Nanomedicina y Celulas Dendriticas - 0 PDF
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en el desarrollo de una
vacuna teraputica frente al VIH
PROGRAMA IBEROAMERICANO
CYTED
CIENCIA Y TECNOLOIGA PARA EL DESARROLLO
PROGRAMA IBEROAMERICANO
CYTED
CIENCIA Y TECNOLOGA PARA EL DESARROLLO
Editor
M ngeles Muoz-Fernndez
Doctora en Biologa
Doctora en Medicina
Especialista en Inmunologa
NOTA
Este libro ha sido realizado por los grupos de investigacin de la Red Temtica CYTED
214rt0482 Nanotecnologa y Clulas Dendrticas en el desarrollo de una Vacuna
Teraputica frente al VIH, dentro del Programa Iberoamericano Ciencia y Tecnologa
para el Desarrollo (CYTED). Estos desean agradecer el apoyo y la autonoma otorgada
para realizar su trabajo y declaran no tener conflicto de inters con este libro.
PRESENTACIN
El prefijo nano indica 109 en la escala del Sistema Internacional de Unidades, por lo que
un nanmetro, 1 nm equivale a 0,000000001 m, la milsima parte de una micra,
dimensin atmica.
Los captulos de este libro van encaminados a la creacin de nuevas terapias y frmacos
dirgidos frente a la infeccin por el VIH, basado en la nanomedicina, que juega un papel
muy relevante en el cuidado de nuestra salud, a travs de la generacin de nuevos
diagnsticos y deteccin rpida de enfermedad. La nanomedicina se agrupa en
nanodiagnstico y nanoterapia, siendo su objetivo mxima curacin con el mnimo dao
secundario posible.
Los relevantes hallazgos obtenidos en los ltimos cincuenta aos sobre el sistema
inmunitario han permitido establecer que las clulas del sistema inmunitario innato
desempean funciones que exceden a su papel inmunolgico, son esenciales para el
mantenimiento de la homeostasis tisular, y que su mal funcionamiento contribuye a la
iniciacin y desarrollo de enfermedades de enorme relevancia clnica y social (diabetes y
obesidad, aterosclerosis, artritis reumatoide, enfermedades neurodegenerativas, cncer).
Por todas estas razones, el libro editado por la Dra. M ngeles Muoz-Fernndez,
generado en el entorno de una Red temtica CYTED, aborda un tema de relevancia
cientfica y clnica, y lo hace desde un punto de vista muy actual, al contemplar el empleo
de la nanotecnologa en la re-educacin de las clulas dendrticas. Los sucesivos
captulos del libro permiten al lector ir conociendo los mecanismos celulares y
moleculares que han conducido al planteamiento de la combinacin
nanopartcula+clula dendrtica como estrategia para la manipulacin efectiva del
sistema inmunitario con fines preventivos (vacunas) o teraputicos en la lucha frente a la
infeccin por VIH-1, objetivo que la Red NANOTECNOLOGA Y CLULAS DENDRTICAS EN
EL DESARROLLO DE UNA VACUNA TERAPUTICA FRENTE AL VIH viene persiguiendo
desde su constitucin.
Angel Corb
Centro de Investigaciones Biolgicas
Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC), Madrid, Espaa
Los imposibles de hoy
sern posibles maana
Konstantn Tsiolko
AGRADECIMIENTOS
Importante destacar que el trabajo presentado en este libro y el libro en si, no hubieran
sido posible sin la participacin y confianza depositada en todos los grupos de
investigacin que formamos parte de la Red Temtica CYTED 214rt0482 Nanotecnologa
y Clulas Dendrticas en el desarrollo de una Vacuna Teraputica frente al VIH, dentro
del Programa Iberoamericano Ciencia y Tecnologa para el Desarrollo (CYTED), orientada a
la transferencia de conocimientos, experiencias, informacin, resultados y tecnologas
entre los pases de la Regin Iberoamericana. Un especial agradecimiento al Dr. Alberto
Maj Pieyra, Secretario General del Programa CYTED, al Dr. ngel Luis Corbi,
Coordinador Cientfico Tecnolgico y a la Dra. Marianela Corriols Molina, Gestora de
Salud, por hacer posible que el proyecto siga adelante. No nos olvidamos del personal con
el que mas contacto tenemos da a da, Maria Jos Penas, Pilar Moreno, Ivan Molinero y
Sandra Mazoteros, siempre dispuestos a ayudarnos en la logstica del proyecto, en su
gestin, que no es sencilla, Muchas gracias.
