Politica para La Validacion de Metodos de Laboratorios de Ensayo y Calibracion

OFICINA NACIONAL DE ACREDITACIN
Poltica Para la Validacin de Mtodos de Laboratorios

de Ensayos y Calibracin.
DOC-ONA-12-011
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1. OBJETO
Establecer una gua para las actividades de validacin de mtodos de ensayo y calibracin no
normalizados, desarrollados o diseados por el Laboratorio, mtodos normalizados
empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los mtodos
normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que el laboratorio puede
aplicar correctamente los mtodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos.
Sistematizar los procedimientos para la realizacin de la validacin de los mtodos de ensayo
y de calibracin facilitando implementacin de este aspecto por parte de los laboratorios as
como su evaluacin por parte del personal de la ONA o sus evaluadores.
Evitar las discrepancia respecto a cundo validar y la extensin de la validacin segn sea el
caso.
2. ALCANCE
Esta gua aplica a todos los laboratorios de ensayo y de calibracin acreditados por ONA y a
aquellos que soliciten la acreditacin, aplica, adems, a los evaluadores y expertos tcnicos
que actan en los procesos de acreditacin, y a todos los mtodos de ensayo establecidos
dentro del alcance de acreditacin.
3. TRMINOS / ABREVIACIONES
Adecuacin al propsito: Grado al cual los datos producidos por un proceso de medicin
permiten a un Usuario tomar decisiones tcnica y administrativamente correctas para un
Propsito establecido. (Gua EURACHEM)
Control de Calidad Interno: Serie de procedimientos asumidos por el personal de un
laboratorio para el continuo seguimiento de las operaciones y de los resultados de las
mediciones con el fin de decidir si los resultados son lo suficientemente confiables como para
ser emitidos. (Gua EURACHEM)
Especificidad: Capacidad de un mtodo analtico para obtener una respuesta debida
nicamente al analito de inters y no a otros componentes de la muestra.(Gua de validacin
de mtodos analticos, Colegio de Qumicos Farmacuticos Bilogos Mxico, A.C.)
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Equipo Tcnico de la ONA
Ing. Eduardo Zamora

Consultor de la ONA
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Lic. Adela Miranda Espinoza

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Incertidumbre de medida: Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que caracteriza

la dispersin de los valores que podran ser razonablemente atribuidos al mesurando (VIM
3.9).
Estabilidad analtica de la muestra: Propiedad de una muestra, preparada para su anlisis,
de conservar su integridad fsica o qumica y la concentracin del analito, despus de
almacenarse durante un tiempo determinado durante condiciones especficas. (Basado en la
Gua de Validacin de Mtodos analticos del Colegio Nacional de Qumicos Farmacuticos,
Bilogos, Mxico A.C. Edicin 2002)
Exactitud de una medicin: Es la proximidad de concordancia entre el resultado de una
medicin y el valor de referencia aceptado. (Gua EURACHEM)
Intervalo: Concentraciones incluidas entre la concentracin superior e inferior del analito
(incluyendo estas), para las cuales se ha demostrado que el mtodo analtico es preciso,
exacto y lineal. (Gua de validacin de mtodos analticos, Colegio de Qumicos Farmacuticos
Bilogos Mxico, A.C.)
Lmite de deteccin: El menor contenido que puede medirse con una certeza estadstica
razonable o La menor concentracin del analito en una muestra que puede detectarse, pero
no necesariamente cuantificarse bajo las condiciones establecidas de la prueba. (Gua
EURACHEM)
Lmite de cuantificacin: La menor concentracin de un analito que puede determinarse con
una precisin (repetibilidad) y una exactitud aceptables bajo las condiciones establecidas de
la prueba. (Gua EURACHEM)
Linealidad: Define la habilidad del mtodo para obtener resultados de la prueba
Proporcionales a la concentracin del analito. (Gua EURACHEM)
Nota: Se deduce que el intervalo lineal es el intervalo de concentraciones del analito dentro
del cual los resultados de prueba obtenidos por el mtodo son proporcionales a la
concentracin del analito.
Material de Referencia (MR): Material o sustancia en la cual uno o ms valores de sus
propiedades son suficientemente homogneos y bien definidos como para ser utilizados en la
calibracin de aparatos, en la evaluacin de un mtodo de medicin o para asignar valores a
otros materiales. (Gua EURACHEM)
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Material de Referencia Certificado (MRC): Material de referencia acompaado de un

certificado, en el cual uno o ms valores de sus propiedades estn certificados por un
procedimiento que establece trazabilidad a una realizacin exacta de la unidad en la cual se
expresan los valores de la propiedad y en el que cada valor certificado se acompaa de una
incertidumbre con un nivel declarado de confianza. (Gua EURACHEM)
Mensurando: Magnitud particular sometida a medicin (VIM 2.6)
Mtodos no normalizados: Se refiere a los mtodos que son proporcionados por el
proveedor de un equipo y no provienen directamente de un libro oficial, por lo que no pueden
considerarse como desarrollados por el laboratorio, pero s pueden ser validados por l.
Repetibilidad (de los resultados de las mediciones): Precisin en condiciones de
repetibilidad, es decir, condiciones segn las cuales los resultados independientes de una
prueba se obtienen con el mismo mtodo, sobre objetos de prueba idnticos, en el mismo
laboratorio, por el mismo operador, usando el mismo equipo y dentro de intervalos de tiempo
cortos. (Gua EURACHEM).
Precisin: Es la proximidad de concordancia entre los resultados de pruebas independientes
obtenidos bajo condiciones estipuladas. (Gua EURACHEM)
Nota 1: La precisin depende slo de la distribucin de los errores aleatorios y no se relaciona
con el valor verdadero o valor especificado. La medida de la precisin generalmente se calcula
como una desviacin estndar de los resultados de la prueba. Resultados de prueba
independientes significa que los resultados fueron obtenidos de tal forma que no son
influenciados por cualquier otro resultado previo sobre el mismo o similar objeto de prueba.
Las mediciones cuantitativas de la precisin dependen en forma crtica de las condiciones
estipuladas. La Repetibilidad y la Reproducibilidad son series particulares de condiciones
extremas.
Precisin intermedia: La precisin intermedia expresa la variacin dentro de un laboratorio
en: diferentes das, diferentes analistas, diferente equipo, etc. (Gua EURACHEM).
Protocolo de Validacin: Descripcin de pruebas especificas para demostrar que un proceso
da resultados que cumplen con los criterios preestablecidos de manera consistentes Gua de
validacin de mtodos analticos, Colegio de Qumicos Farmacuticos Bilogos Mxico, A.C.)
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Prueba de Robustez: Estudio dentro del laboratorio para evaluar el comportamiento de un

proceso analtico cuando se efectan pequeos cambios en las condiciones ambientales y/o
de operacin, semejantes a aqullos que pudieran surgir en los diferentes ambientes de
prueba. La prueba de robustez permite obtener informacin de los efectos de cambios
menores de una forma rpida y sistemtica (Gua EURACHEM).
Rango: Se define como el intervalo entre la concentracin superior e inferior para las cuales
se ha demostrado la correcta precisin, exactitud y linealidad del mtodo. (Validacin de
mtodos analticos; A.E.F.I.) 2001.
Reproducibilidad: Precisin bajo condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones
segn las cuales los resultados de prueba se obtienen con el mismo mtodo, sobre objetos de
prueba idnticos, en diferentes laboratorios, por diferentes operadores, usando diferentes
equipos. (Gua EURACHEM)
Recuperacin: La fraccin de analito adicionada a una muestra de prueba (muestra
fortificada o adicionada) previa al anlisis que es determinada efectivamente por el mtodo;
el porcentaje de recuperacin (%R) entre las muestras fortificadas y sin fortificar se calcula
como sigue:
%R = [(CF-CU)/CA] x 100
Donde CF es la concentracin de analito medida en la muestra fortificada; CU es la
concentracin de analito medida en la muestra sin fortificar; CA es la concentracin del
analito adicionado (valor medido, no determinado por el mtodo) en la muestra fortificada.
(Gua EURACHEM).
NOTA 2: La recuperacin tambin puede evaluarse comparando estadsticamente las
pendientes de las curvas de calibracin obtenidas por adicin de la solucin patrn (AP) y la
obtenida con las soluciones del patrn puro (PP). El clculo del porcentaje de recuperacin se
realiza utilizando la siguiente frmula (ANALISIS, Validacin de Mtodos Analticos: deteccin
del sesgo, Vol 22, N 5, 1994):
%R
pendiente ( AP )
100
pendiente ( PP )
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Revalidacin: La revalidacin de un mtodo analtico consiste en repetir de forma total o

