Metabolic As
Metabolic As
Metabolic As
de Vas Metablicas
Dulce Catalina Daz, Francisco Bolvar y Adelfo Escalante
Departamento de Ingeniera Celular y Biocatlisis, Instituto de Biotecnologa, Universidad
Nacional Autnoma de Mxico. Av. Universidad 2001, Col. Chamilpa, Cuernavaca, Morelos, 62210,
Mxico. E-mail: [email protected]
RESUMEN
La utilizacin de microorganismos como fbricas celulares para la produccin industrial de
diversos compuestos requiere normalmente implementar estrategias de ingeniera de vas
metablicas (IVM) como sobre-expresar e inactivar genes para re-dirigir el flujo de carbono y energa
a las vas de inters. En conjunto con esta aproximacin, la ingeniera de protenas es una
herramienta promisoria que permitira diversificar el espectro de compuestos sintetizados ms all
del repertorio natural y optimizar los sistemas de produccin, enriqueciendo las estrategias y
alcances de la IVM. Por otro lado, la aplicacin de ingeniera de protenas permite construir vas
sintticas novedosas, aumentar la eficiencia de la produccin al mejorar las propiedades catalticas
de enzimas, promoviendo la canalizacin de sustratos o alterando elementos de regulacin, as como
generando sistemas con respuestas moduladas. En esta contribucin, se presenta una revisin de
la metodologa general utilizada para el diseo, construccin y optimizacin de cepas bacterianas
sobreproductoras de compuestos de inters industrial por IVM. Posteriormente se describen los
fundamentos de la ingeniera de protenas considerando el diseo racional, aleatorio y computacional
exponiendo de forma particular el caso de la evolucin dirigida para mejorar las propiedades
funcionales de una protena de inters. Finalmente se presentan diversos ejemplos donde se
describe la aplicacin exitosa de la ingeniera de protenas y de IVM para la obtencin de fbricas
celulares.
Palabras clave: Ingeniera metablica, ingeniera de protenas, evolucin dirigida
ABSTRACT
The utilization of microorganisms as cellular factories suitable for industrial production of several
compounds commonly requires the implementation of metabolic pathway engineering (MPE)
strategies like over-expression and deletion of genes in order to re-direct energy and carbon flux
through the desired pathway. Added to such traditional approaches protein engineering is a promising
tool that might allow a wider spectrum of cell-synthetized compounds (beyond the natural repertory)
as well as production systems optimization broadening the MPE strategies and scopes. Protein
engineering can be used for the construction of novel pathways and enhancement of efficiency by
16
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
improving the catalytic properties of enzymes, prompting of metabolic channeling, modifying the
cellular regulatory machinery and generating modulated-response systems. Herein we introduce the
generalities of the methodology employed for the design, building and optimization of industrially
important overproducer bacterial strains by MPE. Next, we describe protein-engineering
fundamentals considering rational, aleatory and computational design pinpointing directed evolution
as a strategy for protein features improvement. Finally, we show cases that exemplify the successful
application of protein engineering and MPE to achieve the development of cellular factories.
Key words: Metabolic engineering, protein engineering, directed evolution
metablicas completas) y optimizar el sistema
para aumentar su capacidad de sntesis. La
INTRODUCCIN
metabolismo
celular
con
el
objetivo
normalmente
alternativa
complementaria
las
En la generacin de un organismo
sobreproductor
se
requiere
17
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
Para
la
obtencin
de
una
cepa
generales
de
IVM
para
REDES METABOLICAS
Las
redes
metablicas
son
una
18
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
organismo
comprenden
datos
su
encuentran
ENZYME
BRENDA
UNIPROT
modelos
Ntai,
especializadas
en
enzimas,
(www.enzyme.expasy.org)
(www.brenda-enzymes.org).
estructurales
funcionales
de
organismos.
protenas
Algunas
anotaciones
de
bases
diversos
de
datos
&
hospedero
las
vas
Kelleher,
de
la
capacidad
sintticas
2009).
pueden
Herramientas
&
Maranas,
2004),
BNICE
(http://BioCyc.org),
KEGG
REACTOME
ms
organismos
(http://systemsbiology.ucsd.edu/InSilicoOrgan
isms/OtherOrganisms).
(www.genome,jp/kegg/)
de
90
como
propano
(Menon
et
al.,
2015),
sintticas.
La
construccin
de
vas
19
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
metabolitos
distribucin
(Antoniewicz,
del
flujo
2015).
se
refleja
La
en
el
la
mxima
produccin
celular
de
un
metabolitos
para
simule el enriquecimiento de
obtener
el
fenotipo
deseado,
sin
marcados,
construyendo
13C
un
en los
realizar
flujo
resulte
difcil,
por
ejemplo,
la
permite
identificar
blancos
de
manipulaciones
metabolismo
(Wiechert, 2001).
