de base en el cromatograma. Si se inyecta una muestra con molculas que tengan tomos
electronegativos , disminuye la seal elctrica y en el cromatograma se ve un pico. Se detectan microgramos y hasta nanogramos de OC.
Generalmente se utiliza una columna capilar de polaridad intermedia con polifenil metil siloxano como relleno. Temperatura del detector:
300C. Gas portador: Nitrgeno (caudal: 10 ml/ min.). Programa de temperatura: Temperatura inicial de 190C durante 1 minuto. Temperatura
final de 250C durante 6 minutos. La variacin de temperatura es de 1/ min. entre ambas.
Para los OP se utiliza un detector fotomtrico de llama. Este detector consiste en una pequea llama de hidrgeno quemndose en un
exceso de aire y rodeada por un campo electrosttico. El efluente de la columna (con Nitrgeno como gas portador) entra a la base del
mechero y se mezcla con el Hidrgeno.
Los compuestos orgnicos al salir de la columna se ionizan y los electrones libres son colectados en un electrodo cargado positivamente
aumentando de esta manera la corriente que circula por l, la cual es amplificada y registrada. Este detector responde slo a tomos de
Carbono que sean oxidables. Posee una sensibilidad del orden de los nanogramos. Para la determinacin se inyecta entre 0.5-2 microlitros
de muestra.
INHIBICION de COLINESTERASA - (Como recurso de identificacin de la intoxicacin con plaguicidas organofosforados y carbamatos ).
Debido a que resulta difcil encontrar algn plaguicida organofosforado en suero u orina o sus metabolitos, se recurre a determinaciones en
suero, plasma o sangre entera que son muy rpidas y pueden dar indicio de la gravedad de la intoxicacin.
Para la identificacin rpida de colinesterasa, existen tcnicas de ejecucin simple, basadas algunas de ellas, en el empleo de papeles
reactivos. El denominado Merckotest, se recomienda para determinar la actividad de la enzima en suero o plasma, no slo es til en casos
de exposicin o de intoxicacin con inhibidores de colinesterasa, sino tambien en diversos estados patolgicos (lesiones hepticas) o para
evaluar la accin de ciertos medicamentos sobre el sistema enzimtico.
Mtodo pHmtrico de Michel (para acetilcolinesterasa eritrocitaria).
FUNDAMENTO: La acetilcolinesterasa provoca la hidrlisis de la acetilcolina en colina y cido actico. Este mtodo estima la actividad de la
enzima, midiendo el cambio de pH a travs del empleo de un electrodo de vidrio.
Otros mtodos como el de W. Caraway, registra el cambio de pH usando un indicador colorimtrico.
MUESTRA: Se trabaja con sangre heparinizada, aproximadamente 8 ml de sangre, obtenida por venopuncin (evitar la hemlisis),
transferirla a un tubo heparinizado (con una gota de heparina), tapar y agitar cuidadosamente por inversin.
Es conveniente separar el plasma de las clulas lo ms pronto posible, cuando esto no se pueda llevar a cabo, se debe refrigerar la
muestra a 4C durante 2-3 horas (no es conveniente por ms tiempo).
Procedimiento para la determinacin de acetilcolinesterasa eritrocitaria
REACTIVOS
Solucion tampon para globulos rojos: Barbital sodico 0,2 N (4,1236 gr),
fosfato de potasio diacido, 0,004 N (0,5444 gr) y cloruro de potasio 0,6
N (44,736 gr). Disolver los reactivos en 950 ml de agua. Ajustar el pH:
8,10 exactamente a 25 C, con ClH 0,1 N ( se requieren alrededor de
28 ml). Agregar gotas de tolueno y guardar en refrigerador. Debera
comprobarse el pH y la capacidad de la solucion tampon cada vez que
se va a usar ya que estos valores tienden a variar con el tiempo.
NOTA: dietilbarbiturato de sodio= Barbital sodico= Veronal sodico.
Ioduro de acetilcolina: Disolver 3,004 gr de Ioduro de acetilcolina en agua y
llevar a 100 ml. Agregar gotas de tolueno y guardar en heladera.
Si la muestra fue refrigerada esperar a que alcance la temperatura
ambiente.
Saponina al 0,01%: Disolver 10 mg de saponina en agua y llevar a 100 ml.
Heparina: 10000 U/ml.
Transferir 0.04 ml exactos de glbulos rojos sedimentados a un matraz de 5 ml conteniendo 2 ml de saponina al 0.01 %, enjuagando la
pipeta con la mezcla de saponina y glbulos rojos, hasta que todas las clulas se desprendan de la pipeta.
Mezclar mediante vortex. Una vez preparadas las muestras, aadir a cada tubo 2 ml de solucin tampn (para eritrocitos), esperar l0 min.
Determinar el pH de la solucin hasta 0.01 de unidad y anotarlo como pH1, (si la lectura es< de 7.97 desechar la prueba y comenzar otro
ensayo con una solucin tampn recin preparada).
Aadir 0.4 ml de sol. 0.1 M de yoduro de acetil colina para eritrocitos, mezclar con vortex y anotar como T1 el momento en que se aadi el
yoduro , dejar reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente, cumplido este tiempo determinar el pH de la mezcla, se tomar como pH2
y el momento que se mide como T2
CALCULO: El pH/hora se determina siguiendo el siguiente esquema:
(pH1 - pH2 -b) x
pH/hora=
t
reccion
b: correccin para la hidrlisis no enzimtica (ver tabla)
: correccin para la variacin de pH/hora con el pH.
t
recci on
: T2-T1, expresado en horas.
Los factores de correccin para la hidrlisis no enzimtica, no son lineales con respecto al tiempo.
Valor de referencia: La cifra promedio de la actividad de la colinesterasa en un grupo de individuos normales de acuerdo a Michel, es de
Delta de pH/hora: 0.75 para GR.
Factores de correccin que se emplean en el clculo:
pH b f
7.90 0.03 0.94
7.20 0.00 1.00
7.10 0.00 1.00
7.00 0.00 1.00
6.90 0.00 0.99
6.80 0.00 0.98
6.70 0.00 0.97
6.60 0.00 0.97
pH b f
6.50 0.00 0.97
7.30 0.00 1.00
7.80 0.02 0.95
7.70 0.01 0.96
7.60 0.00 0.97
7.50 0.00 0.98
7.40 0.00 0.99
Procedimiento para la determinacin de colinesterasa plasmtica
La Colinesterasa srica o plasmtica (Pseudocolinesterasa o Butirilcolina esterasa) cataliza la reaccin de hidrlisis de los steres de la
colina, tal como la S-butirilcolina, con mxima actividad a pH 7,7. La tiocolina liberada reacciona con el cido 5,5-ditiobis-2- nitrobenzoico
(DTNB) produciendo un compuesto amarillo de acuerdo al siguiente esquema de reaccin.
Butirilcolina + agua
Colinesterasa
Tiocolina + Butirato
Tiocolina +
DNTB
2-nitro-5-
mercaptobenzoato.
La velocidad de aparicin de color es directamente proporcional a la actividad enzimtica y se mide a 405 nm.
Criterios para determinacin del grado y tipo de intoxicacin.
Colinesterasa Srica Colinesterasa Eritrocitaria Indica
Normal o poco
descendida
>o.75 pH/h normal o
poco descendida
(0.75-0.60)
-No intoxicacin.
-Leve intox.
-Intoxicacin a
carbamatos.