parcial su validacin, ya sea debido a modificaciones en el mtodo, equipos, en la muestra a
analizar, etc. para garantizar la obtencin de resultados fiables. (Validacin de mtodos
analticos; A.E.F.I.) 2001.
Sesgo: La diferencia entre el valor esperado (x) de los resultados de prueba y un valor de
de la muestra de referencia. El sesgo se puede evaluar como porcentaje:
NOTA 3:
a) La veracidad puede calcularse como el complemento del sesgo: %V = 100 - E% (gua de
validacin de la Unin Europea).
b) Si no se tiene la muestra de referencia, el sesgo puede ser el complemento de la
recuperacin. Se puede calcular como porcentaje: %E = 100 - %R.
Sensibilidad: El cambio en la respuesta de un instrumento de medicin dividido por el
correspondiente cambio del estmulo. (Gua EURACHEM).
Nota 4: El estmulo puede ser por ejemplo, la cantidad del mensurando presente. La
sensibilidad puede depender del valor de estmulo. Aunque esta definicin se aplica
claramente a un instrumento de medicin, tambin puede aplicarse al mtodo analtico como
un todo, tomando en cuenta otros factores tales como el efecto de los niveles de
concentracin.
Validacin: Confirmacin mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han
cumplido los requisitos para una utilizacin o aplicacin especfica prevista. (ISO
9000:2008/3.8.5)
Validacin de un Mtodo:
1. El proceso de establecer las caractersticas de desempeo y limitaciones de un mtodo y la
identificacin de las influencias que pueden modificar esas caractersticas y hasta qu punto.
Qu analitos puede determinar el mtodo, en qu matrices, en presencia de qu
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interferencias? En esas condiciones, qu niveles de precisin y de exactitud pueden

alcanzarse?
2. El proceso de verificacin de que un mtodo es adecuado a su propsito, o sea, para
resolver un problema analtico particular. (Gua EURACHEM)
Nota 5: La definicin 1. Es aplicable cuando un mtodo se desarrolla sin tener en mente
ningn problema en particular.
La definicin 2. Es aplicable cuando el mtodo se est desarrollando con un propsito
especfico. En qumica analtica otro uso comnmente encontrado del trmino de validacin
es en el contexto de instrumentacin. La Validacin de Instrumentos se usa para describir el
proceso de establecer que un instrumento en un momento dado es capaz de desempearse de
acuerdo a la especificacin diseada. Estos procesos podrn alcanzarse, por ejemplo,
mediante calibraciones o verificaciones de desempeo.
Verificacin: Confirmacin mediante la aportacin de evidencia objetiva de que se han
cumplido los requisitos especificados. (ISO 9000:2008/3.8.4)
Valor verdadero convencional (de una magnitud): Valor atribuido a una magnitud
particular y aceptado, algunas veces por convencin, por tener una incertidumbre apropiada
para un propsito dado. (Gua EURACHEM)
Nota 6: Valor Verdadero Convencional algunas veces es denominado valor asignado,
mejor estimado del valor, valor convencional o valor de referencia. Frecuentemente, se
utiliza un cierto nmero de resultados de medicin de una magnitud para establecer un valor
verdadero convencional.
4. INTRODUCCIN
La validacin ha sido objeto de atencin por ser requerida en normas sobre sistemas de
gestin de la calidad, sobre software y particularmente en la norma ISO/IEC 17025 sobre
requisitos generales para laboratorios de calibracin y ensayo.
La aplicabilidad del requisito sobre validacin de mtodos, particularmente en la norma
ISO/IEC 17025, ha sido frecuentemente materia de controversia dado que cabe la
interpretacin de que cuando se menciona o se describe un mtodo en una norma, entonces
denominado mtodo normalizado, no es ya necesaria la validacin del mismo.
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El propsito de este trabajo es discutir el concepto de validacin, los elementos que lo

constituyen y los procesos para llevarla a cabo, con la esperanza de reducir las controversias
respecto a este tema.
Para que un resultado analtico concuerde con el propsito requerido, debe ser lo
suficientemente confiable para que cualquier decisin basada en ste pueda tomarse con
confianza. As, el desempeo del mtodo debe validarse y debe estimarse la incertidumbre del
resultado a un nivel de confianza dado. La incertidumbre deber ser evaluada y establecida de
una forma que sea ampliamente reconocida, consistente de forma interna y fcil de
interpretar. La mayor parte de la informacin requerida para evaluar la incertidumbre se
puede obtener durante la validacin del mtodo.
La validacin es el proceso establecido para la obtencin de pruebas documentadas y
demostrativas de que un mtodo de anlisis es lo suficiente fiable y reproducible para
producir el resultado previsto dentro de intervalos o parmetros definidos y para el propsito
requerido.
Esta gua aplica a todos los laboratorios de ensayo y de calibracin acreditados por ONA y a
aquellos que soliciten la acreditacin, aplica, adems, a los evaluadores y expertos tcnicos
que actan en los procesos de acreditacin, y a todos los mtodos de ensayo establecidos
dentro del alcance de acreditacin.
5. REQUISITOS GENERALES
5.1. Pasos para la validacin
Cada validacin de un procedimiento consiste en tres pasos:
5.1.1 Establecimiento del protocolo de validacin
5.1.2 Realizacin de la validacin,
5.1.3 Elaboracin del informe de validacin
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5.1.1. Establecimiento del protocolo de validacin

El protocolo de validacin deber contener al menos la siguiente informacin:
Debe incluir una identificacin nica cdigo

El objetivo y alcance
Responsables de las actividades de validacin
La definicin del sistema a validar
Procedimiento para la identificacin de los parmetros a validar
El diseo del plan experimental (incluyendo el muestreo si aplica)
Equipos y su calificacin adecuada al uso (incluye trazabilidad)
Descripcin del mtodo
Los criterios de aceptacin.
Debe ser especfico para cada tipo de muestra y mtodo.
Debe ser firmado y fechado por las personas responsables de la validacin y
aprobacin.
A. Objetivo: Exposicin de la finalidad de la validacin y propuestas de fechas de inicio y

finalizacin de la evaluacin.)
B. Alcance: Delimitacin de tipo de muestra, matriz, analito, rango de concentracin, tcnica
analtica, etc.) Formula cuali-cuantitativa cuando aplique. Aplica en casos de anlisis de
formulacin conocida
C. Responsables: Personal a cargo de la validacin: Analista(s), responsable(s) de la
Validacin, Jefe de Laboratorio, Responsable de Calidad. Debidamente autorizado para tal
fin.
D. Procedimiento para la determinacin de los parmetros a validar: Los parmetros
de desempeo a estudiar se seleccionan en funcin de las caractersticas de la muestra, tipo
de mtodo analtico y rango de concentracin del analito.
Se puede hacer una tabla que permita visualizar los parmetros de desempeo, como se
har la determinacin de cada parmetro de desempeo y que se reportara para la
evaluacin final
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Ejemplo de algunos parmetros, algunas determinaciones y estadsticos a calcular.
PARAMETRO
DE
DESEMPEO
DETERMINACION
REPORTAR
Un analista prepara solucione de estndar al

Precisin del
100% de la concentracin del analito desde una
sistema
solucin ms concentrada y la lee o inyecta 6
instrumental
veces en forma consecutiva
Un analista debe preparar por lo menos por
triplicado 5 niveles de concentracin de la
solucin de referencia por dilucin (a partir de
una solucin ms concentrada).La concentracin
central debe ser la concentracin que representa
Linealidad
el 100% en la muestra procesada para su
del sistema
medicin. El intervalo debe incluir la
(1)
especificacin. Medir la respuesta analtica bajo
las mismas condiciones de medicin, reportar la
relacin concentracin vs respuesta analtica
(Ejemplo. 60%,80%,100, 120%,140%)
Coeficiente de
variacin %
Coeficiente de
determinacin
(r2)
Pendiente (b)
Intervalo de confianza
de la pendiente IC (1)
Rango lineal
Y de igual forma los otros parmetros

