Guia TP Micro 2012
Guia TP Micro 2012
Guia TP Micro 2012
Alimentos
Tema Pgina
Enterococos 3
Estafilococos 4
Enterobacterias 5
Bacterias esporuladas 11
Bacillus 11
Clostridium 12
Clasificacin e identificacin de hongos y levaduras 14
Anlisis de micotoxinas en alimentos 16
Anlisis de leche fluida 19
Anlisis de leche en polvo 24
Anlisis de mantecas y margarinas 31
Anlisis de helados 38
Anlisis de conservas 43
Recuento de filamentos de hongos en conservas. Cmara de Howard 48
Anlisis de azcar 50
Anlisis de carnes y productos crnicos 53
Anlisis de alimentos deshidratados 68
Anlisis de agua 72
Tablas de NMP 76
Bibliografa 79
Anexo - Bioseguridad 80
2
ENTEROCOCOS
-Objetivos:
2) Prueba de la Catalasa: Se emulsiona un ansa de cultivo en una gota de H2O2 10% sobre
portaobjetos. La efervescencia causada por la liberacin de O2 indica la presencia de catalasa.
3) Sembrar en caldo infusin cerebro corazn o caldo glucosa e incubar a 10, 37, y 45C
durante 48 h.
4) Sembrar en caldo infusin cerebro corazn o caldo glucosa a pH 9,6 e incubar a 37C
durante 48 h.
5) Sembrar en caldo infusin cerebro corazn o caldo glucosa al 6.5 % de NaCl e incubar a
37C durante 48 h.
6) Sembrar en KF Streptococcus agar. Para observar la selectividad del medio estriar sobre
una mitad de la placa una cepa conocida no Enterococcus y en la otra mitad la cepa de
Enterococcus a investigar. Incubar a 37C, 48 h. Las colonias tpicas son pequeas de color
rojo y el medio alrededor de las mismas vira al amarillo.
7) Sembrar en agar bilis-esculina. Incubar a 37C, 48 h. Las colonias tpicas son pequeas y
oscuras y el medio alrededor queda oscurecido.
3
ESTAFILOCOCOS
-Objetivos:
2) Prueba de la Catalasa: Se emulsiona un ansa de cultivo en una gota de H2O2 10% sobre
portaobjetos. La efervescencia causada por la liberacin de O2 indica la presencia de catalasa.
3) Sembrar por estra en agar manita (Medio110 para estafilococos) dos cepas de
Staphylococcus sp. con distintas propiedades bioqumicas. Incubar a 37C, 48 h. Revelar con
solucin saturada de sulfato de amonio o con HCl diluido para evidenciar la gelatinlisis.
Revelar con prpura de bromocresol para la fermentacin del manitol.
4) Sembrar en el medio Baird-Parker por estra dos cepas de Staphylococcus sp. Incubar a
37C, 48 h. Las colonias tpicas de S. aureus son circulares, suaves, convexas, de 2 a 3 mm de
dimetro en placas poco crecidas, de grises a negras, rodeadas de un halo opaco y,
frecuentemente de un halo claro ms externo. Ocasionalmente se encuentran cepas no
lipolticas que no presentan halos. La apariencia puede ser seca y el color menos intenso si
proviene de un alimento congelado o desecado.
4
ENTEROBACTERIAS
- Objetivos
MARCADORES
1) Familia Enterobacteriaceae
Se trabajar con una cepa de enterobacteria y otra no enterobacteria.
- Con cada una de las cepas 1), a partir de una suspensin bacteriana sembrar 1 ml en una
placa de Petri y volcar agar Bilis Rojo Violeta Glucosa (ABRV-G), fundido y mantenido a
44-46C. Homogeneizar rotando la placa. Confeccionar una sobrecapa de aproximadamente
10 ml del mismo medio fundido, mantenido a 44-46C. Dejar solidificar. Incubar las placas
en posicin invertida a 35-37C durante 21+3 h. Observar las colonias. Se consideran
presuntas unidades formadoras de colonias de enterobacterias las colonias de color
prpura con halo de precipitacin.
- Transferir una colonia tpica de cada una de las placas a tubos de caldo glucosa y agar
nutritivo. Incubar a 35-37 C durante 21+3 h.
- A partir del cultivo, realizar tincin de Gram. Observar al microscopio.
- A partir del agar inclinado realizar la prueba de la oxidasa.
- Observar la fermentacin de glucosa por viraje del indicador cido base.
Las colonias presuntivas que resulten bacilo-cocos Gram negativos no esporulados,
oxidasa negativas y fermentadoras de glucosa confirman la presencia de
Enterobacteriaceae.
2) Coliformes totales
Se trabajar con una cepa de coliformes y otra no coliforme.
5
- Confirmacin.
A partir de los tubos positivos, estriar una placa de agar EMB (Eosina Azul de Metileno)
segn Levine. Incubar 24 h a 35-37C.
Colonias metlicas, rosadas/rojas o de apariencia mucosa confirman la presencia de
coliformes totales.
- Con cada una de las cepas 2), a partir de una suspensin bacteriana, sembrar por vertido en
placa 1 ml en una placa de Petri y volcar agar ABRV-L fundido y mantenido a 44-46C.
Dejar solidificar y cubrir con sobrecapa de aproximadamente 10 ml del mismo medio fundido
y mantenido a 44-46C. Dejar solidificar. Incubar las placas invertidas 24 h a 35-37C.
Colonias de color rojo oscuro con halo de precipitacin de sales biliares no menor de 0,5
mm se consideran presuntas unidades formadoras de colonias de coliformes.
- Confirmacin.
Sembrar colonias tpicas del ABRV-L en tubos de fermentacin de caldo Lactosa-Verde
Brillante-2% sales biliares, con campanitas de Durham. Incubar uno a 35-37C. La
produccin de gas en la campanita de Durham confirma coliformes totales.
4) Escherichia coli
Se trabajar con una cepa pura de Escherichia coli y de otra bacteria coliforme.
Investigacin de acidez - Prueba del Rojo de Metilo: Partir el cultivo de b.4) en dos alcuotas,
en una de ellas agregar 5 gotas de reactivo, observar inmediatamente.
Color rojo indica acidez (+).
6
Caractersticas del indicador Rojo de Metilo:
pH < 4,4 rojo
4,4 < pH < 6 rango de viraje del indicador
pH > 6 amarillo
Investigacin de utilizacin de citrato (b.5): Los microorganismos que son capaces de utilizar
el citrato producen cambio de color en el medio (de verde a azul). Se considera citrato (+) el
desarrollo de color azul.
PATGENOS
Salmonella spp.
Se trabajar con una cepa pura de Salmonella spp. y de otra enterobacteria.
Incubar las placas invertidas a 37C durante 24 h. Observar las colonias resultantes.
7
Colonias tpicas de Salmonella spp.
- Agar VB: colonias pequeas, traslcidas e incoloras u opacas de un color intermedio entre
rosa y fucsia. El medio vira al rojo brillante.
- Agar Bismuto-Sulfito: colonias con centro negro, borde claro, precipitado negro con brillo
metlico alrededor (ojo de conejo u ojo de pez ).
- Agar Leifson: colonias rosa plido hasta incoloras, de 1mm de dimetro.
- Agar Salmonella-Shigella: colonias pequeas, entre incoloras y rosa plido, opacas y
traslcidas. Algunas cepas dan colonias con centro negro (SFe). El medio vira al amarillo.
8
Identificacin serolgica de Salmonella sp.
OS-A: OS-B:
Grupo Aglutinina___ Grupo Aglutinina___
A 1,2 y 12 B 1, 4, 5 y 12
C1 6y7 D1 1, 9 y 12
C2 6y8 D2 9 y 46
F 11 E1 3 y 10
G1 1, 13 y 22 E4 1, 3 y 19
G2 13 y 23 L 21
H 6, 14 y 24
C3 8 y 20
Cabe sealar que los sueros OS-A y OS-B permiten identificar alrededor del 98% de los
serotipos ms frecuentes de Salmonella.
Cuando una cepa de Salmonella (identificada previamente por sus caractersticas
bioqumicas), no d aglutinacin con ninguno de los sueros polivalentes somticos, es
necesario tener en cuenta que la cepa puede:
a) presentar antgenos de envoltura V (Salmonella typhi), que inhibe la aglutinacin O.
b) ser un secretorio no incluido en la lista (caso muy excepcional).
Tcnica:
Aglutinacin somtica:
-Preparacin del antgeno: utilizar un cultivo de estras de 24 h de incubacin a 37C.
Suspender el crecimiento de la estra con 1ml de solucin fisiolgica.
-Reaccin: sobre lmina de vidrio depositar una gota de c/u de los 2 sueros polivalentes
somticos y los monovalentes. Colocar al lado de cada suero, una gota de suspensin
antignica. Mezclar con un ansa previamente flameada y enfriada.
-Lectura: debe ser inmediata y no despus de 5 minutos. Las reacciones tardas o dudosas no
deben considerarse.
Aglutinacin flagelar:
-Preparacin del antgeno: a partir de una colonia de Salmonella, hacer un cultivo de 24 h en
caldo. Luego agregar igual volumen de solucin formolada al 5%.
-Reaccin: en distintos tubos de ensayos colocar una gota de cada uno de los sueros
polivalentes y monovalentes ciliares. Agregar en cada uno 0,5 ml de la suspensin antignica.
Incubar en bao mara a 50C.
9
-Lectura: se efectuar al cabo de una hora de incubacin. Debe considerarse nicamente la
aglutinacin de tipo ciliar (flculos esponjosos, fcilmente disociables)
Si una cepa de Salmonella (previamente confirmada por su aglutinacin somtica), no
reacciona con ninguno de los sueros ciliares polivalentes hay que tener en cuenta que puede:
a) Tratarse de una variante inmvil
b) Presentar otro tipo de antgeno ciliar no incluido en la lista.
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BACTERIAS ESPORULADAS
Gnero Bacillus
- Objetivo
2) Utilizacin de azcares: sembrar una ansada del cultivo en cada uno de los tubos de caldo
con azcares (glucosa-xilosa-arabinosa-manitol). Incubar 24-48 h a 37C. Observar la
produccin de cido y/o gas.
3) Reduccin de nitratos: sembrar una ansada del cultivo en caldo nitrato. Incubar 24 h a
37C. Agregar los reactivos y observar.
4) Produccin de acetoina: (VP) sembrar una ansada del cultivo en el medio VP modificado.
Incubar 48 h a 37C. Agregar los reactivos A y B y agitar. Agregar unos cristales de creatina.
Leer el resultado luego de 1 h a temperatura ambiente.
6) Catalasa: sembrar por estra un tubo con agar nutritivo inclinado. Incubar 24 h a 37C
Colocar una ansada del cultivo sobre un portaobjeto y agregar unas gotas de H2O2 al 30%.
