Mtodos de diagnstico y cultivo para Bordetella

pertussis
1 INTRODUCCIN
La Bordetella pertussis es el agente etiolgico de la tosferina que infecta
exclusivamente al humano y se localiza en las vas areas superiores. La tosferina es
principalmente una enfermedad peditrica. Pero tambin puede presentarse a cualquier
edad, presentando diferentes sntomas. Ha surgido forma endmica en zonas geogrficas
muy pobladas y en forma epidmica intermitente. En los ltimos aos se han observado
brotes importantes, resurgiendo principalmente en pases con amplias coberturas
vacunales,1,2 afectando primordialmente a lactantes menores de seis meses, adolescentes
o adultos jvenes debido a una inmunidad limitada o disminuida que ha sido inducida por
la vacuna.3,4
La transmisin de la tosferina es por contacto directo de persona a persona con
microgotas en suspensin de los individuos infectados al toser o estornudar. Los seres
humanos son los nicos reservorios de la bacteria Bordetella pertussis.4, 5
Se ha denominado a la tosferina tambin como tos convulsa o coqueluche, debido al
sndrome de tos severa caracterizada por paroxismos (accesos repetidos y tos violenta)
los que pueden ser seguidos de estridor inspiratorio y en ocasiones, de vmito. 6

2 CUADRO CLNICO DE LA TOSFERINA

La tosferina puede dividirse en tres estadios: catarral, paroxstico y convalecencia.
Perodo prodrmico o catarral: (1 a 2 semanas) se caracteriza sntomas inespecficos
de resfriado o gripe", inicio insidioso con coriza, malestar, anorexia y tos nocturna.
Puede estar ausente en el neonato y lactante pequeo. La enfermedad es altamente
transmisible en este estado, ya que hay gran cantidad de microorganismos en las vas
respiratorias altas. Los cultivos recogidos en este momento tienen la mxima probabilidad
de ser positivos.1, 4, 7,9
Perodo paroxstico o espasmdico: (2 a 6 semanas) se caracteriza por tos paroxstica,
en quintas, con 5 a 15 golpes de tos en expiracin que terminan en un silbido inspiratorio.
Puede acompaarse de vmitos y, ocasionalmente, prdida de conocimiento. Las
complicaciones se presentan con cierta frecuencia durante el perodo paroxstico y son de
tipo neurolgico y respiratorio, tales como encefalopata con prdida de conciencia y
convulsiones, atelectasia pulmonar, neumona y bronquiectasias. Se caracteriza por la
tos en staccato con el silbido inspiratorio prolongado que se escucha al final de la
crisis de tos. Durante este estadio, se observa linfocitosis, no hay fiebre, ni otros signos ni
sntomas sistmicos. 1, 4, 7,9
Perodo convaleciente: (2 a 4 semanas) se caracteriza porque la tos es menos intensa y
desaparecen los otros sntomas y signos. Se presentan otras infecciones bacterianas secundarias con
frecuencia, como neumona y otitis media, en especial en los menores de seis meses. 1, 4, 7,9

3 TAXONOMA Y MORFOLOGA DE BORDETELLA PERTUSSIS

TAXONOMA
Anteriormente fue el gnero Bordetella fue
Clase: Betaproteobacteria
clasificado en las especies bacterianas que inclua
Orden: Burkholderiales Haemophilus, Brucella y Alcaligenes, posteriormente se
Familia: Alcaligenaceae incluyeron tanto especies de Bordetella como de
Brucella entre los gneros de afiliacin incierta. De Ley y
Gnero: Bordetella
cols. propusieron que la familia Alcaligenaceae abarcara
Especie: Pertussis especies de Alcaligenes y Bordetella.7 En la Tabla 1 se
describe la taxonoma para la bacteria Bordetella
pertussis.
 Las especies de Bordetella son aerobios estricto, no
Tabla 1 Taxonoma de la bacteria Bordetella
fermentadores y se desarrollan a una temperatura de
pertussis
35 a 37C, son bacterias fastidiosas, diminutos
cocobacilos (0.2-0.7 m), gramnegativos. En 1906 fue aislada por primera vez en cultivo
puro por Bordet y Gengou.1, 7,9
La tabla 2 describe las caractersticas morfolgicas y bioqumicas de la Bordetella
pertussis, as como los medios de cultivo en los cuales crecen.