E) muestreo: El muestreo se realiza de acuerdo con procedimientos escritos, (si aplica) en
los cuales se indican los sistemas de identificacin y tratamiento previo de las muestras, si se
precisan placebos. (en caso de anlisis de formulacin conocida)
F)
Equipos involucrados en la validacin: se mencionan los equipos implicados en el
proceso de validacin (pHmetros, balanzas, cromatgrafos, etc.), y documentar que estn
convenientemente calificados y adecuados a la mediciones a realizarse y calibrados,
referenciando estos datos en el informe de validacin.
G)
Descripcin del mtodo analtico: debe describirse el mtodo tal cual ser puesto en
el uso rutinario, detallando todos los elementos abajo mencionados, y haciendo nfasis en
puntos crticos de la metodologa, condiciones instrumentales y nmero de repeticiones,
verificacin de idoneidad de las condiciones operatorias definidas, formulas para el clculo de
resultados y su tratamiento estadstico si es necesario, bibliografa y referencias.
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H)
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Reactivos
Estandares
Materiales
Instrumentacin
Condiciones ambientales
Medidas de seguridad para el uso de reactivos
Preparacion de reactivos
Preparacin de estandares
Preparacion de la muestra
Procedimiento
Calculos
Criterios de aceptacin: se establecer a priori para cada uno de los parmetros,

basndose en las necesidades o finalidad del mtodo y en la informacin recogida durante
la fase de desarrollo del procedimiento analtico.
Ejemplo de algunos parmetros, estadsticos a reportar y sus lmites.
PARAMETRO DE
DESEMPEO
Precisin del sistema
REPORTAR
LIMITE
Coeficiente de variacin
1.5%
Coeficiente de determinacin ( r 2 )
0.98
Pendiente (1)
Linealidad del sistema
Intervalo de confianza de la pendiente IC (1)

Rango lineal
No debe
incluir el
cero
--------
Y de igual forma los otros parmetros
5.1.2. Realizacin de la validacin.

Una vez se ha aprobado el protocolo se procede a hacer la validacin de acuerdo al mismo.
Aqu se incluye el proceso de clculo estadstico de los distintos parmetros evaluados.
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5.1.3. Elaboracin del informe de validacin.

El informe de validacin contendr la informacin suficiente para poder concluir acerca de
la validacin que se ha desarrollado. Debe incluir:
Protocolo de validacin (o hacer referencia al mismo a travs de un cdigo),

Resultados Analticos,
Resultados Estadsticos,
Interpretacin de resultados,
Conclusiones,
Declaracin de aptitud del Mtodo al uso previsto y
Cuando aplique el certificado de validacin el cual podr incluir:
Analito evaluado
Matriz o matrices ensayadas
Tcnica utilizada
Documentos relacionados (protocolos, procedimientos, instrucciones de trabajo)
Rango Validado
Cuadro resumen con los resultados de los parmetros de desempeo evaluados.
Analistas autorizados para la realizacin del ensayo.
Adems ser autorizado por o las personas asignadas por el laboratorio.

5.2. Establecimiento de las condiciones y alcance de la validacin
5.2.1. Establecimiento de las condiciones
El laboratorio responsable del anlisis o ensayo debe definir las condiciones y el alcance de la
validacin de acuerdo a lo definido por esta gua y a su caso en particular.
En el caso de que el cliente lo solicite, el responsable del anlisis o ensayo deber ponerse de
acuerdo con el cliente sobre este aspecto.
5.2.2. Establecimiento del alcance de la validacin
Se diferencian tres casos, en los que la dificultad de la validacin aumenta del primero al
tercero:
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1.
Se trata de un mtodo de ensayo estandarizado y normalizado, que se aplica

exactamente como est descrito en la norma/procedimiento.
2.
Se trata de una modificacin a un mtodo de ensayo normalizado o cuando se use un

mtodo proporcionado por el proveedor de un equipo o sistema analtico. Ejemplos: un
mtodo de extraccin diferente u otra matriz, rangos distintos de trabajo.
3.
Se trata de un mtodo de ensayo desarrollado en el laboratorio y que no se encuentra

en normas u otras colecciones de mtodos.
La validacin en los casos descritos en el numeral 5.2.2 tiene objetivos distintos como lo
establece la tabla siguiente (tabla a).
Tabla a: Objetivos de la validacin segn el tipo de procedimiento de ensayos
Mtodo de ensayo
Caso 1: mtodo
Normalizado
Objetivos de la Validacin
Comprobacin de que el laboratorio domina el ensayo y lo
utiliza correctamente (Verificacin)
Comprobacin de que la modificacin introducida en el

mtodo original no afecta la capacidad del laboratorio para
Caso 2: Mtodo
proporcionar resultados confiables. Ejemplos: Cambio del
normalizado modificado o mtodo de extraccin, otra matriz, cambios en el pH.
uno no normalizado
Demostrar que el mtodo proporcionado por el fabricante es
capaz de dar resultados confiables para el fin propuesto.
Caso 3: mtodo
Desarrollado / interno.
Comprobacin de que el mtodo cumple con las caractersticas

necesarias para dar resultados confiables para el fin propuesto.
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Tabla b: Alcance de la validacin segn el tipo de procedimiento de ensayo

Mtodos Normalizados
Identificacin
Parmetros
Selectividad/ Especificidad
Estabilidad analtica de la
muestra
Linealidad del Sistema
Linealidad del Mtodo
Rango
Exactitud
Repetibilidad
Precisin Intermedia
Reproducibilidad
Lmite de Deteccin
Lmite de Cuantificacin
Robustez
Cuantificacin
de
componentes
mayoritarios
+
Cuantificacin
de Evaluacin de
componentes
caractersticas
minoritarios
o establecidas*
impurezas en trazas
+
+
No
No
No
No
No
No
No
+
No
+
S
+
+
S
S
S
++
No
+
+
S
+
+
S
S
S
++
No
+
+
+
+
+
+
S
S
++
No
+
+
+: Puede o no requerirse, dependiendo de la normativa de referencia o la naturaleza del

anlisis
++: Depender de la disponibilidad de laboratorios.
*: En esta categora se hace alusin a procesos previos a la cuantificacin (ej: disolucin,
liberacin de analitos, etc) el mtodo usado para la cuantificacin (cuando aplique) se
validar de acuerdo a columnas 2 3.
Parmetros
muestra
Mtodos Normalizados Modificados o No Normalizados

Identificacin Cuantificacin Cuantificacin de Evaluacin
de
de
componentes
caractersticas
componentes minoritarios
o establecidas*
mayoritarios
impurezas
en
trazas
S
+
+
+
+
No
No
S
S
Si
S
+
+
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Rango
Exactitud
Repetibilidad
Precisin Intermedia
Reproducibilidad
Lmite de Deteccin
Robustez
Versin :01
No
No
No
No
No
+
No
+
S
S
S
S
++
No
+
+
Revisin :00
S
S
S
S
++
Si
S
+
+
+
S
S
++
No
+
+

anlisis o de las modificaciones que se le hagan al mtodo.
Identificacin
Parmetros
muestra
Rango
Exactitud
Repetibilidad
Precisin Intermedia
Reproducibilidad
Lmite de Deteccin
Robustez
Mtodos Desarrollados / Internos

Cuantificacin de Cuantificacin de Evaluacin de
componentes
componentes
caractersticas
mayoritarios
minoritarios
o establecidas*
impurezas
en
trazas
S
S
+
No
No
No
No
No
No
No
S
No
+
S
S
S
S
S
S
++
No
+
Si
S
S
S
S
S
S
++
+
S
S
+
+
+
+
S
S
++
No
+
+

anlisis.
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6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA
Vocabulario Internacional de Trminos Bsicos de Metrologa (VIM), Segunda edicin

1993.
ISO 9000:2008 Sistema de Gestin de la Calidad Conceptos y Vocabularios.
Norma NSR ISO/IEC 17025:2005 (NSR 03.00.07:06) Requisitos Generales para la
Competencia de los Laboratorios de Ensayo y Calibracin
Mtodos Analticos Adecuados a su propsito 2 Edicin de la Eurachem, Publicacin
tcnica CNM-MRD-PT-030, CENAM
Gua para la Validacin de mtodos de ensayo del OAA DC-LE-05
Validacin de mtodos analticos; Asociacin Espaola de Farmacuticos de la Industria
A.E.F.I., Barcelona marzo del 2001.
The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation
and Related Topics. First Edition 1998. EURACHEM.
Gua de Validacin de Mtodos Analticos. Colegio Nacional de Qumicos Farmacuticos
Bilogos. Mxico Primera Edicin mayo de 2002.
7. REGISTROS
No aplica.
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8. ANEXOS
ANEXO 1: Ejemplos para la Determinacin de Parmetros de Validacin para Mtodos
Qumicos de Anlisis.
1. Selectividad/ Especificidad
Procedimiento de la evaluacin de la selectividad
En el estudio de la selectividad, como norma general se comparan los resultados del anlisis
de muestras con y sin analito en presencia o ausencia de impurezas, productos de
degradacin, sustancias relacionadas, excipientes (matriz o placebo), y dependiendo del tipo
de muestra, tipo de tcnica analtica, instrumento de medicin.
Partiendo de la experiencia en el anlisis de la muestra, se deben establecer las posibles
sustancias y/o elementos y adicionar cantidades conocidas de stas, solas o combinadas a la
muestra y evaluar su respuesta al mtodo, bajo las mismas condiciones de anlisis.
Para mtodos de Identificacin
-
Se deben seleccionar sustancias que potencialmente interfieran en la determinacin

con base en la estructura molecular del analito, precursores, sustancias relacionadas,
vas degradativas, entre otros.
Para mtodos de Contenido/Valoracin de impurezas.