&
Shimizu,2013).
energtico
previamente
de
la
clula
genticas
en
que
se
estiman
las
le
denomina
metabolmica
(Dromms
&
incluyen
representacin
estado
se
estado
de
metabolmicos
realiza
estacionario
cuantitativa
comnmente
(la
del
en
concentracin
azcares,
cidos
permiten
orgnicos,
identificar
la
20
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
la concentracin de metabolitos no se
sobreproducir
un compuesto es
subproducto,
finalmente
la
posible
serie
de
OPTIMIZACION Y CONSTRUCCIN DE
CEPAS
algoritmos
EN
INGENIERIA
DE
VAS
de
programacin
lineal
para
METABOLICAS
MODIFICACIN
auxilia
de
programas
(Burgard,
permiten
conversin
deseado,
desarrollado
un
producto
diversos
computacionales
para
mtodos
Maranas,
genes
2003),
candidatos
el
utilizando
modelos
predecir
identificar
&
OptKnock
de
Pharkya,
como
estequiomtricos,
revisiones
aproximacin
computacionales
que
emplea
modelos
exhaustivas
de
empleados
mtodos
para
la
basadas
las
estequiomtricos
Maranas, 2012).
en
restricciones.
se
En
ABF
representan
METABOLISMO
21
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
modificar
protenas
actividad
obtencin
propiedades
en
las
cataltica
de
enzimas
la
con
expresin
propiedades
INGENIERA DE PROTENAS
La ingeniera de protenas se refiere al
diseo
modificacin
de
diversas
no
son
limitantes
inherentes
eficientes
para
originados
a
las
resolver
por
pasos
propiedades
protenas
catalizador
optimizado
con
propiedades
como
partir
del
diseo
racional,
aleatorio
22
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
DISEO RACIONAL
previa
PCR
recombinacin
catalizar
nmero
de
protenas
que
pueden
ser
(Labrou,
propensa
2010).
al
error
homloga,
reacciones
Dayan,
en
&
Modificar
(Siloto &
(epPCR),
DNA
shuffling,
ambientes
Fishman,
no
Shemesh,
2014),
la
enantioselectividad
(F.
EVOLUCIN DIRIGIDA
Guo,
MUTAGENESIS AL AZAR
23
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
nucletidos)
reaccin,
evolucin
implica
dirigida
es
una
herramienta
fin
pudiendo
diferenciar
de
promover
variar
las
la
adems
la
protenas
con
en
cambiado.
secuencia
de
tcnicas como
complementacin o de resistencia a un
evalan
construyendo
bibliotecas
que
dichas
En
caractersticas
la
seleccin
analizan
las
se
no
han
aplican
variantes
Fig. 2. Estrategia general para implementar evolucin dirigida como una herramienta de ingeniera de vas
metablicas. Basado en (Abatemarco et al., 2013).
24
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
combinacin
soluciones
uno
los
miembros
seleccionndolos
de
segn
una
la
biblioteca,
fluorescencia
de
campos
de
fuerza
termodinmicamente
ptimas
La
de
propiedades
enzimticas
as
como
diversificacin
de
nuevas
Saven, 2011).
protenas
dirigidos
al
estudio
generacin
de
INGENIERIA
METABLICAS
DE
PROTENAS
COMO
DISEO COMPUTACIONAL
20100
mutantes, an empleando
las
modificando
diferentes
secuencias
realmente
la
funcin
transcripcionales
ingeniera
diseo
ingeniera de protenas
protenas,
1080
el
secuencias en
protenas
factores
de
de
alostricas,
en IVM
y las
25
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
Ests
anlisis de flujo de
13C
ltimas
pyc
modificaciones
que
no
a fin de identificar
siguiente
cambios
va
modificacin.
sobre-expresando
Los
la
enzima
CONCLUSIONES
se
compuestos
encuentran
en
reacciones
iniciales,
normalmente
requiere
enzima
homoserina
con
menor
actividad.