discretamente
descendida (0.60-
0.50)
-Intoxicacin
moderada o a dosis
repetidas
Muy descendida
muy descendida (0.50-
0.25)
-Intoxicacin grave
(aguda).

CUESTIONARIO GUIA
1. Qu es un Plaguicida ?. Qu plaguicidas producen intoxicaciones en forma frecuente ?
2. Cules son las diferencias ms importantes entre pesticidas Organoclorados y Organofosforados en cuanto a sus propiedades
fisicoqumicas ?
3. Respecto a los plaguicidas ORGANOCLORADOS indique su etiologa, metabolismo y mecanismo de accin.
4. Qu caractersticas clnicas orientan a la sospecha de intoxicacin por un organoclorado?. Cmo lo confirma en el laboratorio ?
5. Respecto a los plaguicidas OC indique su etiologa, metabolismo, mecanismo de accin.
6. Respecto a los plaguicidas OP indique su etiologa, metabolismo, mecanismo de accin. Idem para CARBAMATOS
7. Qu caractersticas clnicas orientan a la sospecha de intoxicacin por un organofosforado? Cmo lo confirma en el laboratorio ?
8. Qu tipo de pesticida esperara encontrar en una muestra de sangre de un paciente presuntamente intoxicado con pesticidas ? y en una
muestra de orina ?
9. Respecto a los trabajos entregados, detalle claramente objetivos, metodologa, resultado y conclusiones de los mismos.
10. Cules son los pasos fundamentales en la investigacin de plaguicidas?
11. Qu metodologa emplea en la bsqueda de pesticidas en frutas y verduras?
12. Qu metodologa emplea en la bsqueda de pesticidas en lquidos biolgicos?
13. Qu metodologa emplea en la bsqueda de pesticidas en vsceras?
14. Cules son las ventajas y desventajas de utilizar TLC y CG para OC y OP ?
15. La medida de la actividad enzimtica de las Colinesterasas srica y eritrocitaria es importante en el diagnstico y tratamiento de la
intoxicacin por OP: qu muestra utiliza en cada caso ? Cul de las dos determinaciones es la ms importante y por qu?
16. Cul es el fundamento del mtodo de Michael para la determinacin de la actividad enzimtica de la Acetilcolinesterasa?
17. Cul es el fundamento del mtodo para la determinacin de colinesterasa srica?

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