-
Si se dispone de las impurezas se deben adicionar stas al analito y/o a la muestra

analtica en niveles que incluya la especificacin. Analizar como lo indica el mtodo.
Cuando no se dispone de las impurezas, la muestra que contiene el analito debe

someterse a condiciones que generen su inestabilidad qumica (luz, calor, humedad,
hidrlisis, cido-bsica y oxidacin) y aplicar el mtodo a la muestra resultante.
Para mtodos de lmite de impurezas

Proceder a analizar, como lo indica el mtodo los siguientes:
-
Muestras individuales de la impureza (orgnicas, inorgnicas, o solventes residuales).

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-
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El producto (de pureza aceptable)

Y la mezcla de estos.
Para mtodos indicadores de estabilidad

Si se cuenta con los productos de degradacin, preparar muestras
-
La matriz sola
con matriz adicionada de estos
la matriz adicionada del analito
la matriz adicionada analito y de productos de degradacin.
Analizar como lo indica el mtodo.
Para anlisis farmacuticos si no se tienen los posibles productos de degradacin se pueden

emplear, dependiendo de la naturaleza qumica del analito y si es posible, las siguientes
condiciones para favorecer la inestabilidad del analito en la muestra:
Analito, matriz y muestra
Condiciones
1. En un horno desde 70C a 120 C o a 20 C por
debajo del punto de fusin del analito 2 a 4
semanas
2. Exponer a luz UV, fluorescente y/o humedad
relativa, por un tiempo apropiado
3. Hacer soluciones, ajustando el pH de 1 a 2 (HCl
0.1N) y/o de 10 a 12 (NaOH 0.1N) y someterlas a
60 C por un tiempo apropiado
4. Para muestras liquidas o semislidas (formas
farmacuticas) adicionar perxido de hidrogeno
(3%) para favorecer la oxidacin del analito.
Estos estudios no se deben llevar a cabo para analitos que segn la bibliografa, tengan
propiedades reactivas que puedan dar lugar a condiciones inseguras al someter las muestras
a las condiciones antes mencionadas.
El tiempo y las condiciones se seleccionan con el fin de degradar al analito a niveles de un 15 a
30%.
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En el caso de mtodos no selectivos, como por ejemplo los mtodos que utilizan sistemas de
medicin volumtricas, la especificidad para los componentes de una muestra, es sustentada
con los resultados de exactitud y linealidad del mtodo cumplidos los criterios de aceptacin.
Cuando haya duda en la demostracin de la especificidad de un mtodo analtico, se sugiere
que sea investigada por otra metodologa de soporte.
Los resultados del estudio de selectividad estn vinculados principalmente al origen de
la muestra, su preparacin y las condiciones instrumentales. Cualquier cambio en estos
factores supone reconsiderar el estudio realizado.
Criterios de aceptacin
La respuesta del mtodo debe ser nicamente debida al analito.
2. Estabilidad analtica de la muestra
El analista debe establecer la etapa de anlisis en la cual se desea evaluar la estabilidad,
adems de determinar si en dicha etapa es posible fraccionar (muestras dependientes) o no
(muestras independientes) y las condiciones de almacenaje.
Muestras dependientes
El analista debe procesar hasta la etapa preestablecida por lo menos por triplicado una
muestra homognea.
Fraccionar cada una de las preparaciones de acuerdo a las condiciones de almacenaje
(Ambiente, Refrigeracin, t C , etc. durante un tiempo determinado ) de inters.
Terminar el anlisis de una de las fracciones de cada preparacin.
Proseguir el anlisis de cada una de las fracciones al trmino de cada condicin de
almacenaje, utilizando una solucin de referencia recientemente preparada, si el
mtodo contempla el uso de una solucin de referencia.
Reportar el resultado.
Muestras independientes
A partir de una muestra homognea, el analista debe analizar por triplicado hasta
completar el anlisis y obtener el resultado.
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Simultneamente y de la misma muestra, procesar el nmero de muestras necesarias

para cada condicin de almacenaje hasta la etapa preestablecida (preparaciones) por
triplicado.
Proseguir el anlisis de cada una de las preparaciones al trmino de cada condicin de
almacenaje, utilizando una solucin de referencia recientemente preparada, si el
mtodo contempla el uso de una solucin de referencia.
Reportar el resultado
Clculos
Calcular la media aritmtica del anlisis inicial y de cada condicin de almacenaje
Calcular la diferencia absoluta de la media aritmtica de cada condicin de almacenaje
respecto del anlisis inicial
di 2% para mtodos cromatograficos y volumtricos
di 3% para mtodos qumicos o espectrofotometricos
di 5% para mtodos biolgicos
No mayor a una magnitud preestablecida, acorde a la especificacin del analito en la
muestra.
Otros criterio de aceptacin, deben ser justificado.
3. Linealidad del Sistema
Un analista debe preparar por lo menos por triplicado 5 niveles de concentracin
(Intervalo o rango) de la solucin de referencia ya sea por dilucin (a partir de una
misma solucin concentrada o por pesadas independientes (cuando no sea posible
prepararlas por dilucin).
La concentracin central debe ser igual a la que se prepara la solucin de referencia en
el mtodo.
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El intervalo debe incluir la especificacin para el caso de aquellos mtodos utilizados

para evaluar muestras que se conoce el contenido estimado de activo (ejemplo formas
farmacuticas, Principios activos)
Medir la respuesta analtica bajo las mismas condiciones de medicin, reportar la
relacin concentracin vs. respuesta analtica (Ejemplo: Concentracin vs. rea,
Concentracin vs. Absorbancia).
Calcular el valor de la pendiente (b), la ordenada en el origen (a), el coeficiente de
determinacin ( r2 )y el intervalo de confianza para la pendiente ( IC(b)). Si el mtodo
presenta un ajuste distinto a la lnea recta, utilizar la estadstica apropiada y
justificarla.
El intervalo (rango) est en funcin del propsito del mtodo, y por lo general se expresa
como concentracin. Es crtico que el intervalo no excluya valores de concentracin que
potencialmente puedan dar lugar al contenido del analito en la muestra.
En anlisis farmacutico:
Para Contenido/valoracin/Potencia , sugiere un mnimo de 20%
Para Contenido / Valoracin de impurezas desde un nivel apropiado hasta un 20%
por arriba de la especificacin.
Para mtodos indicadores de estabilidad desde un nivel apropiado hasta un 120%.
r2 0.98
IC (1), no debe incluir el cero
Otros criterios de aceptacin debe ser justificado.
4. Linealidad del mtodo y Rango
Se conocen los componentes de la muestra y es posible preparar una matriz.
Un analista debe preparar una matriz con el tipo de componentes que generalmente
estn presentes en la muestra.
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A la cantidad de matriz analtico equivalente a una muestra analtica por triplicado,