Observar.
8) Hidrlisis de almidn: sembrar una sola estra en agar almidn. Incubar 24 h a 37C.
Agregar solucin de lugol y observar.
9) Hidrlisis de casena: sembrar una estra o cuatro puntos en agar leche descremada o agar
casena. Incubar 24 h a 37C.
10) Lecitinasa: sembrar cuatro puntos en una placa de agar MYP (agar manitol-yema de
huevo-polimixina). Incubar 24 h a 37C .Observar morfologa de las colonias.
11
Gnero Clostridium
- Objetivo
3) Utilizacin de azcares: sembrar 0,2 ml del cultivo en cada uno de los tubos de caldo con
azcares (glucosa- maltosa-salicina-rafinosa-etc.), sin burbujear. Incubar 48 h a 37C.
Agregar unas gotas de indicador. Observar acidez y/o gas.
5) Hidrlisis de la gelatina: sembrar 0,2 ml del cultivo en el fondo de un tubo con agar
gelatina-lactosa, sin burbujear. Incubar 24 h a 37C. Enfriar en heladera y observar el
resultado.
7) Leche: sembrar 0,2-0,5 ml del cultivo en un tubo con leche. Incubar 24 h a 37C. Observar
coagulacin y degradacin del cogulo, por digestin de casena. Observar formacin de gas.
9) Esporulacin: sembrar 0,2 ml del cultivo en caldo Duncan-Strong al fondo y sin burbujear.
Incubar 24 h a 37 C. Realizar tincin de esporas.
10) Prueba de reduccin de sulfito: inocular 0,2 ml del cultivo en agar hierro-sulfito
(SPS/TSN/TSC) fundido y mantenido a 45C. Dejar solidificar e incubar 24 h a 37C.
Observar la formacin de colonias negras en el agar.
11) Lecitinasa: sembrar por estra en agar yema de huevo o similar. Incubar 24 h a 37C.
Observar precipitado alrededor de las colonias.
12) Caldo de hgado con hgado: inocular 0,2 ml del cultivo en el caldo hgado + hgado.
Sellar con vaselina-parafina. Incubar 24 h a 37C. Observar ennegrecimiento y digestin de la
carne (protelisis) o enrojecimiento (sacarlisis) y/o produccin de gas.
12
Observaciones: los tubos con medios lquidos se cubren con vaselina o con vas-par (vaselina-
parafina)
13
CLASIFICACION E IDENTIFICACION DE MOHOS Y LEVADURAS
I. MOHOS
Plan de trabajo:
Se proveer de distintos hongos que han crecido en un medio apropiado en tubo de ensayo y
con cada uno de ellos se harn microcultivos en la siguiente forma:
a) Se recortan cuadrados pequeos de agar Czapek con una esptula estril.
b) Se colocan sobre un portaobjetos.
c) Se hacen toques en el centro de cada lado con un ansa contaminada con el hongo en
estudio.
d) Se coloca encima un cubreobjetos de mayor tamao que el trozo de agar.
e) Se coloca el conjunto en una caja de Petri estril que contiene algodn hmedo.
f) Se incuba a temperatura ambiente y se hacen observaciones peridicas a partir de las 48 h
para estudiar las distintas fases de crecimiento.
II. LEVADURAS
Para identificar las levaduras deben conocerse sus caractersticas morfolgicas y bioqumicas.
Entre los datos morfolgicos figuran aspecto del cultivo en agar extracto de malta, o en el
medio de Sabouraud, tamao y forma de las clulas vegetativas, formacin del micelio y
pseudomicelio, produccin de ascosporas, tamao y nmero de las mismas. Como datos
bioqumicos interesa:
- habilidad para fermentar azcares.
- utilizacin de fuentes de C y N para su crecimiento (mtodo auxonogrfico).
Observaciones microscpicas
Las clulas provenientes de medios lquidos pueden observarse directamente entre porta y
cubreobjetos. Las levaduras provenientes de medios slidos pueden observarse mejor si se
las mezcla sobre el portaobjetos con una gota de nigrosina al 5% en solucin acuosa. La
observacin al microscopio se hace por inmersin.
Coloracin de esporas
14
Aislamiento de mohos y levaduras
En el caso de los mohos o las levaduras que se encuentran en un producto mezclados con las
bacterias, para separarlos de stas deben usarse medios de cultivo que favorezcan el
desarrollo de los primeros. En general se obtienen buenos resultados empleando:
- medios a base de infusin de vegetales, con el agregado de azcares, por ej. agar-papa-
glucosa-cido tartrico. El cido tartrico se emplea para llevar el pH a 3,5 pues as se inhibe
el crecimiento de casi todas las bacterias.
- agar papa-dextrosa con agregado de 40 g/g de cloranfenicol.
Los medios deben incubarse a temperatura comprendida entre 20 y 25 C.
15
ANALISIS DE AFLATOXINAS EN ALIMENTOS
a) mtodos biolgicos: realizados sobre animales de prueba sensibles al efecto txico (en
este caso generalmente se utilizan patos de un da pero tambin pueden emplearse embriones
de pollo, larvas de peces, etc.).
Son de utilidad para los estudios confirmatorios, particularmente cuando surgen dificultades
analticas en el caso de ciertos alimentos. Pero estos mtodos insumen demasiado tiempo para
el anlisis de rutina como el que se precisa en un programa de control de calidad y para este
fin se requieren mtodos qumicos.
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METODO PARA ANALIZAR AFLATOXINAS EN MUESTRAS DE MANI
(AOAC 970.45 1995)
1) Extraccin
1 - Tomar 100 g de muestra molida y colocar en una licuadora junto con 4 g de NaCl, 500 ml
de metanol-agua (55+45) y 200 ml de hexano.
2 - Licuar 1 minuto a alta velocidad.
3 - Filtrar por papel de filtro.
4 - Tomar 25 ml de la solucin metanol-agua (capa inferior) y colocarla en una ampolla de
decantacin con 25 ml de cloroformo.
5 - Tapar la ampolla de decantacin y agitar 1 minuto.
6 - Recoger la capa clorofrmica (inferior) y llevar a sequedad en bao mara bajo corriente
de nitrgeno o en un evaporador rotatorio.
7- Determinar la presencia de aflatoxinas por cromatografa en capa delgada.
Utilizar placas de slica gel G o GF 254 segn Sthal, de 250 micrones de espesor, activadas a
80C durante dos horas. Los sistemas de solventes que se utilizan son: acetona-cloroformo
(1+9) y benceno-acetona-cido actico (80+9+10) a temperatura ambiente.
Vs . Cs . Md
Concentracin de aflatoxina (microgramos/kg) = ---------------------
Vx . P
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Md: volumen (microlitros) de la dilucin final del extracto de muestra (para este caso 250
microlitros).
P: masa (g) de la muestra original en el extracto final (en este caso 5 g).
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ANLISIS MICROBIOLGICO DE LECHE FLUIDA
1) Toma de muestra
Cuando el muestreo de leche fluida se realiza a partir de los tanques o tarros de las granjas
utilizados para el transporte a granel, los tanques de almacenamiento de las centrales lecheras
o los tanques mviles de almacenamiento hay que asegurarse de que se haya mezclado el
contenido hasta hacerlo homogneo. Se vierte entonces una cantidad adecuada de leche en
condiciones aspticas en los recipientes de muestreo, utilizando para ello un cucharn o tubo
de muestreo esterilizado para cada muestra (ICMSF recomienda tomar por lo menos 30 ml de
muestra). Estas muestras se enfran inmediatamente mantenindolas a una temperatura de 0-
4C, y se envan al laboratorio.
Cuando se trata de un producto final envasado (como la leche pasteurizada), es preferible
llevar la muestra al laboratorio sin abrir. Se enfran y se llevan al laboratorio lo ms
rpidamente posible para que puedan comenzar los ensayos antes de que transcurran 36 h.
Previamente al anlisis se mezcla la muestra cuidadosamente agitando o invirtiendo el
recipiente con el fin de lograr una distribucin uniforme de los microorganismos en la
muestra.
2) Preparacin de la muestra
Colocar 1 ml de leche en un tubo de dilucin que contiene 9 ml de agua peptona al 0,1%.
Mezclar bien y realizar las diluciones siguientes tomando siempre 1 ml y transfiriendo este
volumen a 9 ml del medio de dilucin. Se hacen tantas diluciones como sean necesarias.
3) Metodologa de anlisis
Preparacin de la pelcula
1- Mezclar bien la muestra por agitacin.
2- Transferir 0,01 ml al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro marcado tiene
1 cm de lado.
3- Distribuir el material sobre el recuadro mediante un ansa cuyo extremo forme un pequeo
ngulo recto.
4- Secar el extendido al aire o bien colocndolo sobre una chapa caliente, cuidando que no
sobrepase los 45C.
5- Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados sumergindolos en
xileno durante 5 minutos.
6- Luego de secar al aire se lo fija sumergindolo en alcohol absoluto durante 2-3 minutos.
19
7- Sin secarlo se lo tie con la solucin colorante sumergindolo durante 30 segundos. El
exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel
absorbente.
8- Secar cuidadosamente al aire y, una vez seco, sumergir en una cubeta con agua lo
necesario como para que sta no tome color. Secar al aire.
Solucin colorante
Solucin madre al 2% de Azul de Metileno en alcohol absoluto 96. Se toman 30 ml de la
solucin madre y se diluyen con agua destilada hasta 1 litro.
Examen microscpico
La pelcula se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y despus con el
objetivo de inmersin.
Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml de la porcin de muestra de la siguiente
manera: cuando las clulas de un mismo tipo morfolgico se presentan en racimos, stos se
cuentan como unidades individuales, slo si la distancia entre las clulas es igual o mayor al
doble del dimetro menor de las dos clulas que estn ms prximas entre s; las clulas de
morfologa diferente o con tincin diferente se cuentan como unidades tambin diferentes
independientemente de su proximidad a las dems clulas.
Para examinar una parte representativa de la pelcula, se escoge un campo de partida situado a
la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del preparado sobre uno de
los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde (superior o inferior). Se cuentan los
campos de una serie a travs de la pelcula en forma horizontal, y despus se empieza a contar
desde el centro que habamos tomado como punto de partida una serie de campos separados
en un sentido perpendicular a la primera serie.
Si fuese necesario examinar un nmero mayor de campos, se repite la seleccin de campos
segn la explicacin anterior, partiendo de un punto situado a 2 mm de distancia de la primera
serie elegida. Se contarn entre 30 y 60 campos. Si el nmero de microorganismos es menor
de 30000 bacterias/ml g, se efectuar el recuento de 60 campos. Si es de 30000 bacterias/ml
g a 300000 bacterias/ml g basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor a 300000
bacterias/ml g se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200
grmenes en la suma de todos ellos.