Si la RED ha funcionado y funciona, ha sido gracias a las personas que la integran, a cada
uno de los grupos participantes, al grupo de la Dra. Strumia (Cordoba, Argentina), Dr.
Correa (Mxico D.F., Mxico), Dra. Reguera (Len, Espaa), Dr. Gonzalez de Nilo (Chile),
Dr. Cea (Albacete, Espaa), Dr. Mirko (Lima, Per), Dr. Leal (Sevilla, Espaa), Dr.
Rodrigues (Madeira, Portugal) y Dra. Muoz-Fernndez (Madrid, Espaa), que desde un
principio hemos colaborado de forma activa en todos los objetivos propuestos, hemos
tratado y seguiremos tratando de formar a nuestro investigadores a travs de cursos y
movilidad del personal, sin olvidar nuestras reuniones de coordinacin y de "examen"
frente a otros cientficos.
Pero si algo destaca en la RED es que hemos credo desde un principio en el proyecto y
seguimos creyendo en l. Agradecemos a cada uno de los miembros de los grupos de
investigacin su colaboracin, a los que ya no estn y a los que se han incorporado mas
recientemente, porque sin ninguna duda, todos ellos han aportado un granito de arena
para que este proyecto se lleve a cabo y se obtengan buenos resultados. Gracias a todos,
porque sino os hubirais impactado con la nanotecnologa, virus y clulas dendrticas no
hubirais entendido el proyecto y este no hubiera evolucionado.
Todos los grupos hemos afrontado el por qu, el qu y el como llevar a cabo el proyecto,
las herramientas de trabajo y mtodos a utilizar. El elemento bsico han sido los
investigadores que lideran los grupos formando buenos equipos y colaborando en el
trabajo de esta RED. En esta RED temtica CYTED destaca el trabajo en equipo, el
compaerismo, el talento, la creatividad, la innovacin, un ambiente de libertad, la no
penalizacin de los errores, la compentecia por la calidad y no por la cantidad, en
definitiva los buenos resultados. En las reuniones presenciales siempre se han aportado
propuestas de mejora, somos creativos en esencia, creamos interaccionando,
disponemos de un objetivo que alcanzar y disfrutamos da a da con nuestro trabajo, por
ello hemos credo y seguimos creyendo que los resultados obtenidos en esta atmsfera se
deberan plasmar en un libro como este.