adicionarle la cantidad de analito (puede ser una sustancia de referencia secundaria)
correspondiente al 100% de este en la muestra.
Seleccionar al menos dos niveles, superior e inferior de la cantidad del analito
(intervalo) y preparar el matriz adicionado al menos por triplicado a cada nivel,
manteniendo constante la cantidad de matriz analtico en los tres niveles.
Los matriz adicionados deben ser analizados por un mismo analista bajo las mismas
condiciones, utilizando como referencia, la sustancia empleada en la adicin al matriz
analtico.
Como lo indica el mtodo, preparar 3 soluciones estndar al 100% de la concentracin
terica.
Realizar una determinacin de cada matriz adicionado, de acuerdo a la siguiente
secuencia:
Estndar
Matriz adicionado nivel inferior
Matriz adicionado 100%
Matriz adicionado nivel superior
Hasta terminar los 3 bloques
Hacer clculos, como lo indica el mtodo para cada bloque de muestras con referencia
a su estndar respectivo.
Determinar la cantidad recuperada del analito.
No se conocen los componentes de la muestra
Un analista debe analizar la muestra con el mtodo, para determinar el contenido del
analito.
El mismo analista debe preparar por lo menos 3 muestras adicionadas, por ejemplo
utilizando la mitad de la muestra analtica que originalmente requiere el mtodo y
adicionar el analito (puede ser una sustancia de referencia secundaria) hasta
completar lo que represente el 100% de ste en la muestra.
Seleccionar al menos dos niveles, superior e inferior de la cantidad del analito
(intervalo) y preparar la muestra adicionada al menos por triplicado a cada nivel,
manteniendo constante la cantidad de muestra en los tres niveles.
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Las muestras adicionadas deben ser analizadas por un mismo analista bajo las mismas
condiciones utilizando como referencia la sustancia empleada en la adicin de la
muestra.
Realizar una determinacin de cada preparacin de muestra, de acuerdo a la
siguiente secuencia :
Estndar
Muestra adicionada nivel inferior
Muestra adicionada 100%
Muestra adicionada nivel superior
Hasta terminar los 3 bloques
Hacer clculos, como lo indica el mtodo para cada bloque de muestras con referencia
a su estndar respectivo.
Determinar la cantidad recuperada del analito.
Cuando no sea posible adicionar de manera directa el analito a la muestra, la adicin pude ser
llevada a cabo en alguna etapa del mtodo. Se recomienda que la adicin se lleve a cabo en las
primeras etapas del mtodo, para poder asegurar que las etapas posteriores, no den lugar a
resultados incorrectos.
Por ejemplo, si una muestra se debe extraer, filtrar y diluir, es conveniente que la adicin se
lleve a cabo antes de extraer; ya que si existiera algn problema con la extraccin o con la
filtracin, puede dar lugar a resultados incorrectos si el analito se adiciona a la muestra o
matriz analtico hasta antes de diluir.
El intervalo (rango) de la concentracin del analito adicionado, depende del propsito del
mtodo y debe incluir la especificacin, los limites segn una normativa en particular.
En anlisis farmacutico segn la gua ICH Q2A se recomienda los rangos segn el
propsito de mtodo cuantitativo.
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Propsito del
mtodo
Valoracin del
contenido de
principio
activo
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Rango recomendado para

estudiar la linealidad
En especialidades farmacuticas de 80 -120%
90 110% a caducidad respecto al
valor nominal
En materia prima 98 102% o 99
101%
85 -115%
70 -130% (*)
Especificacin
Uniformidad
de contenido
Disolucin de Siendo
Q
la
especificacin
principio
establecida .(segn USP)
activo
Cuantificacin Depende de cada impureza
de Impurezas
20% respecto a la especificacin

Rango= (Q+20%, Q-20%)
Desde el lmite de cuantificacin o

desde el 50% de la especificacin
limite de cada impureza hasta un
120% de dicha especificacin
(*) En el caso de que el procedimiento analtico para el anlisis del contenido y el de uniformidad
coincidan, puede aprovecharse el mismo rango y evaluar la linealidad una sola vez entre el 70
130%
Reportar la relacin cantidad adicionada vs cantidad recuperada o seal obtenida
Utilizando el mtodo de estimacin por mnimos cuadrados, calcular el valor de la pendiente
( b ), la ordenada en el origen ( a ), el coeficiente de determinacin ( r2 ), el intervalo de
confianza para la pendiente ( IC(b)), el intervalo de confianza para la ordenada al origen (
IC(a)), y el coeficiente de variacin de regresin (CV y/x ).
Calcular
Promedio aritmtico, la desviacin estndar (S), el coeficiente de variacin (CV) y el intervalo
de confianza para la media poblacional IC ( ) del porcentaje de recobro (recuperacin)
Cantidad adicionada vs cantidad recuperada
r2 0.995 (El criterio de aceptacin definido por el laboratorio depender del tipo de anlisis
y del nivel de concentracin del analito en la matriz.)
IC (b), debe incluir la unidad
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IC (a), debe incluir el cero

El (CVy/x) coeficiente de variacin de regresin (del porcentaje de recobro) no > 2% si el
mtodo es volumtrico o cromatogrfico, no > 5% si el mtodo es qumico o
espectrofotomtrico
Cantidad adicionada vs. seal obtenida
r2 0.995 (El criterio de aceptacin definido por el laboratorio depender del tipo de anlisis
y del nivel de concentracin del analito en la matriz.)
IC (b), no debe incluir el cero
El (CVy/x) coeficiente de variacin de regresin (del porcentaje de recobro) no > 2% si el
mtodo es volumtrico o cromatogrfico, no > 5% si el mtodo es qumico o
espectrofotomtrico
CRITERIOS DE DECISIN SOBRE LA LINEALIDAD:
treg >> ttab. Correlacin significativa.
tint < t tab. Intercepto significativamente diferente de cero.
tpend > ttab. Pendiente significativamente diferente de cero.
CLCULOS ESTADSTICOS INVOLUCRADOS EN LA EVALUACIN DE LA LINEALIDAD
ENSAYO DE HIPTESIS PARA LA CORRELACIN
Suposiciones: Ausencia de dependencia lineal entre las variaciones de la seal analtica y la
concentracin del analito.
Hiptesis Nula: H0: r = 0
Alternativa: H1, dos colas: r 0.
Una cola: r < 0 y r > 0.
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ESTADSTICO DE PRUEBA: t
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r (n 2)
1 r2
CRITERIOS DE DECISIN:
Si tcalculado > tCrtico: La correlacin entre la variacin de la seal analtica y la variacin de la
concentracin es significativa.
Si tcalculado < tCrtico: La correlacin entre la variacin de la seal analtica y la variacin de la
concentracin no es significativa.
CONCLUSIONES:
Si la correlacin entre la variacin de la seal analtica y la variacin de la concentracin es
significativa: La linealidad es adecuada.
Si la correlacin entre la variacin de la seal analtica y la variacin de la concentracin es
significativa: La linealidad no es adecuada
ENSAYO DE HIPTESIS PARA LA PENDIENTE (b).
Suposiciones: Ausencia de linealidad.
Hiptesis Nula: H0: b = 0
Alternativa: H1, dos colas: b 0.
ESTADSTICO DE PRUEBA: tcalculado
b
Sb
Si tcalculado > tCrtico: La pendiente se diferencia significativamente de cero.
Si tcalculado < tCrtico: La pendiente no se diferencia significativamente cero.
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CONCLUSIONES:
Si La pendiente se diferencia significativamente: La pendiente y la linealidad son
adecuadas.
Si La pendiente no se diferencia significativamente: La pendiente y la linealidad no son
adecuadas.
ENSAYO DE HIPTESIS PARA EL INTERCEPTO
Suposiciones: El valor numrico del intercepto (a) no se diferencia significativamente de cero.
Hiptesis Nula: H0: a = 0
Alternativa: H1, Dos colas: s 0.
ESTADSTICO DE PRUEBA: tcalculado
a
Sa
Si tcalculado < tCrtico: El intercepto no se diferencia significativamente de cero.
Si tcalculado > tCrtico: El intecepto se diferencia significativamente cero.
CONCLUSIONES:
Si el intercepto no se diferencia significativamente de cero: El efecto de fondo de los
reactivos sobre la seal analtica no es significativo y la linealidad es vlida.
Si el intercepto se diferencia significativamente de cero: El efecto de fondo de los
reactivos sobre la seal analtica es significativo y la linealidad no es vlida.
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Porcentaje de recobro. De acuerdo al anexo 2.