Clculo
Se calcula el valor promedio de grmenes por campo y se multiplica este valor por el factor
microscpico (FM) y por (la inversa de la alcuota tomada) el nmero recproco de la
dilucin:
Donde FM = 100/A. A es el rea del campo microscpico (la mayora de los microscopios
para alumnos tienen un dimetro de campo de 0,16 mm). FM = 4970/cm
20
46C. Se mezcla para lograr una distribucin homognea. Siguiendo las mismas indicaciones,
sembrar tres diluciones sucesivas.
2- Cuando las placas estn fras se invierten y se incuban a 30C 1C durante 72h 3h.
3- Se cuentan las colonias y se calcula el valor de recuento total siguiendo las pautas dadas en
el captulo de muestreo. Se seleccionan las placas con recuento entre 25 y 250 colonias, se
multiplica el nmero promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilucin
correspondiente y se informa como UFC de bacterias aerobias mesfilas/ml g.
21
Prueba de confirmacin
Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro
rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metlico.
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Con la ayuda de una tabla de
Nmero Ms Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/ml g de muestra,
teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.
Resultados caractersticos:
1- Cocobacilo Gram negativo no formador de esporas.
2- Fermentacin de lactosa a 44C con formacin de gas.
22
3- Produccin de indol a 44C
4- No utiliza citrato
4) Antibiticos en leche
Durante el tratamiento de la mastitis, se usan antibiticos que pueden aparecer eventualmente
en la leche de los animales bajo tratamiento. Los antibiticos residuales, pueden producir
interferencias en el proceso de fermentacin lctica, que se lleva a cabo para la fabricacin de
quesos y otros productos lcteos.
Investigacin de antibiticos
Un ensayo prctico consiste en calentar 100 ml de leche en un erlenmeyer por 2-5 minutos a
83C (para evitar falsos positivos debido a sustancias inhibidoras naturales en la leche cruda
que la pasteurizacin reduce pero no elimina completamente). Enfriar a 45C y agregar una
cucharadita de yogurt (Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus). Incubar a
45C y examinar a las 2-3 h. Si la leche no ha coagulado es probable la presencia de
antibiticos.
23
ANLISIS DE LECHE EN POLVO
1) Toma de muestra
Para el muestreo, es preferible tomar como muestra los recipientes o paquetes originales, sin
abrir. Cuando haya que muestrear productos a granel, la muestra se tomar en un punto cerca
del centro del recipiente que la contiene, si es posible, quitando la capa superficial de polvo
con un instrumento esterilizado, y extrayendo despus la muestra con una cuchara o varilla
esterilizada. ICMSF recomienda para cada producto a granel tomar no menos de 30 g.
2) Preparacin de la muestra
Con una cuchara estril mezclar el contenido del frasco de leche en polvo. Pesar
aspticamente 10 g de muestra en un erlenmeyer que contenga 90 ml de agua peptona 0,1%
previamente calentada a no ms de 45C. Agitar hasta disolucin de grumos.
Preparar las siguientes diluciones transfiriendo 1 ml a un tubo con 9 ml de agua peptona al
0,1%.
La mayora de las leches en polvo pueden ser disueltas en agua peptona al 0,1% o en solucin
salina de fosfatos tamponada. Las muestras ms insolubles (por ejemplo leches de alta acidez)
se disuelven bien agregando 1,25 % de citrato de sodio a la solucin de fosfatos.
3) Metodologa de anlisis
Preparacin de la pelcula
1- Mezclar bien la muestra por agitacin.
2- Transferir 0,01 ml al recuadro de un portaobjeto especial limpio. El recuadro marcado tiene
1 cm de lado.
3- Distribuir el material sobre el recuadro mediante un ansa cuyo extremo forme un pequeo
ngulo recto.
4- Secar el extendido al aire o bien colocndolo sobre una chapa caliente, cuidando que no
sobrepase los 45C.
5- Los extendidos de los alimentos ricos en grasa deben ser desengrasados sumergindolos en
xileno durante 5 minutos.
6- Luego de secar al aire se lo fija sumergindolo en alcohol absoluto durante 2-3 minutos.
7- Sin secarlo se lo tie con la solucin colorante sumergindolo durante 30 segundos. El
exceso de colorante es eliminado colocando el borde del portaobjeto sobre un papel
absorbente.
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8- Secar cuidadosamente al aire y, una vez seco, sumergir en una cubeta con agua comn lo
necesario como para que sta no tome color. Secar al aire.
Solucin colorante
Solucin madre al 2% de Azul de Metileno en alcohol absoluto 96. Se toman 30 ml de la
solucin madre y se diluyen con agua destilada hasta 1 litro.
Examen microscpico
La pelcula se examina primero con un objetivo seco de gran apertura y despus con el
objetivo de inmersin.
Se calculan los microorganismos presentes en 1 ml de la porcin de muestra de la siguiente
manera: cuando las clulas de un mismo tipo morfolgico se presentan en racimos, stos se
cuentan como unidades individuales, slo si la distancia entre las clulas es igual o mayor al
doble del dimetro menor de las dos clulas que estn ms prximas entre s; las clulas de
morfologa diferente o con tincin diferente se cuentan como unidades tambin diferentes
independientemente de su proximidad a las dems clulas.
Para examinar una parte representativa de la pelcula, se escoge un campo de partida situado a
la misma distancia de cualquiera de los dos lados (punto medio del preparado sobre uno de
los lados) y dos o tres campos adentro a partir del borde (superior o inferior). Se cuentan los
campos de una serie a travs de la pelcula en forma horizontal., y despus se empieza a
contar desde el centro que habamos tomado como punto de partida una serie de campos
separados en un sentido perpendicular a la primera serie.
Si fuese necesario examinar un nmero mayor de campos, se repite la seleccin de campos
segn la explicacin anterior, partiendo de un punto situado a 2 mm de distancia de la primera
serie elegida. Se contarn entre 30 y 60 campos. Si el nmero de microorganismos es menor
de 30000 bacterias/ml g, se efectuar el recuento de 60 campos. Si es de 30000 a 300000
grmenes /ml g basta el recuento de 20 a 30 campos. Si es mayor a 300000 grmenes /ml
g se recuentan tantos campos como fuesen necesarios para obtener 150 a 200 grmenes en la
suma de todos ellos.
Clculo
Se calcula el valor promedio de grmenes por campo y se multiplica este valor por el factor
microscpico (FM) y por (la inversa de la alcuota tomada) el nmero recproco de la dilucin
Donde FM = 100/A. A es el rea del campo microscpico (la mayora de los microscopios
para alumnos tienen un dimetro de campo de 0,16 mm). FM = 4970/cm
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multiplica el nmero promedio de colonias contadas en las placas por el factor de dilucin
correspondiente y se informa como UFC de bacterias aerobias mesfilas/g.
Prueba de confirmacin
Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/
rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metlico.
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Con la ayuda de una tabla de
Nmero Ms Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/g de muestra, teniendo
en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.
26
e) Recuento de Staphylococcus aureus (FIL 145:1990)
Se recomienda realizar el recuento sembrando por duplicado cada dilucin.
En caso de requerir un inculo ms grande por un valor bajo del requisito microbiolgico de
aceptacin, puede hacerse una siembra combinada de la siguiente forma:
Distribuir 1 ml de dilucin 1/10 equitativamente en la superficie de tres placas de agar Baird
Parker perfectamente secas. Distribuir con una esptula de Drigalsky cuidadosamente (tener
la precaucin de enfriar bien la esptula para no matar los microorganismos). Dejar secar las
placas tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez
secas, incubarlas invertidas a 37 1C durante 24-48 h.
Tomar para enumerar placas con no ms de 150 colonias. Seleccionar un nmero
representativo de colonias tpicas y atpicas; y transferirlas a tubos de caldo infusin cerebro-
corazn. Incubar a 37C 35C por 20 a 24 h.
Las colonias tpicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara,
generalmente un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara.
Identificacin y confirmacin
Sobre los cultivos puros de 20-24 horas, realizar:
- Tincin de Gram
- Catalasa
- Coagulasa (comparar con cepa patrn): Agregar 0,1 ml del cultivo a aprox. 0,3 ml de plasma
de conejo reconstituido en un tubo estril. Incubar a 35-37C. Examinar despus de 4 a 6
horas. El cogulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo
(4+).
Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estril en lugar del cultivo. Para que el
ensayo sea vlido, no debe observarse ningn signo de coagulacin.
Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa
de Baird Parker.
S. aureus coagulasa positiva son cocos Gram positivos, catalasa positivo, coagulasa positivo
(3 o 4+) y termonucleasa positivo.
Informar UFC de S. aureus coagulasa positivo/ g de muestra. Para realizar el clculo contar
el nmero total de colonias confirmadas en las tres placas.
27
Aislamiento en medio slido
A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo
Fenol (agar BPLS) y una de agar Bismuto Sulfito (son cuatro placas en total). Incubar las
placas invertidas a 37 1C durante 20-24 h.
De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento 18-24 h ms y volver a
estriar en los medios de aislamiento.
Si al cabo del perodo de incubacin el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por
18-24 h adicionales a la misma temperatura.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella. En agar
BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar Bismuto Sulfito,
las colonias tpicas son marrones a negras con brillo metlico. Algunas cepas forman colonias
verdosas.
Identificacin y confirmacin
De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 37 1C durante 18-24 h. Al cabo de la
incubacin, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmacin
bioqumica y serolgica.
Confirmacin serolgica
Seguir la tcnica explicada en TP N 2: Enterobacterias Salmonella.
Emplear una cepa patrn de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios
empleados en las pruebas de confirmacin e identificacin.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el
anlisis (25 g, en este caso).
Aclarar modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.
28
REQUISITOS MICROBIOLOGICOS DEL CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
- MERCOSUR
LECHE
29
Deber responder a las siguientes exigencias:
Leche UHT
Res MS y AS N 110 del 4.04.95
GMC Res. N 78/94
MICROORGANISMOS CRITERIO DE ACEPTACION CATEGORIA METODO DE
I.C.M.S.F. ENSAYO
Microorganismos n=5 c=0 m= 100 2 FIL1008: 1991
aerobios mesfilos
viables/ml
30
ANLISIS DE MANTECAS Y MARGARINAS
Alternativamente se puede trabajar solamente con la fase acuosa y sus diluciones. Permitir la
separacin de las fases (dejar reposar a 45C por no ms de 15 minutos) y tomar de la fase
inferior: 1 ml equivale a 1 gramo de manteca.
2) Metodologa de anlisis
31
Si se hizo el recuento combinado, contar el nmero de colonias en las tres placas.
Corresponden al nmero de bacterias proteolticas en 1 g de muestra.
Informar como UFC de bacterias proteolticas /g.
32
Prueba de confirmacin
Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/
rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metlico.