CARACTERSTICAS Bordetella pertussis

Cocos Diminutos cocobacilos teidos dbilmente, dispuestos en forma aislada o en pares. La modificacin de la tincin de
gramnegati Gram, aumentando el tiempo de tincin del colorante de contraste (Safranina O o solucin acuosa de fuscina
vos bsica al 0.2%), aumenta su visibilidad. En subcultivos pueden observarse pleomrficos.
Aerobios No esporulado No encapsulado Inmvil
estrictos
Pruebas Bioqumicas: Son inactivos a la mayora de las pruebas bioqumicas.
Catalasa: POSITIVO Oxidasa: POSITIVO Oscurecimiento en el agar con
Glucosa: NEGATIVO Lactosa: NEGATIVO peptona. Coloracin parda:
NEGATIVO
Ureasa: NEGATIVO Citrato: NEGATIVO Requerimiento de X y V :
Indol: NEGATIVO Reduccin de NEGATIVO NEGATIVO
Nitrato:
Crecimiento en Das que tarda en aparecer las Crecimiento en Das que tarda en aparecer las
Agar: colonias en el medio Agar: colonias en el medio
Bordet-Gengou 2-6 DAS Sangre Sin crecimiento
Regan-Lowe 3-6 DAS Chocolate Sin crecimiento
MacConkey Sin crecimiento SS NEGATIVO

Tabla 2 Caractersticas de la Bacteria Bordetella pertussis

.

4 MTODOS DE DIAGNSTICO
El diagnstico de la tos ferina est basado en las manifestaciones clnicas, la OMS
establece como caso confirmado por clnica al presentase tos de duracin mayor de 2
semanas, ms tos paroxstica, estridor, gallo inspiratorio o vmitos tras los accesos de tos,
sin otra causa aparente y sin prueba de laboratorio confirmatoria. 3 No obstante el cultivo
es considerado por la OMS como el estndar de oro para la confirmacin de casos por
laboratorio. 10
El diagnstico de laboratorio se efecta por mtodos directos e indirectos. Los mtodos
directos abarcan el cultivo y la Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) para la
identificacin de la bacreria B. pertussis. Los mtodos indiretos son esencialmente por
serologa al detectar anticuerpos de un paciente infectado frente a la bacteria, pero no se
pueden considerar como mtodo nico para diagnstico debido a que no se dispone de
un estndar de referencia de la OMS para cuantificar el ttulo de anticuerpo, ni es posible
diferenciar entre la respuesta a la vacunacin de la respuesta a la infeccin. 4,8,10, Las
tinciones de inmunofluorescencia directa con anticuerpos especficos a partir de
secreciones nasofarngeas con frecuencia muestran resultados falso negativos y
positivos.10
La tcnica de PCR es la ms sensible, inclusive que el cultivo bacteriano y arroja
resultados en un menor tiempo, a pesar de considerarse como la ms idnea presenta
como desventaja su elevado costo as como la infraestructura de laboratorios para
biologa molecular que se requiere. Es importante seguir realizando el cultivo para analizar
la evolcin de la bacteria y la vigilancia de eventuales variantes antgenicas con respecto
a las cepas vacunales.3, 8,10
En la tabla 3 se describen los diferentes mtodos para diagnstico de Bordetella
pertussis, as como la especificidad y sensibilidad para cada uno de ellos.