5. Intervalo o Rango
Para cualquier mtodo cuantitativo es necesario determinar el intervalo de concentraciones
del analito o los valores de la propiedad relacionada, sobre los cuales el mtodo puede
aplicarse. En el extremo inferior del intervalo de concentracin los factores limitantes son los
valores del lmite de deteccin y/o de cuantificacin. En el extremo superior del intervalo de
concentracin las limitaciones sern impuestas por varios efectos que dependen del sistema
de respuesta del instrumento. (perdida de linealidad)
Anlisis
Tratamiento de datos
Comentarios
Fortificar alcuotas de un A partir de los resultados El lmite de cuantificacin
blanco de muestra a varias calcular
el
lmite
de forma
efectivamente
el
concentraciones del analito cuantificacin
extremo inferior del rango
cercanas al lmite de
intervalo de trabajo.
deteccin.
Es aconsejable investigar la varianza a lo largo del intervalo de trabajo. La relacin entre la
respuesta del instrumento con la concentracin no tiene que ser perfectamente lineal para
que un mtodo sea efectivo, pero la curva debe ser repetible da con da. Observe que los
intervalos de trabajo pueden ser diferentes para distintas matrices de acuerdo al efecto de las
interferencias que produce la matriz.(7)
6. Exactitud :
6.1 Veracidad
La evaluacin prctica de la veracidad se fundamenta en la comparacin de la media de los
resultados de un mtodo con relacin a valores conocidos, es decir, la veracidad se determina
contra un valor de referencia.
Se dispone de dos tcnicas bsicas:
-
Verificacin con respecto a los valores de referencia de un material caracterizado y

Comparacin con otro mtodo caracterizado.
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Para verificar la veracidad utilizando un material de referencia, se determina la media y la

desviacin estndar de una serie de rplicas de una prueba y se compara contra el valor
caracterizado del material de referencia. Es recomendable que el material de referencia sea
un material certificado de matriz natural, muy semejante a la muestra de inters. Claramente
la disponibilidad de stos materiales es limitada. Los materiales de referencia para una
validacin pueden ser:
a) Preparados por adicin de materiales tpicos con materiales de referencia con pureza
certificada u otros materiales de pureza y estabilidad adecuada.
b) Materiales tpicos bien caracterizados, de estabilidad verificada internamente y
conservados para control de calidad interno.
Anlisis
Efectuar 10 rplicas del
material de referencia
usando el mtodo a
validar.
Efectuar 10 rplicas del
material de referencia
usando el mtodo a
validar y un mtodo
oficial o validado.
Comparar con un contraste
estadstico adecuado el valor
medio con el valor del material
de referencia utilizado.
Comparar con un contraste
estadstico adecuado los valores
medios
del
material
de
referencia obtenido por ambos
mtodos
Comentarios
Contraste t de un valor
conocido contra una media
poblacional
Contraste
t
de
Comparacin de dos medias
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CRITERIO DE DECISIN PARA LA EXACTITUD: Si texp < ttab, el mtodo analtico desarrollado
tiene la exactitud requerida, y ambos valores no son estadsticamente diferentes. Mientras
que, si texp > ttab significa que el mtodo analtico no es exacto y que existe un error sistemtico
por defecto o por exceso que en valor absoluto es |-xmed|, donde representa el valor
verdadero o esperado de concentracin del analito.
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6.2 Porcentaje de Recobro

Debe evaluarse en al menos tres rplicas de tres niveles de concentracin, incluidos en el
rango de trabajo del mtodo. (Ver linealidad del mtodo)
7. Precisin.
La precisin es medida mediante la repetibilidad, reproducibilidad y precisin intermedia.
REPETIBILIDAD: Estudia la variabilidad del mtodo efectuando una serie de anlisis sobre la
misma muestra en las mismas condiciones operativas (un mismo analista, mismos aparatos y
reactivos, etc.) en un mismo laboratorio y en un tiempo de tiempo corto.
PRECISION INTERMEDIA: Estudia la variabilidad del mtodo efectuando una serie de anlisis
sobre la misma muestra, pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas,
aparatos, das, etc.) y en un mismo laboratorio.
CRITERIO DE DECISIN PARA LA PRECISIN: El coeficiente de Variacin de los resultados,
tanto para los datos correspondientes a la Repetibilidad como para la precisin Intermedia no
debe ser mayor de 5%. Al aplicar el anlisis de Varianza en la Evaluacin de la Repetibilidad
interda se aplic el criterio de Fisher, en cuyo caso el valor experimental de F debe ser menor
que el valor crtico.
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CLCULOS ESTADSTICOS INVOLUCRADOS EN LA EVALUACIN DE LA PRECISIN

Desviacin estndar muestral
( Xi X)
N1
Desviacin estndar poblacional
( Xi X)
Desviacin estndar relativa
RSD
S
X media
RSD
CV ,%
S
X media
*100
CV ,%
*100
COMPARACIN DE LAS VARIANZAS DE DOS CONJUNTOS DE RESULTADOS (APLICACIN

DE LA PRUEBA DE FISHER)
Suposiciones: Dos muestras independientes (1 y 2) de Distribucin Aproximadamente
Normal.
Hiptesis Nula: H0: V1 = V2
Alternativa: H1, Dos colas: V1 V2.
Una cola: V1 < V2 y V1 > V2
ESTADSTICO DE PRUEBA: F = S12/S22
Si Fcalculado < FCrtico: Varianzas no se diferencian significativamente.
Si Fcalculado > FCrtico: Varianzas se diferencian significativamente.
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CONCLUSIONES:
Si las varianzas no se diferencian significativamente, los dos conjuntos de resultados
presentan repetibilidades similares y se pueden unir en un solo conjunto.
Si las varianzas no se diferencian significativamente, los dos conjuntos de resultados
presentan repetibilidades diferentes y no se pueden unir en un solo conjunto.
CLCULOS ESTADSTICOS INVOLUCRADOS EN LA EVALUACIN DE LA PRECISIN
INTERMEDIA (REPRODUCIBILIDAD)
1. Se lleva a cabo preliminarmente la comparacin de las varianzas mediante la prueba de
Fisher abordada en la seccin anterior.
2. Seguidamente se implementa un ensayo de hiptesis de t de Student conforme al
siguiente modelo:
Suposiciones: Dos muestras independientes (1 y 2) con Distribucin Aproximadamente
Normal.
Hiptesis Nula: H0: X1 = X2
Hiptesis Alternativa: H1, dos colas: X1 X2
Hiptesis Alternativa: H1, una cola: X1 < X2 y X1 > X2
ESTADSTICO DE PRUEBA:
A. Si las varianzas no se diferencian significativamente:
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Si las varianzas se diferencian significativamente:
Si tcalculado < tCrtico: Las medias de los dos conjuntos de resultados no se diferencian
significativamente.
Si tcalculado > tCrtico: Las medias de los dos conjuntos de resultados se diferencian
significativamente.
CONCLUSIONES:
Si las medias no se diferencian significativamente, no hay probabilidades de presencia de
error sistemtico.
Si las medias no se diferencian significativamente, hay probabilidades de presencia de
error sistemtico.
RECOMENDACIONES:
Tener en cuenta los nuevos grados de libertad (df), para el caso cuando las varianzas de
los dos conjuntos de resultados se diferencian significativamente.
H1: X1 X2
(test dos colas)
-t/2, df < t < t/2, df H0 aceptada
H1: X1 < X2
(test una cola)
t > -t, df
H0 aceptada
H1: X1 > X2
(test una cola)
t < t, df
H0 aceptada
REPRODUCIBILIDAD: Estudia la variabilidad mtodo bajo condiciones operativas diferentes y
en distintos laboratorios.
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Anlisis
10 rplicas de un material
de referencia utilizando
mismo analista, equipo y
laboratorio, en un perodo
de tiempo corto.
de referencia, utilizando
diferente analista, equipo,
y mismo laboratorio y
perodo.
de referencia utilizando
diferentes
analistas,
equipos y laboratorio en
perodo
de
tiempo
prolongado.
Versin :01
Revisin :00
Comentarios
Determinar la desviacin Determina
estndar de los resultados
repetibilidad.
la
Determinar la desviacin Determina la precisin

intermedia
Determinar la desviacin Determina

reproducibilidad
la
The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and
Related Topics. First Edition 1998. EURACHEM
Nota: ver en esta misma gua: clculos estadsticos involucrados en la evaluacin de la

precisin intermedia (reproducibilidad)
8. Lmite de Deteccin y Lmite de Cuantificacin.
Estos parmetros se relacionan con la cantidad de analito requerida para dar un
resultado significativo, cualitativo o cuantitativo.
Segn un resultado "positivo" no es suficiente para que el analista considere detectado un
analito. Se precisa adems, conocer el lmite de deteccin en las condiciones del mtodo;
de lo contrario se puede incurrir en un falso positivo: suponer el analito presente en la
muestra cuando de hecho no lo est.
El lmite de Cuantificacin es un trmino cuantitativo (menor cantidad medible) mientras
que el lmite de deteccin es cualitativo (menor cantidad detectable).
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Numricamente es mayor el lmite de Cuantificacin y representa la menor cantidad de