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Con la ayuda de una tabla de
Nmero Ms Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/ml g de muestra,
teniendo en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.
Resultados caractersticos:
1- Cocobacilo Gram negativo no formador de esporas.
2- Fermentacin de lactosa a 44C con formacin de gas.
3- Produccin de indol a 44C
4- No utiliza citrato
33
g) Recuento de mohos y levaduras (FIL 94 B: 1990)
Sembrar por duplicado 1 ml de por lo menos dos diluciones sucesivas en placas de Petri.
Agregar agar YGC (cloranfenicol-glucosa-extracto de levadura) fundido a 44-46C y mezclar
para homogeneizar el inculo en el agar.
Si el recuento esperado es bajo, puede realizarse un recuento combinado distribuyendo 10 ml
de la dilucin 1/10 en tres placas de Petri y agregando luego agar YGC de la misma forma
que antes.
Dejar solidificar. Incubar sin invertir a 25 1C durante 5 das.
Si se hizo el recuento por duplicado, contar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias.
Si hay excesivo crecimiento contar la placa de mayor dilucin an cuando contenga menos de
10 colonias.
Si se hizo el recuento combinado, contar el nmero de colonias en las tres placas.
Corresponden al nmero de mohos y levaduras en 1 g de muestra.
Las colonias sospechosas o dudosas deben confirmarse por observacin microscpica.
Informar el resultado como UFC de mohos y levaduras /g de muestra.
Identificacin y confirmacin
Sobre los cultivos puros de 20-24 horas, realizar
- Tincin de Gram
- Catalasa
- Coagulasa (comparar con cepa patrn): Agregar 0,1 ml del cultivo a aprox. 0,3 ml de plasma
de conejo reconstituido en un tubo estril. Incubar a 35-37C. Examinar despus de 4 a 6
horas. El cogulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo
(4+).
Realizar un control empleando 0,1 ml de caldo BHI estril en lugar del cultivo. Para que el
ensayo sea vlido, no debe observarse ningn signo de coagulacin.
Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa
de Baird Parker.
S. aureus coagulasa positiva son cocos Gram positivos, catalasa positivo, coagulasa positivo
(3 o 4+) y termonucleasa positivo.
Informar UFC de S. aureus coagulasa positivo/ g de muestra. Para realizar el clculo contar
el nmero total de colonias confirmadas en las tres placas.
34
i) Determinacin de Salmonella (FIL 93 A: 1985)
Preenriquecimiento en medio lquido
Preparar un erlenmeyer con 225 ml de agua destilada con 1 ml de solucin de Verde Brillante
(0,5% en agua, agregar verde brillante al agua; dejar la solucin en la oscuridad por lo menos
un da para autoesterilizar).
Pesar aspticamente 25g de muestra en dicho erlenmeyer. Dejar a temperatura ambiente
durante aproximadamente 1 h sin agitar. Incubar a 371C durante 16-20 h.
Identificacin y confirmacin
De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 371C durante 18-24 h. Al cabo de la
incubacin, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmacin
bioqumica y serolgica.
35
Confirmacin serolgica
Seguir la tcnica explicada en TP N 2: Enterobacterias-Salmonella
Emplear una cepa patrn de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios
empleados en las pruebas de confirmacin e identificacin.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el
anlisis (25 g, en este caso).
Aclarar modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.
36
REQUISITOS MICROBIOLOGICOS DEL CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
- MERCOSUR
Manteca
Art. 596
Res MS y AS N 003 del 11.01.95
Criterios microbiolgicos y tolerancias
Margarina
Art. 551. (Res. 511. 9.4.86)
37
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE PRODUCTOS LACTEOS
HELADOS
2) Metodologa de anlisis
38
Agregar aprox. 12 ml de agar ABRV fundido a aprox. 44-46C. Mezclar. Dejar solidificar
completamente y agregar entonces 4 ml ms de medio fundido. Dejar enfriar e incubar las
placas invertidas a 30C por 22-26 h.
Seleccionar las diluciones que presenten entre 10 y 150 colonias. Contar las colonias rojas
oscuras con dimetro de por lo menos 0,5 mm, caractersticas de bacterias coliformes.
Confirmacin: Tomar entre 5 y 10 colonias del ABRV y transferirlas a tubos de fermentacin
con caldo Verde Brillante Lactosa 2% de Sales Biliares (cada colonia a un tubo distinto).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran positivas aquellas colonias que den produccin de
gas.
El resultado se calcula en base al nmero de colonias confirmadas. Se expresa como UFC de
coliformes totales /ml g.
La confirmacin de las colonias es especialmente recomendable para el caso de alimentos que
contengan otros azcares distintos de lactosa.
Prueba de confirmacin
Estriar cada tubo presuntamente positivo en agar EMB (agar eosina azul de metileno).
Incubar a 30C por 22-26 h. Se consideran colonias de coliformes las de aspecto oscuro/
rojo/rosado y/o mucoso, con o sin brillo metlico.
Registrar el nmero de tubos positivos de cada dilucin. Con la ayuda de una tabla de
Nmero Ms Probable (NMP), calcular el NMP de coliformes totales/g de muestra, teniendo
en cuenta los tubos positivos y las diluciones empleadas.
d) Determinacin de Salmonella
Preenriquecimiento en medio lquido
Preparar un erlenmeyer con 225 ml de agua destilada con 1 ml de solucin de Verde Brillante
(0,5% en agua, agregar verde brillante al agua; dejar la solucin en la oscuridad por lo menos
un da para autoesterilizar).
Pesar aspticamente 50 g de muestra en dicho erlenmeyer. Dejar a temperatura ambiente
durante aproximadamente 1 h sin agitar. Incubar a 371C durante 16-20 h.
39
Enriquecimiento en medio lquido.
Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo tetrationato (Mller Kauffmann).
Incubar a 43 0,5C durante 18-24 h.
Transferir 10 ml del preenriquecimiento a 100 ml de caldo selenito-cistina. Incubar a 371C
durante 18-24 h.
Identificacin y confirmacin
De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 371C durante 18-24 h. Al cabo de la
incubacin, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmacin
bioqumica y serolgica.
Confirmacin serolgica
Seguir la tcnica explicada en TP N 2: Enterobacterias -Salmonella
Emplear una cepa patrn de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios
empleados en las pruebas de confirmacin e identificacin.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el
anlisis (25 g, en nuestro caso).
Aclarar modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.
40
e) Recuento de S. aureus (FIL 145:1990)
Se recomienda realizar el recuento sembrando por duplicado cada dilucin.
En caso de requerir un inculo ms grande por un valor bajo del requisito microbiolgico de
aceptacin, puede hacerse una siembra combinada de la siguiente forma:
Distribuir 1 ml de dilucin 1/10 equitativamente en la superficie de tres placas de agar Baird
Parker perfectamente secas. Distribuir con una esptula de Drigalsky cuidadosamente (tener
la precaucin de enfriar bien la esptula para no matar los microorganismos). Dejar secar las
placas tapadas sin invertir a temperatura ambiente por aproximadamente 15 minutos. Una vez
secas, incubarlas invertidas a 37 1C durante 24-48 h.
Tomar para enumerar placas con no ms de 150 colonias. Seleccionar un nmero
representativo de colonias tpicas y atpicas; y transferirlas a tubos de caldo infusin cerebro-
corazn. Incubar a 37C 35C por 20 a 24 h
Las colonias tpicas son negras, brillantes y convexas rodeadas de una zona clara,
generalmente un halo opaco rodea a la colonia por dentro de la zona clara.
Identificacin y confirmacin
Sobre los cultivos puros de 20-24 horas, realizar
- Tincin de Gram
- Catalasa
- Coagulasa (comparar con cepa patrn): Agregar 0,1 ml del cultivo a aprox. 0,3 ml de plasma
de conejo reconstituido en un tubo estril. Incubar a 35-37C. Examinar despus de 4 a 6
horas. El cogulo formado debe ser firme y organizado (3+) o que no se cae al invertir el tubo
(4+)
Complementariamente puede realizarse la prueba de la termonucleasa sobre la misma placa
de Baird Parker.
S. aureus coagulasa positiva son cocos Gram positivos, catalasa positivo, coagulasa positivo
(3 o 4+) y termonucleasa positivo.
Informar UFC de S. aureus coagulasa positivo/ g de muestra. Para realizar el clculo contar
el nmero total de colonias confirmadas en las tres placas.
41
REQUISITOS MICROBIOLOGICOS DEL CODIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
- MERCOSUR
Helados
Art. 1078 (Res 2141, 5.9.83): Los distintos tipos de helados debern responder a las
siguientes exigencias microbiolgicas:
I. Helados de elaboracin industrial:
a) Ausencia de grmenes patgenos. Esta exigencia se dar por no cumplida si el
producto presenta:
1. Recuento de bacterias aerobias mesfilas (PCA, 30C, 72 h): mayor de 100000/g
2. Bacterias coliformes: ms de 100/g
3. Bacterias coliformes fecales: ms de 1/g
4. Staphylococcus aureus coagulasa positiva: ms de 500/g
5. Salmonella: presencia en 50 g
6. (Res. 23, 30.01.95): Cuando el recuento de hongos y levaduras supere 100/g slo
podr recomendarse verificar las prcticas de elaboracin y la calidad de las materias
primas utilizadas, no siendo este indicador habilitante para declarar al producto No
Apto para el Consumo.
b) Ausencia de toxinas microbianas.
42
ANLISIS MICROBIOLGICO DE CONSERVAS ALTERADAS (APHA 1992)
b) Latas no abombadas:
- Desinfectar con hipoclorito 2% durante 15 minutos; retirar el exceso y flamear hasta
sequedad.
- Abrir con abrelatas estril y cubrir con una placa de Petri estril.
3) Toma de material
La tcnica utilizada para obtener material y el punto de donde hay que tomarlo varan segn
la naturaleza del producto.
Los lquidos y semilquidos se siembran directamente en los medios, a razn de 1-2 ml cada
10 ml de medio.
Los slidos se transfieren a un recipiente estril de boca ancha de 100 ml, que contiene 50 ml
de agua destilada estril. Se agita para homogeneizar.
Se recomienda guardar parte de la muestra para repetir anlisis en caso necesario.
43
5) Examen microscpico
Tomar material con un ansa y hacer un extendido, secarlo, fijarlo y colorearlo con cristal
violeta. Si el alimento es graso, enjuagar con xilol luego de fijarlo.
Si se dispone de microscopio de contraste de fases, realizar un montaje hmedo, de una
ansada del material con agua, cubrir con cubre-objetos y observar.
6) Cultivo
b.3) Hongos
Sembrar por estra una placa de agar para recuento de hongos. Incubar 5-7 das a 28 C.
