Semana 7 Determinacion de La Actividad Enzimática de La Alfa Amilasa Vegetal

FACULTAD DE CIENCIAS
Departamento Acadmico de Biologa, Microbiologa y Biotecnologa
ALUMNO: ..................................................................................................................................... CICLO: III

SEMANA: 7 PROFESOR: Mg. Bilogo. Jos David Medina Moreno FECHA: 09 /06/2017
EAP: INGENIERIA AGRONOMA ASIGNATURA: BIOQUIMICA
Practica N 05
01UNIDAD
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA ALFA AMILASA VEGETAL
I. INTRODUCCION
Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica cuya funcin es acelerar las reacciones qumicas
llevndolas ms rpidamente a su posicin de equilibrio. Pertenecen al grupo de las protenas globulares
4 6
cuyos pesos moleculares oscilan entre 10 y 10 daltons; pueden consistir de una sola o de varias cadenas
polipeptdicas, y contener tambin partes no proteicas.
En una reaccin bioqumica catalizada por enzimas, a medida que progresa la reaccin se incrementa la
concentracin de los productos a expensas de la desaparicin de los correspondientes sustratos, en tanto que
pertenece fija la concentracin de la enzima. De esto podemos deducir que si se desea medir la actividad de
una enzima puede hacerse controlando el sustrato no transformado (sustrato residual) o controlando los productos
liberados. Tambin puede medirse la modificacin de los factores, en el caso de enzimas que requieren estas
sustancias.
La actividad cataltica se expresa en trminos de unidades de actividad, y para ello la Comisin de Enzimas
para la Unin Internacional de Bioqumica sugiri que "Una unidad (u) de cualquier enzima se define como
la cantidad que catalizar la transformacin de un micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas
de pH y temperatura".
En la prctica se estudiar la actividad de una amilasa de origen vegetal, midiendo el sustrato residual.
Asimismo, se medir su actividad especfica, que viene a constituir un criterio de pureza, y se define como
"el nmero de unidades de enzima por mg de protena.
II.OBJETIVOS
2.1. Determinar la actividad enzimtica de una amilasa, extrada de trigo germinado, dosando almidn
residual.
2.2. Determinar la actividad especfica de la amilasa vegetal
III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS
3.1 EQUIPOS
3.1.1 Estufa
3.1.2 Espectrofotmetro
3.2 MATERIALES Y REACTIVO PROPORCIONA DO POR EL ALUMNO

3.2.1 Semillas germinadas de trigo
3.2.2 Semillas germinadas de cebada
PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO

3.2.3 Solucin de almidn 0.1%
3.2.4 cido clorhdrico 0.5N
3.2.5 Lugol
3.2.6 Reactivo de Biuret
3.2.7 Tubos de ensayo
3.2.8 Embudos
3.2.9 Mortero
3.2.10 Pipetas de 1, 5 y 10 ml
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 EXTRACCION DE LA AMILASA
4.1.1. Poner a germinar 3 das, 50 semillas
4.1.2. Triturar las semillas cuando las raicillas tenga 0.5 cm de largo, adicionando 10 ml de buffer +
cloruro de calcio.
4.1.3. Filtrar en gasa
4.2 DEMOSTRACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA
4.2.1 Armar el siguiente sistema:
Almidn inicial Almidn residual

TUBOS (ml) I II III IV
Sustrato 1.0 1.0 1.0 1.0
Dejar en incubacin a 30 C durante 5 minutos
Extracto crudo de enzima --- 0.1 0.2 0.3
Mezclar e incubar a 30 C durante15 minutos exactos
cido clorhdrico 0.5 N 1.0 1.0 1.0 1.0
Dejar en reposo por 5 minutos a temperatura ambiente
Agua destilada 9.9 9.8 9.7 9.6
Lugol 0.5 0.5 0.5 0.5
4.2.2 Mezclar, medir las absorbancias despus de 5 minutos a 620 nm

4.2.3 Anotar las absorbancias de los 4 tubos de prueba.
4.3 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ESPECFICA

4.3.1 Determinar el contenido proteico del extracto crudo de la enzima con el reactivo de Biuret de acuerdo
al siguiente esquema:
TUBOS (ml) I II III IV

Preparado enzimtico --- 0.2 0.1 0.05
Agua destilada 1.0 0.8 0.9 0.95
Reactivo de Biuret 4.0 4.0 4.0 4.0
4.3.2 Mezclar e incubar a 37 C durante 30 minutos
4.3.3 Realizar las lecturas de absorbancia a 540 nm calibrando a cero con el tubo N 1
V. DATOS EXPERIMENTALES
5.1. Determinacin de la actividad enzimtica
N TUBO ABSORBANCIA (.. nm)

I
II
III
IV
5.2. Determinacin de la actividad especfica
N TUBO ABSORBANCIA (.. nm)

I
II
III
IV
VI. CALCULOS, RESULTADOS Y DISCUSION

6.1. Determinar la concentracin del almidn (mg/ml), multiplicando absorbancia por factor de
calibracin. Obtener el promedio de los tubos II, III, y IV.
6.2. Calcular las unidades de enzima (U) de la siguiente forma:
6.3. Determinar mg de protena/ml = Absorbancia X Factor

6.4. Obtener el promedio de los tubos II, III, IV, y determinar la Actividad Especfica (AE) de la siguiente
manera:
6.5. Realizar un flujograma de la obtencin de la amilasa.
VII. CONCLUSIONES
7.1. Anotar sus conclusiones de la prctica
VIII. CUESTIONARIO
8.1. En la sntesis de arginina a partir de cido glutmico se observaron las siguientes reacciones:
1 2 3 4
Glu - N ac. Glu - Orn - Cit - Arg
Siendo 1, 2, 3, 4 enzimas.
Indica C ules son los sustratos y productos correspondientes para estas enzimas mediante un
cuadro
8.2. Por qu se sometieron las raicillas del cereal a un proceso fsico y qumico en el proceso de
extraccin?
8.3. Si se te da una solucin que supuestamente contiene una enzima, Cmo determinaras en la
solucin la presencia de una enzima que cataliza la hidrlisis del almidn?
8.4. Represente mediante un flujograma el proceso de extraccin de una amilasa de una fuente diferente a
la utilizada en prctica
8.5. Cmo se puede incrementar la actividad especfica de una enzima?
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAF ICAS
9.1. Horna, E. 1988. Enzimas. Mdulo 03 de Bioqumica. Universidad Nacional del Santa. Chimbote
-Per.
9.2. Villavicencio, M. 1993. Bioqumica. Tomo I. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa. Lima -Per.

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Departamento Acadmico de Biologa, Microbiologa y Biotecnologa

ALUMNO: ..................................................................................................................................... CICLO: III

III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS

3.2 MATERIALES Y REACTIVO PROPORCIONA DO POR EL ALUMNO

PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Almidn inicial Almidn residual

4.2.2 Mezclar, medir las absorbancias despus de 5 minutos a 620 nm

4.3 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ESPECFICA

TUBOS (ml) I II III IV

N TUBO ABSORBANCIA (.. nm)

5.2. Determinacin de la actividad especfica

N TUBO ABSORBANCIA (.. nm)

VI. CALCULOS, RESULTADOS Y DISCUSION

6.3. Determinar mg de protena/ml = Absorbancia X Factor

6.5. Realizar un flujograma de la obtencin de la amilasa.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAF ICAS

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