analito que puede analizarse con un % de Coeficiente de Variacin y de Recuperacin
aceptables. Concentraciones menores pueden detectarse pero no cuantificarse.
Si las concentraciones a determinar son elevadas, se puede sustituir su estudio por la
determinacin de la precisin y la exactitud a la concentracin ms baja que presente el
analito en la prctica.
DETERMINACIN DE LOS LMITES DE DETECCION Y CUANTIFICACION.
a- Relacin seal-ruido. (aplica a mtodos instrumentales)
Se compara la respuesta del blanco de la muestra (matriz de la muestra conteniendo todos
los excipientes excepto el analito a estudiar) con la respuesta de muestras preparadas por la
adicin de pequeas cantidades de analito al blanco.
Se obtiene, primero el nivel medio de ruido del blanco y se multiplica por 2 3 para el lmite
de deteccin y por 6 10 para el lmite de cuantificacin. Estos valores se comparan
con las respuestas de la serie de blancos con analito, hallndose finalmente la concentracin
de analito que corresponde al valor de la seal.
b- Estudio de la menor cantidad detectable.
El lmite de deteccin se determina mediante el anlisis de muestras con cantidades o
concentraciones conocidas de analito y estableciendo el nivel mnimo en el que este puede
detectarse fiablemente.
Este se emplea en cromatografa en capa fina para hallar el lmite de deteccin de las
impurezas y/o productos de degradacin en una materia prima.
Primero se determina experimentalmente la mxima cantidad de materia prima (carga
mxima) que se separa correctamente en las condiciones cromatogrficas establecidas (sin
colas, ni distorsin en la mancha). Despus se halla experimentalmente la menor cantidad
de impureza o producto de degradacin que puede detectarse fiablemente sin
interferencia de la mancha principal.
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Para ello, se preparan una serie de soluciones conteniendo una cantidad constante de
materia prima, del orden de la carga mxima y cantidades decrecientes del analito que se
desea estudiar.
El lmite de deteccin se calcular a partir de la dilucin en que no se pueda distinguir la
respuesta del analito de la del blanco.
El resultado se expresa en valor absoluto o bien en forma de porcentaje respecto a la carga
mxima de materia prima. Este ltimo es el utilizado habitualmente por las farmacopeas
en los ensayos de pureza por cromatografa en capa fina.
c- Estimacin del lmite de deteccin mediante el valor de la ordenada en el origen
expresada en unidades de concentracin.
Si la recta del ensayo de linealidad ( y = bx + a ) se ha confeccionado con un rango de
concentraciones bajo, se admite utilizar el trmino independiente "a", para estimar,
aproximadamente el lmite de deteccin. El lmite inferior de la respuesta se toma como 3 a
y el lmite de deteccin expresado en las mismas unidades que las abscisas en la recta de
calibracin es 3a b.
d- Anlisis repetido del blanco de la muestra.
Se analizan una serie de blancos de la muestra (n 10) y se calcula la media y blanco y la
desviacin estndar Sblanco de las respuestas obtenidas. A partir de estos valores
existen diferentes expresiones en las que interviene la sensibilidad (pendiente de la recta de
calibracin) y que da una estimacin de los lmites de deteccin y cuantificacin
expresados en unidades de concentracin.
Las frmulas a utilizar varan en funcin de:
- el procedimiento (mtodos con correccin de lecturas frente al blanco o mtodos sin
correccin).
- el grado de ajuste de la recta de calibracin (si el ajuste es defectuoso intervienen las
desviaciones estndares de la pendiente (Sb) y del trmino independiente (Sa).
- del nmero de rplicas que se efectan al analizar la muestra problema (medicin nica o n
mediciones).
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d.1- Con correccin de la lectura frente al blanco (caso de muchos procedimientos

espectroscpicos por ej. UV-VIS, espectrofluorimetra, etc., en los que la lectura problema se
obtiene por comparacin con un blanco.
CL
K S blanco
b
(A)
Donde: CL= lmite de deteccin o cuantificacin.

K = constante K = 3 para lmite de deteccin.
K = 10 para lmite de cuantificacin.
Sblanco = Desviacin estndar de la respuesta de los n blancos.
b = Pendiente de la recta de calibracin.
d.2- No existe correccin de la lectura frente al blanco (caso
cromatogrficos, CG y HPLC).
blanco
K S blanco
b
de los procedimientos
(B)
CL, K, S blanco, b igual a la ecuacin (A)

Y blanco = media de la respuesta de los n blancos.
d.3- Las frmulas anteriores slo son vlidas si la mayor fuente de error es la desviacin
estndar del blanco o sea cuando se cumple que S blanco >> Sa y Sb. Estos dos ltimos
evaluados en apego al mtodo de mnimos cuadrados
Cuando los test de linealidad y proporcionalidad de la recta de calibracin revelan falta de
ajuste hay que sustituir la desviacin estndar del blanco Sblanco en las frmulas (A) y (B)
por:
2
a 2 2 )1/2 (C)
( Sblanco
S2
Sb
a
b
Esta expresin tiene en cuenta los errores por falta de linealidad y la existencia de sesgo.
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Cuando el ajuste de la recta es muy defectuoso, la estimacin obtenida por (C) ser poco
fiable; y al no presentar ninguna ventaja, es preferible en este caso determinar los lmites
de deteccin y/o cuantificacin por un mtodo que suponga menos trabajo experimental
(relacin seal-ruido).
Si en el mtodo analtico se efecta la medicin final por duplicado o triplicado, disminuye
la incertidumbre de la medicin y mejora la precisin.
1
Por este motivo, el lmite de deteccin es menor y se introduce el factor
n
(n = nmero de mediciones) en las ecuaciones (A) y (B).
CL
CL
K Sblanco
b
1
n
yblanco K Sblanco
b
(D)
1
n
(E)
e- Determinacin por extrapolacin a concentraciones cero de muestras conteniendo

bajas concentraciones de analito.
Los lmites de deteccin y cuantificacin pueden estimarse tambin por extrapolacin a
partir del anlisis de muestras conteniendo concentraciones bajas:
Partiendo de la respuesta de cada concentracin, se extrapolar grfica o matemticamente la
respuesta para concentracin cero, la cual se tomar como estimacin de la respuesta de
un blanco hipottico ( y blanco ).
Se determinar la desviacin estndar de la respuesta a concentracin cero por la
extrapolacin grfica o bien por clculo matemtico, la cual se tomar como estimacin de
la desviacin estndar de la respuesta de un blanco hipottico. (S blanco). Conociendo y blanco y
S blanco se aplicarn las mismas frmulas descritas anteriormente.
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Los lmites de deteccin y/o cuantificacin obtenidos por clculos en los literales c, d y
e han de comprobarse posteriormente, mediante el anlisis de muestras conteniendo el
analito en concentracin igual o prxima a los lmites estimados, los resultados de Porcentaje
de Coeficiente de Variacin y porcentaje de recuperacin debern ser coherentes con el tipo
de anlisis que se realiza y del nivel de concentracin del analito en la matriz.
ANEXO 2: Criterios de precisin y exactitud en funcin de la concentracin de analito
Concentracin de analito vs precisin.

Proporcin de
Analito
Unidades
CV%
100
10
1
1
10-1
10-2
100%
10%
1%
1.3
2.8
2.7
0.1
10-3
0.1%
3.7
0.01
10-4
100 mg/L
5.3
0.001
10-5
10 mg/L
7.3
0.0001
10-6
1 mg/L
11
0.00001
10-7
100 g/L
15
0.000001
10-8
10 g/L
21
0.0000001
10-9
1 g/L
30
Analito %
(AOAC Peer-Verified Methods Program, Manual on policies and procedures, Arlington, Va., USA
(1998).
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% de recuperacin de Analito a distintas concentraciones

Ingrediente
Activo (%)
Proporcin
de Analito
Unidades
Recuperacin
Promedio (%)
100
10
1
1
10-1
10-2
100%
10%
1%
98-102
98-102
97-103
0.1
10-3
0.1%
95-105
0.01
10-4
100 mg/L
90-107
0.001
10-5
10 mg/L
80-110
0.0001
10-6
1 mg/L
80-110
0.00001
10-7
100 g/L
80-110
0.000001
10-8
10 g/L
60-115
0.0000001
10-9
1 g/L
40-120
(AOAC Peer-Verified Methods Program, Manual on policies and procedures, Arlington, Va., USA
(1998).
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ANEXO 3: Formulas y Pruebas Estadsticas
- Media de los resultados. ( X )

x
i
X
n
- Desviacin estndar de los resultados ( S )
( Xi X )2
n 1
- Coeficiente de variacin.
Cv
S
100
Prueba de Fischer.- Se utiliza para determinar si existe diferencia significativa entre los
resultados de los analistas que emplearon el mismo mtodo.
Se determina como sigue:
S1 - Desviacin estndar de la condicin 1.
S2 - Desviacin estndar de la condicin 2.
Se calcula:
2
S
F 12
S2
de forma tal que F 1
El valor critico (F tabulado) debe consultarse en las tablas estadsticas. Para emplear estas
tablas debe hallarse primero el nmero de grados de libertad, el cual es igual a n-1, donde n
es el nmero de muestras para un analista individual. Si Fexp < Ftab (F n 1-1/n 2-1, P = 0.05)
no existe diferencia significativa entre la precisin alcanzada por los analistas.
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Prueba de significacin de t (student): para determinar si existe diferencias

