M Biotecnologia PDF
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UNAD
TABLA DE CONTENIDO
UNIDAD 1 : : ASPECTOS GENERALES DE BIOTECNOLOGA
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ACTIVIDADES
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Leccin 9 : Biorreactores
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Actividades:
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Leccin 3 : Cofactores
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Leccin 1: Mutagnesis
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Leccin 7 : Vinagre
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SECUNDARIO.
Leccin 1 : Produccin de acido ctrico
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Actividades:
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BIBLIOGRAFIA
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vivos o productos derivados de ellos para atender las necesidades del hombre tales como el vino y
el pan, entre otros; estos productos no pueden considerarse como un resultado de procesos
biotecnolgicos, puesto que en este estadio de desarrollo las fermentaciones son procesos
naturales que no involucran la manipulacin de los sistemas biolgicos para modificar o controlar
las propiedades del producto obtenido. Sin embargo, esta es una larga etapa de prembulo
caracterizada por las ideas vitalistas o animistas que desde un enfoque dialctico motivan el
desarrollo de mtodos experimentales que buscan predecir, explicar y transformar los fenmenos
biolgicos para obtencin de bienes y servicios, que finaliza con la consolidacin de la moderna
Biotecnologa en el siglo XX I.
Para comprender la historia de la Biotecnologa es preciso dividirla en cuatro fases.
Primera poca o era precientfica: corresponde a la poca anterior a Pasteur y sus comienzos
se confunden con los de la humanidad. En esta poca, se realizan prcticas empricas de
seleccin de plantas y animales y sus cruzas, y fermentaciones como un proceso para preservar y
enriquecer el contenido protenico de los alimentos. Este perodo se extiende hasta la segunda
mitad del siglo XIX y se caracteriza como la aplicacin artesanal de una experiencia resultante de
la prctica diaria. Era tecnologa sin ciencia subyacente en su acepcin moderna. Como ejemplos
concretos cabe mencionar las aplicaciones en :
Las civilizaciones Sumeria y Babilnica (6000 aos a.C.) ya conocan cmo elaborar
cerveza.
Los egipcios ya saban fabricar pan a partir del trigo hacia el 4000 a.C.
Antes de la escritura del libro del Gnesis, se disfrutaba del vino en el Cercano Oriente: recurdese
que, segn la Biblia, No "sufri" (o disfrut) accidentalmente los efectos de la fermentacin
espontnea del mosto de la uva (primera borrachera con vino)
Se podra afirmar que esta era pre-cientfica termina en el siglo XVIII cuando cobra cuerpo la idea
de que la materia viva puede ser estudiada como la materia inanimada, es decir, usando el mtodo
experimental, con lo que se inicia el lento declive de las ideas vitalistas (creencias errneas de que
"la vida depende de un principio vital irreducible a otras ramas de la ciencia"), que an daran sus
ltimos estertores casi al final del siglo XIX.
Segunda poca
El trabajo preliminar de los primeros microscopistas, como van Leeuwenhoek y Hooke (siglo XVII),
facilit un par de siglos ms tarde, la comprensin, de la verdadera importancia de las clulas
procariticas y eucariticas, en procesos relacionados con la fermentacin y en el origen de las
enfermedades infecciosas.
Un segundo factor contribuyente al nacimiento de la ciencia microbiolgica fue el establecimiento
de la relacin que une ciertas transformaciones qumicas que se dan en las infusiones con el
crecimiento de los grmenes en ellas existentes. Cagniard-Latour en 1836, y Schwann y Ktzing
en 1837 haban sugerido que las levaduras eran las causantes de la fermentacin alcohlica por la
que el azcar pasa a alcohol etlico y dixido de carbono, pero se encontraron con la crtica
adversa de los grandes qumicos de la poca (Berzelius, Wohler y Liebig). Liebig, hacia 1840,
haba realizado importantes confirmaciones a la "teora mineral" sobre la nutricin de las plantas,
enfrentndose a la "teora del humus" sostenida por Thaer, asestando un golpe a las ideas
vitalistas heredadas de Leibniz. Puesto que se consideraba a las levaduras como plantas
microscpicas, se supona que los procesos de fermentacin y putrefaccin se deban a
fenmenos qumicos de descomposicin y muerte encuadrables en el marco de la teora mineral
de la fisiologa vegetal. Su convencimiento de que toda actividad vital se poda explicar en trminos
de qumica y fsica retras por algn tiempo la adscripcin de estos fenmenos a clulas vivas.
Fue Pasteur (que, desde sus primeros estudios sobre las propiedades pticas de los cristales de
tartrato, vena suponiendo que estos compuestos tenan un orgen orgnico) quien de nuevo
intervino en el debate de forma decisiva. En 1857 demostr que los agentes de la fermentacin
lctica eran microorganismos, trabajando sobre un problema que haba surgido entre los
destiladores de Lille cuando en sus cubas la fermentacin alcohlica se vio sustituida por una
indeseable fermentacin lctica. Este fue el inicio de una larga serie de estudios que habra de
durar hasta 1876, en los que Pasteur identific distintos microorganismos responsables de
diferentes clases de procesos fermentativos. As, en 1860 adscribe inequvocamente la
fermentacin alcohlica a ciertos tipos de levaduras, y en 1866, en sus tudes sur le vin resume
sus hallazgos al respecto, inaugurando la Microbiologa Aplicada, una de las primeras derivaciones
prcticas no empricas emanadas de la Biologa. A finales del siglo XIX eminentes bilogos como
Hansen, en Copenhague, y Beijerink, en Delft, desarrollaban su actividad en industrias y
destileras.
microbiano) era siempre menor, al no poder realizarse la degradacin total de las correspondientes
sustancias.
Una profundizacin en los fenmenos de fermentacin lleg cuando en 1897 Buchner obtuvo, a
partir de levaduras, una preparacin enzimtica (zimasa) que era capaz de realizar la misma
transformacin de "fermentacin" que las clulas vivas. Este descubrimiento, que evocaba las
propuestas de Berzelius y Liebig, supuso en realidad la confluencia de los enfoques qumico y
biolgico: las fermentaciones eran procesos qumicos catalizados por enzimas presentes dentro de
clulas vivas, que podan ser estudiados extracelularmente. De esta forma, la Bioqumica, nacida
como una rama de la qumica fisiolgica, que se vena especializando en la enzimologa, encontr
una alianza fructfera y duradera con la joven Microbiologa, estableciendo las bases enzimticas y
metablicas de muchos procesos de fermentacin. De esta forma se desarrollaron procedimientos
industriales para producir enzimas (invertasa, proteasas, amilasas, etc.). y el siguiente
descubrimiento por parte de Buchner de la capacidad de las enzimas, extradas de las levaduras,
de convertir azcares en alcohol.
Tercera poca
En la historia de la biotecnologa se caracteriza por desarrollos en cierto sentido opuestos, ya que
por un lado la expansin vertiginosa de la industria petroqumica tiende a desplazar los procesos
biotecnolgicos de la fermentacin, pero por otro, el descubrimiento de la penicilina por Fleming
en 1928, sentara las bases para la produccin en gran escala de este antibitico con el fin de
satisfacer las demandas generadas en la II Guerra Mundial, en esa poca, la produccin de
penicilina es el resultado de avances importantes en tcnicas de esterilizacin a gran escala,
mejora de las instalaciones de fermentacin, comprensin y control de procesos de fermentacin
(incluyendo temperatura, pH, aireacin), entre otros. A partir de entonces se disearon estrategias
para mejorar genticamente las cepas microbianas industriales.
Desde esa poca, las tcnicas de ingeniera qumica, aliadas a la microbiologa y a la bioqumica,
permiten la produccin masiva de antibiticos, cidos orgnicos, esteroides, polisacridos y
vacunas.
Estos desarrollos dieron un gran impulso a la aplicacin de las tcnicas de fermentacin en la
industria alimenticia y al desarrollo industrial de productos como las levaduras, los cidos ctricos y
lcticos y, finalmente, al desarrollo de una industria qumica para la produccin de acetona,
"butanol" y glicerol, mediante el uso de bacterias. Las dcadas de los 60 y 70 vieron la mejora de
procesos de obtencin de pequeos metabolitos como nuclesidos, aminocidos y vitaminas.
Los procesos de fermentacin experimentaron mejoras con las tcnicas de inmovilizacin de
clulas y enzimas en soportes, y con la fermentacin continua para obtener protena de clulas
sencillas (biomasa microbiana). As mismo los polmeros microbianos como xantanos y dextranos
se obtuvieron industrialmente, con aplicaciones en el campo de la alimentacin (como aditivos). Y
se abri la posibilidad de cultivar cada cepa microbiana sin mezclas con otras: cultivos puros en
medios de cultivo de laboratorio
Cuarta poca.
Es la actual. Se inicia con el descubrimiento de la doble estructura axial del cido "deoxiribonucleico" (ADN) por Crick y Watson en 1953, seguido por los procesos que permiten la
inmovilizacin de las enzimas, los primeros experimentos de ingeniera gentica realizados por
Cohen y Boyer en 1973 y aplicacin en 1975 de la tcnica del "hibridoma" para la produccin de
anticuerpos "monoclonales", gracias a los trabajos de Milstein y Kohler.(1983). Estos importantes
descubrimientos han dado lugar a numerosos trabajos de mejoramiento gentico tanto en plantas
como animales; el cultivo de tejidos vegetales y animales a partir de clulas madre, y el importante
acontecimiento de la aparicin de la oveja Dolli en el contexto cientfico, que dio un vuelco total al
concepto de Biotecnologa.
Revisin de conceptos
Parte
de
lo
que
hemos
aprendido
sobre
el
manejo
de
agrupan en tres
categoras bsicas:
Aunque estos tres grupos se complementan entre s, existe una diferencia fundamental entre los
dos primeros y el tercero. Los primeros se basan en el conocimiento de las caractersticas y
comportamiento de los microorganismos y en el uso deliberado de estas caractersticas (de cada
organismo en particular), para el logro de objetivos especficos como la obtencin de nuevos
productos o procesos. La enorme potencialidad del ltimo grupo se deriva de la capacidad de
manipular, las caractersticas estructurales y funcionales de los organismos y de aplicacin prctica
de esta capacidad para superar ciertos lmites naturales en el desarrollo de nuevos productos o
procesos.
A diferencia de la primera clasificacin, que seala las tcnicas propiamente tales, la segunda se
refiere tambin a las actividades econmicas en las que se hace uso de dichas tecnologas. La
nueva biotecnologa crea nuevos procesos y nuevos productos en diversas reas de la economa.
Como estos procesos se basan en los mismos principios, ya sea que se apliquen en un sector
econmico o en otro, ello introduce cierto grado de flexibilidad, ya que permite la movilidad entre
diferentes sectores. Por ejemplo, los procesos de fermentacin pueden aplicarse para la
produccin, en gran escala, de alcohol o de antibiticos como la penicilina, o en escalas menores
para la produccin de aminocidos en la industria farmacutica. Esto facilita la, movilidad de
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factores productivos y tiene impacto sobre la calificacin de la mano de obra, la cual, aun cuando
deber adaptarse a este nuevo perfil tecnolgico (tanto en trminos, cuantitativos como
cualitativos) posiblemente logre al mismo tiempo una mayor facilidad de empleo.
Leccin 4: Tipos de Biotecnologa: Dependiendo del campo de aplicacin del servicio o producto
obtenido la biotecnologa se ha clasificado en:
Biotecnologa Microbiana: La biotecnologa microbiana o como se llamaba anteriormente
microbiologa industrial se refiere a los procesos donde participan los microorganismos para la
obtencin de productos o metabolitos de inters humano.
La microbiologa industrial comenz con los procesos de fermentacin alcohlica por ej. La
fermentacin del vino y de la cerveza. Ms tarde se desarrollaron los procesos microbianos para la
produccin de agentes farmacuticos como los antibiticos, la produccin de aditivos alimentarios
como los amino cidos, para la produccin de enzimas y sustancias qumicas industriales como el
butanol, el acido ctrico, entre otros.
En la actualidad estamos en una nueva era de la tecnologa microbiana con el advenimiento de la
tecnologa de genes. La tecnologa gentica permite que un microorganismo procesado
genticamente fabrique sustancias que normalmente no sera capaz de producir, es as como
utilizando ingeniera gentica se ha podido producir insulina por una bacteria introduciendo el gen
de la insulina humana en la bacteria Escherichia coli.
Podemos dividir a la biotecnologa microbiana en dos fases distintas:
1) La tecnologa microbiana tradicional, que implica la fabricacin a gran escala de productos que
los microorganismo son capaces de fabricar normalmente. En este caso la tarea del microbilogo
consiste en modificando el organismo o el proceso para aumentar el rendimiento del producto
deseado.
2) La tecnologa microbiana con organismos alterados mediante procesos de ingeniera, es decir
microorganismos en los cuales se ha insertado genes extraos. En esta nueva tecnologa el
microbilogo industrial trabaja estrechamente asociado con el ingeniero gentico en el desarrollo
de un organismo adecuado que no solo produzca el producto de inters, sino que tambin pueda
ser cultivado en la escala necesaria para su explotacin comercial. (Brook y Scaligan 2002)
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y control de malezas ahora pueden ser tratados genticamente en lugar del uso de qumicos. Una
planta modificada por ingeniera gentica, que contiene ADN de una fuente externa, es un
organismo transgnico. Un ejemplo de planta transgnica es el tomate que permite mantenerse
durante mas tiempo en los almacenes evitando que se reblandezcan antes de ser transportados
Algunos pases desarrollados como Estados Unidos y a sus multinacionales, defienden el uso de
la biotecnologa y pone de relieve la importancia de su industria, que crea nuevos puestos de
trabajo y fomenta la innovacin tecnolgica y podra acabar con el hambre del mundo. En Europa,
los casos de Soja y Maz transgnicos resultan de especial relevancia. La soja se utiliza en un 40 a
60% de los alimentos procesados: aceite, margarina, alimentos dietticos e infantiles, cerveza, etc.
Espaa importa de EEUU 15 millones de toneladas, el cuarto pas importador detrs de Japn,
Taiwan y Holanda.
La comercializacin del maz transgnico est autorizada en EEUU, Canad, Japn y tambin en
la Unin Europea desde Enero de 1997.
