Vectores de clonacin

Dra. Alejandra Aquino Andrade

Febrero 2015

Clon
Clon: es una coleccin de organismos idnticos que
se derivan de un nico ancestro.

La clonacin molecular involucra dos estados generales:

El DNA de alguna fuente en particular es cortado y
liberado, puede ser un gen o un fragmento de inters.
Este fragmento es entonces clonado por su insercin
en otro DNA, conocido como vector.

Clonacin molecular
Insertar un segmento de DNA de inters en una
molcula de DNA que se replica autnomamente,
llamada vector de clonacin o vehculo de forma
que el segmento de DNA es replicado con el
vector.

Vectores de clonacin
Una quimera es entonces una molcula
de DNA hbrida, como un vector ms un
gen clonado, el cual ha sido construido
de dos diferentes fuentes de DNA.

Chimera
monstruo de la mitologa griega que tiene cabeza de len, cuerpo de cabra y cola de serpiente

Clonacin de DNA
Seleccionar una molcula pequea de
DNA capaz de replicarse (Vectores de
clonacin o vehculo).
2. Cortar el DNA en una localizacin
precisa
3. Unir estos dos fragmentos de forma
covalente (DNA recombinante).
4. Introducir el DNA recombinante a una
clula husped
5. Seleccionar o identificar las clulas
husped que contienen el DNA
recombinante.
1.

Los mtodos involucrados en llevar a cabo

estos procesos son referidos como
tecnologa del DNA recombinante o ms
informalmente ingeniera gentica.

Caractersticas generales de los vectores

El vector debe ser una molcula de DNA
razonablemente pequeo y manejable
El movimiento del vector de clula a clula.
Generar y purificar grandes cantidades del DNA del
vector
Detectar la presencia del vector
Seleccionar directamente las clulas que contienen al
vector
Insertar genes en el vector
Detectar la presencia de un gen insertado en el vector

Tipos de vectores
Plsmidos
Virus
Cromosomas artificiales

Vectores plasmdicos

Caractersticas de vectores
plasmdicos 1
10kb
Replicacin (sitio ori)
Varias copias por clula
Contener al menos un sitio de clonacin

Enzimas de restriccin
Son endonucleasas que cortan DNA de doble cadena
Se unen a DNA en una regin especfica (sitio de
reconocimiento)
Los sitios de reconocimiento son regiones invertidas
de 4,6 y 8 bases

Tipos de enzimas de restriccin

Tipo I Cortan el DNA lejos del sitio de
reconocimiento
Tipo II Cortan el DNA en el sitio de reconocimiento
-Generan extremos romos o cohesivos

Sitios de clonacin

Fragmento de DNA sintetizado artificialmente

50pb
Se mantiene la estructura del plsmido
Direccin

Caractersticas de vectores
plasmdicos 1
10kb
Replicacin (sitio ori)
Varias copias por clula
Contener al menos un sitio de clonacin

Caractersticas de vectores
plasmdicos 2
Marcadores de seleccin

Deteccin de resistencia 1
b-lactamasas: Enzimas que catalizan la ruptura del
enlace amida del anillo b-lactmico
Codificadas por genes bla

Deteccin de resistencia 2

Medio de cultivo
suplementado con
ampicilina

Medio de cultivo
suplementado con
ampicilina

Medio de cultivo
suplementado con
ampicilina

Plsmidos de la serie pBR

Serie pBR
10-20 copias por clula
Inactivacin por insercin

pBR: Inactivacin por insercin

Las clulas que reciben el plsmido sin el inserto debern resistir a ambos
antibiticos, y aquellas que reciben el plsmido con el inserto resistirn solo al
primer antibitico.