Mtodo de Tipo de Especifici

Descripcin Sensibilidad
laboratorio muestra dad
Aspirado o
Cultivo en agar Bordet-Gengou o Regan-
Cultivo hisopado 100% menos del 50%-60%
Lowe
nasofarngeo
 Realizada con fluorocromos conjugados Sobre el
monoclonales y policlonales, que reconocen cultivo o
Inmunofluorescenc
el eptope de un lipo-oligosacrido directamente 90% 29 a 60%
ia Directa (I.F.D.)
especfico de B. pertussis. Muy dependiente en la muestra
de la experiencia del laboratorio.7 nasofarngea.
Deteccin en suero de IgG frente a toxina
pertusoide (TP) y hemaglutinina filamentosa Dificultad
Variable en funcin del
(HAF) mtodos serolgicos aplicados a la para
tipo de antgeno
deteccin de anticuerpos frente a Bordetella Suero del comparar
Serolgico utilizado, la clase de
sp. (entre los que se incluyen aglutinacin, paciente los
inmunoglobulina y
microaglutinacin, inmunofluorescencia resultados
8 vacunacin
indirecta e inmunoblot) ELISA tcnica ms
aceptada.8
Muestras
nasofarngeas
Reaccin en Genes, cebadores de PCR especficos de
o
cadena de la especie o ambos y sondas tanto para la 65-99% 90-100%
microorganism
polimerasa (PCR) deteccin directa de microorganismos.7
os aislados en
cultivo

Tabla 3 Mtodos de laboratorio para el diagnstico de Tos ferina

5 CULTIVO PARA BORDETELLA PERTUSSIS

Entre los factores que determinan el xito del aislamiento de la bacteria de Bordetella
pertussis se encuentran: la fase de la enfermedad en la que se realiza la toma de muestra,
la tcnica empleada para obtener la muestra, asi como los medios de transporte y de
enriquecimiento en donde se realiza el cultivo. El momento ideal para la toma de muestra
es al trmino del periodo de incubacin, durante la fase catarral y al comienzo de la fase
convulsiva. El inicio de tratamiento antimicrobiano temprano con macrlidos influye en el
rendimiento del cultivo. La muestra debe ser obtenida a travs de un aspirado o exudado
(hisopo de alginato o Dacrn) nasofaringeo. Muestras de exudado farngeo o esputo no
son apropiados para el aislamiento de Bordetella pertussis porque no es posible obtener
una cantidad suficiente de clulas epiteliares ciliadas.11 Los hisopos de algodn pueden
ser txicas para esta bacteria, las de alginato son recomendadas para cultivo, no as para
PCR, ya que puede inhibir las reacciones de amplificacin del ADN, por lo que el uso de
hisopo de Dacrn permite la utilizacin de la muestra tanto para el cultivo como para la
PCR.8
La Bordetella pertussis no requiere de hemina ni NAD, sin embargo el medio de cultivo
para el aislamiento primario requiere de agregado de carbn, resinas de intercambio
inico o sangre al 15-20% para neutralizar los efectos inhibidores de crecimientos de
cidos grasos insaturados, sulfas, perxidos y metales pesados. 7 Los dos medios slidos
ms utilizados para el cultivo de Bordetella perussis son agar de Bordet-Gengou (BG) y
medio de Regan-Lowe (RL), ste ltimo tambin utilizado como medio de transporte,
brindando 1-2 das de conservacin, incubndolo a 36 C. 4,7,8 El medio de Bordet-Gengou
ha dejado de utilizarse prefiriendo a el uso del medio con carbn de Regan-Lowe
complementado con glicerol, peptonas y sangre de caballo. 11 En la tabla 4 se describe
brevemente los diferentes medios de cultivo para el aislaminto de la Bordetella pertussis.
Como se muestra en la tabla 5 los medios de trasnporte se encuentran disponibles en el
comercio. El medio de Casamino cido tambin puede emplearse para el enriquecimiento
y transporte rpido de B. pertussis, que brinda 4 horas mximo de tiempo mximo de
conservacin en condiciones de refrigeracin. 8
Otro medio de cultivo para el aislamiento de esta bacteria es el agar base de carbn
con suplemento de sangre de caballo desfibrinada mas antibiticos como lincomicina. 7
Medio de cultivo Contenido Ventajas y desventajas
Bordet-Gengou Agar infusin de papa con glicerol y sangre de carnero Baja selectividad.14 Vencimiento
con meticilina o cefalexina. 4 Se puede sustituir por corto.4 La base de agar BG
meticilina (2.5 g/mL) u oxaclina (0.625 ng/mL).7 casera es superior, existe un
Fundir la base de agar papa/glicerol y se agregan 30 Ml medio basal deshidratado
de sangre desfibrinada de carnero por 100 mL de comercial
 medio base de agar (aproximadamete 23% de sangre (Remel Laboratories; BD
peso/volumen).7 Biosciences).7
Vencimiento de 4 a 8 semanas.4
Agar carbnsuplementado con el 10% de sangre de
Mayor rendimiento debido a la
caballo y cefalexin.
estimulacin que produce la
Composicin por litro de agua destilada :51 g de Agar
Regan-Lowe sangre de caballo en la
carbn (Oxoide CM 119) 100 mLmSangre de caballo,
proliferacin ms abundante y
desfibrinada, 0.04 g Cefalexina (omitir para agar no
rpida de la B. pertussis.
selectivo), 0.05 g Anfotericina B (opcional).
Disponible comercialmente.
Agar-carbn Carbn vegetal de Jones-Kendrick. Agar con carbn
tamponado con vegetal y extracto de levadura, almidn y 40g de Vencimiento en 2 3 meses.4
extracto de levadura cefalexina. 4
Mejora la selectividad. Largo
periodo de vencimiento. La
No contiene sangre. Contenido por litro de agua cefalexina ya no puede ser un
destilada: 10.7 g de glutamato de sodio, 0.24 g of L- reactivo selectivo adecuado
Medio slido con
prolina, 2.5 g de NaCl, 0.5 g de KH 2PO4, 0.2 g de KCl, para el aislamiento de B.
cyclodextrin con 5
0.1 g de MgCl26H2O, 0.02 g de CaCl2, 6.1 g de Tris, 2.5 pertussis a partir de muestras
g/ml de Cefalexina
g de Casamino Acido, 2.0 g de dimetil--ciclodextrina, nasofarngeas debido a la
and 17.0 g de agar Bacto.14 resintencia bacterina a
lactmicos de microbiota
normal.14
Reemplazando cefalexina por cefdnir (4 g/ml) que
inhibe M. catarrhalis, vancomicina (8 g/ml), y
Mayor sensibilidad (95.6 % ) y
anfotericina B (4 g/ml). Contenido: 40 mg de L-
una mayor inhibicin de la flora
cistena, 10 mg de FeSO47H2O, 20 mg de cido
Medio modificado nasofarngea que el agar
ascrbico, 4 mg niacina, y 150 mg de glutatin
con cyclodextrin Bordet - Gengou ( 65.2 %) o
reducido por 10 ml fue aadido a un litro de agar base.
(medio MCS) medio slido ciclodextrina
Todos los ingredientes excepto los antibiticos fueron
( 39.1 %). Complejidad en su
esterilizados en autoclave a 121C durante 15 min. 14
preparacin.14
Despus la mezcla se enfri a 50 C, se aadi la
solucin madre estril (100 mL) de cada antibitico.
Tabla 4 Medios de cultivo para el aislamiento de Bordetella pertussis.