NDICE DE CAPTULOS
Pginas
CAPITULO 12: BIOBANCO VIH HGM: SU PAPEL EN INVESTIGACIN Y ENSAYOS CLNICOS 159
NDICE
pginas
1. Introduccin 16
2. Nuevos Retos: Estrategias de Erradicacin del VIH-1 16
3. ltimos avances en la Reactivacin viral: La Briostatina-1 como frmaco Anti-latencia
19
frente al VIH-1
4. Vacunas frente al VIH-1 22
5. Referencias 26
1. Introduccin 32
2. Monocitos, Macrfagos y Clulas Dendrticas 33
3. Inmunidad Innata, Receptores de Clulas Dendrticas, Citoquinas y Quimiocinas 35
4. Maduracin y Migracin de Clulas Dendrticas a rganos Linfoides Secundarios 36
5. Papel de las Clulas Dendrticas en la Inmunidad Adaptativa 37
6. Las Clulas Dendrticas y Terapias Futuras 38
7. Referencias 38
1. Sntesis Definicin 54
2. Sntesis de Dendrmeros 55
2.1. Dendrmeros polipropileniminia (PPI) 56
2.2. Dendrmeros carbosilano (CBS) 57
2.3. Dendrmeros basados en pptidos 58
2.4. Dendrmeros tipo Newkome 58
2.5. Dendrmeros tipo poliamido(amino) (PAMAM) 59
2.6. Dendrmeros de fsforo 59
2.7. Otras estructuras dendrticas 60
2.8. Dendrmeros mixtos 61
3. Caracterizacin Estructural de Dendrmeros 62
3.1. Mtodos espectromtricos y espectroscpicos 62
3.1.1. Espectrometra de masas (MS) 62
3.1.2. Resonancia magntica Nuclear (RMN) 63
3.1.3. Resonancia paramagntica electrnica (EPR) 63
3.1.4. Espectroscopia por fluorescencia 63
3.1.5. Espectroscopia infrarroja y Raman 64
3.1.6. Espectroscopia de UV-VIS 64
3.2. Tcnicas cromatogrficas 64
3.2.1. Cromatografa de permeacin de Gel (GPC) 64
3.2.2. Cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC) 65
3.3. Tcnicas de dispersin 65
3.3.1. Dispersin de Neutrones de ngulo Pequeo (SANS) 65
3.3.2. Dispersin de neutrones cuasi-elstica (QENS) 65
3.3.3. Dispersin de rayos X de ngulo pequeo (SAXS) 65
3.3.4. Dispersin dinmica de luz (DLS) 66
3.4. Microscopa 66
3.4.1. Microscopa de Fuerza Atmica (AFM) 66
3.4.2. Microscopa de Efecto Tnel (STM) 66
3.5. Tcnicas Electroforticas 66
3.6. Otras Tcnicas 67
3.6.1. Difraccin de Rayos X 67
3.6.2. Valoraciones cido-base 67
4. Referencias 68
1. Introduccin 72
2. Sntesis, Caracterizacin y Aspectos relevantes de los NCDs 74
3. Aplicaciones de los NCDs en Bionanomedicina y como Nanotransportadores en
Liberacin Controlada 76
4. Diseo, Sntesis y Optimizacin de NCDs adaptadas para su aplicacin como
Nanotransportadores de Molculas Orgnicas a Clulas Dendrticas 81
4.1. Modificacin qumica de nanopartculas de oro por dendronizacin 81
4.2. Modificacin qumica de nanopartculas magnticas (MNPs) por dendronizacin 82
5. Referencias 85
CAPTULO 12: BIOBANCO VIH HGM: SU PAPEL EN INVESTIGACIN Y ENSAYOS CLNICOS 159
1. Biobancos e Investigacin Biomdica 159
2. Nanotecnologa, Biobancos y Biorepositorios en la Investigaci de la Infeccin VIH-1 160
3. El BioBanco y BioRepositorio VIH 160
4. BioBanco VIH: Desarrollo de Proyectos de Investigacin y Ensayos Clnicos 161
5. Referencias 168
EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA 1
CAPTULO 1
EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA
M Dolores Garca-Alonso1, Jos Correa-Basurto2, Manuel Leal3, Rosa M Reguera
Torres4, M ngeles Muoz-Fernndez1
En 1981 se public en MMWR, boletn epidemiolgico de los Centros para Control y Prevencin
de Enfermedades (CDC) en Atlanta, un brote de neumona por Pneumocystis carinii (PCP), en
cinco jvenes homosexuales (1). Se trataba de pacientes sin registro previo de enfermedades,
pero con nmero de linfocitos T CD4+ bajos, infecciones y sarcoma de Kaposi, una variante de
cncer de piel (2). En 1982 se informaron ms de 450 casos al CDC (3), amplindose la poblacin
de riesgo con adictos a drogas por va parenteral (ADVP) (4) y hemoflicos (5). La enfermedad,
se defini como sndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) por los CDC en septiembre
de 1982 (6), aunque la patognesis no estaba todava clara. Los casos descritos en relacin con
trasfusiones de sangre (7) y transmisin materno-fetal (8), apoyaban la etiologa infecciosa, y la
identificacin de casos nuevos en parejas de mujeres con hombres con SIDA, sugera un papel
importante en la transmisin heterosexual (9).