44
ANLISIS MICROBIOLOGICO DE CONSERVAS DE BAJA ACIDEZ
MARCHA AEROBIA
MUESTRA
GTA/GTB
Aerobiosis
30-35C 55C
(hasta 4 das) (hasta 4 das)
crecimiento + crecimiento +
Examen microscpico Bacilos con o sin
esporas
Esporas Esporas +
Contaminacin
post-proceso.
Shock trmico
85C 10 min
NAMn NAMn
30-35C 55C
(hasta 4 das) (hasta 4 das)
crecimiento + crecimiento +
Bacillus sp mesfilo Bacillus sp termfilo
Proceso trmico Enfriado insuficiente o
insuficiente temperatura muy alta de
almacenamiento
Crecimiento +
a 30 y a 55C
Bacillus sp. termfilo
facultativo
45
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE CONSERVAS DE BAJA ACIDEZ
MARCHA ANAEROBIA
MUESTRA
PE-2 o CMM
Anaerobiosis
30-35C 55C
(hasta 10 das) (hasta 4 das)
crecimiento + crecimiento +
Examen microscpico Examen microscpico
Crecimiento + Crecimiento +
Bacillus sp. mesfilo Clostridium sp. mesfilo*
Posible contaminacin Posible inadecuado proceso
post-proceso trmico
Crecimiento +
Aerobiosis y anaerobiosis
Examen microscpico
46
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE CONSERVAS ACIDAS
MARCHA AEROBIA
MUESTRA
TAA o OSB
Aerobiosis
30-35C 55C
(hasta 5 das) (hasta 5 das)
Crecimiento + Crecimiento +
Bacillus sp. mesfilo Bacillus sp. termfilo o
(flat sour) termfilo facultativo
Proceso trmico (flat sour)
insuficiente Enfriamiento insuficiente o
alta temperatura de
almacenamiento
MUESTRA MUESTRA
25C
35C (hasta 5 das)
(hasta 5 das)
Crecimiento +
Anaerobios mesfilos
butricos
47
METODO DE CAMARA DE HOWARD PARA RECUENTO DE FILAMENTOS DE
HONGOS EN CONSERVAS (AOAC 984.29, 1990)
2) Materiales
Se emplea un portaobjetos especial en el centro consta de un rectngulo de 15 x 20 mm que
est limitado a cada lado por depresiones y soportes paralelos. Estos estn 0,1 mm ms altos
que el rectngulo el cubre objeto queda apoyado sobre estas barras. El rectngulo, los
soportes y el cubreobjetos tienen superficies planas. Para facilitar la calibracin del
microscopio, el rectngulo tiene dos lneas paralelas separadas 1,382 mm.
Para el recuento de mohos el campo del microscopio debe tener 1,5 mm2 (una circunferencia
de 1,382 mm de dimetro) y debe utilizarse una magnificacin comprendida entre 90 y 125
aumentos totales (fig. 1).
3) Preparacin de la muestra
Tratndose de jugo de tomate o de salsa ketchup la muestra es examinada tal como viene en el
envase. Pesar 20 g de muestra y colocarlo en un vaso de precipitados. Agregar 50 ml de agua
estril y mezclar. En el caso de pur o pasta de tomates se agrega agua para obtener 8,37%-
9,37% de slidos totales, lo cual puede verificarse midiendo el ndice de refraccin a 20C
(1,3447-1,3460). Para facilitar la observacin microscpica se recomienda usar como
diluyente un colorante que se prepara en la forma siguiente: disolver 0,1 g de azul de algodn
en 100 ml de lactofenol (partes iguales de fenol, glicerina, cido lctico y agua). No se
colorean los protoplasmas viejos, pero s los elementos anatmicos del tomate. Debe
limpiarse la cmara de Howard de modo que se produzcan anillos concntricos con los
colores del arco iris, los cuales se pueden observar sosteniendo el portaobjetos en un ngulo
tal que la luz se refleje sobre el cubreobjetos. Los anillos de Newton se deben a la
descomposicin de la luz cuando se adosan perfectamente dos cristales de superficies pulidas.
Sobre el portaobjetos se coloca una porcin de la muestra bien homogeneizada, de modo tal
que cubra exactamente el centro y cuyo espesor sea suficiente para llenar completamente el
espacio existente entre porta y cubreobjetos. Es necesario evitar derrames laterales y en el
preparado no deben quedar burbujas de aire.
La iluminacin debe ser normal ya que demasiada luz impide una observacin adecuada.
La preparacin se lleva al microscopio y se observan 25 campos normalizados. Para tal fin
con el objetivo de 10 aumentos se regula el ocular adecuado (8x, 10x, 12x) de forma tal que
las dos lneas paralelas grabadas en el portaobjetos sean tangentes al campo. Dicho campo
normalizado tiene un dimetro de 1,382 mm y una superficie de 1,5 mm2. Los 25 campos
deben observarse de modo tal que el resultado obtenido sea representativo del total del
preparado (mtodo oficial). La distribucin de campos ideal corresponde a la figura 2. Se
deben examinar por lo menos dos preparados.
48
Cada campo se observa anotando la ausencia o presencia de filamentos fngicos; cuando la
identificacin es difcil se usa un aumento de 200x. Debe usarse el tornillo micromtrico para
observar filamentos en todos los planos del preparado.
En el caso de observarse filamentos cortos, se consideran positivos aquellos campos en los
cuales la longitud agregada de no ms de tres filamentos exceda 1/6 del dimetro del campo.
4) Clculo
Se suman los campos positivos de ambas determinaciones, se multiplica por dos y se obtiene
el porcentaje de campos positivos.
Reglamentacin bromatolgica
En las conservas de tomate se establecen las siguientes tolerancias en el recuento de
filamentos en cmara de Howard (EE.UU. y Canad):
1- Los jugos de tomate examinados, no deben tener ms del 25% de campos positivos.
2- Las latas de tomates, ketchup, los purs de tomates, no deben superar el 60% de campos
positivos.
figura 1 figura 2
49
ANLISIS MICROBIOLGICO DE AZCAR
Tan pronto se estableci que el azcar puede contener bacterias, levaduras y mohos, que al
proliferar pueden producir deterioro en los alimentos enlatados y en las bebidas sin alcohol en
que se usa, se desarrollaron mtodos adecuados para su recuento.
Los laboratorios de la National Canners Association de USA pusieron a punto una serie de
ensayos, que, junto con otros, nos permiten reconocer la calidad del azcar que se examina.
1) Muestreo
Tomar muestras de 250 g de 5 bolsas de cada lote. Estas muestras deben enviarse al
laboratorio en envases limpios y cerrados.
3) Metodologa de anlisis
b) Recuento total
El recuento total de esporas termfilas se hace a partir de las mismas cajas de Petri. El clculo
se hace en la misma forma que para las esporas del flat sour incluyendo todas las esporas
visibles.
50
c) Termfilos anaerobios que no producen SH2
Dividir 20 ml de la solucin del azcar en 6 porciones aproximadamente iguales y sembrarlas
en 6 tubos de caldo hgado. Estratificar el medio con agar triptona. Solidificar el medio
inmediatamente por inmersin parcial en agua fra. Cuando se ha solidificado el medio
precalentar a 55C e incubar a esta temperatura por 48 h. En estas condiciones se produce
rotura del agar y formacin de cido. A veces se produce olor a queso.
Es un mtodo cualitativo con una aproximacin cuantitativa lejana. Los resultados se
expresan como + o - . Por ejemplo: +++---.
51
ANLISIS DEL AZCAR PARA BEBIDAS SIN ALCOHOL
2) Metodologa de anlisis
a) Bacterias mesfilas
b) Levaduras y mohos
a) Bacterias mesfilas
Pipetear 2,1 ml de la solucin en cada una de dos cajas de Petri. Se cubren y se mezcla el
inculo con aproximadamente 12-14 ml de agar nutritivo. Se incuban las cajas durante 48 h a
30C. Finalizado ese lapso el recuento combinado en ambas cajas representa el nmero de
bacterias en aproximadamente 2,5 g del azcar original. El resultado se expresa por 10 g de
azcar.
b) Levaduras y mohos
Se pipetean 2,1 ml de la solucin de azcar antes preparada en cada una de 4 cajas de Petri.
Se cubren mezclando con 12-14 ml de agar para recuento de mohos ajustado a pH 4,5-4,8
con cido lctico 10 % justo antes de su uso. Se incuban las cajas a 30C durante 2 a 3 das.
Al final de ese lapso el recuento combinado de colonias desarrolladas en la placa representa el
nmero de levaduras y mohos en aproximadamente 5 g de azcar original. Se expresan los
resultados por 10 g de azcar.
52
ANALISIS DE CARNES Y PRODUCTOS CARNICOS
2) Metodologa de anlisis
c) Recuento de Enterobacteriaceae
Sembrar 1 ml de dos diluciones sucesivas por duplicado en placas de Petri y volcar sobre
ellas agar Bilis Rojo Violeta Glucosa (ABRV-G), fundido y mantenido a 44-46C.
Homogeneizar rotando la placa. Confeccionar una sobrecapa de aproximadamente 10 ml del
mismo medio fundido, mantenido a 44-46C. Dejar solidificar. Incubar las placas en posicin
invertida a 35-37C durante 21+3 h. Observar las colonias. Se consideran presuntas
53
unidades formadoras de colonias de enterobacterias las colonias de color prpura con
halo de precipitacin.
54
e.3) Confirmacin de Escherichia coli
Estriar una ansada de los tubos positivos de EC en e.2) en una placa de EMB. Incubar 18-24 h
a 35C.
Transferir colonias tpicas a AN y efectuar ensayos de confirmacin (IMViC y produccin de
gas de lactosa) o set de pruebas mltiples.
Calcular el NMP de Escherichia coli/g de muestra en base a los tubos de EC confirmados.
Resultados caractersticos:
1- Coco bacilo Gram negativo no formador de esporas.
2- Fermentacin de lactosa a 44C con formacin de gas.
3- Produccin de indol a 44C.
4- No utiliza citrato.
55
Aislamiento en medio slido
A partir de cada uno de los enriquecimientos estriar una placa de agar Verde Brillante-Rojo
Fenol (agar BPLS) y una de agar MLCB (manitol-lisina-cristal violeta-verde brillante).
Incubar las placas invertidas a 36-38C durante 20-24 h.
De ser necesario, seguir incubando los caldos de enriquecimiento 18-24 h ms y volver a
estriar en los medios de aislamiento.
Si al cabo del perodo de incubacin el crecimiento en las placas fuera escaso, reincubar por
18-24 h adicionales a la misma temperatura.
Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella. En agar
BPLS, las colonias son rosadas y el medio circundante rojo brillante. En agar MLCB, las
colonias tpicas son violetas y, a veces, con centro negro.
Identificacin y confirmacin
De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 36-38C durante 18-24 h. Al cabo de la
incubacin, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmacin
bioqumica y serolgica.