China planea plantar tomates, arroz, pimientos y patatas por lo menos en la mitad de todas sus
tierras de labor (500.000 kilmetros cuadrados) en el plazo de cinco aos. Sus investigadores
analizaron el efecto de los pimientos y los tomates transgnicos en ratas de laboratorio,
comparando el peso y el estado de los mismos con los de otros no alimentados, y no observaron
diferencias significativas.
Para profundizar en este tema haga clic aqu: La biotecnologa en la alimentacin y la agricultura
Biotecnologa animal: Esta ha experimentado un gran desarrollo en las ltimas dcadas. Las
aplicaciones iniciales se dirigieron principalmente a sistemas diagnsticos, nuevas vacunas y
drogas, fertilizacin de embriones in vitro, uso de hormonas de crecimiento, entre otros
procedimientos. Los animales transgnicos como el "ratn oncognico" han sido muy tiles en
trabajos de laboratorio para estudios de enfermedades humanas.
Existen tres reas diferentes en las cuales la biotecnologa puede influir sobre la produccin
animal:
-El uso de tecnologas reproductivas
-Nuevas vacunas y
-cultivos celulares que producen hormonas.
En animales tenemos ejemplos de modelos desarrollados para evaluar enfermedades genticas
humanas, el uso de animales para la produccin de drogas y como fuente donante de clulas y
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rganos, por ejemplo el uso de animales para la produccin de protenas sanguneas humanas o
anticuerpos.
Para las enfermedades animales, la biotecnologa provee de numerosas oportunidades para
combatirlas, y estn siendo desarrolladas vacunas contra muchas enfermedades bovinas y
porcinas, que en los ltimos tiempos han hecho mella en estos animales.
Biotecnologa Humana Las tcnicas del ADN estn siendo utilizadas para determinar relaciones
familiares en litigios de paternidad, para confrontar donantes de rganos con receptores en
programas de trasplante, unir sospechosos con la evidencia de ADN en la escena del crimen
(biotecnologa forense).
El desarrollo de tcnicas para el diagnstico de enfermedades infecciosas o de desordenes
genticos es una de las aplicaciones de mayor impacto de la tecnologa de ADN. Al utilizar las
tcnicas de secuenciacin de ADN los cientficos pueden diagnosticar infecciones vricas,
bacterianas o mapear la localizacin especfica de los genes a lo largo de la molcula de ADN en
las clulas.
El primer tratamiento exitoso en terapia gnica fue en 1990, cuando se trat una enfermedad del
sistema inmune de nios llamada "Deficiencia de ADA". Clulas sanguneas con los genes
correctos de ADA fueron inyectadas al cuerpo del paciente donde produjeron suficientes clulas
normales que permitieron mejorar el sistema inmune.
Hoy, la terapia gnica esta tratando enfermedades tales como tumores cerebrales malignos,
fibrosis qustica y HIV. Con esta tcnica se pretende tambin reparar rganos, como por ejemplo
un hgado cirrtico a partir de las pocas clulas sanas que le quedan, un par de ventrculos nuevos
para reemplazar los efectos devastadores de un infarto, la regeneracin de una mano amputada o
disponer de una fuente inagotable de neuronas para corregir los efectos de enfermedades tan
graves como el Alzheimer o el mal de Parkinson.
a nivel
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En el sector del medio ambiente se han iniciado algunos trabajos a nivel del tratamiento de aguas
residuales industriales como lodos activados y biofiltros, mtodos de descontaminacin de los
derramamientos de petrleo mediante el uso de microorganismos nativos o transformados
genticamente. Algunos trabajos de investigacin cientfica se estn realizando sobre
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biodigestores de alta calidad. Sin embargo, el desarrollo nacional en este sector es todava
discreto.
La diversidad biolgica de Colombia es una ventaja comparativa que al ser usada sosteniblemente
puede apoyar el desarrollo del sector productivo. As mismo constituye una respuesta a problemas
de seguridad alimentaria, sostenibilidad de aguas, suelos y aire, as como un elemento de
negociacin poltica internacional y fortalecimiento de la soberana. Por estas razones, su
conocimiento, conservacin y uso sostenible es prioritario. Sin embargo, como se observa con el
estado de la biotecnologa en Colombia, los avances en estos campos son muy pequeos
comparativamente con otros pases de Amrica Latina como Costa Rica, Brasil y otros del mundo .
Con relacin a los bio-recursos, Colombia es un pas privilegiado ya que se encuentra entre uno de
los pases de mayor diversidad biolgica del planeta por rea . Sin embargo, para aprovechar ese
potencial, el pas debe desarrollar la capacidad cientfica y tcnica que le permita explorar,
conocer, estudiar, investigar, valorar, conservar y desarrollar esos biorrecursos como un patrimonio
altamente productivo y no simplemente como una diversidad ecolgica, social y econmicamente
improductiva.
A nivel mundial el inters por la biotecnologa es indudable, como se ve a travs del, frecuente
abordaje de tales temas en los peridicos, libros y medios de comunicacin.
Algunos descubrimientos tiles sern una consecuencia directa del uso de las tcnicas de
ingeniera gentica que logren transferir determinados genes (a veces incluso genes humanos) a
un determinado microorganismo apropiado, para hacer el producto que es precisamente requerido
en el mercado. Determinadas protenas humanas y algunos enzimas requeridos en Medicina se
conseguirn de esta forma, en el futuro. Otros muchos beneficios, sern el resultado de la
fabricacin mediante tcnicas de fermentacin, de anticuerpos especficos para, fines analticos y
teraputicos. Estos anticuerpos monoclonales se producirn mediante el uso de microorganismos
en grandes fermentadores, como por ejemplo la produccin de antibiticos como la penicilina.
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sociedad, atractivos para la industria por motivos comerciales y en algunos casos recibirn el
apoyo de los respectivos gobiernos.
Resulta claro que siendo la biotecnologa un sistema de diversas innovaciones cientficotecnolgicas interrelacionadas, no todas ellas evolucionan al mismo ritmo. Las condiciones de
mercado, las expectativas de beneficios, aspectos organizativos y de gestin, entre otros,
favorecen la rpida puesta en marcha y difusin de algunas de estas tecnologas, relegando a
otras. La literatura sobre la innovacin tecnolgica acostumbra distinguir entre aquellas
innovaciones que surgen como respuesta a una situacin de mercado, y a expectativas de
beneficios econmicos, de aqullas que se originan en el rea de I y D como resultado de un
proceso continuo y acumulativo de desarrollo cientfico-tecnolgico. En el primer caso se habla de
"demand or market-pull" y en el segundo, de "technological-push". Ha sido frecuente, en los ltimos
tiempos, sealar el lser y la biotecnologa como ejemplos del segundo tipo de innovacin. Es
decir, descubrimientos cientficos a los que se arriba sin una aplicacin especfica predeterminada
en mente, pero que luego encuentran una gama considerable de aplicaciones prcticas.
Sin embargo, pareciera ms correcto considerar ambos actores, el inherente proceso cientficotecnolgico y aqul que corresponde a incentivos eonmicos, como complementarios. As, en el
caso de la biotecnologa, aun cuando sta nace e el mbito de la I y D, de las muchas aplicaciones
posibles, las que se desarrollan primero son aquellas que ofrecen expectativas de importantes
beneficios econmicos en un plazo ms menos breve.
En la agricultura, la biotecnologa se orienta a la superacin de los factores limitantes de la
reduccin agrcola a travs de la obtencin de variedades de plantas tolerantes a condiciones
ambientales negativas (sequas, suelos cidos), resistentes a enfermedades y pestes, que
permitan aumentar el proceso fotosinttico, la fijacin de nitrgeno o la captacin de elementos
nutritivos. Tambin se apunta al logro de plantas ms productivas y/ o ms nutritivas, mediante la
mejora de su contenido protenico o aminocido.
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La magnitud del mercado potencial agrcola para la biotecnologa es, en gran medida materia de
especulacin debido precisamente a la falta de un conocimiento detallado de muchas de estas
condiciones locales. En este campo, la biotecnologa est orientada a la utilizacin en gran escala
de "biomasa" para la produccin de materias primas orgnicas, que actualmente se obtienen
mediante procesos qumicos convencionales. Las ventajas son que la "biomasa" es un recurso
altamente subutilizado y relativamente barato., ya que en gran parte esta constitudo por residuos y
desechos de plantaciones forestales y de cultivos en gran escala. Es adems un recurso
renovable. Las principales fuentes potencialmente disponibles para la produccin tanto de etanol
como de otros productos qumicos a granel son (aparte de las melazas de la caa) cultivos como la
yuca, el sorgo, las papas y el maz; los sueros de la industria de la leche; los residuos de las
plantaciones de caf y, en general, todo tipo de residuo celuloso.
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agentes fsicos (rayos UV, rayos X) o qumicos, con ulterior bsqueda (seleccin o rastreo screening) de alguna variante de inters (algo tedioso y frecuentemente infructuoso), etc.
Debimos esperar a la dcada de los 70 para que surja un conjunto de tcnicas de laboratorio
revolucionarias que por primera vez permiten "tocar" de modo racional el sancta sanctorum de la
vida. Son tcnicas y herramientas con las que se puede modificar el ADN de acuerdo a diseos
previos y objetivos concretos (de ah el nombre popular de Ingeniera Gentica).
La Ingeniera Gentica (I.G.), mejor llamada tecnologa del ADN recombinante in vitro, se
caracteriza por su capacidad de cortar y empalmar genes o fragmentos de ADN de organismos
distintos, creando nuevas combinaciones no existentes en la Naturaleza, combinaciones que
ponemos a trabajar en el interior de una variedad de organismos hospederos, para nuestro
provecho.
Teniendo en cuenta lo anterior se puede inferir que las tendencias cientficas mundiales a todos los
niveles y clasificacin de la Biotecnologa, se han concentrado en seis aspectos:
-
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A todo esto tenemos que aadir que un factor importantsimo en el desarrollo de la biotecnologa
es la evaluacin de la seguridad del producto, sometida a controles rigurosos segn normativas
nacionales e internacionales. De hecho este factor es tan importante que se puede convertir en
limitante, de modo que las regulaciones estrictas desincentivan ciertos desarrollos biotecnolgicos.
Por todo ello, es importante que tales regulaciones sean realistas, y no exijan ms de lo que la
evidencia cientfica sugiere, manteniendo en todo momento la preservacin de la salud y el medio
ambiente. A su vez, las regulaciones reflejan la percepcin pblica de los riesgos y promesas de la
biotecnologa. Por ejemplo, hoy en Europa la percepcin pblica ha logrado prcticamente una
parada en las plantas transgnicas, a pesar de los informes cientficos que dicen que en la mayor
parte de los casos, sus riesgos son similares a las plantas convencionales. La creacin o
elaboracin de este tipo de alimentos depende del nivel de desarrollo del pas, de los intereses
polticos del mismo y del grado de presin que ejerzan las grandes industrias privadas del sector.
Hay un gran debate en torno a la conveniencia o no de este tipo de organismos.
Habr que llegar a un dilogo racional entre los diversos actores (cientficos, empresas,
consumidores, ecologistas, entre otros) para asegurar el correcto empleo de estas tecnologas, que
por un lado no impida aplicaciones benficas sin riesgos, y por otro regule adecuadamente
aquellos mbitos donde las dudas razonables hagan recomendables ms restricciones. El ideal
sera permitir todo aquello que aporte beneficios sin aumentar riesgos, pero no caer en el error de
prohibir usos positivos solo bajo vagas ideas de riesgos no sustanciados, en buena parte
imaginaciones y tergiversasiones de grupos de presin que pueden esconder agendas polticas
ocultas.
ACTIVIDADES
Lectura 1. Aplicando el mtodo de Lectura Auto regulada IPLER ;
Realice un ensayo de la
siguiente lectura.
Los beneficios de la biotecnologa alimentaria
La biotecnologa ya nos est ayudando de muchas maneras:
Proteccin del medio ambiente. Los cientficos lograron que algunos alimentos, como la papaya y
la papa, sean ms resistentes a las plagas. Estos cultivos necesitan ahora menos productos
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qumicos para estar protegidos de insectos o virus dainos, lo que es mucho mejor para el agua y
la vida silvestre. Otros cultivos estn protegidos de los herbicidas que se usan para controlar a las
malezas. El mejor control de las malezas permite que los agricultores conserven el suelo ya que no
tienen que arar la tierra con tanta frecuencia.
Mayores rendimientos. Los agricultores tambin usan la biotecnologa para ayudar a las plantas a
sobrevivir. Por ejemplo, las nuevas variedades de maz y algodn rechazan a los insectos dainos,
y la soya mejorada puede tolerar los herbicidas. Los agricultores pueden esperar mayores
rendimientos de la cosecha en estas plantas ms resistentes.
Alimentos con mejor sabor y ms frescos. Pimientos ms dulces y tomates que maduran ms
despacio son slo dos ejemplos de cmo la biotecnologa puede producir alimentos ms frescos y
de mejor sabor.
El futuro de la biotecnologa
En el futuro, la biotecnologa podr ayudarnos a:
Cultivar ms alimentos en menor superficie. En la actualidad hay 6,000 millones de personas
viviendo en la Tierra. Para el ao 2050, seremos 9,000 millones. Al usar la biotecnologa, los
agricultores podrn producir mayores cosechas en la misma superficie que utilizan en la actualidad.
Si podemos obtener los alimentos que necesitamos de estos cultivos, ya no tendremos que
destinar ms superficie al cultivo. Los pases en desarrollo sern los que ms se beneficien con
esta tecnologa moderna ya que en ellos se producir el mayor crecimiento de la poblacin.
Mantener alimentos que sean seguros para comer. Los cientficos podrn detectar con mayor
precisin cules son los virus y bacterias dainas que pueden hallarse en los alimentos. Por lo
tanto, correremos menos riesgos de contraer enfermedades transmitidas por los alimentos.
Obtener alimentos ms saludables. Mejorar algunos alimentos por medio de la biotecnologa nos
podr ayudar a disminuir nuestro riesgo de contraer enfermedades crnicas como el cncer y
afecciones cardacas. Por ejemplo:
o Algunas frutas y verduras contendrn ms antioxidantes, Vitamina C y Vitamina E.
o Los aceites para cocinar se obtendrn de plantas que contendrn menos grasas saturadas.
o Los cacahuates podrn contener menos cantidad de las protenas que causan alergias.
Mantener seguros los alimentos para los animales. Algunos tipos de hongos que se hallan en las
sustancias que libera el maz pueden daar a los animales que lo consumen. Estas sustancias ya
estn reguladas en los Estados Unidos y la biotecnologa representa otra herramienta que ayudar
a reducir la cantidad de estas sustancias presentes en el maz.