A comienzos de 1983, el Instituto Pasteur informaba del aislamiento de un nuevo retrovirus
procedente de un paciente con signos precoces de SIDA (10). En el ao 1984, dos grupos de
investigadores confirmaron que se trataba de un nuevo retrovirus (11,12), que finalmente se
denomin virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) por el comit internacional de
taxonoma de virus (CITV) (13). En 1986 se aisl un retrovirus diferente en pacientes con SIDA
del oeste de frica, al que se denomin VIH de tipo 2 o VIH-2 (14,15).
El final de los aos 1980 y 1990 estuvo marcado por un rpido progreso en el campo del VIH. La
"Food and Drug Administration" (FDA) de EEUU aprob la primera prueba comercial para
diagnosticar la infeccin por el VIH-1 en 1985, y el primer agente antirretroviral, zidovudina, en
1987 (16). Dos inhibidores de la transcriptasa inversa anlogos de nuclesidos fueron aprobados
por la FDA en 1991, lo que provoc una discusin cientfica sobre la posibilidad de utilizar
tratamientos combinados. Tras la aprobacin del primer inhibidor de la proteasa en 1995, los
regmenes de antirretrovirales combinados de dos anlogos de nuclesidos y un inhibidor de la
proteasa (IP), se convirtieron rpidamente en el tratamiento de eleccin. A esta combinacin de
frmacos antirretrovirales se la denomin terapia antirretroviral de gran actividad o TARGA y
actualmente se la denomina terapia antirretroviral combinada o TARc. El TARc influye de forma
dramtica en la disminucin de la mortalidad relacionada con el SIDA (17). A pesar del
optimismo provocado por el aumento en la supervivencia, los cientficos comenzaron a
considerar la posibilidad de que se generasen reservorios del VIH-1 permitiendo su replicacin
2 CAPTULO 1
en las clulas mononucleares y en el sistema nervioso central (SNC) (18-20). En 1997, los
investigadores identificaron un reservorio del virus en las clulas T memoria (21) y demostraron
la replicacin del VIH-1 en los ndulos linfticos, en el contexto de individuos VIH-1+ con carga
viral indetectable en plasma (22). Al reconocer que la infeccin por el VIH-1 no se poda erradicar
con el TARc disponible, suscit gran inters conocer las posibles consecuencias que tendra la
infeccin por el VIH-1 a largo plazo y el TARc, incluyendo trastornos metablicos, enfermedad
heptica y renal.
Por otro lado, se ha estimado que en la poblacin humana, la fecha del primer antepasado
infectado por VIH-1, podra ser en la dcada de 1930, entre 1915 y 1941 (23,24), a travs de
infecciones zoonticas mltiples por el virus de la inmunodeficiencia del simio (VIS) (25).
Todos los aislados -1-1 conocidos por infectar al hombre, incluyendo el VIH-1 de los grupos M,
N y O estn relacionados directamente con el aislado SIVcpz de las subespecies de chimpancs
Pan troglodytes troglodytes (26) mientras que los del VIH-2 estn asociados con el SIVsm del
sooty mangabeys Cercocebus atys (27).
En 2014 se estim que haba aproximadamente 36,9 millones de personas en el mundo que
convivan con el VIH-1, de las cuales en junio de 2015, slo 15,8 millones estaban bajo TARc
(ONUSIDA 2015). El TARc y los nuevos antirretrovirales han supuesto un cambio radical en la
vida de los enfermos VIH-1, controlando la carga viral, y mejorando su calidad y esperanza de
vida (28). El VIH-1 ha dejado de ser mortal, al menos en los pases con acceso al TARc. Sin
embargo, los pacientes continan presentando una mortalidad significativa, 2% anual (29) y a
da de hoy no hay un tratamiento que cure la enfermedad. A esto hay que sumar la elevada
carga econmica asociada a la enfermedad. Se estima que puede llegar un momento en que los
pases desarrollados carezcan de capacidad para afrontar el gasto en antirretrovirales, dada la
alta supervivencia de los pacientes en TARc, el aumento de nuevos casos anuales y la necesidad
del TARc de por vida (30). Hay que tener en cuenta que an no se ha conseguido una vacuna
eficaz frente al VIH-1, aunque sera la mejor estrategia a largo plazo para acabar con la epidemia.