Plsmidos de la serie pUC

200-1000 copias/ clulas pUC18
Los plsmidos de la serie pUC estn basados es pBR322 del cual
poseen el 40% del DNA
Los vectores pUC tienen MCS.
ampr permite seleccionar a las bacterias que reciben una copia
del vector.
Tienen elementos genticos que proveen una manera
conveniente para escanear los clones con el DNA recombinante.

a-complementacin
Los sitios mltiples de clonacin estn
dentro de la secuencia que codifica la
porcin N-terminal (a- pptido 146 aa)
de la enzima b-galactosidasa (lacZ).

La bacteria husped usada para los

vectores pUC lleva el fragmento que
codifica para la porcin C-terminal de bgalactosidasa.
Pueden complementarse in vivo, en un
proceso llamado a-complementacin

pUC19

Sitio mltiple de clonacin

Los MCS han sido
cuidadosamente construidos
para preservar el marco de
lectura de b-galactosidasa
Insertos ms largos
destruyen la funcin del gen

Sustrato cromognico X-gal

(5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactopiransido)

galactosa

5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole
5,5'-dibromo-4,4'-dichloro-indigo

http://genome-www.stanford.edu/vectordb/vector_pages/plasmid_pages/all_plasmid.html

VECTORES VIRALES

FAGOS COMO VECTORES DE CLONACIN

Dr. Fred Blattner

Fagos Charon
Los fagos tienen una ventaja
natural sobre los plsmidos:
infectan clulas de manera
ms eficiente
Charon & Ro Styx

Vectores basados en el fago l

Aproximadamente un tercio de
su genoma no es esencial y
puede ser remplazado.
Las partculas fgicas solo se
forman si el DNA es de 40,000 a
53,000 bp
23 Kb

Empaquetamiento in vitro
Fago-DNA recombinante se
empaqueta dentro de una
partcula al aadir el extracto
crudo de clulas bacterianas
que contienen todas las
protenas necesarias para
ensamblar un fago completo

Csmidos
Es un plsmido que contiene un sitio cos y como
todos los vectores plasmdicos tienen:
un origen de replicacin
un marcador de seleccin
un sitio de clonacin.
Puede utilizarse para clonar fragmentos de hasta
45 kb

Empaquetamiento de DNA en la cabeza del fago

requiere una secuencia de 14 bp especfica
conocida como sitios cos
Situados en ambos extremos
Estn separado por 36-51 kb.

1. El csmido en forma lineal

1
2. El fragmento de inters y el csmido deben
ser cortados con la misma enzima de
restriccin .

3
3. La ligacin de las dos piezas del csmido
permite obtener un DNA con sitos cos en cada
uno de sus extremos.

4. Empaquetar in vitro.

5
5. Esta construccin puede ser
empaquetada en partculas l in vitro y ser
usada para infectar a E. coli. Se replica
como plsmido

Vectores provenientes de M13

Fago de cadena sencilla
Introdujeron en el fago M13 el
fragmento del gen de la bgalactosidasa.
No pueden mantener > 1kb
Puede ser utilizado para ensayos de
mutagnesis dirigida, secuenciacin

1. Un fragmento de DNA y el fago es

cortado con la misma enzima de
restriccin

1
2. Ligacin

2
3. Clula husped

3
4. Forma replicativa

Fagmidos

Producen DNA de cadena sencilla

Poseen caractersticas de plsmidos y fagos
La variedad ms utilizada pBS (Bluescript)
Poseen un sitio mltiple de clonacin (lacZ)
Tiene un origen de replicacin del fago F1,
el cual esta relacionado con M13 (DNA una
cadena).
Esta clase de vectores tienen MCS que esta
flanqueado por dos diferentes promotores
de RNApol.
pBS tiene el promotor T3 de un lado y del otro
T7, esto permite aislar el DNA fgico de doble
cadena y transcribirlo in vitro con alguna de las
dos polimerasas para producir transcritos de
RNA correspondientes a cada hebra.

Una vez que un gen ha sido clonado

en un vector, este puede ser o no
expresado

Si el gen estructural y el promotor son clonados en el mismo

segmento de DNA el gen podra ser expresado.
Por otro lado, si solo el gen fue clonado entonces la expresin
depender de que el promotor se encuentra dentro del
plsmido.