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programas universitarios que se dedican a estos temas.En los sitios de Internet que se mencionan
a continuacin hallar la informacin que necesita:
Servicio de Inspeccin de Salud de Animales y Plantas, Servicios Regulatorios de Biotecnologa
del Departamento de Agricultura de los Estados Unidoshttp://www.aphis.usda.gov/brs/
Centro de Seguridad de los Alimentos y Nutricin Aplicada de la FDAhttp://www.cfsan.fda.gov/
Agencia de proteccin ambiental (EPA) http://www.epa.gov
La Asociacin Diettica de los Estados Unidos http://www.eatright.org
Consejo de Ciencia y Tecnologa Agrcola http://www.cast-science.org
Instituto de Tecnlogos de Alimentos http://www.ift.org
Sociedad de Toxicologa http://www.toxicology.org/
IFIC Foundation http://ific.org/food/biotechnology
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Las sustancias que son tomadas de medio externo las cuales son utilizadas con fines energticos
o plsticos se denominan como nutrientes, en cualquier caso, los nutrientes deben suministrase en
los diferentes medios de cultivo.
Los nutrientes pueden ser divididos en dos clases: (1) macronutrientes, los que son requeridos en
grandes cantidades; (2) Micronutrientes, y (3) factores de crecimiento que lo son solamente en
pequeas cantidades. Empezaremos por los macronutrientes mayoritarios: carbono y nitrgeno.
1.1 Macronutrientes:
Prcticamente la totalidad de la masa celular est formada por sustancias con cuatro tipos de
tomos: Carbono, oxgeno, hidrgeno y nitrgeno. Estos cuatro elementos constituyen el esqueleto
de las macromolculas as como las molculas orgnicas pequeas.
La mayora de los procariotas requieren un compuesto orgnico de algn tipo como fuente de
carbono. Estudios nutricionales han demostrado que muchas bacterias pueden asimilar varios
compuestos de carbono orgnico y utilizarlos para fabricar material celular. Un incontable nmero
de compuestos tales como animocidos, cidos grasos, y compuestos aromticos pueden ser
usados por una bacteria u otra. En peso seco, una clula tpica consta de aproximadamente 50%
de carbono y a su vez este es el elemento mayoritario de las macromolculas.
Despus del carbono, el siguiente elemento ms abundante en la clula es el nitrgeno. Una
bacteria tpica contiene aproximadamente el 12% de nitrgeno (peso seco) y a su vez el nitrgeno
es un componente mayoritario de protenas, cidos nucleicos y otros constituyentes celulares. El
nitrgeno se encuentra en la naturaleza tanto en forma orgnica como inorgnica. Sin embargo, la
globalidad del nitrgeno utilizable est en forma inorgnica, bien como amonaco (NH3), nitrato
-
(NH3 )
23
N2. La mayora de las bacterias pueden utilizar amonaco y muchas adems nitrato. El nitrgeno
molecular (gas), sin embargo, puede ser fuente de nitrgeno para un reducido grupo de bacterias
(bacterias fijadoras de nitrgeno).
1.2 Otros macronutrientes: P,S,K,Mg,Ca,Na,Fe
El fsforo acontece en la naturaleza en forma de fosfatos orgnicos o inorgnicos y es requerido
por la clula para la sntesis de cidos nucleicos y fosfolpidos. El azufre es fundamental por ser un
elemento estructural en los aminocidos cisteina y metionina y porque est presente en vitaminas
tales como la tiamina, biotina, cido lipoico as como coenzima A. El potasio es necesario en todos
los organismos. Una gran diversidad de enzimas, incluyendo varias implicadas en la sntesis de
protenas, lo requiere especficamente. El magnesio estabiliza los ribosomas, las membranas
celulares, los cidos nucleicos y se requiere tambin para la actividad de muchas enzimas. El
calcio (que no es nutriente esencial para el crecimiento de muchos microorganismos ),ayuda a
estabilizar la pared celular bacteriana y juega un papel fundamental en la termorresistencia de la
endospora bacteriana. El sodio es requerido por algunos, pero no todos, microorganismos y
cuando lo es, es debido a la naturaleza qumica de su hbitat. El hierro es requerido por las
clulas en mayores cantidades que otros metales traza y por ellos debe ser considerado como un
macronutriente. El hierro juega un papel fundamental en la respiracin celular, siendo un
componente clave de los citocromos, y de las protenas que contiene hierro y azufre implicadas en
el transporte de electrones. Debido a que la mayor parte de las sales inorgnicas son altamente
insolubles, muchos microorganismos producen agentes que unen el hierro de una manera muy
especfica, denominados siderforos, que solubilizan las sales de hierro trasportndolo al interior
celular.
1.3 Micronutrientes (elementos traza)
Aunque los micronutrientes son requeridos en muy pequeas cantidades son, sin embargo, tan
importantes como los macronutrientes para la funcin celular. Los micronutrientes son metales,
muchos de los cuales forman parte de enzimas que son los catalizadores celulares. Entre los
micronutrientes ms importantes de sistemas vivos, que son necesarios para el funcionamiento de
enzimas estn: Cromo, Cobalto, Cobre, Manganeso, Molibdeno, Nquel, Selenio, Tungsteno,
Vanadio, Zinc, Hierro.
1.4 Factores de crecimiento
Estos son compuestos orgnicos que, como los micronutrientes, son requeridos en muy pequeas
cantidades y slo por algunas clulas. Los factores de crecimiento incluyen vitaminas,
aminocidos, purinas y pirimidinas. Aunque la mayora de los microorganismos son capaces de
sintetizar estos compuestos, otros microorganismos
24
El metabolismo puede dividirse, para su mejor estudio, en tres aspectos diferentes pero
ntimamente ligados (figura 1) : el catabolismo (Metabolismos energtico) que es la suma de
reacciones exergnicas que permiten liberar la energa contenida en los nutrientes o estratos y ser
acumulada en forma de ATP u otros compuestos, el anfibolismo o metabolismo intermediario, que
es el conjunto de reacciones en que los productos de hidrlisis del catabolismo y algunos
nutrientes son transformados en cidos orgnicos , steres fosfricos y otros compuestos como
aminocidos; el anabolismo o metabolismo biosinttico que es la parte del metabolismo implicado
en la sntesis de macromolculas-cidos nucleicos, protenas sustancias de reserva y otros, todas
Figura 1: Diferentes fases del metabolismo microbiano:
25
de
utilizar
compuestos
inorgnicos
como fuente
de
energa
se
denominan
quimiolitotrofos
Los mecanismo por los que se sintetiza ATP como resultado de reacciones de oxidacin
reduccin que implican compuestos orgnicos, pueden contemplarse en dos grandes grupos: (1)
Fermentacin, en que los procesos de oxido reduccin ocurren en ausencia de aceptores
terminales de electrones aadidos; y (2) respiracin, en que el oxgeno molecular u otros
oxidantes sirven como aceptores terminales de electrones.
26
Un ejemplo de fermentacin es el catabolismo de la glucosa por una bacteria del cido lctico:
Glucosa
( CcH12O6
2 lactatos +2 H+
2C3H4O3 - + 2CO2)
Ntese que sta es una reaccin balanceada y que los productos, lactato ms protones, tienen la
misma proporcin de tomos de hidrgeno y oxgeno que la glucosa. Esta reaccin puede
analizarse desde tres puntos de vista: Termodinmicamente, por la energa de enlace y por el
metabolismo intermediario.
Desde el punto de vista termodinmico, las fermentaciones se caracterizan por ser una suma de
reacciones, al final de las cuales los productos poseen un contenido energtico menor que el
inicial.
27
Tipo de fermentacin
Producto(s)
Fermentacin lctica
Lactato
Fermentacin alcohlica
etanol, CO2
Fermentacin cida-mixta
Fermentacin butilngliclica
butilnglicol, CO2
Fermentacin aceto-butrica
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La mayor parte de peso seco de la bacteria est constituidos por macromolculas de cuatro tipos:
cidos nucleicos, protenas, polisacridos y lpidos complejos. Estas macromolculas son
polmeros formados por unidades estructurales debajo peso molecular que tiene que formarse
como precursores. Ya sabemos que las subunidades estructurales de los cidos nucleicos son 8
tipos distinto de nucletidos, las de las protenas 20 aminocidos diferentes, las de los
polisacridos, unos 15 azucares diferentes, y que para la formacin de los lpidos se requieren
cidos grasos, polialcoholes, azcares, aminas y aminocios que constituyen tambin unos 20
tipos diferentes de molculas orgnicas. Adems se requieren sintetizar unas 20 coenzimas y
transportadores de electrones.
29
30
31
poblacin microbiana y establecer relaciones con los sustratos del medio de cultivo o los
productos de biosntesis.
En los organismos unicelulares la clula se divide por fisin binaria dando lugar a dos clulas hijas,
cada una de las cuales se divide nuevamente produciendo dos clulas nuevas, por lo que en cada
periodo e divisin la poblacin se duplica. Esta multiplicacin representa una progresin
geomtrica en la cual hay una relacin directa entre el nmero de clulas iniciales y la cantidad de
clulas en otro tiempo determinado. La expresin matemptica que representa esta relacin es:
n
N = No2 Donde:
N= numero final de clulas,
No = nmero inicial de clulas
N = nmero de generaciones
Para explicar la anterior ecuacin en trminos de n se aplica una transformacin logartmica cuyo
resultado es:
de donde:
x = nmero de clulas o algn componente (protena)
constante de velocidad de crecimiento instantneo
Integrando se obtiene:
ln X1 = ln Xo + t
tomando el antilogaritmo a cada lado se obtiene
X1 = Xoe
32
entonces:
= 0.693/td
Una aplicacin especialmente importante de la constante de velocidad instantnea, es el
quimiostato, el cual es un dispositivo de cultivo continuo donde el Volumen es constante y el
nutriente entra con la misma velocidad con la que sale. En este equipo el tamao de la poblacin y
la velocidad de crecimiento pueden mantenerse constantes, puesto que la velocidad de
crecimiento es una funcin de la concentracin de nutrientes. Monod propueso la siguiente
ecuacin para representar esta relacin :
mx
se puede calcular
1) Fermentacin discontinua Una fermentacin discontinua (en batch) puede ser considerada
como un sistema cerrado. A tiempo cero t = 0, la solucin esterilizada de nutrientes se inocula con
microorganismos y se permite que se lleve a cabo la incubacin en condiciones ptimas de
fermentacin. A lo largo de toda la fermentacin no se aade nada, excepto oxgeno (en forma de
aire), un agente antiespumante y cidos o bases para controlar el pH. La composicin del medio de
cultivo, la concentracin de la biomasa y la concentracin de metabolitos cambia generalmente en
33
forma continua como resultado del metabolismo de las clulas. Despus de la inoculacin de una
solucin nutritiva estril con microorganismos y su cultivo en condiciones fisiolgicas se observan
cuatro fases tpicas de crecimiento: fase de latencia, fase logartmica, fase estacionaria y fase de
muerte
2) Proceso de fermentacin alimentada (fed-batch)
En los procesos convencionales discontinuos que acabamos de describir, todos los substratos se
aaden al principio de la fermentacin. Una mejora del proceso cerrado discontinuo es la
fermentacin alimentada, que se utiliza en la produccin de substancias como la penicilina. En los
procesos alimentados los substratos se aaden escalonadamente a medida que progresa la
fermentacin. La formacin de muchos metabolitos secundarios est sometida a represin
catablica por altas concentraciones de glucosa, por otros carbohidratos, o por compuestos
nitrogenados. Por esta razn en el mtodo alimentado los elementos crticos de la solucin de
nutrientes se aaden en pequeas concentraciones al principio de la fermentacin y continan
aadindose a pequeas dosis durante la fase de produccin.
Puesto que generalmente no es posible medir la concentracin del substrato directa y continuamente durante la fermentacin a fin de controlar el proceso de alimentacin, tienen que ser
medidos parmetros indirectos que estn correlacionados con el metabolismo del substrato crtico.
Por ejemplo, en la produccin de cidos orgnicos, el valor del pH puede ser utilizado para
determinar la velocidad de alimentacin de la glucosa. En fermentaciones con valores osmticos
crticos la alimentacin puede ser regulada controlando el valor de pO2 o el contenido en CO2, en
los gases que se liberan.
3) Fermentacin continua.
En la fermentacin continua se establece un sistema abierto. La solucin nutritiva estril se aade
continuamente al biorreactor y una cantidad equivalente de solucin utilizada de los nutrientes, con
los microorganismos, se saca simultneamente del sistema. Entre las distintas clases de fermentaciones continuas pueden ser distinguidos dos tipos bsicos:
a. Biorreactor mezclado homogneamente. Este es utilizado como un quimiostato o como
un turbidostato. En el quimiostato en estado de equilibrio, el crecimiento de las clulas se
controla ajustando la concentracin de un substrato (Fig. 3.A). cualquier substrato que se
requiera (carbohidrato, compuesto nitrogenado, sales, a,) puede ser utilizado como
substrato limitante. En el turbidostato el crecimiento de las clulas se mantiene constante
utilizando la turbidez para controlar la concentracin de biomasa y la velocidad de alimentacin de la solucin de nutrientes se ajusta de forma apropiada (Fig. 3).
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En un proceso continuo en condiciones de equilibrio la prdida de clulas debida al fluido que sale
debe ser balanceada por el crecimiento del microorganismo
La velocidad de flujo D se define corno la velocidad de flujo volumtrico (que entra y sale) a travs
del volumen del fermentador.
Utilizando la ecuacin de Monod que describe la dependencia de la velocidad especfica de
crecimiento sobre la concentracin de substrato limitante pueden ser determinados en el
biorreactor la constante de rendimiento biomasa/substrato (Y X/S), la densidad de las clulas (X) y la
concentracin de substrato (S).
35
A velocidad ms baja de flujo el substrato es casi completamente agotado por las clulas (S O).
La concentracin de clulas es entonces X = So/Y. Si D aumenta, X desciende lentamente, al
principio en forma lineal y luego a D = m cae bruscamente hasta O. S aumenta lentamente al
principio y se aproxima a So a D = m. Cuando X es cero en la ecuacin que explica el sustrato (S),
se alcanza el punto de lavado Dm.