El genoma del VIH-1 est formado por dos hebras idnticas de RNA (ssRNA) de
aproximadamente 9,8 Kb y comprende las secuencias repetidas situadas en los extremos del
genoma (LTR) (34).
El genoma viral est codificado por nueve genes que permiten la integracin del VIH-1 en el
genoma del hospedador utilizando la maquinaria celular para generar nuevos virus. Adems de
tener tres de los principales genes que codifican para protenas estructurales (gag, pol y env)
comn a todos los retrovirus, el VIH-1 tambin tiene 6 genes adicionales nicos con funcin
reguladora (tat y rev) o accesoria (vif, vpr, vpu y nef) (Figura 2).
gag: codifica para la poliprotena Gag, la cual es procesada durante la maduracin para generar
las protenas estructurales p17 matrix (MA); p24 capsida (CA); p7 nucleocapsida (NC); p6 y dos
pptidos espaciadores, p2 pptido espaciador 1 (SP1) y p1 pptido espaciador 2 (SP2).
pol: codifica las enzimas virales transcriptasa reversa, integrasa y proteasa
env: codifica la gp160, precursor de la gp120 y la gp41, que son embebidas en la envuelta viral
y facilitan la fusin del virus con la clula diana.
tat y rev: codifican para las protenas reguladoras Tat y Rev, que regulan la expresin gnica
transcripcional y post-transcripcional del VIH-1.
vif, nef, vpr y vpu: codifican las protenas reguladoras Vif, Nef, Vpr y Vpu, respectivamente.
Aunque son inicialmente prescindibles para la infeccin, son muy importantes para que se
produzca una infeccin eficiente in vivo.
interior por una matriz proteica conformada por alrededor de 2000 copias de la protena matrix
p17 (MA). En el interior de la partcula vrica se encuentra una nucleocpside cnica compuesta
por aproximadamente 2000 copias de la protena p24 que confiere la forma icosadicra del
ncleo del virus. La nucleocpside contiene la maquinaria enzimtica para los primeros pasos
de la replicacin viral, denominadas transcriptasa reversa e integrasa y contiene dos copias del
ARN genmico del VIH-1 que son estabilizadas por 2000 protenas p7.
La clula diana por excelencia del VIH-1 es el linfocito T CD4+ (36), que es infectado a nivel de
los rganos linfoides y las mucosas de las regiones de entrada viral. El receptor viral CD4 se
expresa tambin en los precursores de clulas T dentro de la mdula sea y el timo, en
monocitos, macrfagos, eosinfilos, clulas dendrticas y clulas de la microgla del sistema
nervioso central, hecho que hace a todos estos tipos celulares susceptibles a la infeccin por el
VIH-1 (37).
El ciclo de replicacin del VIH-1 incluye varios pasos, todos ellos potencialmente inhibidos por
frmacos (Figura 4). El ciclo del VIH-1 se puede dividir en dos etapas bien diferenciadas: la fase
temprana, que culmina con la integracin del ADN viral en el genoma de la clula y la fase tarda,
que incluye la transcripcin del genoma viral, la sntesis y procesamiento de sus protenas,
ensamblaje y generacin de nuevas partculas infecciosas (37).
EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA 5
Figura 4. Ciclo infectivo del VIH-1 Anclaje/Fusin y entrada del VIH-1: las glicoprotenas gp120 y gp41
de la envoltura del VIH-1, se unen a una molcula de CD4 y a un tipo de correceptor, CCR5 o CXCR4, de la
clula husped, vaciando su contenido dentro de la clula. Retrotranscripcin/Integracin: la enzima
viral transcriptasa inversa copia el ARN viral en una hebra de ADN, y lo transporta al interior del ncleo
para unirse al ADN celular por la enzima integrasa. Transcripcin y traduccin: la clula se divide y
transcribe el ADN viral formando cadenas largas de protenas virales. Ensamblaje: Los grupos de
protenas virales se juntan para el ensamblaje de los nuevos virus. Salida y maduracin: los virus
inmaduros salen por gemacin llevndose parte de la membrana celular, la proteasa forma las cadenas
virales del virus que conforman el ncleo viral, formando un nuevo virus infectivo.
6 CAPTULO 1
Tras la entrada del VIH-1 en el organismo, se inicia un proceso en el que se distinguen una serie
de fases o estadios evolutivos bien definidos, con una duracin variable, que depende de una
serie de factores tanto del virus como del husped.
El VIH-1 infecta principalmente clulas del sistema inmunolgico, preferiblemente linfocitos T
CD4+, pero tambin infecta, como ya se ha descrito, monocitos, macrfagos, clulas dendrticas
y clulas de la microgla. La infeccin por el VIH-1 se caracteriza por una prdida gradual de
linfocitos T CD4+, activacin crnica del sistema inmunolgico y subsecuente prdida de
competencia inmunolgica, eventualmente finalizando en el desarrollo del SIDA. El curso
natural de la infeccin por el VIH-1 tiene un periodo de entre 8 a 10 aos antes de que sucedan
manifestaciones clnicas relacionadas con el SIDA. Sin embargo, existe una gran variabilidad de
cmo evoluciona el curso natural de la infeccin entre individuos VIH-1+, de tal forma que
dependiendo de la respuesta de los individuos este periodo puede ser de tan slo 2 aos o
menos. En ausencia de TARc, el curso de la infeccin por el VIH-1 se divide en tres fases (Figura
5).
VIH
Figura 5. Esquema del curso natural de la infeccin por el VIH-1 (PI: primoinfeccin)
EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA 7
b. Fase crnica o asintomtica: Tiene una duracin muy variable, en la que existe un equilibrio
dinmico entre la replicacin viral y la respuesta inmunolgica del individuo VIH-1+.
Siguiendo el curso de la infeccin aguda inicial, los ttulos de carga viral disminuyen
alrededor de 100 veces, llegando a un punto altamente predictivo del tiempo que tardarn
en surgir enfermedades asociadas a la infeccin por el VIH-1. Esta segunda fase se
caracteriza por desarrollar una continua estimulacin del sistema inmunolgico por
repetidas exposiciones a antgenos virales y un ambiente alterado de citoquinas y
quimiocinas. A pesar de la estimulacin de la respuesta inmunolgica innata y adaptativa,
el virus contina replicndose y diseminndose en los rganos linfoides. El individuo VIH-1+
puede permanecer en un estado de latencia clnico durante varios aos. En general, tras 10
aos de infeccin en ausencia de TARc, el 50% de los individuos VIH-1+ desarrollan signos
de infeccin, incluyendo un marcado descenso de linfocitos T CD4+, hiperplasia linfoide y
deterioro de las funciones del sistema inmunolgico (48).
c. Fase final: La progresiva inmunodeficiencia culmina en el desarrollo del SIDA. En esta fase,
el nmero de linfocitos T CD4+ est por debajo de 200 clulas/l, la carga viral incrementa
rpidamente y la respuesta inmunolgica fracasa bruscamente. De tal forma que este
escenario facilita el comienzo de infecciones oportunistas y distintos tipos de cncer
asociado al VIH-1, tales como sarcoma de Kaposi o linfoma de Burkitt y finalmente se
produce la muerte del paciente.