VECTORES DE EXPRESIN

Vectores de expresin

Vectores de clonacin con

seales necesarias para
regular la expresin de un
gen clonado

Elementos de un vector de
expresin

Secuencias promotor y operador

Sitio de unin a ribosomas
Sitio mltiple de clonacin
Secuencia terminacin de
transcripcin
Marcador de seleccin
Sitio ori
Gen codificante para represor
(unin a operador o promotor)

Tipos de promotores
Promotores fuertes: Altos niveles del
producto son requeridos
Promotores de regulacin estricta:
Utilizados en experimentos fisiolgicos
donde el efecto de la expresin gentica
son evaluados bajos varias condiciones.

Vectores de expresin con promotores

fuertes
Promotor trp (del opern del
triptofano)

Tiene la regin promotora/operadora

seguida por un sitio de unin a
ribosoma
Puede ser usado como un vector de
expresin directamente insertando el
gen de inters en el sitio ClaI
La regin control trp puede ser
eliminada por el corte con ClaI y
HindIII e insertarlo en otro vector

Promotores inducibles
Mantienen al gen clonado apagado mediante la
represin.
En algunos casos los genes clonados son eficientemente
expresados, el producto de inters constituye el 10% de
las protenas.
A estas concentraciones pueden matar o intervenir con
el crecimiento de la bacteria husped .

Opern lac
Un promotor (p), un operador (o), un lugar de unin
de la protena activadora de catabolito CAP (c),
Tres genes estructurales en un mRNA policistronico
(lacZ, lac Y, lac A) y un gen estructural que produce la
protena represora Lac (lacI)

Promotor lac
El promotor lac de E. coli es inducible

Es estimulado por el inductor

isopropiltiogalactosidasa (IPTG)

La represin causada por el represor lac es dbil, la

expresin de los genes clonados puede observarse,
incluso en ausencia del inductor.

Construccin de plsmido o
fagmido que lleve su propio
gen represor lacI como el pBS.
El exceso del represor produce
que el mantenga al gen clonado
apagado hasta el momento en
que el inductor (IPTG) se
adicione.

Promotor PL del fago l

Promotor controlado PL del fago l

Las clulas husped (cl857) poseen

un gen represor l que codifica para
la protena cl
La protena cl represora es sensible a
la temperatura

32C- reprime
42C - EXPRESA

Promotor del fago T7

Promotor fuerte
La transcripcin solo ocurrir si
la bacteria husped contiene
el gen de la RNA polimerasa T7
El gen de la RNA polimerasaT7
puede estar bajo el control de
un promotor lac modificado
en una clula que tambin
pueda llevar el represor lac

 El gen de la polimerasa T7 es fuertemente

reprimido hasta que el inductor est
presente
La transcripcin del gen de inters no puede
llevarse a cabo porque el promotor T7
requiere de propia polimerasa
Controla alternadamente la expresin de la
RNA polimerasa T7.
La induccin del promotor lac induce la
sntesis de la RNA polimerasa T7, la cual
alternadamente transcribe el gen clonado.
Esto provee una regulacin estricta y un alto
nivel de expresin

Protenas de fusin
La mayora de los vectores de expresin producen
protenas de fusin, esto puede a primera vista ser
una desventaja porque el producto natural del gen
insertado no lo hace.
Sin embargo aminocidos extras en la protena de
fusin puede ser de gran ayuda para purificar el
producto

pUC y pBS
Vectores que insertan DNA bajo el
control del promotor lac
Si un DNA es insertado en el mismo
marco de lectura que el gen lacZ se
producir una protena de fusin.
Esta tendr una secuencia parcial de
la protena b-galactosidasa en su
extremo N-terminal y la secuencia de
la otra protena del gen insertado en
el otro extremo.