Medio de transporte Caractersticas

Agar Regan-Lowe Regan-Lowe Semi-slido. Disponible comercialmente. Cat.
Preparado con una concentracin No. Q32, 13x100mm Tubo, 4ml
al medio de su frmula original.
Casamino cido Hidrolizado de casena en fro y el Disponible comercialmente
caldo con casamino cido.
Tabla 5 Medios de transporte para muestras de exudado o aspirado nasofarngeo para el aislamiento de
Bordetella pertussis.

PROTOCOLO PARA LA TOMA DE MUESTRA DE EXUDADO (HISOPADO) Y

ASPIRADO NASOFARINGEO.
CONDICIONES DEL PACIENTE MATERIALES

No aplicar ningn tipo de EQUIPO DE SEGURIDAD: Bata, Guantes.

gotas nasales como Cubrebocas. Gafas.
mnimo 12 horas antes. Medio de transporte Regan Lowe (para
EL paciente presente Tos cultivo).
paroxstica o emetizante Pauelos desechables.
Menos de 7 das de haber Exudado: Hisopo de Dacrn Figura 3 Kit para toma de
iniciado los sntomas Sin preferentemente. muestra para aspirado
tratamiento Aspirado nasofaringeo: Kit deaspiracin nasofarngeo
antimicrobiano previo. traqueal (taparosca,etiqueta, tubo
han recibido tratamiento con tapa y conectores) Figura 2 Medio de
antimicrobiano previo. No se recomienda la toma de muestra transporte Regan-
Lowe