significativas entre las medias obtenidas por las 2 condiciones.
Condicin 1
Condicin 2
Media
Desviacin estndar
Nmero de muestras
X
S
N
X 1
S 1
N1
2
2
2
( X 1 X 2)
t
1
1
S
N1 N 2
2
2
2 ( N 1 1) S1 ( N 2 1) S 2
S
( N 1 N 2) 2
Si texp < ttab (P = 0.05, GL = N1 + N2 -2 ) no existe diferencia significativa entre las medias
obtenidas por las dos condiciones.
Lmites de confianza (95%).-Este estadgrafo determina el rango en el cual el resultado
verdadero estar en el 95% de los casos y se calcula segn:
S
n
Notacin.
X= media de los juegos de resultados del estudio de reproducibilidad.
t = t de Student.
S = Desviacin estndar del conjunto de valores.
n = nmero de muestras (el total de los anlisis).
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Limite de confianza para el 95 %=
X t
S
n
Las frmulas anteriores se pueden utilizar tambin con porcentajes de recuperacin, basta
sustituir el valor medio por el porcentaje de recuperacin R, el valor verdadero m por 100 y
la desviacin estndar S por el coeficiente de variacin Cv.
t exp
100 R
Cv
Para determinar si el factor concentracin tiene alguna influencia en los resultados se utiliza
un test de igualdad de varianzas de los grupos mustrales del mismo tamao.
En este ejemplo, se utiliza el test G de Cochran:
2
S
Gexp 2 max
2
2
S1 S 2 S 3
Gtab = ( P = 0.05,
K = 3,
n=3 )
Si Gexp < Gtab las varianzas de las tres concentraciones son equivalentes, o lo que es lo
mismo que el factor concentracin no influye en la variabilidad de los resultados. En este caso
se calcula la recuperacin media y el coeficiente de variacin.
Tabla Diseo experimental para el estudio de la linealidad de un mtodo analtico.
x (ug)
x1
x1
x1
x2
x2
x2
Y
y1
y1
y1
y2
y2
y2
xy
x1y1
x1y1
x1y1
x2y2
x2y2
x2y2
x2
x12
x12
x12
x22
x22
x22
y2
y12
y12
y12
y22
y22
y22
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x3
x3
x3
x4
x4
x4
x
Versin :01
y3
y3
y3
y4
y4
y4
y
x3y3
x3y3
x3y3
x4y4
x4y4
x4y4
xy
Revisin :00
x32
x32
x32
x42
x42
x42
x2
y32
y32
y32
y42
y42
y42
y2
Clculo de b:
x y
n
b
2
2 x
x
n
Clculo de a:
a
Ecuacin:
xy
y b x
n
y = bx + a
Coeficiente de correlacin r.
El coeficiente de correlacin refleja el grado de relacin o ligazn entre las variables x
(concentracin), y (respuesta). Su valor mximo es 1.
Si r es cercano a la unidad, significa que existe correlacin con una probabilidad elevada.
(Existen tablas de r que dan el grado de significacin del valor obtenido para el coeficiente de
correlacin).
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Frmula para hallar r.
xy
2 ( x)
x
x y
n
y ( y)
El cuadrado del coeficiente de correlacin se denomina coeficiente de determinacin e

indica la proporcin de la varianza total de y, que es explicada por el modelo lineal de
regresin.
Clculo de los factores de respuesta.
x (ug)
x1
x1
x1
x2
x2
x2
x3
x3
x3
x4
x4
x4
Media de f:
y
y1
y1
y1
y2
y2
y2
y3
y3
y3
y4
y4
y4
f (y/x)
f1
f1
f1
f2
f2
f2
f3
f3
f3
f4
f4
f4
f
n
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Desviacin Estndar de f:
Coeficiente de variacin de f:
( f i f )
Sf
100
Sf
n 1
f
Significacin estadstica de la varianza de la pendiente b (de la recta de regresin).
La pendiente b se llama tambin coeficiente de regresin: a mayor pendiente, mayor
sensibilidad (respuesta del mtodo frente a los cambios de concentracin del analito).
La varianza de la pendiente Sb2 se utiliza como expresin matemtica de la linealidad: a
menor varianza mejor linealidad. Se determina segn:
2
Sb
S y ,x
2
2 x
n
Donde S2y, x = varianza del error experimental total.

= varianza residual.
= varianza de regresin de y sobre x.
El valor de S2y, x se obtiene segn:
2
S y, x
a y b xy
n2
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Para expresar la linealidad tambin se utiliza la desviacin estndar o error estndar de la

pendiente Sb y la desviacin estndar relativa Sb rel (%) cuyas frmulas son:
Sb Sb
Sb rel (%)
Sb 100
b
- Los lmites de confianza de la pendiente se hallan a partir de la expresin: b tSb donde t

es el valor de la distribucin de Student para n-2 grados de libertad a la probabilidad escogida
(generalmente P = 0.05).
-Otro test estadstico de b se deduce de la expresin:
t exp
Sb
En la tabla de t se halla el grado de significacin para n-2 grados de libertad.

Hiptesis nula: b = 0.
Test de proporcionalidad.
El valor de a, intercepcin con el eje de ordenadas u ordenada en el origen, indica el error
sistemtico del mtodo. En el caso ideal debe ser cero.
La varianza del trmino independiente se deduce de las frmulas:
2
Sa
2
Sb
x2
n
2
S y ,x
2
n
x
2
n
Siendo S2y, x la varianza del error experimental total.

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- La desviacin o error estndar del trmino independiente es:
Sa
Sa
- La desviacin estndar relativa del trmino independiente es:
S a rel (%)
S a 100
a
A.- Los lmites de confianza del trmino independiente son:

a t Sa
siendo t el valor de la distribucin de Student para n - 2 grados de libertad a la
probabilidad escogida (generalmente P = 0.05).
Si estos lmites incluyen el cero se cumple la condicin de proporcionalidad.
B.- La significacin estadstica de a se puede establecer utilizando la expresin:
t exp
Sa
En la tabla de t se halla el grado de significacin para n - 2 grados de libertad.

Hiptesis nula a = 0
Lmites de confianza de un valor de y en la recta de regresin para un valor determinado de
x ( x = xo ).
Para un valor dado de x = xo se obtiene (aplicando la frmula de la recta de regresin el valor
y. Los lmites de confianza se obtienen aplicando uno las siguientes frmulas:
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Lmites de tolerancia =
Lmite de confianza
Versin :01
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xo x
1
b x o a t S y ,x 1
2
n
x x
b xo a t S y, x

x o x
2
n
x x
En ambos casos se halla t para n-2 grados de libertad y al nivel de probabilidad escogido,
generalmente P = 0.05.
Los lmites de tolerancia son los lmites de confianza de los valores individuales de y en la
recta de regresin.
Los lmites de confianza son los lmites de confianza de los valores medios de y en la recta
de regresin.
Dando a x diferentes valores xo , x1 , x2 , se obtienen los correspondientes lmites de
tolerancia o confianza para los respectivos valores de y en la recta de regresin.
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Fecha: 2012-05-29

Responsable de ONA
Fecha: 2012-11-26
Fecha: 2012-01-09

DOC-ONA-12-011
Versin :01
Revisin :00
BIBLIOGRAFIA DE ANEXOS.
1. Comit de expertos de la OMS en especificaciones para las preparaciones
farmacuticas. 32
Informe, OMS, Serie de Informes Tcnicos 823, Pg. 121-125;
1992.
2. NC: 92-21:79. Procedimientos para evaluar la normalidad de los resultados de las
observaciones.
3. NC: 92-16:89. Tcnica de estimacin y dcimas relativas a las medias y las varianzas.
4. ISO 2854:76. Interpretacin estadstica de datos. Tcnicas de estimacin y dcimas
relativas a las medias y a las varianzas.
5. ISO/DI 5725-1:1991. Accuracy. (Trueness and precisin of measurement method and
results). A basic method for determination of repeatibility and reproducibility of a
standard measurement method.
6. ISO/DI 5725-2:1991. Accuracy (Trueness and precision of measurement method and
results). General principles and definitions.
7. Validacin de mtodos analticos; Asociacin Espaola de Farmacuticos de la
Industria A.E.F.I., Barcelona marzo del 2001.
Pgina 49 de 49
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Politica para La Validacion de Metodos de Laboratorios de Ensayo y Calibracion

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