El virus que se transmite en la fase aguda, por lo general, corresponde al que presenta
tropismo por los macrfagos y que requiere la presencia del correceptor CCR5 (aislados viral
R5) y se caracterizan por no producir sincitios linfocitarios cuando se cultivan in vitro. Por el
contrario, los aislados que aparecen en estadios avanzados de la infeccin (aislados virales X4)
requieren la expresin del correceptor CXCR4, siendo aislados linfotrpicos y formadores de
sincitios.
Con el tiempo los mecanismos de inmunosupresin y destruccin de los linfocitos T CD4+ por
el VIH junto con la aparicin de variantes ms agresivas al virus, rompern este equilibrio y el
sistema inmunolgico presentar su incapacidad progresiva para controlar la replicacin que
conducir a la aparicin de las enfermedades oportunistas de la fase final del SIDA. La carga
viral con la que se llega al equilibrio dinmico "steady-state", ser uno de los factores
determinantes del tiempo de evolucin a SIDA.
8 CAPTULO 1
Durante el periodo de infeccin crnica se suelen detectar valores altos de carga viral, en todo
el ganglio linftico, especialmente en regiones perifoliculares de los centros germinales. Hasta
un tercio de los linfocitos T CD4+ en tejido linfoide y sangre perifrica tienen ADN del VIH-1
detectable (provirus), la mayor parte del cual tiene genoma defectivo (49). El SIDA, como ya se
ha mencionado, es el estadio clnico ms avanzado de la enfermedad, representando la etapa
final de la infeccin por el VIH-1 y se caracteriza por una inversin del cociente de linfocitos T
CD4+/CD8+. Hasta las fases muy tardas de la enfermedad, el nmero total de clulas CD3+
permanece relativamente constante con un aumento de linfocitos T CD8+ que contrarrestan la
prdida de linfocitos T CD4+ (50). En las fases ms tardas de la enfermedad, los defectos en la
linfopoyesis producen una incapacidad para mantener la homeostasis de los linfocitos T,
producindose una prdida (deplecin) subsiguiente de ambos tipos celulares T CD4+ y T CD8+
(51).
El objetivo de una "cura esterilizante" es alcanzar una completa eliminacin del VIH-1
competentemente replicativo. Tan solo se ha reportado un caso, el conocido caso del "paciente
de Berln" en el que despus de haberse sometido a un trasplante de mdula sea de un donante
homocigoto para la mutacin defectiva 32 en el gen CCR5, debido a la eliminacin de los
primeros 32 residuos del correceptor, consigui una "cura funcional" del VIH-1 (53,54). Cinco
aos despus del trasplante, el paciente presentaba valores de carga viral en sangre
indetectables, an sin estar sometido a ningn TARc. Aunque este caso ha abierto la esperanza
de que se pueda conseguir una "cura funcional", an es pronto para sacar conclusiones
definitivas, requirindose un seguimiento continuado de este paciente con el fin de evaluar si
los valores de carga vial continan disminuidos o indetectables o por el contrario podra
producirse una reactivacin viral en algn reservorio (55). El objetivo de numerosas
investigaciones es alcanzar la "cura esterilizante", centrndose en el reservorio viral latente para
erradicar el VIH-1.
10 CAPTULO 1
a. Variabilidad gentica: La variabilidad gentica del VIH-1 es alta y es debida a la elevada tasa
de error de la transcriptasa reversa, lo que supone la produccin de una gran cantidad de
virus defectivos y la generacin de una alta diversidad en las protenas del virus que le
permite escapar al control de la respuesta inmunolgica especfica (56). A esta variabilidad,
debida a la tasa de error de la transcriptasa inversa, se aaden otros mecanismos como la
recombinacin gentica que origina nuevos subtipos.
b. Latencia y reactivacin: El VIH-1 puede infectar de forma latente sus clulas diana, lo que
le permite escapar de la vigilancia inmunolgica, ya que no expresa productos virales en la
membrana celular (57). Adicionalmente, los procesos de reactivacin y reinfeccin se
producen en los centros germinales de los rganos linfoides, que presentan un
microambiente idneo para el proceso de la infeccin. Por otra parte, la reactivacin a partir
del estado de latencia es un proceso tan rpido que puede dificultar una respuesta citotxica
eficaz que destruya los linfocitos en los que el virus se est reactivando.