36
37
se convierte en la fase continua (aceite y agua no son miscibles). Por encima de esta
concentracin la productividad decrece.
Figura 5. Productividad total y productividad mxima
Cuando se utiliza la relacin de la ecuacin sobre sustrato (S) resulta la siguiente ecuacin
38
39
El valor P1 es la concentracin de producto y la velocidad especfica de produccin qp es equivalente a la velocidad especfica de crecimiento en la ecuacin 1. Sin embargo, en los procesos de
tipos II y IlI no hay correlacin directa entre y qp
Leccin 8: Coeficientes de rendimiento
Hoy los coeficientes generales de rendimiento se utilizan para caracterizar los procesos de fermentacin, es decir las relaciones de las clulas producidas a los substratos individuales
convertidos o a la energa liberada o energa consumida. Sin embargo, los coeficientes de
rendimiento no son constantes, ya que dependen de parmetros biolgicos (X, ) y de parmetros
qumicos (pO2 relacin C/N, y contenido en fsforo del medio.
Los coeficientes de rendimiento han sido clasificados en tres grupos. El primer grupo de coeficientes (Ys Y02 Ykcal) da informacin acerca de los procesos tcnicos y por tanto acerca de la
economa. El segundo grupo (Yc Yp YN Yave) describe el catabolismo, anfibolismo y anabolismo.
El tercer grupo incluye YATP un coeficiente que describe las relaciones de energa de las clulas
(Tempest y Neijssel, 1984). Algunos autores utilizan otros coeficientes de rendimiento que deben
ser propiamente designados, como muestra;
40
Para satisfacer los cuatro primeros puntos es necesario que el biorreactor est provisto de un
sistema de agitacin, a dems para el punto d) se requiere de un sistema que inyecte aire en el
cultivo.
Describiremos brevemente dos tipos de biorreactores de uso muy difundido: el tanque agitado y
al "air lift". En el primero de ellos (Figura 7) la agitacin se realiza mecnicamente mediante un eje
provisto de turbinas accionado por un motor.
41
El aire se inyecta por la parte inferior del tanque y es distribuido por una corona que posee
pequeos orificios espaciados regularmente. El chorro de aire que sale de cada orificio es
"golpeado" por las paletas de la turbina inferior generndose de este modo miles de pequeas
burbujas de aire, desde las cuales difunde el O2 hacia el seno del lquido. El sistema de agitacin
se completa con cuatro o seis deflectores que tienen por finalidad cortar o romper el movimiento
circular que imprimen las turbinas al lquido, generando de este modo mayor turbulencia y mejor
mezclado. El tanque est rodeado por una camisa por la que circula agua, lo que permite controlar
la temperatura. Para tanques mayores que 1000 2000 litros este sistema ya no es eficiente y es
reemplazado por un serpentn que circula adyacente a la pared interior del tanque. Debe tenerse
en cuenta que a medida que es mayor el volumen de cultivo tambin lo es la cantidad de calor
generado, por lo que se hace necesario una mayor rea de refrigeracin. Los tanques son de
acero inoxidable y estn pulidos a fin de facilitar la limpieza y posterior esterilizacin.
42
El aire que ingresa al biorreactor debe estar estril, lo que se consigue hacindolo pasar por un
filtro cuyo dimetro de poro es de 0,45 micrones, que impide el paso de microorganismos y
esporas. En los reactores de tipo "air lift" (Figura 8) es el mismo aire inyectado al cultivo lo que
promueve la agitacin. Bsicamente consiste en dos cilindros concntricos y por la base de uno de
ellos, por ejemplo el interior, se inyecta aire. De este modo se genera una circulacin de lquido
ascendente en el comportamiento interno y descendiente en el externo, lo que favorece el
mezclado.
Leccin 10: Transferencia de O2
La velocidad de transferencia de 02, R02, desde el seno de la fase gaseosa (burbujas) hasta la
fase lquida est dada por la siguiente ecuacin:
43
Es til en este punto retomar el ejemplo visto al final del y calcular el KLa necesario para que la
velocidad de transferencia de 02 sea igual a la de consumo; esto significa que R02 deber ser igual
a 1,526 mg 1-1 h-1. Asumiendo que C* = 7,8 mg 1 -1 y C = 0,5 mg 1 -1, resulta Por tanto valores
de KLa iguales o superiores al calculado asegurarn, que el cultivo no est limitado por 02. Cuando
la velocidad de consumo del oxgeno vara con el tiempo, como ocurre por ejemplo en un cultivo
"batch", el clculo de KLa necesario se realiza empleando el mximo valor de RO2 esperado, a fin
de asegurar un adecuado suministro de 02 durante todo el cultivo.
Producto
Enzimas para diagnstico, sustancias para
biologa molecular
Algunas enzimas, antibiticos
Penicilina,
antibiticos
amino-glicsidos,
proteasas, amilasas, transformaciones de
esteroides, amino cidos
Amino cidos ( cido glutmico)
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microbiolgicos o bioqumicos. Las computadoras tambin permiten graficar los datos obtenidos
permitiendo al operador del fermentador tener una representacin visual del progreso de la
fermentacin. Finalmente la computadora nos permite almacenar los datos en forma legible de
modo que estos datos se puedan traducir a otro sistema, o analizar en forma mas sofisticada.
Un uso mas sofisticado de las computadoras es el control inmediato del proceso de fermentacin
por ej. cambiando los parmetros ambientales a medida que la fermentacin progresa o agregando
un nutriente a la velocidad de equilibrio exacto del crecimiento, en esta forma el nutriente es
aadido cuando se necesita evitando en algunos casos que el mismo sea metabolizado a
productos indeseables.
Finalmente, las computadoras pueden ayudar a modular los procesos de fermentacin, para ello se
debe desarrollar un modelo matemtico del proceso de fermentacin, el cual incorpora ecuaciones
diferenciales para describir el crecimiento microbiano y la formacin del producto. El valor del uso
de una computadora para modelar el proceso de fermentacin es que se puede ensayar el efecto
de varios parmetros sobre el crecimiento y sobre la formacin del producto en forma rpida e
interactivamente, y entonces hacer modificaciones en los parmetros para ver como afectan al
proceso. De esta forma se pueden estudiar con gran economa muchas variaciones de la
fermentacin en la Terminal de la computadora y no en forma ms costosa en la planta piloto o en
la planta industrial.
11.2 Escalamiento del proceso de fermentacin.
Uno de los aspectos mas importantes y complicados de la microbiologa industrial es la
transferencia de un proceso del equipo de laboratorio a pequea escala, al equipo comercial a gran
escala, procedimiento que se llama escalamiento. Es sumamente importante comprender los
problemas del escalamiento ya que es raro que un proceso microbiano se comporte de la misma
forma en fermentadores a gran escala que en un equipo de laboratorio a pequea escala. La
mezcla y la aireacin son mucho mas eficientes en el matraz de laboratorio pequeo que en el
fermentador industrial grande. A medida que cambia el tamao del equipo, cambia la relacin
superficie/volumen. El fermentador tiene un volumen mucho mayor para un rea superficial
determinada. Como la transferencia del gas y la mezcla dependen de la superficie expuesta ms
que del volumen del fermentador, es obvio que sea ms difcil mezclar el contenido del tanque
grande que del matraz pequeo. Como la mayor parte de las fermentaciones industriales son
aerbicas, es indispensable una transferencia efectiva del oxigeno. Con el medio de cultivo rico
que se utiliza en los procesos industriales se obtiene una alta biomasa, que origina una gran
demanda de oxigeno. Si se reduce la aireacin, aun durante un periodo corto, el cultivo puede
experimentar una anaerobiosis parcial, con serias consecuencias en trminos de rendimiento del
producto.
45
3) La etapa en planta piloto, que se suele llevar a cabo en equipos de 300 a 3000 litros. Aqu las
condiciones se acercan mas a la escala industrial, pero el costo no es aun un factor de
importancia. En el fermentador de una planta piloto es deseable una cuidadosa instrumentacin y
un control con computadora, de modo que las condiciones que se obtengan sean lo ms similares
a las del fermentador industrial.
Actividades:
Investigue en su localidad los sustratos o subproductos que pueden utilizarse como fuente de
Carbono, nitrgeno y fsforo. Enuncie sus caractersticas relacionadas en cuanto a produccin
mensual del sustrato, estabilidad del sustrato y concentracin de los nutrientes.
Investiga sobre mtodos de cuantificacin del crecimiento microbiano, realiza un foro con tus
compaeros y compara las diferentes tcnicas.
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Definicin:
El choque entre dos molculas produce energa que puede ser absorbida por las molculas
mismas, o puede ser disipada bajo forma de calor en el medio.
Si la energa absorbida por el substrato (S) es suficiente para franquear la barrera de potencial,
llamada energa de activacin, el substrato se puede transformar y conducir a la formacin de un
producto (P), es decir llegar a un estado final, diferente del estado inicial.
Esta energa de activacin generalmente es elevada y no es compatible con las condiciones del
medio en el cual se deben desarrollar las reacciones del metabolismo de los organismos vivientes:
pH vecino de la neutralidad, temperatura comprendida entre O y 40C, presin vecina a la presin
atmosfrica. Por tanto, la realizacin de esas reacciones necesita de catalizadores bioqumicos, las
enzimas cuya accin consiste, como la de todo catalizador abatir la energa de activacin lo que
tiene por efecto acelerar la reaccin, cuya velocidad se encuentra multiplicada por un factor del
orden de 1012-1020.
Al final de cada ciclo de reaccin, la enzima permanece inalterada.
E+S
ES
E+P
Las enzimas son pues, catalizadores biolgicos de naturaleza protdica que intervienen en todas
las reacciones metablicas energticamente posibles, que ellas aceleran por activacin especfica.
Permiten alcanzar rpidamente el estado de equilibrio de la reaccin sin modificarlo. Son las llaves
tiles de la biotecnologa y de la bioindustria. Son ellas las que en la ingeniera microbiolgica,
catalizan las reacciones metablicas puestas en juego y aseguran su regulacin. Son ellas
igualmente las que conducen la ingeniera gentica para realizar las modificaciones del
equipamiento enzimtico de ciertos microorganismos con vista a hacerlos aptos para la biosntesis
de metabolitos interesantes
El conocimiento de las enzimas, de su naturaleza y de sus propiedades, as como de la cintica de
las reacciones que catalizan es fundamental en biotecnologa
47
Especificidad de reaccin. Una enzima no puede catalizar sino un solo tipo de reaccin,
por ejemplo: hidrlisis de enlaces glucosdicos o hidrlisis de enlaces steres (liplisis), etc.
Esta especificidad sirve de base a la clasificacin de estos catalizadores bioqumicos.
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por ejemplo, que en el metabolismo de los cidos aminados, el fosfato depiridoxal puede, de
acuerdo a la apoenzima con la cual est combinado, catalizar reacciones, sean de transaminacin,
sean de descarboxilacin, de desaminacin, o de racemizacin.
La actividad de las enzimas es funcin directa de su estructura terciaria o de la cuaternaria. En
estas condiciones, todo tratamiento que modifique la conformacin de la enzima (calentamiento,
modificacin del pH), es decir estorbando o impidiendo, la fijacin del substrato a la enzima o
cambiando la estructura del sitio activo, alterar las propiedades catalticas de la enzima y por
tanto su funcin.
Leccin 3: Cofactores
Las enzimas heteroprotenicas utilizan diversos tipos de cofactores: algunos son iones metlicos
(Mg++, Fe++, eu++, Mo+++, Zn++), Fig. otros cofactores son orgnicos (heme, nicotinamida,
flavina, coenzima A, fosfato de piridoxal, tiamina, etc.). Este tipo de enzima adopta diversas formas
de funcionamiento, lo que con frecuencia entraa una confusin en la terminologa de estos
cofactores. En efecto, algunos estn combinados fuertemente a la apoenzima por intermedio de
enlace covalente; son parte integrante de la enzima y no se le separan: se les designa con el
nombre de grupos prostticos. Otros, por el contrario, son co-substratos; se fijan en un primer
tiempo sobre la apoenzima, provocando la transformacin del substrato sufriendo una modificacin
en su estructura qumica; despus se separan de la apoenzima: se les denomina coenzimas.
Regresan a su estado inicial en el transcurso de una segunda etapa enzimtica fijndose sobre
otra apoenzima.
Para ilustrar esta distincin, tomemos el caso de dos enzimas responsables de la oxidacin de
cidos aminados: la L-aminocido-oxidasa y la glutamato deshidrogenada.
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ADH:z. La enzima regresa a su estado inicial cediendo los dos hidrgenos, fijados transitoriamente,
a un segundo substrato, oxidante ms potente, que provoca la reoxidacin del F ADH:z a F AD.
A la inversa, la glutamato deshidrogenasa (EC. 1.4.1.2) cataliza una reaccin del mismo tipo, la
oxidacin del cido glutmico a cido 2-oxoglutrico con ayuda de la coenzima nicotinamida
adenina dinucletido (NAD). Esta se encuentra reducida. Abandona la superficie de la apoenzima.
En seguida ser reoxidada a expensas de otro substrato que es reducido por otro sistema enzimtico del medio. El NAD se comporta en estas dos reacciones sucesivas como un substrato.
La nomenclatura y la clasificacin de las enzimas han sido normalizadas por la Comisin sobre
Enzimas de la Unin Internacional de Bioqumica, creada en 1955 antes de solucionar la confusin
que haba y el-riesgo de que la situacin se agravara con el rpido progreso del conocimiento
acerca de las enzimas.
Los objetivos que fueron asignados a esa Comisin sobre Enzimas desde su creacin fueron:
Definir, con base en esta Clasificacin, reglas de nomenclatura que permitan designar,
sin ambigedad, a una enzima dada, proporcionando la mayor informacin posible
sobre la naturaleza de la reaccin catalizada.
La reaccin catalizada.
50
Y sobre todo su nmero de identificacin que define sin ninguna ambigedad, el lugar de la
enzima en la clasificacin normalizada. Este I nmero contiene 4 cifras o nmeros,
separados por puntos, cada uno de ellos corresponde a los elementos siguientes:
a) La primera cifra indica la clase a la cual pertenece la enzima. Estas clases, en nmero
de 6 se definen de acuerdo a la naturaleza general de la reaccin catalizada. Hay: loxidorreductasas, 2-Transferasas, 3-Hidrolasas, 4-Liasas, 5-Isomerasas, 6-Ligasas (o
sintetasas). I
b) La segunda y la tercera cifras designan la subccase y la sub-sub- I clase, definiendo en
cada clase, segn ciertos criterios que se precisarn ms adelante.