Figura 1 Hisopo de Dacrn

 ASPIRADO NASOFARINGEO
El paciente debe encontrarse en pposicin supina, la cabeza del
paciente deber estar inclinado hacia atrs con el cuello
extendido.12
Inserte la sonda de aspirado en la nasofaringe hasta que alcance
la faringe posterior. Indicar al paciente que debe contener la
respiracin y no tragar saliva durante el procedimiento. Puede ser
incomodo o causarle un lagrimeo o incluso estornudo. 12
La distancia de la nariz a la oreja puede servir de gua para
calcular la distancia que se deber insertar la
sonda, introduzca unas 7 o 9 cm menos si es
Figura 4 Toma de muestra de nio, de la sonda
en la fosa nasal aspirado nasofarngeo dirigiendo hacia
atrs a lo largo de la parte inferior de
la cavidad nasal hasta que toque la pared posterior de la
nasofaringe tener cuidado de no insertarla hacia arriba, si se siente
una obstruccin realizarlo en otra fosa nasal. 12 Una vez que el tubo
est colocado, se aplica aspiracin suave. 7

EXUDADO (HISOPADO) NASOFARINGEO

Introduzca suavemente el hisopo en la fosa nasal en posicin recta hasta el fondo
dirigindolo hasta la pared posterior a lo largo de la pared inferior Figura 1 Toma de muestra de exudado
de la cavidad nasal hasta alcanzar la pared posterior de la (hisopado) nasofarngeo
nasofaringe cuidando de no insertarlo hacia arriba; la distancia de la nariz a la oreja puede
servir de gua para calcular la distancia que se deber insertar el hisopo. No introduzca el
hisopo a la fuerza, si siente una obstruccin pruebe en la otra fosa nasal, mantenga el
hisopo en el rea de insercin se rota suavemente durante 30 segundos a 1 minuto y
luego retrelo lentamente.7, 12 Se puede utilizar el medio de transporte de Regan-Lowe.
Este procedimiento se realiza en ambas narinas preferentemente. 7
 Diagrama 1 ALGORITMO PARA EL AISLAMIENTO, CULTIVO E IDENTIFICACIN DE LA
Bordetella pertussis.
Toma de muestra de NOTA: Incubar las placas en aire
aspirado o exudado ambiente en una cmara hmeda
(hisopado) nasofarngeo (por ejemplo, un frasco BD
Medio de transporte GasPak con algo de agua en un
para exudado vaso).
nasofarngeo: Agar
Regan-Lowe Regan-Lowe
Inoculacin en medio SIN cefalexina
NO selectivo
El medio de transporte se incuba
48 horas a 35 C en CO2 5-10%
ambiente humidificado Inoculacin en medio
Ya que algunas cepas
selectivo
de B. pertussis pueden
ser ligeramente
Regan-Lowe inhibidas por la
CON cefalexina
Bordet-Gengou Cefalexina
Incubar 35-37 C en C02 al
5-7% por lo menos durante Colonias
7-12 das. pequeas, con
cpula y brillantes,
Colonias ligeramente - con una
hemolticas sobre todo en las IDENTIFICACIN
reas ms confluentes de Morfologa opalescencia en
crecimiento. Pequeas Velocidad de crecimiento, madreperla blanca.
Caractersticas en determinados medios.
gotitas de mercurio,
Aspecto microscpico en la tincin de Gram.
convexas, traslcidas. Reaccin obtenida con pruebas rpidas de
Al envejecer color blanco identificacin.
grisaceo.

Tiempo Aglutinaci
Hemlisis
de Crecimiento Catala Oxida Ureas n
Especie (Bordet- Gram
crecimien agar-sangre sa sa a (antisuero
Gengou
to especfico)
2-4 dias Beta hemlisis
B. pertussis Negativo + + - Pertusis +
(hasta ) estrecha
Gamma Cocobacilos Parapertusi
B. parapertusis 2 das Positivo + - +
hemlisis Gram Negativo s+
B. Gamma Bonchisept
1-2 das Positivo + + +
brochinseptica hemlisis ica
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 Tabla 3 Mtodos de laboratorio para el diagnstico de Tos ferina
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