VENTAJAS:
1. El sitio de insercin EcoRI inactiva el gen de la b-galactosidasa. Pueden seleccionarse
con medio con X-gal.
2. Se obtendr una protena fusionada con el producto y b-galactosidasa. Deteccin

Vectores (His)6
Secuencia corta rio arriba del sitio de
clonacin mltiple que codifica para
seis histidinas.
Se obtiene una protena de fusin con
6 histidinas en el extremo amino
terminal.

Tienen alta afinidad por metales

como el nquel, por lo que estas
protenas podran purificarse
utilizando cromatografa por afinidad
al nquel

Qu ocurre si las 6 histidinas

interfieren en con la actividad de la
protena?

Justo antes del sitio de clonacin esta una

regin que codifica para una regin de
aminocidos que reconoce la enzima
enterocinasa.
La enterocinasa puede ser usada para
romper la protena de fusin en dos partes:
la cola de poli-histidinas y la protena de
inters

La protena de inters puede ser removida con

una columna de nquel una vez ms para
separar los fragmentos de poli-histidina.

Cromosomas bacterianos artificiales

(BACs)

Plsmidos
100-300 kb.
Marcadores de seleccin como
resistencia .
Sitio ori que mantiene al
plsmido en 1-2 copias /clula.
Son introducidos por
electroporacin.
Usan clulas husped con
cambios en la pared celular que
permiten la captura de grandes
molculas de DNA

Vectores de expresin
eucariticos

Vectores lanzadera
(shuttle vectors)
Replicarse en ms de un tipo de
clula husped.
25-100 copias
Orgenes de replicacin
(bacterias y levaduras)
Secuencia centrmero
Sitio de clonacin mltiple
Marcadores de deteccin
Complementacin de mutaciones
auxotrficas (trpI, leu2, his3)

E. colilevaduras

Complementacin de mutaciones
auxotrficas

Cromosomas artificiales de levaduras

(YACs)
Contienen todos los elementos
necesarios para mantener un
cromosoma eucaritico en el
ncleo (tel)
Se pueden insertar hasta 100 Kb
Dos marcadores de seleccin
Sitios de restriccin

Vectores para vegetales

Plsmido Ti de Agrobacterium
Puede mediar la transferencia de DNA de
bacterias a clulas vegetales
Gnero Agrobacterium
A. tumefaciens produce tumores (Ti tumorinducing) en los que puede desarrollarse

Plsmido Ti
El plsmido Ti confiere la capacidad a ciertas bacterias
de introducir el DNA dentro de las clulas vegetales.

Dos secuencias repetidas 25 bp

Genes para hormonas que promueven el
crecimiento y divisin clulas de la
vegetales.
Genes para la sntesis de opina (fuente de
carbono).
Tiene un origen de replicacin

Solo el fragmento T-DNA es transferido a la

planta. Cualquier fragmento introducido en el
sitio T-DNA ser transferido a la clula vegetal

Vectores para
mamferos

Vectores vaccinia
Las protenas son procesadas y modificadas
correctamente.
Las protenas son transportadas apropiadamente y
localizadas en la clula husped.
La produccin uniforme de protena es alcanzada
dentro de una poblacin de clulas blanco.
Poseen un amplio rango de clulas husped lo que
permite transformar un gran nmero de lneas
celulares.

Un origen para replicacin en

bacterias
DNA no
esencial

Un marcador de resistencia

gen reportero

Promotor del
virus vaccinia

Sitios de
restriccin

Lneas de trabajo
Deteccin de beta-lactamasas en enterobacterias de
inters clnico
Tipificacin por PFGE de enterobacterias
Anlisis de variables en protenas vacunales de
Bordetella pertussis
Deteccin de resistencia y tipificacin de
Staphylococcus aureus
Deteccin oportuna de patgenos relacionados a
sepsis y bacteriemia a travs de EM-MALDITOF
Diagnstico de neumonas atpicas causadas por M.
pneumoniae y C. pneumoniae

Dra. Alejandra Aquino Andrade

Instituto Nacional de Pediatra
[email protected]