OXIDORREDUCTASAS
Catalizan las reacciones de oxidorreduccin: transferencia de hidrgeno o de electrn(es) de un
donador, que est oxidado, a un receptor, que est reducido.(Fig. 5) En esta clase, que lleva la
cifra, se reagrupan todas las enzimas llamadas: oxidasas, reductasas, deshidrogenasas y
peroxidasas.
Los nombres comunes que se han retenido son del tipo "donador: deshidrogenasa" o "receptor:
reductasa". El trmino oxidasa no se ha conservado salvo cuando el receptor es el oxgeno.
TRANSFERASAS
51
Fig. 4: TRANSFERASAS se
encargan de transferir grupos
funcionales
HIDROLASAS
Provocan la hidrlisis de diversos tipos de enlaces: ster, acetal (osdico), amida (peptdico), (Fig.
7)
Las subclases son definidas por la naturaleza general del enlace que es hidrolizado.
El nombre sistemtico se forma de acuerdo al modelo "substrato hidrolasa", un prefijo que precisa
la naturaleza del grupo eliminado cuando la enzima es especfica para este enlace.
El nombre comn que se recomienda es, en la mayor parte de los casos, formado por el nombre
del substrato al cual se adiciona el sufijo "asa". En general las hidrolasas son holoprotenas.
Algunas pueden tener un grupo prosttico, por ejemplo el fosfato de piridoxal.
Fig.5:
HIDROLASAS..Reacciones de
hidrlisis, transforman
polmetro en monmeros
LIASAS
Son enzimas que rompen los enlaces C - C, C - O, C - N u algn otro, por medios diferentes a la
hidrlisis o a, la oxidacin, con formacin de un doble enlace en alguno de los dos fragmentos.
52
Cuando ellas actan en sentido inverso -condensacin de dos molculas con desaparicin de un
doble enlace se les designa con el nombre de sintetasas.
Las subclases son definidas por la naturaleza del enlace roto y las sub. clases precisan la identidad
de la fraccin eliminada: CO2, aldehdo, amoniaco, etc.
El nombre sistemtico se forma de acuerdo al modelo, substrato: fraccin eliminada-liasa.
Fig. 6: Liasas.
Condensacin de
molculas con desaparicin
de doble enlace
ISOMERASAS
Catalizan las reacciones de isomerizacin: racemizacin, epimerizacin, isomerizacin cis-trans, o
tambin originan modificaciones intramoleculares tales que transfieren un agrupamiento o
producen oxidorreduccin.
Para su nomenclatura se retiene el principio "substrato. . .asa", pero el trmino isonerasa se
reserva a ciertas subclases; un prefijo hace precisa la naturaleza de la isomerizacin, por ejemplo
cis-trans isomerasa.
Fig. 7: Ejemplo de
Isomerizacin
LIGASAS O SINTETASAS
Son enzimas que catalizan la reaccin de unin de dos molculas, acopladas a la ruptura, sin
intervencin del agua, de un enlace pirofosfrico en el ATP o eventualmente en un nucletido
trifosfrico del mismo tipo.
Las subclases corresponden al tipo de enlace que se establece (C - , C - S, C - N, C - C) y la subsubclases se refieren a la naturaleza del producto formado (amida, pptido, etc.) o a la reaccin
que es catalizada.
El nombre sistemtico es formado de acuerdo al modelo, " X: Y ligasa (formando ADP), X Y , son
los dos substratos que se condensan; el producto formado a partir del nucletido trifosfrico
implicado .en la reaccin (ADP o AMP) se indica entre parntesis.
Para darle nombre comn se utiliza, en general, el nombre del producto formado seguido del
trmino "sintetasa".
53
Fig. 8: Ligazas
54
curva, P o S = f(t) no es constante para las concentraciones dadas en enzima o en substrato (fig.9),
y disminuye en funcin del tiempo debido a la desaparicin del substrato en el curso de desarrollo
de la reaccin.
Siempre, al principio de la reaccin, se puede considerar que la tangente a la curva se confunde
con aqulla en que la velocidad permanece constante.
Los estudios de cintica enzimtica corresponden siempre a esta parte lineal de la curva; lo que
implica el trabajar a velocidades iniciales. En estas condiciones, al principio de la reaccin, la
concentracin en producto es muy dbil; puede despreciarse, as como la reaccin inversa de
transformacin del producto en substrato. Entonces se puede escribir
E + S
ES
k1
k3
E + P
k2
Fig. 9. Curva de aparicin del producto en funcin del tiempo
c) Por otra parte, para una concentracin dada de substrato, el estudio de las variaciones de la
velocidad inicial de reaccin en funcin de la concentracin de enzima (fig. 10) muestra que
esta variacin no es lineal. La curva presenta un trazo hiperblico correspondiente al hecho de
que para una cierta concentracin de enzima, la totalidad del substrato se encuentra bajo la
forma de complejo enzima-substrato;
55
de lo que resulta que la velocidad inicial, funcin de la concentracin de este complejo, permanece
constante. Para los estudios cinticos, es necesario situarse en las condiciones que corresponden
al principio de la curva, donde es lineal, es decir a concentraciones bajas de enzimas.
En otros trminos, la cantidad de enzima debe ser pequea en comparacin a la concentracin del
substrato, de tal manera, que la formacin del complejo enzima-substrato, ES, no modifica, o
modifica poco la concentracin del substrato,
Hiptesis de Michaelis-Menten: Al establecer la ecuacin de la velocidad, Michaelis y Menten
toman como principio de que la velocidad de transformacin del complejo ES en E + P es muy
lenta, con relacin a la velocidad de la ruptura del complejo que vuelve a dar E + S.
Esta hiptesis significa que k3 ~ k2 Y que E y ES estn en equilibrio, sea:
Hiptesis del estado estacionario de Briggs y Haldane: Estos autores consideraron que la hiptesis
de Michaelis-Menten es demasiado restrictiva y que es preferible postular un estado estacionario,
estado para el cual la velocidad de formacin del complejo ES es igual a su velocidad de
descomposicin en todas las direcciones (formacin de productos y aumento del substrato).
Velocidad de formacin de ES = k1 [E] [S]
Velocidad de desaparicin de ES = k2 [ES] + k3 [ES] = (k2 + k3)
[ES]
El estado estacionario se describe entonces:
Al escribir que la cantidad de enzima que se ha puesto en el medio de reaccin [ET] se reparte en
una fraccin libre [E], y una fraccin que forma un complejo [ES], se tiene:
[ET] = [E] + [ES]
Al sustituir E por su valor, se obtiene:
56
La velocidad de formacin del producto est dada por: v = k3 [ES], la ecuacin general es de la
forma:
57
Figura 11 :
Representacin grfica
de Michaelis-Menten
58
de los parmetros
cinticos de una reaccin enzimtica reversible y muestra que no es posible olvidar la reaccin
inversa en la que los productos se acumulan.
La produccin mundial de enzimas representa una cifra anual de 1.5 millares de millones de
dlares, 60% de ellos con utilizacin en las industrias agroalimentarias.
Las enzimas que se utilizan en procesos agroalimentarios son objeto de una reglamentacin
estricta, en lo que concierne a su produccin, su pureza qumica y microbiolgica. En su
presentacin comercial, sea bajo la forma ms o menos diluida, fijada sobre soportes inertes, o
diluyentes estn tambin igualmente reglamentadas. Las enzimas, biocatalizadores utilizados en la
bioindustria o en otras diversas industrias (farmacia, textiles, pieles...) pueden provenir de varias
fuentes, especialmente:
Las enzimas de origen vegetal y especialmente las proteasas son por orden decreciente de inters
tecnolgico, una de las ms importantes enzimas vegetales de uso industrial se encuentran: la
papana que proviene de una planta ecuatorial y tropical (Carica papaya L.), la bromelina, extrada
de la pifia (Ananas comosus Merr) y la ficina proveniente del higo (Ficus carica).
59
Son numerosas las aplicaciones de la papana industrial (alrededor de 300 ton.), de las cuales se
usa 75% en la industria cervecera para la estabilizacin coloidal de la cerveza; 10% en la industria
de la carne (ablandamiento), 5% en la fabricacin de hidrolizados de pescado destinados a la
alimentacin animal, 2% en la industria farmacutica, entre otros. La tasa de utilizacin puede
variar seriamente en funcin de la legislacin alimentara de cada pas. El desarrollo de la papana
industrial es ciertamente interesante de seguir, pues puede sufrir fluctuaciones por razones
diversas (produccin, acontecimientos polticos, cambios de tecnologas). En los ltimos aos se
han introducido exigencias muy estrictas sobre la calidad del producto.
Leccin 2: Enzimas de origen animal
Un ejemplo importante de este tipo de enzimas en la pepsina, esta enzima es producida
industrialmente a partir de la mucosa gstrica del cerdo donde se encuentra en forma de un
precursor, el pepsingeno, de una masa molecular de 42,000. La preparacin industrial de la
pepsina se puede hacer de acuerdo a varios mtodos: en general se practica la auto digestin de
mucosas gstricas de cerdo, raspadas y trituradas, en medio acuoso. acidificado con cido clorhdrico, en presencia de cloroformo. Despus de flltracin se efecta una concentracin por
liofilizacin. La pepsina purificada es blanquecina y soluble en agua.
Desde que el desarrollo de la microbiologa ha permitido comprender mejor los sistemas que
condicionan la sntesis de enzima s en los microorganismos, la produccin industrial de enzimas se
ha orientado hacia los procesos de fermentacin. Las principales ventajas de las enzimas en la
fermentacin con relacin a las enzimas en la extraccin son las siguientes:
- Una produccin independiente de restricciones estacinales o geogrficas.
60
En la produccin industrial de las enzimas se consideran las siguientes etapas . (Scriban, 1985)
A. Definicin de la enzima que se busca
La produccin de una enzima industrial que responda, en principio, a una exigencia potencial de
quienes la pueden utilizar, hace necesario determinar las propiedades que esta enzima pueda
tener. Prioritariamente, de acuerdo a Sicart (1980):
61
ENZIMAS
Lctea
Tripsina.
Lactasa
Quesera
Helados
Crnicas
Panificacin
Cervecera
Vinificacin
Bebidas
alcohlicas
Quimosina
(renina)
Lactasa
Lipasa
Lactasa
Glucosaisomerasa
Papana,
Fiscina
Bromelina
Amilasa
Proteasa
Lipoxidasa
Lactasa
Amilasas
Papana,
Pepesina
Pectinasas
Glucosaoxidasa
Pectinasas
Glucosano isomerasa
Tannasa
Glucosaoxidasa
USOS
Enmascara
el
gusto
a
xido.
Fabricacin de leche delactosada, evita la cristalizacin de leche
concentrada.
Coagulacin de las protenas de la leche
Influencia en el sabor y aceleracin de la maduracin.
Evita la textura arenosa provocada por
Permite la utilizacin de jarabes de alta fructosa.
Ablandamiento
Produccin de hidrolizados.
la cristalizacin.
de
Mejora
la
calidad
Disminuye
la
viscosidad
Produce
una
miga
Mejora la coloracin de la superficie.
(casena).
carnes.
del
de
la
muy
pan.
pasta.
blanca
Usadas
para
licuar
la
pasta
de
malta.
Evitan la turbidez durante la conservacin de ciertos productos.
Mejoran
la
clarificacin
y
extraccin
de
Evitan el oscurecimiento y los sabores desagradables.
jugos.
Mejoran
la
clarificacin
de
jugos.
Conversin de la glucosa en fructosa (jarabes de alta fructuosa).
Aumenta la solubilidad y disminuye la turbidez del t.
Evita el oscurecimiento y los sabores desagradables.
- El valor ptimo de pH: Este factor tiene una influencia variable segn las enzimas; algunas de
ellas, como la proteasa alcalina an son activas a pH = 10, en tanto que las enzimas fngicas
funcionan an a pH = 3.
- El valor ptimo de temperatura: Generalmente, quienes utilizan enzimas se interesan en poder
disponer de enzimas que soporten temperaturas elevadas, ya que estas temperaturas conservan
en parte la esterilidad del medio de fermentacin.
62
Despus, es necesario definir el sistema que se adoptar para medir su actividad, pero conviene
disociar la nocin de actividad que se aplica a la cantidad de enzima presente en una preparacin,
la que se puede determinar mediante un mtodo de laboratorio, de la nocin de eficacia que
caracteriza el comportamiento de la misma preparacin colocada en las condiciones industriales en
las que vaa utilizarse. (Sicart, 1980).
B. Seleccin de una cepa microbiana
Los microorganismos que son capaces de producir enzimas de degradacin de ciertos compuestos
se localizan generalmente en donde abundan esas substancias. Por ejemplo, los microorganismos
que secretan celulosas son numerosos en el suelo de los bosques. Inicialmente, las cepas se han
aislado del suelo o de elementos naturales.
Los mtodos de aislamiento que se utilizan son los mtodos clsicos, el ms importante es el
cultivo de enriquecimiento, seguido de un sub cultivo en un medio selectivo. En el medio selectivo
ideal, el substrato de la enzima es la nica fuente de uno de los elementos vitales. Por ejemplo, el
almidn como nica fuente de carbono. para aislar a los microorganismo s que tienen una amilasa.
Las tcnicas de difusin en agar se han desarrollado para la deteccin de la actividad enzimtica.
Esta prueba, en las condiciones estndar, puede dar informacin de orden cualitativo. Para que la
cepa aislada sea retenida definitivamente debe presentar algunas caractersticas, de acuerdo a
Aunstrup y col. (1979) y Sicart (1980):
- Desarrollarse sobre un medio sencillo fcilmente asequible.
- Producir el menor nmero posible de metabolitos secundarios, como antibiticos, por ejemplo.
- Excretar la enzima en forma que se facilite su separacin y su purificacin. .
- No originar contaminantes diversos
- No ser patgena ni producir compuestos txicos.
Con los progresos de la gentica, las posibilidades de mejoramiento de las cepas son,
tericamente, ilimitadas; por una 'parte por una mutacin, por otra parte, mediante la nueva va de
la ingeniera gentica.
En cualquier forma, la gentica de los microorganismos que se utilizan en la produccin industrial
de enzimas (Bacillus, Aspergillus) an est mal conocida para que puedan realizarse las
aplicaciones de la ingeniera gentica y son las mutaciones las ms utilizadas.