Salmonella es lisina decarboxilasa +, ureasa +, lactosa - (la gran mayora de las cepas),
sacarosa - (la gran mayora de las cepas).
De ser necesario, pueden realizarse las pruebas del indol (la mayora de las cepas son -), la
prueba de Voges Proskauer (-), citrato de Simmons (la mayora de las cepas son +), etc.
De ser posible confirmar el resultado con un test de pruebas mltiples.
Confirmacin serolgica
Seguir la tcnica explicada en TP N 2: Enterobacterias-Salmonella
Emplear una cepa patrn de Salmonella para controlar los medios de cultivo y los medios
empleados en las pruebas de confirmacin e identificacin.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el
anlisis. Aclarar modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.
56
El volumen y las diluciones empleadas dependen de la contaminacin que se espere en la
muestra. Recordar que no se recomienda sembrar ms de 0,2 o 0,25 ml por placa. Tambin
puede realizarse un recuento por duplicado sembrando 0,1 ml por placa.
Identificacin y confirmacin
Sobre los cultivos puros de 24 h realizar:
- Tincin de Gram
- Catalasa
- Coagulasa
- Termonucleasa (en la misma placa de Baird - Parker)
Sembrar en paralelo una cepa patrn para comparar con un positivo.
Para realizar los clculos tener en cuenta las diluciones y las alcuotas sembradas. Aclarar las
modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.
Informar UFC de S. aureus coagulasa positiva / g de muestra.
Calcular el nmero de colonias de B. cereus teniendo en cuenta las diluciones empleadas y las
colonias confirmadas. Informar como UFC de B. cereus/g.
m.1) Enriquecimiento
Enriquecimiento primario:
Colocar 25 ml (o g) de muestra en 225 ml de caldo UVM. Homogeneizar durante 2 minutos.
Incubar por 20 a 24 horas a 30C.
Enriquecimiento secundario:
Transferir 0,1 ml del cultivo anterior a un tubo con 10 ml de caldo Fraser. Incubar 26 + 2
horas a 35C.
Comparar la coloracin de los tubos incubados con uno sin sembrar. Observar tubos
oscurecidos o ennegrecidos por la hidrlisis de esculina. Si el tubo no muestra oscurecimiento
se informa como "Ausencia de L. monocytogenes en 25 g".
En caso de muestras sospechosas de haber causado enfermedad, debe continuarse el anlisis
estriando en agar de aislamiento y reincubando el caldo Fraser por otras 24 horas para realizar
otro aislamiento.
58
Seleccionar colonias tpicas de Listeria monocytogenes: colonias translcidas de 1 a 2 mm de
dimetro con una delgada zona de -hemlisis alrededor de la colonia y completo
aclaramiento del medio por debajo.
Las colonias caractersticas bien aisladas se pican y se transfieren a un tubo de caldo BHI y a
un tubo de agar para movilidad (alternativamente puede emplearse agar SIM) por puncin con
ansa recta. Incubar durante la noche a 20-25C.
Sobre los cultivos ensayar:
- Tincin de Gram
- Catalasa
- Movilidad tpica:
En agar, observar lnea de siembra difusa con forma tpica de sombrilla invertida.
Del caldo: por la gota pendiente o en fresco.
Si se trata de una cepa bien aislada y pura, bacilo corto Gram positivo no formador de
esporas, catalasa (+), de movilidad caracterstica y hemoltica; se procede a la identificacin.
m.4) Identificacin
A partir de cultivos puros, realizar pruebas para diferenciar L. monocytogenes de las otras
especies hemolticas
- Camp Test
- Fermentacin de ramnosa
- Fermentacin de xilosa
Camp Test
Se realiza sobre una placa de agar sangre. Se inocula en forma de fina estra un cultivo fresco
de Staphylococcus aureus y otra lnea paralela de un cultivo fresco de Rhodococcus equi. En
forma transversal se estran, tambin como finas lneas y sin llegar a atravesar las estras ya
hechas, cepas de Listeria monocytogenes, L. seeligeri, L. ivanovii (las tres hemolticas) y L.
innocua (no hemoltica).
Una reaccin Camp positiva se observa por aumento de la hemlisis en la zona cercana a S.
aureus o R. equi.
Resultados caractersticos:
59
n) Determinacin de E. coli 0157:H7 (USDA, FSIS. Laboratory Communication #38,
revisin 4)
n.1) Enriquecimiento
Pesar 65 g en 225 ml de caldo EC modificado con novobiocina. Agitar para homogeneizar.
Incubar a 35C por 18-24 horas.
Incluir por lo menos un control positivo por cada grupo de muestras ensayadas. El inculo
debe ser de aproximadamente 30-300 UFC por el volumen total de enriquecimiento.
Se registrarn todas las reacciones observadas en el control.
n.5) Confirmacin
Se realizan las siguientes pruebas (reaccin caracterstica de Escherichia coli O157: H7):
- TSI (amarillo/amarillo, H2S negativo)
- Fermentacin de sorbitol (negativo)
- Fermentacin de celobiosa (negativo)
- Caldo triptona (indol positivo)
- Medio RM-VP (RM: positivo; VP: negativo)
- Citrato de Simmons (negativo)
60
- Lisina decarboxilasa (positivo) *
- Ornitina decarboxilasa (positivo)*
- Medio decarboxilasa base (negativo)
- Medio movilidad (+/-)
Todos los medios se incuban a 35C. Los azcares deben leerse a las 24 horas.
*Los caldos decarboxilasa deben llevar un sello de vaselina. Los positivos son prpura
(medio bsico por decarboxilacin) y el negativo es amarillo (por acidificacin por
fermentacin de la glucosa del medio).
61
REQUISITOS MICROBIOLGICOS DEL CDIGO ALIMENTARIO ARGENTINO
-MERCOSUR-
ANEXO I
Texto de los artculos 156 tris, 255 y 302 del Cdigo Alimentario Argentino (segn la
modificacin/ inclusin por la Resolucin Conjunta SPyRS/ SAGPyA N 79/04 y 500/04).
Art 156 tris: Los productos preparados a base de carne picada, tales como chacinados
frescos embutidos o no embutidos, y otras preparaciones a base de carne picada (albndigas,
empanadas, pasteles, arrollados o similares) precocidas o no, una vez cocidos y listos para
consumir, ya sea que se dispensen inmediatamente despus de finalizada la coccin, en el
establecimiento elaborador o sean enviados a domicilio, debern responder a las siguientes
especificaciones microbiolgicas:
Criterio complementario
ICMSF o equivalente
Microorganismos de los
n=5 c=2
Recuento de aerobios Alimentos-Vol I-Tcnicas de
m=104 M=105 anlisis microbiolgicos-Parte II-
mesfilos/g
Enumeracin de microorganismos
aerobios mesfilos- Mtodos de
Recuento en Placa
ICMSF o equivalente
n=5 c=2 Microorganismos de los
Recuento de coliformes/g Alimentos-Vol I-Tcnicas de
m=100 M=500 anlisis microbiolgicos-Parte II-
Bacterias coliformes
ICMSF o equivalente
Microorganismos de los
E. coli/g Ausencia/g Alimentos-Vol I-Tcnicas de
anlisis microbiolgicos-Parte II-
Bacterias coliformes
ICMSF o equivalente
Microorganismos de los
Recuento de S. aureus n=5 c=1 Alimentos-Vol I-Tcnicas de
coagulasa +/g m<100 M=500 anlisis microbiolgicos-Parte II-
S. aureus- Recuento de
estafilococos coagulasa positiva
62
Criterio obligatorio
Art. 255: Con la designacin de carne triturada o picada, se entiende la carne apta para
consumo dividida finamente por procedimientos mecnicos y sin aditivo alguno.
Debe prepararse en presencia del interesado salvo en aquellos casos en los que por la
naturaleza del establecimiento o volumen de las operaciones sean autorizados expresamente
por la autoridad competente.
La carne picada fresca deber responder a las siguientes especificaciones microbiolgicas:
Criterio complementario
ICMSF o equivalente
Microorganismos de los
Recuento de aerobios n=5 c=3 Alimentos-Vol I-Tcnicas de
anlisis microbiolgicos-Parte II-
mesfilos/g m=106 M=107 Enumeracin de microorganismos
aerobios mesfilos-Mtodos de
Recuento en Placa
ICMSF o equivalente
n=5 c=2 Microorganismos de los
Recuento de E. coli/g Alimentos-Vol I-Tcnicas de
m=100 M=500 anlisis microbiolgicos-Parte II-
Bacterias coliformes
ICMSF o equivalente
Microorganismos de los
Recuento de S. aureus n=5 c=2 Alimentos-Vol I-Tcnicas de
coagulasa +/g m=100 M=1000 anlisis microbiolgicos-Parte II-
S. aureus-Recuento de
estafilococos coagulasa positiva
63
Criterio obligatorio
Art. 302: Se entiende por chacinados, los productos preparados sobre la base de carne y/o
sangre, vsceras u otros subproductos animales que hayan sido autorizados para el consumo
humano, adicionados o no con substancias aprobadas a tal fin. Los chacinados frescos
debern responder a las siguientes especificaciones microbiolgicas:
Criterio complementario
64
Criterio obligatorio
65
SE.NA.SA PRODUCTOS DE LA PESCA MATERIAS PRIMAS
(Decreto 42.38/68)
Pescados, moluscos Moluscos valvados Crustceos Vacuna Porcina Tripas naturales
no valvados, y escaldados
crustceos crudos
AEROBIOS MESOFILOS 1.000.000 col/g 800.000 col/ g 500.000 col/ g 1.000.000 col/g 1.000.000 col/g 5.000.000 col/ g
ENTEROBACTERIAS 200 col/g 500 col/ g 200 col/g 500 col/ g 1000 col/ g 10.000 col/g
COLIFORMES 100 col/ g 200 col/ g 100 col/g 300 col/ g 500 col/ g 5000 col /g
ESTREPTOCOCOS
100 col/ g 100 col/g 100 col/g No considerar No considerar 5000 col /g
GRUPO D
66
CLOSTRIDIOS
20 col/ g 20 col/g 20 col/g 20 col/g 20 col/g 100 col/g
SULFITOREDUCTORES
Bacillus cereus No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar
LACTOBACILOS No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar No considerar
FLORA MICOTICA TOTAL 600 col /g 200 col/g 200 col/g 1100 col/ g 1100 col/g 1100 col/g
LEVADURAS 500 col/g 100 col/g 100 col/g 1000 col/ g 1000 col/ g 1000 col/ g
Escherichia coli Ausente en 0,1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g
Salmonella sp. Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g
Staphylococcus aureus < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g
COAGULASA +
SE.NA.SA Embutidos frescos Embutidos secos Salazones secas Salazones Chacinados Subproductos
(Decreto 42.38/68) Chorizos, salchichas y Salame, salamn, Bondiola, jamn hmedas cocidos comestibles
longanizas parrilleras. longaniza, chorizos crudo, panceta, Jamn, paleta, lomo Salchicha tipo Viena, Extracto de carne,
espaoles, etc. pastrn, etc. de cerdo cocido. salchichn, gelatina.
mortadela, morcilla,
matambre, etc.