enzima
deshidrogenasa
La
principal
26
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
Optimizacin de vas
metablicas
ZZZ
Aproximacin
Ejemplo
Metodologa
Referencia
Modificacin de residuos o
motivos determinantes de la
especificidad para emplear
diferentes sustratos
Construccin de una
va de novo para la
sntesis
de
1,3propanediol a partir de
homoserina
Utilizacin
de
enzimas
promiscuas
para
obtener
enzimas en que se diversifique
el uso de sustratos, catlisis o
sntesis de compuestos
Obtencin de enzimas
que
sintetizan
sesquiterpenos
particulares desde un
parental que produce
hasta 52 compuestos
diferentes
(Yoshikuni, Ferrin,
& Keasling, 2006)
Obtencin
de
nuevas
actividades catalticas con el
diseo de novo de protenas
Generacin de una
nueva va para la
fijacin de carbono que
puede ser ligada al
metabolismo central
(Siegel
2015)
Modificacin de la regulacin
enzimtica
(Geng,
Chen,
Zheng, Sun, &
Zeng, 2013)
Optimizacin de cepas
productoras de etanol
(Bengtsson,
Hahn-Hgerdal, &
GorwaGrauslund, 2009)
Cambio en la especificidad de
cofactores o ismeros
et
al.,
27
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
Construccin
de sistemas
dinmicos
para regular
el
metabolismo
Modificacin
de vas de
sealizacin
y
canalizacin
de
metabolitos
Aumento en la eficiencia
cataltica de enzimas
Aumento
en
la
actividad de enzimas
heterlogas que son
cuello de botella en la
produccin
de
compuestos de inters
farmacutico
(Leonard et al.,
2010)
Ingeniera
de
factores
transcripcionales o enzimas
alostricas para regular la
actividad de vas metablicas
Desarrollo
de
un
sistema
sensorregulador
para
la
produccin
de
biodiesel
(Zhang,
Carothers,
&
Keasling, 2012)
Utilizacin
proteicos
Aumento
en
la
produccin
de
compuestos de inters
para
la
industria
qumica
(Moon, Dueber,
Shiue, & Prather,
2010)
de
andamios
28
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
produccin.
ciencia
individual
ha
reportado
su
ciencia
individual
ha
reportado
methods
in
untargeted
13(8), 270116.
42, 31725.
alternativa
real
compuestos
para
desde
la
generacin
un
de
enfoque
biotecnolgico.
engineering
glutamicum
of
for
Corynebacterium
L-lysine
production.
REFERENCIAS
with
models:
COBRA
the
constraint-based
Toolbox.
Nat.
Protoc., 2, 72738.
29
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
Xylose
Grauslund,
xylose
M.
F.
(2009).
fermentation
by
recombinant
Biofuels, 2, 9.
10720.
Bornscheuer,
U.
T.,
Huisman,
G.
W.,
194.
J.
high-level
pathway
Establishing
synthetic
(2015).
J., 8, 52333.
for
proteomics
approach
to
discovering
for
microbial
strain
647657.
1090122.
30
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
mutagenesis
and
structure-guided
of
Geobacillus
consensus
stearothermophilus
Lipase
T6
for
36, 7074.
C., Djoumbou, Y
759.
ECMDB:
Enhancement
E.
coli
Metabolome
proteolytic
Guo, F., Franzen, S., Ye, L., Gu, J., & Yu, H.
protease
by
of
The
Wishart, D. (2013).
structure-based
rational
Rational
substitution
coupled
design
enhances
with
of
K173A
thermostability
catalytic
activity
of
the
substrate
chitooligosaccharide
Fusarium
inspired
scope
oxidase
graminearum
mutagenesis.
of
from
by structure-
Biotechnol
Dahiyat,
computational
Geng, F., Chen, Z., Zheng, P., Sun, J., & Zeng,
of
B.
I.
(2002).
and
Combining
experimental
99, 1592631.
dihydrodipicolinate
31
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
Multiple
high-throughput
analyses
Lu,
T.,
&
Stephanopoulos,
G.
(2005).
escherichia
characterization of tyrosine-insensitive
Koffas,
M.,
Roberge,
C.,
Lee,
K.,
&
coli:
generation
and
A.,
&
Nielsen,
J.
(2014).
S.,
&
Siegel,
J.
B.
(2014).
Computational
715.
enzyme
design:
100.
Lee, J. W., Na, D., Park, J. M., Lee, J., Choi,
fermentative
butanol
pathway.
synthetic
scaffolds
for
improved
61, 2228.
closer
protein
engineering
of
terpenoid
mutations
better?
Trends
32
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
OptStrain:
computational
encoding
23672376.
DNA
construction
sequences:
methods
for
library
directed
L.
(2013).
Accelerated
protein
nonnatural
enzymes,
complexes,
nonbiological
cofactor
and
membrane
452457.
platform
for
in
silico
metabolic
applications
Comput.
Struct.
e201402005.
Biotechnol.
J.,
9,
in
protein
engineering.
33
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1
and
an
application
to
metabolic
13, 272281.
metabolomics
for
systematic
1082.
173.
regulator
Wiechert, W. (2001).
13C
metabolic flux
phenotypes.
omics
Environ.
for
production
of
system
analysis
and
Microbiol.,
15,
19011916.
Yang, L., Cluett, W. R., & Mahadevan, R.
(2011). EMILiO: A fast algorithm for
of
metabolic
networks
from
KEGG.
A.
R.,
Suthers,
P.
F.,
Mathematical
applications
in
metabolic
optimization
networks.
34
BioTecnologa, Ao 2016, Vol. 20 No. 1