Las cepas industriales deben ser protegidas contra la degeneracin, la prdida de viabilidad y las
contaminaciones. Los medios ms seguros son la liofilizacin o la conservacin a temperatura del
nitrgeno lquido. Estas tcnicas permiten conservar las cepas casi indefinidamente.
C. Produccin industrial de la enzima
63
Tradicionalmente, las enzimas microbianas eran producidas por cultivo en superficie, en una
delgada capa de medio lquido o de medio semislido. Esta tcnica es an utilizada para algunas
producciones, en particular de enzimas de origen fngico, tales como las amilasas de Aspergillus,
las proteasas de Aspergillus y de Mucor o las pectinasas de Penicillium. Pero existen varios
problemas en el control de la temperatura, de la aireacin y de la humedad, por ello se prefieren
los cultivos sumergidos a los cultivos en superficie. Los cultivos en medio lquido, profundos,
agitados, son mejor adaptados a los diferentes controles mediante mtodos modernos y reducen
los riesgos de contaminacin. Adems se prestan mejor a las operaciones de extrapolacin y de
optimizacin necesarias para el paso del fermentador piloto de laboratorio al fermentador industrial.
Preparacin del inculo
En esta etapa de preparacin del inculo, la capacidad de produccin de la cepa debe
conservarse y eliminarse todo riesgo de contaminacin. Para ello es necesario evitar que haya
un nmero excesivamente grande de cultivos sucesivos. Es preferible el sembrar directamente
un matraz de medio gelosado, a partir de la cepa liofilizada, despus, a partir de este cultivo se
sembrar un nico fermentador que servir el mismo de inculo para el fermentador industrial. El
volumen del inoculo representa generalmente de 3 a 10% del volumen del fermentador de
produccin y la composicin del medio para la preparacin del inculo se aproxima bastante a la
del medio de produccin. El tiempo de permanencia en el fermentador vara de 10 a 80 horas
segn el procedimiento, la cepa, las condiciones de cultivo, . . . (Aunstrup y col., 1979)
D. Composicin del medio de cultivo
El medio de cultivo debe contener la fuente de carbono, la fuente de nitrgeno y los principales
factores de crecimiento necesarios para la cepa microbiana. Se pueden adicionar ciertos factores
para abreviar la fase de latencia. De todas formas, la produccin de enzima puede no tener lugar a
pesar de que el medio sea el conveniente para un buen desarrollo. Hay que tomar en cuenta la
necesidad de un inductor, de las represiones posibles debida a algn componente del medio, de la
represin catablica producida por la glucosa. Esta represin puede ser evitada reemplazando la
glucosa por glcidos fermentables lentamente o por almidn parcialmente hidrolizado.
Para aumentar la productividad, se utilizan medios concentrados, pero esta concentracin puede
igualmente -ser causa de aumento en la presin osmtica y dificultar la aireacin.
A menudo se adicionan sales para complementar la cantidad de nitrgeno en el medio
E. Fermentacin y equipo necesario
Vincent y Priestley (1975) han detallado las condiciones de fermentacin que deben mantenerse
para producir una enzima.
Los fermentadores utilizados habitualmente contienen volmenes de 100 a 200 m3. Deben estar
equipados de un sistema de agitacin de gran potencia, capaz de agitar medios relativamente
viscosos, ya que pueden contener hasta 350 g/lt. de materia seca (Sicart, 1980).
64
Los fermentadores estn equipados de una corona clsica de aereacin, ya que la mayor parte de
las fermentaciones productoras de enzimas tienen una fuerte demanda de oxgeno. Generalmente,
estas fermentaciones son conducidas en condiciones limitadas de oxigenacin. Para la
glucoamilasa, la productividad est limitada a la transferencia de oxgeno (Aunstrup y col., 1979).
Los equipos de medicin y de control del fermentador permiten seguir y regular los parmetros del
cultivo. Los controles se ejercen generalmente sobre el pR, la temperatura, el oxgeno disuelto, la
espuma y la evolucin de la concentracin de ciertos nutrientes. Adems la medicin de la aparicin de la actividad enzimtica se efecta a intervalos regulares por el laboratorio de control. An
no existen reguladores que permitan hacer esas mediciones en forma continua. (Sicart, 1980). Esta
medicin es importante porque de ella depende la decisin de detener la fermentacin.
Para la produccin de enzimas, son necesarias condiciones rigurosas de asepsia, por una parte
para obtener un buen rendimiento, por otra parte para no tener el riesgo de secrecin de
substancias txicas como contaminantes. Esta asepsia es difcil de mantener, siendo el medio muy
rico y el pH cercano a la neutralidad.
Se necesita tomar precauciones a nivel de la construccin del fermentador y para la eleccin de las
instalaciones y los equipos colaterales. Durante toda la fermentacin, una ligera supresin de aire
en el fermentador impide la penetracin de contaminantes, esta precaucin la refuerzan las
protecciones de vapor en todos los puntos de comunicacin con el exterior (fig. 12).
An no se ha establecido el modelo cintico general para la sntesis de enzimas, pero, ya se ha
estudiado la regulacin de la formacin de algunas enzimas. Algunas enzimas se forman durante
la fase exponencial de crecimiento, pero la mayor parte aparecen en la fase postexponencial.
Segn sean las enzimas y los procedimientos, la fermentacin dura de 30 a 150 horas.
La cantidad de protena -enzima en el medio, al final de la fermentacin, representa de 1 a 5% de
la materia seca inicial, en tanto que la biomasa celular puede alcanzar de 2 a 10%.
La calidad de las enzimas producidas est en estrecha relacin a la forma en que se condujo la
fermentacin. La seleccin de las materias primas, el mtodo de esterilizacin, el procedimiento
para regular la formacin de espuma, la aireacin y la agitacin, as como la duracin de la
fermentacin afectan, no solamente al rendimiento y al costo de produccin, sino tambin al color,
olor y a la estabilidad de la enzimas.
65
Desde 1916, Nelson y Griffin haban demostrado que la invertasa adsorbida sobre carbn
activo, conservaba su actividad. Pero de cualquier modo hubo que esperar hasta la dcada de
los 50's para que aparecieran las primeras aplicaciones de esta tcnica, en particular con los
trabajos de Grubhofer y Schleith.
Despus de 1960, las investigaciones se han intensificado y bajo el impulso de los equipos de
Katchalski en Israel y de Manecke en Alemania, se han multiplicado las utilizaciones potenciales
de las enzimas inmovilizadas. En1969 Chibata y sus colaboradores desarrollaron en Japn el
primer reactor industrial con enzima fijada, una L-aminocidos a partir de la correspondiente
mezcla racmica. Esta tcnica permitira, segn los autores, disminuir el precio de costo a menos
del 40% con relacin al procedimiento convencional.
En la actualidad, se han desarrollado numerosos mtodos de fijacin de inters para ms de 100
enzimas, tanto en la etapa de laboratorio como en escala piloto y se ha abierto un campo de
experimentacin, despus de algunos aos, para la inmovilizacin de clulas intactas, vivas o
muertas. Esta multiplicacin de trabajos ha dado lugar a una abundante literatura cientfica.
Leccin 5: Inmovilizacin de enzimas
66
En esta clasificacin, las enzimas inmovilizadas se consideran como un caso particular de las
enzimas modificadas. Despus apareci la tcnica de reticulacin (enlazamiento cruzado) en el
cual las molculas enzimticas son polimerizadas por intermedio de un ligando polifuncional.
67
- Medicin de la actividad
Las condiciones ptimas de accin de las enzimas inmovilizadas difieren a menudo de las de las
enzimas en solucin y deben ser perfectamente conocidas para evitar todo riesgo de error de
interpretacin. As para la ureasa, fijada sobre bentonita, la actividad de pH 7.7 no alcanza sino a
75% de la actividad de la enzima libre mientras que es de 100% a pH 7.1.17
La Comisin Internacional de Hennicker en 1971, ha propuesto caracterizar la actividad de los
complejos por la velocidad inicial de reaccin expresada en microkatales (JIkat): cantidad de
producto formado en micromoles por segundo y por mg (materia seca) o por unidad de superficie
del soporte; precisando las condiciones de determinacin de la materia seca, el tenor en protenas
fijadas y la actividad especfica de la enzima antes de la inmovilizacin.
Con las reservas antes dichas, parece que la inmovilizacin entraa con frecuencia una prdida de
actividad, muy variable segn sea la naturaleza de la enzima y el modo de fijacin; pero tambin se
han sealado algunos casos en los que hay aumento de actividad. Estas variaciones en un sentido
o en otro podran explicarse por una modificacin estrica del sitio activo de la enzima bajo el
efecto de un cambio de conformacin de la cadena polipeptdica.
Gracias a la gran especificidad en su accin, las enzimas constituyen una herramienta de
fabricacin y de anlisis indispensable en numerosos sectores de la investigacin, del control y de
la produccin industrial.
La introduccin de las tcnicas de insolubilizacin de los biocatalizadores suscita un inters
considerable en razn de las ventajas que presenta: tratamientos en continu, control
automatizado, mejoramiento de los rendimientos por unidad de enzima, obtencin de derivados
ms puros, disminucin de requerimientos energticos. . . y los recientes desarrollos de los
mtodos de inmovilizacin de clulas enteras han abierto nuevas perspectivas.
A pesar de los numerosos trabajos de investigacin, las instalaciones de produccin industrial son
an muy limitadas. Es necesario buscar la causa en la complejidad del funcionamiento de los
reactores, en donde la matriz es a menudo muy delicada y en la gran inestabilidad de los
catalizadores biolgicos; sin olvidar las limitaciones debidas a regulaciones legales.
La obtencin de nuevas fuentes de enzimas ms estables, el desarrollo de sistemas
multienzimticos, la recuperacin y la re utilizacin de cofactores de. Las enzimas son las vas de
investigacin susceptibles de ampliar el campo de las aplicaciones actuales:
68
TAREA:
1. Realice un Glosario, de la unidad estudiada:
2. Realice una investigacin bibliogrfica sobre las enzimas ms importantes en la industria
alimenticia, escoja una de ellas y realice un diagrama de flujo para la produccin de la misma.
3. Para mayor comprensin lea el articulo de Miguel Arroyo en el siguiente link: Inmovilizacin de
enzimas: Fundamentos, mtodos y aplicaciones. Y realice una comparacin de los diferentes
mtodos teniendo en cuenta sus ventajas y desventajas.
CIBERGRAFIA:
http://www.arrakis.es/~lluengo/enzimas.html. Sitio que incluye informacin acerca de las enzimas,
su funcin y caractersticas.
http://minnie.uab.es/~veteri/21264/t4_els_enzims.pdf. Las enzimas en los alimentos
Biotecnologa de los alimentos. Introduccin. ILSI International Life Sciences Institute. Serie de
monografas concisas de ILSI Europa. http://www.ilsi.org/ y en Argentina http://argentina.ilsi.org/
Alimentos y tecnologa de modificacin gentica. Salud y seguridad en el consumidor. ILSI
International Life Sciences Institute. Serie de monografas concisas de ILSI Europa.
http://www.ilsi.org/ y en Argentina http://argentina.ilsi.org/
69
parmetros, particularmente los que se refieren a las mejoras en las caractersticas de crecimiento
y la eliminacin de subproductos perjudiciales. (Wiseman, A,1986)
Todas las vas metablicas, la expresin de anticuerpos, la actividad de los virus, en fin, todas las
manifestaciones del fenmeno viviente, estn, en ltima instancia, orquestados por la expresin
ordenada y regulada de los genes, por medio de la produccin de protenas especficas.
El extraordinario proceso por el cual una sola clula, el huevo fecundado, da origen a un organismo
complejo, es decir; las etapas de diferenciacin celular; constitua un reto extremadamente
atractivo, pero a la vez formidable. Un descubrimiento clave inici el cambio dramtico que
70
conocemos hoy como ingeniera gentica o ADN recombinante: en 1970 Hamilton Smith y Daniel
Nathans descubren una enzima capaz de reconocer y cortar el ADN en secuencias especficas,
que les vali el Premio Nobel de fisiologa o medicina, compartido con Werner Arber, en 1978.
Muchos microorganismos producen enzimas que modifican y digieren o rompen el ADN. Estos
sistemas, llamados de modificacin-restriccin, son anlogos a un sistema inmune, los cuales
probablemente evolucionaron como un mecanismo de proteccin de los microorganismos contra
infecciones virales. En efecto, las bacterias, por ejemplo, son infectadas por virus, llamados
bacterifagos, que inyectan su propio ADN en la clula bacteriana para despus controlar su
maquinaria celular y redirigirla hacia la sntesis de sus propios componentes, dando como
resultado final la ruptura de la clula y la liberacin de cientos o miles de nuevos virus. En algunas
bacterias el ADN propio est modificado en ciertas secuencias. Una enzima de modificacin se
desliza sobre la hebra de ADN, y cada vez que se topa con su secuencia blanco, por ejemplo
GAATTC, introduce un pequeo grupo qumico en la adenina (A) central. Otra enzima, la enzima
de restriccin, tambin se desliza en la hebra de ADN, y si encuentra la secuencia GAATTC, corta
el ADN en esa posicin. La enzima, sin embargo, no corta el ADN modificado, por lo que
efectivamente es capaz de degradar el ADN extrao que puede entrar a la clula, sin alterar el
ADN propio.
Es una secuencia palindrmica. Cuando acta la enzima que reconoce y corta esta secuencia,
llamada EcoRI, genera segmentos de ADN con extremos que se proyectan fuera de la doble
cadena:
71
5G AATTC3
3CTTAA G5
Estos extremos se denominan cohesivos o pegajosos, porque tienden a aparearse o hibridarse
nuevamente. En realidad, cualquier extremo de ADN generado por un corte con EcoRI puede
hibridarse o aparearse con otro extremo generado por la misma enzima. Los descubridores de las
primeras enzimas de restriccin pronto se dieron cuenta de que su accin sobre el ADN
(comnmente llamada "digestin") produca un conjunto definido de diferentes segmentos.
Sbitamente, el ADN dej de ser una sustancia montona y frgil, donde purificar un segmento
especfico resultaba una tarea ardua o imposible. Al poder generar segmentos especficos, con las
enzimas de restriccin, la molcula de la vida qued a merced del bilogo molecular y por lo tanto
nos facilit el camino para manipular la secuencia del ADN, de cualquier especie. Este, entonces
se convirti en la nueva herramienta de la Biologa moderna y por lo tanto de la BIOTECNOLOGA.