AEROBIOS MESOFILOS 30.000.000 col/ g No considerar* 800.000 col/ g 10.000 col/ g 10.000 col/ g 10.000 col/ g
ENTEROBACTERIAS 25.000 col/ g 2.000 col/ g 200 col/ g 200 col/ g 200 col/ g 100 col/ g
COLIFORMES 10.000 col/ g 1.000 col/ g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g
ESTREPTOCOCOS
10.000 col/ g 200.000 col /g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g 100 col/ g
GRUPO D
CLOSTRIDIOS
100 col/ g 50 col/ g 20 col/ g 20 col/ g 20 col/ g 20 col/ g
67
SULFITOREDUCTORES
Bacillus cereus No considerar 400 col/ g 400 col/ g 400 col/ g 400 col/ g 400 col/ g
LACTOBACILOS No considerar Sin lmite Sin lmite No considerar No considerar No considerar
FLORA MICOTICA TOTAL 2.200 col/ g No considerar 1.100 col/ g 1.100 col/ g 200 col/ g 200 col/ g
LEVADURAS 2.000 col/ g Sin lmite 1.000 col/ g 1.000 col/ g 100 col/ g 100 col/ g
Escherichia coli Ausente en 0,1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g Ausente en 0.1 g
Salmonella sp. Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g Ausente en 25 g
Staphylococcus aureus < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g < 100 col/ g
COAGULASA +
2) Metodologa de anlisis
Identificacin y confirmacin
Pasar un nmero representativo de colonias sulfito reductoras a tubos con 10 ml de caldo
tioglicolato. Incubar 24 h a 37C observando si hay crecimiento vigoroso entre 4 y 6 horas
con produccin de abundante gas. A partir de tubos con buen crecimiento realizar:
- Tincin de Gram
- Licuacin de la gelatina en tubos con discos de gelatina-carbn. Sembrar 0,2 ml en el
fondo de los tubos conteniendo el medio previamente deaireado. Incubar a 37C por 18 h.
- Movilidad y reduccin de nitrato en agar semislido Nitrato-Movilidad-Buffereado.
Sembrar por puncin e incubar por 24 h a 37C.
- Fermentacin de la lactosa en medio para fermentacin de azcares. Sembrar 0,2 ml en el
fondo de tubos previamente deaireados. Incubar a 37C por 24 h.
d) Determinacin de Salmonella
Pre-enriquecimiento en medio lquido
Pesar aspticamente 25g de muestra en un erlenmeyer con 225 ml de agua peptonada
tamponada. Agitar para homogeneizar. Incubar a 37C durante 16-20 h.
Identificacin y confirmacin
De cada placa seleccionar cinco colonias sospechosas. Estriar en una placa de agar nutritivo
para que desarrollen colonias aisladas. Incubar a 36-38C durante 18-24 h. Al cabo de la
incubacin, seleccionar colonias aisladas para proseguir con las pruebas de confirmacin
bioqumica y serolgica.
Salmonella es lisina decarboxilasa +, ureasa +, lactosa - (la gran mayora de las cepas),
sacarosa - (la gran mayora de las cepas).
De ser necesario, pueden realizarse las pruebas del indol (la mayora de las cepas son -), la
prueba de Voges Proskauer (-), crecimiento en caldo KCN (no crece), etc.
De ser posible confirmar el resultado con un sistema de pruebas mltiples.
Confirmacin serolgica
Seguir la tcnica explicada en TP N 2: Enterobacterias-Salmonella
Emplear una cepa patrn de Salmonella para chequear los medios de cultivo y los medios
empleados en las pruebas de confirmacin e identificacin.
Informar ausencia o presencia de Salmonella en la cantidad de muestra empleada en el
anlisis. Aclarar modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.
70
Identificacin y confirmacin
Sobre los cultivos puros de 24 h realizar:
- Tincin de Gram
- Catalasa
- Coagulasa
- Termonucleasa (en la misma placa de Baird-Parker)
Sembrar en paralelo una cepa patrn para comparar con un positivo.
Para realizar los clculos tener en cuenta las diluciones y las alcuotas sembradas. Aclarar las
modificaciones y pruebas bioqumicas realizadas.
Informar UFC de S. aureus coagulasa positiva/g de muestra
Calcular el nmero de colonias de B. cereus teniendo en cuenta las diluciones empleadas y las
colonias confirmadas. Informar como UFC de B. cereus /g de muestra.
71
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA
2) Metodologa de anlisis
72
Esquema del mtodo 9221. Standard Methods 18th. Ed. 1992.
(1.1) (1.2)
Colonias tpicas o atpicas. Colonias no tpicas.
- Transferir a Caldo Lauril Sulfato. Ausencia de coliformes
Incubar 24-48 h a 35C.
- Transferir a Agar nutritivo inclinado.
Incubar 24 h a 35C a 1.2.
(a) (b)
Produccin de gas -. Gas +
Ausencia de coliformes Tincin de Gram del AN:
73
c) Determinacin de coliformes totales por el mtodo de filtracin por membrana
(Directiva 95/131 CEE)
Se filtra por membrana la cantidad necesaria de agua y se coloca el filtro en 25 ml de Caldo
Lauril Sulfato. Se incuba 4 h a 30oC y 14 h a 37oC. Si hay produccin de cido y/o gas y/o
crecimiento abundante, confirmar como en (1). Se determina ausencia o presencia del grupo
coliforme en el volumen filtrado.
Si se desea hacer recuento colocar el filtro sobre un pad estril embebido en el medio de
cultivo (Caldo Lauril Sulfato para filtracin por membrana), incubando de igual forma. Las
colonias amarillas se confirman como en (1). Se pueden determinar UFC de coliformes
totales/volumen de agua.
74
REQUERIMIENTOS MICROBIOLGICOS DEL CAA
75
Tabla I. - Nmero ms probable (N.M.P.) de bacterias coliformes por 100 ml de la muestra, sembrando porciones en no ms de tres diluciones
0 1 0 .. 4,9 4,9 4,7 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,5 4,4 4,4 4,4 4,4 4,4 4,3 4,2 4,2 4,2 4,2 4,2 4,1 4,1 4,0 4,0 4,0 4,0
0 1 1 .. .. 9,7 .. 9,3 9,2 9,2 9,2 9,1 .. 8,9 8,8 8,8 8,8 8,7 .. 8,5 8,5 8,4 8,4 8,4 .. 8,1 8,1 8,1 8,1 8,0
0 2 0 .. .. .. 9,5 9,5 9,4 9,4 9,3 9,3 9,1 9,1 9,0 9,0 8,9 8,9 8,7 8,7 8,6 8,6 8,5 8,5 8,3 8,3 8,3 8,2 8,2 8,2
0 2 1 .. .. .. .. 14 14 14 14 14 .. 14 14 14 14 13 .. 13 13 13 13 13 .. 12 12 12 12 12
0 3 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. 14 14 14 14 14 14 14 14 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13
1 0 0 6,9 6,5 6,4 6,1 6,0 6,0 6,0 5,9 5,9 5,7 5,7 5,6 5,6 5,6 5,5 5,4 5,4 5,3 5,3 5,3 5,2 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1 5,1
1 0 1 .. .. 13 .. 12 12 12 12 12 .. 12 12 12 12 11 .. 11 11 11 11 11 .. 10 9,9 9,9 9,9 9,9
1 1 0 .. 14 14 13 13 13 13 13 13 12 12 12 12 12 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 10
1 1 1 .. .. 22 .. 20 20 20 20 19 .. 19 19 18 18 18 .. 18 17 17 17 17 .. 16 16 16 16 16
1 1 2 .. .. .. .. .. 28 27 27 27 .. .. 26 25 25 25 .. .. 24 24 24 23 .. .. 22 22 22 22
1 2 0 .. .. .. 21 21 21 21 20 20 19 19 19 19 19 19 18 18 18 18 18 18 17 17 17 17 17 17
1 2 1 .. .. .. .. 29 29 28 28 28 .. 27 26 26 26 26 .. 25 25 24 24 24 .. 23 23 23 23 23
1 3 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. 28 28 27 27 27 27 26 26 25 25 25 25 24 24 24 24 23 23
1 3 1 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 36 36 35 35 35 .. 33 33 33 32 32 .. 31 31 30 30 30
2 0 0 .. 30 30 24 24 23 23 22 22 20 20 20 20 19 19 18 18 18 17 17 17 16 16 16 16 15 15
2 0 1 .. .. 95 .. 52 50 48 46 45 .. 38 38 37 36 35 .. 32 31 31 30 30 .. 27 27 27 26 26
2 0 2 .. .. .. .. .. 95 91 87 83 .. .. 65 63 61 59 .. .. 50 49 48 47 .. .. 42 41 40 40
2 0 3 .. .. .. .. .. .. 140 140 130 .. .. .. 95 92 90 .. .. .. 72 71 69 .. .. .. 58 57 56
2 1 0 .. .. 240 69 66 62 57 54 51 45 43 42 41 40 39 35 34 34 33 33 32 29 29 29 28 28 28
76
2 1 1 .. .. .. .. 140 130 120 110 110 .. 81 77 74 72 69 .. 57 56 54 53 51 .. 46 45 45 44 43
2 2 3 .. .. .. .. .. .. .. 1.400 920 .. .. .. 290 270 260 .. .. .. 170 170 160 .. .. .. 130 130 120
2 2 4 .. .. .. .. .. .. .. .. 1.600 .. .. .. .. 350 340 .. .. .. .. 210 200 .. .. .. .. 150 150
2 3 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 340 280 240 210 190 140 130 130 120 110 110 90 89 86 84 81 79
2 3 1 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 690 410 290 220 .. 190 180 170 160 160 .. 120 120 120 110 110
2 3 2 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.100 700 510 .. .. 250 230 220 210 .. .. 160 150 150 140
0 1 0 .. 3,3 3,3 3,2 3,2 3,2 3,1 3,1 3,1 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9
1 0 0 4,1 3,9 3,9 3,8 3,7 3,7 3,6 3,6 3,6 3,6 3,6 3,5 3,5 3,5 3,5 3,4 3,4 3,4 3,4 3,4 3,3 3,3 3,3 3,3
1 1 0 .. 8,1 8,0 7,7 7,7 7,7 7,4 7,4 7,4 7,3 7,3 7,3 7,2 7,1 7,1 7,1 7,1 7,0 6,9 6,9 6,9 6,8 6,8 6,8
1 2 0 .. .. .. 12 12 12 12 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 10
1 2 1 .. .. .. .. 16 16 .. 16 15 15 15 15 .. 15 15 15 15 15 .. 14 14 14 14 14
1 3 0 .. .. .. .. .. .. 16 16 16 16 16 16 15 15 15 15 15 15 15 15 15 15 14 14
1 3 1 .. .. .. .. .. .. .. 20 20 20 20 20 .. 19 19 19 19 19 .. 18 18 18 18 18
2 0 0 11 10 10 9,8 9,8 9,7 9,3 9,3 9,2 9,1 9,1 9,1 8,9 8,8 8,8 8,7 8,7 8,7 8,5 8,5 8,4 8,4 8,3 8,3
2 0 1 .. .. 16 .. 15 15 .. 15 14 14 14 14 .. 14 14 14 14 13 .. 13 13 13 13 13
2 1 0 .. 17 17 16 16 16 15 15 15 14 15 15 14 14 14 14 14 14 13 13 13 13 13 13
2 1 1 .. .. 24 .. 22 22 .. 21 21 20 20 20 .. 20 19 19 19 19 .. 19 18 18 18 18
2 2 0 .. .. .. 23 23 23 21 21 21 21 21 21 20 20 20 20 20 20 19 19 19 19 19 19
