Ensayo Electroforesis

Introduccin.
La electroforesis es la separacin de molculas bajo influencia de un campo elctrico, las

cuales migran a travs de una matriz porosa hacia el ctodo o nodo, dependiendo de
una combinacin de su carga, peso molecular y estructura tridimensional.
Esta tcnica sirve como mtodo de separacin de mezclas complejas como cidos
nucleicos, protenas, y otras biomolculas, siendo de gran importancia a escala analtica
ya que permite determinar parmetros como peso molecular, punto isoelctrico (pH al cual
su carga neta es cero y en un campo elctrico no migra), numero de cadenas
polipeptdicas, caractersticas, propiedades cido-bsicas de protenas (usualmente
revisadas antes de hacer una separacin por cromatografa), etc.
La mayora de las biomolculas tiene una determinada carga elctrica, con grupos
catinicos y anicnicos capaces de disociarse, que est determinada por el pH del medio,
esto se aprovecha, ya que esta carga determinar en qu sentido se desplazar la
molcula durante la electroforesis. La velocidad de migracin electrofortica depende de
la densidad de carga de la molcula (relacin carga / peso), del voltaje aplicado y de la
porosidad del gel de electroforesis.
Factores que afectan a la electroforesis.
El xito de la electroforesis depende de mltiples factores y es imprescindible conocerlos
para tomarlos en cuenta durante el desarrollo de la tcnica.
Campo Elctrico.
Es la fuerza impulsora (gradiente de potencial) que hace posible la electroforesis, a su vez
depende de ciertos parmetros:
-
Diferencia de potencial (V). Es lo que define al campo elctrico y de este depender la
velocidad de migracin.
Intensidad (I). Se relaciona con V mediante la ley de Ohm y cuantifica el flujo de la
carga elctrica.
Resistencia (R). Cuanto mayor sea la resistencia menor ser la movilidad
electrofortica. Relacionada con la concentracin del tampn de electroforesis.

Temperatura. El efecto Joule describe la generacin de calor entre mayor sea la
diferencia de potencial y resistencia del sistema.
Muestra.
La movilidad electrofortica de una molcula es tanto mayor cuanto mayor sea su carga y
disminuye segn aumenta su tamao, ya que mayor es la friccin de la molcula con el
medio y menor es su carga por unidad de superficie. Las molculas del mismo tamao y
carga, pero con diferente forma, pueden tener una movilidad electrofortica diferente y por
lo tanto se pueden separar por electroforesis.
Tampn.
Durante una electroforesis, se produce una electrolisis del agua debido al campo elctrico,
esto genera protones en la proximidad del nodo e iones hidroxilo en el ctodo. El tampn
es esencial durante la electroforesis para evitar que el nodo se acidifique y el ctodo se
haga ms bsico, pero no debe afectar a las molculas a separar. Adems, la fuerza
inica condiciona la movilidad electrofortica de las substancias a separar, ya que influye
la conductividad de todo el sistema. Se emplean tampones con fuerzas inicas
moderadas (0.05-0.10M), siendo el pH la caracterstica que debe ser ms controlada,
puesto que determina la carga de la muestra.
Soporte.
El soporte promueve una serie de fenmenos de gran importancia durante el desarrollo de
la electroforesis:
-
Adsorcin. Es una retencin inespecfica de las molculas de la muestra sobre el

soporte, por lo que afecta negativamente a la resolucin, ensanchando las bandas
de migracin.
Electroendsmosis (EEO). Es un fenmeno que se da en algunos soportes (como
agar o agarosa) donde intervienen flujos de cationes (flujo electroendosmtico)
que afectaran la resolucin de las bandas.
Tipos de electroforesis.
Inmunoelectroforesis.
Es una tcnica principalmente cualitativa que combina una electroforesis en geles de
agarosa con una inmunodifusin, sirve para detectar protenas de manera especfica,
incluso si estas se encuentran en mnimas cantidades (g). Apropiada para el anlisis de
lquidos fisiolgicos. Los anticuerpos y las protenas (que actan como anticuerpos)
producen complejos Antgeno-Anticuerpo que precipitan y aparecen en el gel como
bandas elipsoidales. Cada protena de la muestra precipita de manera independiente, por
lo que es posible identificar el nmero de constituyentes que son reconocidos en la
muestra.
Electroforesis en geles de poliacrilamida.
Es una tcnica til para la separacin de protenas, ya sea por su tamao o peso
molecular en geles de poliacrilamida. Esta forma geles qumicamente inertes, de alta
estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos, y que principalmente
se puede ajustar el tamao de poro segn la concentracin de polmeros. Existen 3
formas diferentes de realizar electroforesis: lmina vertical, varilla cilndrica y lmina

horizontal.
Formatos de la PAGE.
-
PAGE en condiciones no desnaturalizantes: No se altera la conformacin natural de

las protenas, por lo que pueden realizarse estudios de funcionalidad una vez
separadas (actividad enzimtica, capacidad de unin de anticuerpos, unin a
receptores, etc.).
PAGE en condiciones desnaturalizante: Se usa agentes qumicos que despliegan la
conformacin tridimensional de las protenas perdiendo as su actividad biolgica. Se
pueden separar las protenas en funcin de su carga (con detergentes no inicos,
anfteros), muy bsicas o cidas (detergentes catinicos).