72
al interior
de clulas vivas el
ADN recombinante
(transformacin).
4. Mecanismo para asegurar la replicacin e identificacin de la molcula recombinante
dentro de la clula (vehculo molecular).
El primer experimento en el que se puso en prctica este concepto, realmente simple, que se
conoce como clonacin molecular se logr al utilizar plsmidos bacterianos como vehculos y ADN,
tambin bacteriano, como pasajero. (Fig.2)
73
74
Hasta el momento hemos mencionado a la ADN ligasa, una importante enzima que permite ligar o
unir molculas de ADN. La investigacin sobre la fisiologa de los cidos nucleicos ha
proporcionado, adems, una serie de enzimas que se utilizan ampliamente para manipular los
cidos nucleicos en el tubo de ensayo, y que forman parte importante de las herramientas del ADN
recombinante. Cada una de estas enzimas, al igual que las endonucleasas de restriccin, cumple
un papel dentro de la clula viva, para alterar el material gentico (por ejemplo, para repararlo,
replicarlo, degradarlo, recombinarlo, etc.). en el laboratorio se pueden usar estas enzimas, despus
de purificarlas de sus fuentes naturales, para efectuar transformaciones tiles a los propsitos del
experimentador. Por ejemplo, la enzima transcriptasa reversa, que naturalmente producen ciertos
virus para invadir el genoma de sus clulas blanco, se utiliza ampliamente para clonar genes a
partir de sus ARN mensajeros
Dado que el propio desarrollo del ADN recombinante , ha potenciado, a su vez el desarrollo de
herramientas moleculares, hoy en da contamos con un enorme nmero de enzimas y reactivos
que permiten gran versatilidad en la manipulacion del ADN.
75
Adems de las enzimas que hacen posible la transformacin y manipulacin del DNA, hay otro
elemento indispensable para el trabajo del ingeniero gentico: los vectores. Los vectores no son
ms que los portadores del fragmento de DNA que se quiere aislar o clonar.
Plsmidos
Fagos
Csmidos
Plsmidos:
La replicacin de los plsmidos puede o no requerir de protenas codificadas por ellos y puede
o no estar sincronizada con la del cromosoma bacteriano.
Ya en la dcada de los 70, en los primeros trabajos de Biologa Molecular y de I.G. se
construyeron muchos plsmidos naturales para ser usados como vectores
Todos los plsmidos que se usan como vectores poseen tres caractersticas comunes:
76
1. Un sitio replicador
2. Un marcador de seleccin
3. Un sitio de clonaje (Polylinker o Multiple cloning site)
1. Sitio replicador:
El replicador es el segmento de DNA que contiene el sitio a partir del cual se comienza a
replicar el DNA usualmente llamado origen de replicacin: ORI. Este sitio incluye los genes
que codifican para las protenas y RNAs que se requieren para la replicacin.
El nmero de copias de un plsmido puede ser alto o bajo en dependencia del control al
que estn sometido los replicadores. Este control puede ser de dos tipos: relajado o
restringido
Control relajado: La replicacin del plsmido no depende de las protenas sisntetizadas al
comienzo del ciclo celular bacteriano: protenas de la iniciacin de la replicacin. Por tanto
estos plsmidos se pueden amplificar aun cuando se trate la cepa bacteriana con
inhibidores de la sntesis de protenas (cloranfenicol). Produce un nmero de copias alto
del plsmido (>20 copias por clula en condiciones determinadas)
Control restringido: La replicacin precisa de la sntesis de protenas inestables que
participan en la iniciacin de la replicacin y por tanto est sincronizada con el ciclo celular
o sea con la replicacin del cromosoma bacteriano. Produce un bajo nmero de copias
(<20 copias por clula)
2. Marcadores de Seleccin:
Los marcadores de seleccin ms usados sobre todo en bacteria son genes que codifican
para la resistencia a determinados antibiticos. Los antibiticos son sustancias qumicas
que producen la muerte de los microrganismos pero son relativamente poco txicos a las
clulas eucariticas.
Los vectores plasmdicos o de fagos portan genes para la resistencia a estos antibiticos.
Estos genes son normalmente dominantes y por lo tanto las clulas que los contengan
pueden ser identificadas por su capacidad de crecer y formar colonias en presencia del
antibitico. Los plsmidos que contienen tales genes le confieren a las clulas donde son
isertados la capacidad de vivir en presencia de tales sustancias.
77
Los antibiticos se aaden usualmente a medio slido recien autoclaveado antes que la
temperatura haya disminuido por debajo de 50 oC. En casos de emergencia se pueden
aadir directamente a plcas ya preparadas, dando tiempo para que el antibitico pueda
o
difundir (~60 min). Se deben guerdar a 4 C pues los antibiticos pierden potencia a RT.
Algunos como la Tet y la Rifampicina deben guardarse en la oscuridad pues son sensibles
a la luz
En levaduras se emplea la auxotrofia a determinados amonicidos como marcadores de
seleccin.
3. Sitio de Clonaje
En efecto hacia 1985 con el ADN recombinante ya plenamente establecido como una tcnica
aplicada rutinariamente por cientos de laboratorios en el mundo, Kary Mullis, quien a la sazn
trabajaba para la compaa Cetus, en San Francisco, California, tuvo una sbita inspiracin
mientras manejaba su auto y se diriga hacia una cabaa en la que se dispona descansar el fin de
semana. Como muchos otros investigadores, Mullis se encontraba desarrollando aplicaciones para
los oligos sintticos. Concibi entonces la idea de que combinando el uso de los oligos con varios
ciclos de replicacin in vitro se poda amplificar, es decir; obtener en gran cantidad, un segmento
de ADN especfico (por ejemplo, un gene en particular).
En esencia la idea consiste en que la enzima ADN polimerasa participa en la replicacin del ADN
(Ver fig. 3) . Para convertir una molcula de ADN de doble cadena en dos molculas idnticas, la
78
enzima requiere que las cadenas de la molcula inicial se separen, para as tener un molde
disponible.
Adems, la enzima requiere un segmento de ADN con un extremo libre, que sirve para cebar o
iniciar la reaccin de replicacin y los nucletidos precursores. Si se colocan estos sustratos en un
tubo de ensayo, la ADN polimerasa puede incorporar uno por uno los nucletidos
correspondientes, es decir, frente a una A en el molde, adicionar T en la cadena creciente; frente
a G, C, etc.
En realidad, ste concepto era perfectamente conocido y aplicado desde mucho antes de que se
concibiera la tcnica de la PCR. Lo original de la idea de la concepcin de Mullis fue pensar qu
sucedera si se aplica este procedimiento en ciclos sucesivos, en una reaccin en cadena. Los
oligos sintticos, en virtud de su propiedad de hibridacin de los cidos nucleicos, definen los
puntos de partida para el copiado de las cadenas de ADN. Si se colocan dos oligos cuya secuencia
define los extremos de un segmento determinado de ADN, se hacen hibridar con las hebras del
molde, previamente separadas, y se someten a una reaccin con ADN polimerasa, de lo que
resultarn dos molculas cuyos extremos estn definidos por los oligos y que corren en sentido
opuesto. Las cadenas resultantes son complementarias entre si: existen ahora el doble de
molculas con la secuencia que demarcan los oligos. , por lo tanto s el proceso se replica
cclicamente entonces, la replicacin del ADN, ser exponencial. En el siguiente ciclo de
separacin de cadenas, hibridacin con los oligos y reaccin con ADN polimerasa, se obtendrn
cuatro molculas de la regin entre los oligos. Los ciclos subsiguientes generarn 8, 16, 32, 64
molculas, y as sucesivamente. (Fig. 3 )
Fig. 3 : Replicacin del ADN, utilizando (PCR)
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La tecnologa del DNA recombinante ha abierto todo un nuevo campo de mutagnesis. Mientras
que los mutgenos convencionales actan al azar, mediante el uso de DNA sinttico y las tcnicas
del DNA recombinante es posible introducir mutaciones en sitos determinados con toda precisin
en los genes. Este proceso se denomina mutagnesis dirigida. Es de esperar que las protenas
fabricadas a partir de cepas que cuyas mutaciones tengan propiedades diferentes de las protenas
de las cepas silvestres, propiedades que pueden predecirse al conocerse la estructura de la
protena. A continuacin se esquematiza los procedimientos bsicos utilizados en esta tcnica (Fig.
4)
MUTAGENESIS
Al Azar (Random)
Dirigida
(Site-Specific)
Coloca mutaciones
En cualquier
Sitio del ADN
Mutaciones puntuales en
sitios determinados
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Sin lugar a dudas, estas tcnicas han revolucionado la forma obtener productos y su
comercializacin, sin embargo existen todava muchos inconvenientes de costos y ticos que aun
no se han resuelto. Una de las mayores controversias se ha suscitado ha raz de la obtencin de
animales y vegetales transgenicos con fines teraputicos y /o alimenticios.
Leccin 4: Animales Transgnicos
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glndula mamaria, podemos pensar en manipular este sistema para que se elaboren en ella
productos diferentes. Utilizando estos conceptos, ya existen los primeros animales transgnicos
que producen protenas de inters mdico.
La posibilidad de utilizar "granjas moleculares" en las que los animales producen leche protenas
de altsimo valor y utilidad es realmente un triunfo maysculo de la biotecnologa moderna.( Fig7).
Con gran seguridad, en pocos aos los enfermos con deficiencias de alguna de estas protenas,
por ejemplo los hemoflicos, dispondrn de una fuente relativamente barata para conseguirlas.
Recientemente se anunci ya la obtencin de vacas transgnicas.
Los animales transgnicos tambin pueden usarse para muchos otros propsitos.
Fig. 7 . Mejoramiento gentico de bovinos
Las posibilidades de beneficiarnos a travs del mejoramiento gentico de las plantas ya existentes
por medio del transplante de genes es enorme, puesto que uno de los problemas que se han
generado a partir del cultivo intensivo es el uso exagerado de fertilizantes y pesticidas. Debido a
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esto permite efectuar la seleccin de un rasgo gentico especfico de un organismo e introducir ese
rasgo en el cdigo gentico del organismo fuente del alimento, por medio de tcnicas de ingeniera
gentica. esto ha hecho posible que se desarrollen cultivos para alimentacin con rasgos
ventajosos especficos u otros sin rasgos indeseables. Resumiendo, se puede decir que la
biotecnologa tiene un amplsimo rango de aplicacin en la industria alimenticia, ofreciendo los
medios para producir alimentos de mejor calidad en forma ms eficiente y segura para la salud y el
medio ambiente. una de las promesas de la biotecnologa es generar innovaciones y mejoras en
los alimentos conduciendo a prcticas agrcolas ms ecolgicas, contribuyendo a una agricultura
sustentable que utiliza con respecto los recursos del medioambiente.
El rea de mayor aplicacin de la biotecnologa en alimentos y la ms antigua, corresponde a las
fermentaciones, de gran importancia dentro de la tecnologa de alimentos y que abarca varios
campos, como fermentaciones alcohlicas, fermentaciones crnicas y fermentaciones lcticas.
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mayor
proteccin
Actividad: Organice un foro con sus compaeros sobre las ventajas y desventajas de los
alimentos gm en la alimentacin mundial, saque las conclusiones correspondientes y
presntelas en un informe. Para ello busque informacin en pginas Web.
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Los microorganismos han sido utilizados durante siglos para modificar los alimentos, y tanto stos
como las bebidas fermentadas constituyen un sector primario y extremadamente importante de la
industria aumentara. En este capitulo se describirn algunos procesos para la obtencin de
compuestos derivados del metabolismo energtico (fermentacin), metabolismo intermedio y
biosntesis
Capitulo 1: APLICACIN DE LA BIOTECNOLOGA EN LA OBTENCIN DE PRODUCTOS
DERIVADOS DEL METABOLISMO ENERGTICO POR VA FERMENTATIVA.
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Aunque !as fermentaciones alcohlicas son en gran medida anaerbicas. las levaduras necesitan
algo de oxgeno para sinterizar algunos esteroles y cidos grasas insaturados componentes de la
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En las levaduras, los valores de pH comprendidos entre 3 y 6 son la mayora de las veces
favorables al crecimiento y actividad fermentara; esta ltima es mayor cuanto mayor sea el pH y
se produce una cada notable a valores de pH de 3-4. El pH influye en la formacin de
subproductos; por ejemplo, a valores de pH elevados se incrementa la formacin de glicerol. El
pH del mosto de uva est generalmente comprendido entre 3 y 3,9 debido a su elevado
contenido de cidos (5-15 g/I), principalmente tartrico y mlico, de forma que, como la mayora
de las bacterias, con excepcin de las bacterias del cido actico y lctico prefieren pH ms
neutros, la susceptibilidad del mosto de vino a la contaminacin bacteriana es reducida.
Las temperaturas ptimas de la fermentacin, la respiracin de las levaduras y el crecimiento
celular son claramente diferentes. La velocidad de fermentacin aumenta. generalmente con la
temperatura entre los 15 y los 35C y los niveles d e glicerol, acetona, buteno-2,3-diol,
acetaldehdo, piruvato y 2-cetoglutarato se elevan en los caldos de fermentacin. La formacin
de niveles elevados de alcohol tambin depende de la temperatura. En los vinos blancos, la
menor temperatura de fermentacin da lugar a vinos ms frescos y afrutados, y el riesgo de
infeccin bacteriana y de produccin de cidos voltiles como resultado es reducido. Para la
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alcohlica, puesto que se une al acetaldehido y adems inhibe algunas de las reacciones de
oxidacin indeseables. En el mosto del vino, el SO2 inhibe algunos microorganismos indeseables,
entre ellos las bacterias del cido lctico y cido actico, as como algunas levaduras naturales que
producen un exceso de cidos voltiles, piruvato y -cetoglutarato. Adems la produccin del
desagradable sabor del cido actico tambin inhibe las fermentaciones de levaduras,
particularmente combinado con el etanol, Saccharomyces cerevisiae es ms susceptible a esta
inhibicin que Saccharomycoides ludwigii, Schizosaccharomyces pombe. En los mostos cuya
acidez total es baja, es muy til emplear S02 para inhibir la fermentacin malo-Ictica por las
bacterias del cido lctico, impidiendo la disminucin posterior del nivel de cido. Una concentracin elevada de S02 puede retrasar el comienzo de la fermentacin.