2 2 1 .. .. .. .. 30 30 .. 28 28 28 27 27 .. 26 26 26 26 26 .. 25 25 24 24 24
2 3 0 .. .. .. .. .. .. 29 29 29 29 28 28 27 27 27 27 27 26 26 25 25 25 25 25
2 3 1 .. .. .. .. .. .. .. 37 36 36 36 36 .. 34 34 34 33 33 .. 32 32 31 31 31
2 4 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 35 35 35 35 34 34 33 33 33 32 32 32
2 4 1 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 43 43 42 42 42 .. 40 40 39 39 39
2 5 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 42 41 41 41 40 40
2 5 1 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 49 49 48 48 48
2 5 2 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 57 56 56 56
3 0 0 .. 34 33 28 27 27 24 24 23 23 23 23 21 21 21 21 21 20 19 19 19 19 19 19
77
3 0 1 .. .. 95 .. 53 51 .. 40 39 39 38 37 .. 34 33 33 32 32 .. 29 29 29 29 28
3 0 2 .. .. .. .. .. 95 .. .. 65 64 62 60 .. .. 51 50 49 48 .. .. 43 42 41 40
3 1 1 .. .. .. .. 140 130 .. 81 78 75 72 70 .. 59 57 56 54 53 .. 47 46 46 45 44
3 1 2 .. .. .. .. .. 210 .. .. 120 120 110 110 .. .. 85 83 81 78 .. .. 67 65 64 63
3 2 0 .. .. .. .. 300 240 110 100 98 93 89 85 69 67 65 63 61 59 51 50 49 48 47 46
3 2 1 .. .. .. .. .. 700 .. 170 160 150 140 130 .. 100 100 97 94 91 .. 77 75 73 71 69
3 2 2 .. .. .. .. .. .. .. .. 230 210 200 190 .. .. 140 140 130 130 .. .. 100 99 97 94
3 3 2 .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.100 700 530 .. .. 250 230 220 210 .. .. 160 150 150 140
3 3 3 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.400 920 .. .. .. 300 280 270 .. .. .. 190 180 180
3 3 4 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 1.600 .. .. .. .. 360 340 .. .. .. .. 220 210
3 3 5 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 420 .. .. .. .. .. 250
3 4 0 .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 370 300 270 240 220 160 150 150 140 140 130
78
BIBLIOGRAFIA
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Mossel y Moreno Garca, "Microbiologa de los alimentos. Fundamentos ecolgicos para
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Vanderzant, C. & Splittstoesser, D. (Eds.). Compendium of methods for the microbiological
examination of foods 3rd Ed. APHA, 1992.
79
ANEXO - BIOSEGURIDAD
Las prcticas que se realizan en los laboratorios presentan riesgos propios de cada actividad.
Las reglas bsicas aqu indicadas son un conjunto de normas destinadas a proteger la salud de
los alumnos y a evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro del mbito de trabajo, como
hacia el exterior.
MEDIDAS GENERALES
80
14. Todo residuo generado debe colocarse en los recipientes destinados para tal fin segn las
indicaciones del docente (ver Pautas para Gestin de Residuos).
LABORATORIOS DE QUMICA
81
6. No almacenar en estantes sobre mesadas sustancias corrosivas y en caso de cidos o
lcalis concentrados (mayor de 2N) deben ser mantenidos en bandejas de material
adecuado.
7. Las prcticas que produzcan gases, vapores, humos o partculas, y que puedan ser
riesgosas por inhalacin deben llevarse a cabo bajo campana.
8. Se debe verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender una fuente de
ignicin.
9. No se debe trabajar con materiales inflamables o solventes sobre llamas directas o cerca
de las mismas. Para calentamiento, slo se utilizarn resistencias elctricas o planchas
calefactoras blindadas. Se prestar especial atencin al punto de inflamacin y de
autoignicin del producto.
10. Est prohibido descartar lquidos inflamables o txicos o corrosivos por los desages de
las piletas, sanitarios o recipientes comunes para residuos. Se deben seguir las pautas
para la gestin de residuos.
11. Los cilindros de gases comprimidos y licuados deben estar en posicin vertical sujetos
con correas o cadenas a la pared en sitios de poca circulacin, de ser posible fuera del
lugar de trabajo, protegidos de la humedad y fuentes de calor.
12. El material de vidrio roto no se depositar con los residuos comunes. Ser conveniente
envolverlo en papel y ubicarlo en cajas resistentes,
13. Todo recipiente que hubiera contenido agentes qumicos puede ser descartado junto a los
residuos comunes vaciado totalmente, enjuagado apropiadamente y sin etiquetas.
14. Est terminantemente prohibido hacer experimentos no autorizados por el Docente. No
substituya nunca un producto qumico por otro en una prctica.
LABORATORIOS DE BIOLOGIA
82
PAUTAS PARA LA GESTIN DE RESIDUOS PELIGROSOS Y PATOGNICOS
) EMERGENCIAS MDICAS
Si ocurre una emergencia tal como cortes o abrasiones, quemaduras o ingestin accidental de
algn producto qumico, txico o peligroso, se deber proceder en la siguiente forma:
1. A los accidentados se les proveer los primeros auxilios
2. Se da aviso al Departamento de Seguridad y Control (Int. 311 Emergencias)
3. El Docente responsable del turno o una autoridad del Departamento, deber
completar el Formulario de Incidentes y enviarlo al Servicio de Higiene y Seguridad
para su conocimiento y evaluacin.
INTOXICACIONES:
Hospital de Nios. Dr. R. Gutirrez
Snchez de Bustamante 1399. Capital Federal. Tel: 4962-6666.
Hospital de Nios. Dr. P. de Elizalde
Av. Montes de Oca 40 Tel. 4307-7491 Toxicologa 4300-2115
QUEMADURAS:
Hospital de Quemados
P.Goyena 369 Tel. 4923-4082 / 3022
83
OFTALMOLOGA
Hospital Santa Luca
San Juan 2021 Tel. 4941-7077
Hospital Dr. P. Lagleyze
Av. Juan B. Justo 4151 Tel. 4581-0645 / 2792
1. Quemaduras.
Las pequeas quemaduras producidas por material caliente, baos, placas o mantas
calefactoras, etc., se trataran lavando la zona afectada con agua fra durante 10-15 minutos.
Las quemaduras ms graves requieren atencin mdica inmediata. No utilices cremas y
pomadas grasas en las quemaduras graves.
2. Cortes.
Los cortes se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10 minutos como
mnimo. Si son pequeos y dejan de sangrar en poco tiempo, lvalos con agua y jabn y
tpalos con una venda o apsito adecuados. Si son grandes y no paran de sangrar, requiere
asistencia mdica inmediata.
5. Fuego en el cuerpo.
Si se te incendia la ropa, pide ayuda. El afectado no correr, tiene que tirarse en el suelo y
rodar sobre si mismo para apagar las llamas. Es tu responsabilidad ayudar a alguien que se
est quemando. Cubrirlo con una manta antifuego, conducirlo hasta la ducha de seguridad, si
est cerca. No utilices nunca un extintor sobre una persona. Una vez apagado el fuego,
mantener a la persona tendida, hasta que llegue la asistencia mdica.
84
8. Actuacin en caso de inhalacin de productos qumicos.
Identificar el vapor txico. Si se trata de un gas, utilizar el tipo adecuado de mscara para
gases durante el tiempo que dure el rescate del accidentado. No arriesgarse. Conducir
inmediatamente la persona afectada a un sitio con aire fresco. Requiere asistencia mdica lo
antes posible. Ante el primer sntoma de dificultad respiratoria, iniciar la respiracin artificial
boca a boca.
) INCENDIOS
1. Fuego en el laboratorio.
Mantenga la calma.
Informe al docente responsable.
Se dar aviso inmediatamente al Dpto. de Seguridad y Control (Interno 311) informando el
lugar y las caractersticas del siniestro
2. Fuegos pequeos
Si el fuego es pequeo y localizado, y sabe utilizar un extintor, trate de apagarlo utilizando un
extintor adecuado, arena, o cubriendo el fuego con un recipiente de tamao adecuado que lo
ahogue.
Retirar los productos qumicos inflamables que estn cerca del fuego.
No utilices nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamacin de un solvente.
3. Fuegos grandes
Si el fuego es de consideracin, no se arriesgue y manteniendo la calma ponga en marcha el
plan de evacuacin. Apague los equipos elctricos y cierre las llaves de gas y ventanas.
Acate las indicaciones de los brigadistas.
Evacue la zona por la ruta asignada.
No corra, camine rpido, cerrando a su paso la mayor cantidad de puertas. No utilice
ascensores. Descienda siempre que sea posible.
No lleve consigo objetos, pueden entorpecer su salida.
Si pudo salir por ninguna causa vuelva a entrar. Deje que los equipos especializados se
encarguen.
85
Deje actuar y luego recoger con pala y colocar el residuo en la bolsa roja (patognicos) o
negra (peligrosos) y cirrela.
Si el derrame es de algn elemento muy voltil deje dentro de la campana hasta que lo
retire para su disposicin.
Disponer la bolsa con los residuos (consultar al Servicio de Higiene y Seguridad, int. 275)
Lave el rea del derrame con agua y jabn. Seque bien.
Cuidadosamente retire y limpie todos los elementos que puedan haber sido salpicados por
el derrame.
Lave los guantes, la mscara y ropa.
86
Fecha: ..................................................................
Firma:...................................................................
Aclaracin:............................................................
L.U. N: ...............................................................
87