PAGE-SDS: Permite el clculo de parmetros moleculares (al contrario que el resto
de los tipos de electroforesis), pues los complejos SDS-protena se separan
estrictamente segn su tamao molecular. la SDS-PAGE es la electroforesis ms
utilizada para el anlisis de protenas debido a:
La gran mayora de las protenas son solubles en SDS.
Todos los complejos SDS-protena tienen carga negativa y migran, por lo
tanto, en el mismo sentido.
Su densidad de carga es muy elevada, por lo que su velocidad de migracin
tambin lo es y las electroforesis son muy rpidas.
La separacin depende de un parmetro fsico-qumico, como es la masa
molecular, que se puede calcular.
Los complejos SDS-protena se tien fcilmente.
Electroforesis en geles de gradiente.

El uso de geles de poliacrilamida que tienen un gradiente creciente de concentracin de
acrilamida + bis acrilamida, y por lo tanto un gradiente decreciente en el tamao del poro,
pueden tener ventajas sobre los geles de concentraciones uniformes de acrilamida. En un
gel en gradiente la protena migra hasta alcanzar una zona donde el tamao de poro
impida cualquier avance. Una vez se alcanza el lmite del poro no se produce una
migracin apreciable aunque no se detiene completamente. Una de las ventajas de este
tipo de geles es que resuelve mejor las 26 bandas pues las concentra en regiones ms
estrechas, adems de incrementar el rango de pesos moleculares que se pueden resolver
en un mismo gel comparado con los de una concentracin fija.
Electroforesis capilar.
La electroforesis capilar se basa en los mismos principios de las tcnicas electroforticas
convencionales, pero utiliza condiciones y tecnologa distinta que nos permiten obtener
una serie de ventajas al respecto. Separa pptidos en un capilar de slica fundida a

potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a 500 v/cm refrigerados por aire. La
corriente electroendosmtica (FEO) generada por los grupos silanol de la superficie
interna del capilar da como resultado una corriente plana del frente del lquido que
contrasta con el frente parablico de la cromatografa lquida de alta resolucin. Con esta
tcnica descrita es posible separar cationes, aniones, protenas, macromolculas y
sustancias no cargadas en forma simultnea.
Electroforesis en geles de agarosa.
La agarosa es un polisacrido, cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la
propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 C y formar un gel, semislido al
enfriarse. Este gel est constituido por una matriz o tridimensional de fibras polimricas
sumergidas en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas. Se
usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos.
Reactivos y funciones.
Reactivo
cido
actico
cido
brico
Teratgen
o.
Acrilamida
Funcin
Empleado para la formacin de geles de

poliacrilamida. Monmero
Agarosa
Azul de
bromo
fenol
Bis
acrilamida
Bromuro
de etidio
Butanol
Dodecil
sulfato de
sodio
(SDS)
Empleado para la formacin de geles de

poliacrilamida. Monmero intercalante
Se utiliza butanol saturado con agua como

disolucin de recubrimiento en el gel de resolucin.
Empleado para la desnaturalizacin de las
protenas. Rompe las interacciones no covalentes
que determinan la estructura terciaria y cuaternaria
de las protenas y les confiere una carga neta
negativa
EDTA
Glicerol
Glicina
Mercaptoe
tanol
Metanol
Persulfato
de amonio
Sucrosa
TEMED
Tris
Xilene
cianol
Aumenta la densidad de la muestra cargada en los

posos del gel de poliacrilamida con el fin de que
esta no se difunda en el buffer
Se ha utilizado como fuente de iones de arrastre (o
lentos)
Rompe los puentes disulfuro de las protenas
promoviendo su desnaturalizacin
Parte del sistema cataltico REDOX para la

polimerizacin de la acrilamida. Agente oxidante
Aumenta la densidad de la muestra cargada en los
posos del gel de poliacrilamida con el fin de que
esta no se difunda en el buffer
Parte del sistema cataltico REDOX para la
polimerizacin de la acrilamida. Agente reductor
Bibliografa
Ybar Varas, C. A. (2003). MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE ELECTROFORESIS
PARA PROTENAS Y ADN. Lima, Per: Ministerio de Salud. Divisin de Biologa
Molecular. Centro Nacional de Salud Pblica.
BIO RAD. (2013). Instruction Manual. Mini-PROTEANTetra Cell.
Morales Snchez., D., & Gallo Ramrez, L. (2006). Mtodos Fisco-Qumicos en
Biotecnologa. Plataformas de Protemica. Cuernavaca, Morelos., Mxico:
Instituto de Biotecnologa. Universidad Nacional Autnoma de Mxico .
http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio.htm

Ensayo Electroforesis

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Ensayo Electroforesis

Cargado por

Información del documento

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Ensayo Electroforesis

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

Introduccin.

La electroforesis es la separacin de molculas bajo influencia de un campo elctrico, las

Diferencia de potencial (V). Es lo que define al campo elctrico y de este depender la

electrofortica. Relacionada con la concentracin del tampn de electroforesis.

Adsorcin. Es una retencin inespecfica de las molculas de la muestra sobre el

formas diferentes de realizar electroforesis: lmina vertical, varilla cilndrica y lmina

PAGE en condiciones no desnaturalizantes: No se altera la conformacin natural de

anfteros), muy bsicas o cidas (detergentes catinicos).

Electroforesis en geles de gradiente.

una serie de ventajas al respecto. Separa pptidos en un capilar de slica fundida a

Empleado para la formacin de geles de

Empleado para la formacin de geles de

Se utiliza butanol saturado con agua como

Aumenta la densidad de la muestra cargada en los

Parte del sistema cataltico REDOX para la

También podría gustarte