El bajo pH del mosto y del vino suministran un medio selectivo para el crecimiento de las bacterias
del cido actico y del cido lctico, aunque la supervivencia de !as primeras sea usualmente corta
debido a las propiedades reductoras del medio. Las bacterias lcticas del vino son anaerobias
facultativas u organismos microflicos que son homofermentivos (todas las Pediococcus y algunos
Lactobacillus producen cido lctico a partir de glucosa) y heterofermentivos (todos los
Leuconostoc y algunos Lactobacillus producen cido lctico, etanol y CO2 a partir de la glucosa).
Las bacterias lcticas pueden metabolizar los cidos mlico y tartrico presentes en el vino a
concentraciones elevadas, as como al cido ctrico, presente en cantidades ms bajas. Existen
mtodos qumicos para reducir la acidez. La reduccin de los cidos puede impedir el deterioro de
los vinos de pH elevado. A pH 3,3-3,4, los Leuconostocoenus fermentan el cido mlico aunque los
Pediococcus no lo hacen. Los Lellconosto se adaptan bien a los pH bajos y generalmente se
prefieren siempre que se desee una fermentacin malo-Ictica. Una fermentacin malo-lctica por
Pediococcus va con frecuencia acompaada de la formacin de diacetilo e histamina, indeseables.
Leccin 5: Alimentos basados en soja fermentada
Las fermentaciones de productos a base de saja y otras materias primas relacionadas se llevan a
cabo desde hace muchos siglos, especialmente en Oriente. Entre las fermentaciones ms
importantes
ilustrados en la Figura 1
92
C. Despus de adherirle agua salada, para hacer que el contenido de sodio alcance el 18 %, la
masa o moromi se transfiere a tinas grandes donde se produce la fermentacin secundaria, con
bacterias holofilicas y levaduras osmofilicas; el proceso tiene lugar a una temperatura de 35-40 oC,
con agitacin intermitente, y el tiempo de fermentacin oscila entre 2 y 12 meses. Al finalizar esta
fermentacin secundaria, se recupera la salsa lquida y se pasteriza. Los enzimas producidos en la
fermentacin primaria o fermentacin koji hidrolizan las protenas a pptidos y aminocidos
libres y convierten el almidn en azcares simples. Estos productos de ruptura son a su vez
metabolizados por otros microorganismos, produciendo diversos compuestos aromatizantes y
saborizantes. Utilizando inculos de levaduras, bacterias y hongos puros el proceso de
fermentacin se controla mejor y se obtiene un producto de calidad, aroma y sabor consistentes.
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que usualmente se corta en rebanadas, se sala y se consume frito, tiene una vida corta.
Leccin 6: Productos crnicos fermentados
La mayora de los productos crnicos fermentados consisten en fiambres (secos o semiseco), con
una relacin humedad-protena que oscila entre 1,5 y 3 a 1. En general, la etapa de fermentacin
microbiana tiene lugar a una temperatura ptima, previa a la de calentamiento y/o secado.
La fermentacin microbiana, que da lugar a la formacin de cido, ayuda al procesado de muy
distintas formas, puesto que contribuye a la estabilidad y alarga la vida del producto, facilita la
posterior eliminacin de humedad y genera aromas y sabores caractersticos. Generalmente se
recomienda que el pH del producto sea inferior a 5,3, basados en la creencia de que dicho valor
sirve para controlar los Staphylococcus aureus. El proceso de fermentacin para reducir el pH por
debajo de 5,3 deber ajustarse a las normas de seguridad temperatura/tiempo especificadas,
o
comprendidas entre 23,9 y 43 C durante un perodo de incubacin de entre 80 y 18 horas. Con
frecuencia se utilizan inculos comerciales, como los Pediococcus, que tienen una buena
capacidad para producir cido lctico. Los Staphylococcus carnosus, especies inocuas coagulasa
negativas, se emplean de forma rutinaria en la produccin de embutidos secos. Los nitritos influyen
positivamente en la conservacin de la carne, puesto que controlan el desarrollo de Clostridium
botulinum. Las especies de Micrococcus capaces de reducir los nitratos a nitritos, de forma
controlada, contribuyen a la curacin de la carne as corno al control de los e boculinum. Tambin
pueden utilizarse cultivos startem en el procesado del bacon, con objeto de eliminar cualquier
nitrito residual presente, disminuyendo o anulando la formacin de nitrosaminas, carcingenos,
durante la fritura.
Se puede predecir que a partir del mayor empleo de los inculos comerciales, los procesos de
fermentacin de los productos crnicos se caracterizarn por su elevado nivel de control del
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Las bacterias acidoacticas, que oxidan el etanol a cido actico y pueden existir a valores bajos
de pH, pertenecen a los gneros Acetobacter y Gluconobacter, estrechamente relacionados. Los
cultivos puros de estos organismos se caracterizan por su alto grado de variabilidad y en las
fermentaciones industriales se pueden desarrollar posteriormente cultivos mezclados a partir de
cultivos puros. Los cultivos industriales se seleccionan en funcin de que toleren una acidez
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elevada y de que las velocidades de produccin de acetato sean altas. Estas bacterias son
extremadamente sensibles y se mueren en ausencia de oxgeno y etanol y tambin resultan
daadas a gradientes de concentracin de etanol y acetato. La sensibilidad a la falta de oxgeno
aumenta a medida que lo hace la concentracin total de cido actico ms etanol. No obstante,
con una aireacin suficiente, puede conseguirse una utilizacin del 80 % de oxgeno sin producir
efectos adversos en la fermentacin. La sobreoxidacin, esto es la conversin de cido actico en
CO2 y H20 puede impedirse manteniendo la concentracin de cido actico por encima del 6 % e
impidiendo el agotamiento total del etanol.
Leccin 8: cido Lctico
Aproximadamente la mitad de la demanda mundial de cido lctico se obtiene mediante
fermentacin. Sus principales usos industriales son como acidulante alimentario (50 % del
mercado), y para la manufactura de estearoil-2-lactilato (20 %) as como en la industria
farmacutica y en otras aplicaciones.
El cido L-( + )-lctico se obtiene por fermentacin anaerobia con Lactobacillus de/bruckii y cepas
homofermentativas relacionadas. El medio contiene aproximadamente un 15 % de sacarosa o
dextrosa y nitrgeno en forma compleja. El pH se controla en fa regin de 5,0 a 6,5 mediante
neutralizacin con CaCO3 o Ca(OH)2. la temperatura se mantiene entre 45 y 60 C y el tiempo de
fermentacin es de 3 a 4 das. con lo que se obtiene un rendimiento en cido lctico del 90 al 95
%, basado en el contenido inicial de azcar. El proceso de fermentacin se basa en la conversin
de hexosa en piruvato por la ruta de Embden-Meyerhof-Parnas y su conversin en L-( + )-lactato
por el enzima L-lactato deshidrogenasa
Leccin 9: Acido Actico
El mercado mundial anual del acetato es de unos 2,5 millones de Tm. Desde 1950 los mtodos
sintticos han proporcionado la mayor parte del suministro mundial de cido actico, pero, como el
etileno es la principal materia prima utilizada y su precio se ha incrementado de 6 centavos/Kg a 30
centavos/Kg desde 1970 a 1980. han ido ganando en importancia distintas rutas de produccin
alternativas, incluyendo los mtodos biolgicos. Brasil produce cido actico por conversin
qumica de etanol, obtenido nicamente a partir de biomasa. Tambin tienen aplicacin potencial
los mtodos de fermentacin para la produccin de acetato como materia prima qumica.
En el Captulo 7 ya se ha descrito el proceso aerobio para la produccin de vinagre. En las
fermentaciones acidognicas anaerobias se producen una gran variedad de cidos grasas
voltiles. El cido actico constituye el componente mayoritario de la mezcla, aunque tambin se
producen cantidades significativas de cido propinico y butrico. Los Clostridium butyricum
producen una mezcla de cido actico y butrico a partir de glucosa. Los Clostridium thermocel/um
y e thermoaceticum fermentan la glucosa y la fructosa casi estequiomtricamente a acetato. En la
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manganeso del orden de 3 mg 1- 1. Por tanto, es necesario pretratar las molasas con agentes que
acomplejen o precipiten este metal. por ejemplo con hexacianoferrato (HCF) o con cobre, que
contrarresta el efecto del manganeso al inhibir su absorcin por las clulas. Las condiciones
deficientes en manganeso tambin favorecen la produccin de pequeos grnu los micelianos con
superficies lisas y compactas, caractersticos de las buenas fermemaciones fngicas de citrato.
Cuando la concentracin de manganeso aumenta, la morfologa fngica se vuelve fijamentosa,
incrementando drsticamente la viscosidad del cultivo y disminuyendo rpidamente de forma
concomitante la tensin del oxgeno disuelto. Como la produccin de cido ctrico necesita
oxgeno, la velocidad de produccin de cido aumenta a medida que aumenta la cantidad de
oxgeno disuelto. Adems, una corta interrupcin del suministro d~ oxgeno puede conducir al cese
irreversible de la produccin de citrato. Para la biosntesis de citrato es esencial mantener el pH por
debajo de 2.0, puesto que a pH superiores, el A. niger acumula cido glucnico en vez de citrato.
La produccin de citrato con Candida gullermondi difiere en varios aspectos del proceso
sumergido con A. niger. Por ejemplo, la deficiencia de manganeso no es un prerrequisito, siendo
innecesaria una etapa de pre tratamiento para eliminar este metal del medio; el citrato se produce
a un pH superior (3,5-5,0). Adems, la limitacin de nitrgeno provoca la acumulacin de cido. La
principal ventaja del proceso que emplea Candida respecto al que emplea A. niger consiste en que
la productividad global de la fermentacin es superior, ya que se pueden utilizar concentraciones
de azcar ms altas debido a la naturaleza ms osmotolerante de los organismos y adems la
fermentacin es ms rpida.
- Bioqumica de la produccin de citrato con A. niger
El proceso metablico que conduce a la acumulacin de citrato implica (a) la descomposicin de
las hexosas a piruvato y acetil CoA, (b) la formacin anaplertica de oxalacetato a partir de
piruvato y CO2 y (c) la acumulacin de citrato dentro del ciclo del cido tricarboxliico. En este
esquema no debera eliminarse CO2 durante la produccin de ctrato, puesto que el CO2 liberado
en la decarboxilacin oxidativa del piruvato a acetil-CoA debera utilizarse en la conversin de
piruvato en oxalacetato. El enzima clave que cataliza esta reaccin, la piruvato carboxilasa, lo
producen intrnsecamente las especies AspergiIlus. Las concentraciones elevadas de azcar
aumentan adems la actividad de este enzima as como la de los enzimas glicoliticas y pueden
inhibir algunos de los enzimas del ciclo del cido tricarboxilico. Para que se acumule citrato es
necesario que al menos uno de las enzimas de este ciclo resulte inhibido. Las evidencias recientes
sugieren que la principal etapa reguladora es la de la excetoglutarato deshidrogenasa, etapa
limitante de la velocidad en el ciclo y la nica reaccin irreversible. Este enzima se inhibe al
incrementar las concentraciones fisilogicas de oxalacetato y NADH durante la produccin de
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citrato. La fosfofructoquinasa es inhibida por el citrato, aunque esta inhibicin puede contrarrestarse con concentraciones intracelulares elevadas de NH4+
La deficiencia de manganeso reduce la actividad de algunos de los enzimas de la ruta de la
pentosa fosfato (que podran desviar las hexosas de la glicolisis y la produccin de citrato) y
tambin inhibe el ciclo del cido tricarboxilico, y adems perjudica el metabolismo anablico en
general, incluyendo el recambio de las protenas y los cidos nucleicos. Durante estas deficiencias,
se forma una proteasa cida y la reserva intracelular de cidos nucleicos y protenas disminuye con
+.
Una actividad elevada de los enzimas glicolticos y de la piruvato carboxilasa inducida por
los carbohidratos que conducen a la sntesis de citrato.
La inhibicin de un enzima del ciclo del cido tricarboxlico que podra causar la
descomposicin del citrato.
La produccin mediada por una deficiencia de manganeso de una concentracin elevada de
NH: intracelular que contrarresta la inhibicin de la fosfofructoquinasa por el citrato.
Una tensin de oxgeno elevada y el suministro continuo de oxgeno para mantener activa la
respiracin sensible al SHAM para la reoxidacin del NADH.
Un pH bajo para inactivar la glucosa oxidasa.
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La goma xantano es el nico polisacrido microbiano obtenido por la fermentacin que representa
una parte significativa del mercado mundial. Su unidad repetitiva bsica consiste en un
pentasacrido que contiene glucosa, manosa, cido glucurnico, acetato y piruvato. Esta goma
tiene una viscosidad elevada a concentraciones bajas, que es estable en un amplio rango de pH y
es independiente de la temperatura y de la presencia de cationes. En solucin acuosa y combinada
con polisacridos de las plantas forma geles estables, por lo que se utiliza como estabilizante de
suspensiones y para controlar la viscosidad. Debido a sus propiedades pseudoplsticas,
combinadas con su estabilidad frente a la temperatura ya los cationes, se emplea como lubricante.
Tambin se utiliza junto con surfactantes e hidrocarburos para mejorar la recuperacin de aceites.
Los alginatos se obtienen a partir de algas marinas, aunque como esta fuente est sujeta a una
gran variabilidad, se ha considerado interesante a nivel industrial el substituirlos por polisacridos
similares obtenidos por fermentacin, por ejemplo el polisacrido de Azotobacter vinelandii. Entre
otros polisacridos microbianos de inters comercial se incluyen el pululano, producido por
Aureobasidium pullulans, el seleroglucano, producido por especies de Selerotium y el gelano,
producido por Pseudomonas elodea.
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- 1
Y los
Investiga los procesos de produccin de cerveza y vino. Realice comparaciones relacionadas con:
Tipo de Microorganismos utilizados, Substratos y Procesos.
Investiga sobre metabolitos derivados del metabolismo intermedio y su aplicacin en la Industria
alimenticia.
Elabore un mapa conceptual que permita visualizar las diferentes aplicaciones de la Biotecnologa
en la industria alimenticia
Consulte un proceso Biotecnolgico, y realice un estudio de casos, a partir del proceso que se
desarrolla y sustntelo ante sus compaeros.
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BIBLIOGRAFIA BASICA
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