Actualmente, la mayor parte de los esfuerzos por parte de la comunidad cientfica y mdica se
encaminan al desarrollo de estrategias preventivas que permitan controlar la propagacin y
transmisin del VIH-1 (67-69). Esto est en concordancia con la estrategia Getting to zero
(Llegar a 0) propuesta por ONUSIDA y la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) para el
periodo 2011-2015, en el que el objetivo era reducir a la mitad el nmero de nuevas infecciones
por el VIH-1, especialmente las producidas por transmisin sexual, que en la actualidad
constituyen un 80% del total (UNAIDS).
Estas estrategias de prevencin se agrupan en:
Vacunas: todava no se ha conseguido desarrollar una vacuna eficaz frente al VIH-1.
Aunque esta sera la mejor estrategia a largo plazo para acabar con la epidemia.
Microbicidas: geles, cremas o espumas que aplicados por va vaginal o rectal puedan
impedir la transmisin sexual del VIH-1.
11. REFERENCIAS
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pneumonia and mucosal candidiasis in previously healthy homosexual men: evidence of a new acquired cellular
immunodeficiency. N Engl J Med. 10;305(24):1425-31.
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Morb Mortal Wkly Rep 1982; 31:294, 300-291.
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initial man-ifestation of cellular immune dysfunction. N Engl J Med 305:1431-1438.
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14 CAPTULO 1
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EL VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA 15
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16 CAPTULO 2
CAPTULO 2
NUEVAS APROXIMACIONES TERAPUTICAS FRENTE AL VIH-1:
ESTRATEGIAS DE ERRADICACIN Y VACUNAS
1. INTRODUCCIN
A pesar del xito del TARc, y de las mejoras a su acceso durante los ltimos aos, la aparicin de
resistencias a los frmacos actuales as como los fracasos en el desarrollo de una vacuna
profilctica hacen necesario la identificacin de nuevas dianas teraputicas que puedan
responder a las limitaciones de las terapias actuales. Adems, puesto que el TARc acta sobre
virus replicativos, los provirus integrados latentemente escapan a los efectos de estos
tratamientos. Por ello, a pesar de que el TARc controla de forma eficaz la carga viral o viremia
en la mayora de los individuos VIH-1 positivos, todava no ha sido posible curar esta infeccin
al no poder eliminarse los reservorios virales. En la actualidad existen dos grandes reas de
investigacin enfocadas a la cura de la infeccin por VIH (4-6).
La primera persigue una "cura funcional" mediante la consecucin de un estado de carga viral
indetectable prolongada en el tiempo sin necesidad de tomar TARc. Situaciones de cura
funcional se dan espontneamente en algunos individuos infectados denominados
NUEVAS APROXIMACIONES TERAPUTICAS FRENTE AL VIH-1:
ESTRATEGIAS DE ERRADICACIN Y VACUNAS 17
controladores de lite, quienes consiguen controlar la replicacin del VIH-1 sin necesidad de
TARc, as como en algunos sujetos que han iniciado el TARc durante la infeccin aguda y que,
tras retirrseles el tratamiento han permanecido durante aos con la viremia controlada. A estos
individuos VIH-1+ se les conoce como los controladores post-tratamiento.
La segunda pretende alcanzar una "cura esterilizante", lo que supone una completa eliminacin
del virus competentemente replicativo. El primer caso conocido de este tipo de curacin fue la
del afamado Paciente de Berln (7), el cual se mantiene con viremia indetectable en ausencia
de TARc, cinco aos despus de haberse sometido a un trasplante de mdula sea de un
donante homocigoto para la mutacin defectiva 32 en el gen CCR5 causadas por eliminacin
de 32 residuos del co-receptor (8).
Numerosos estudios pretenden alcanzar la cura esterilizante enfocndose en un efecto sobre el
reservorio viral latente para intentar erradicar el VIH-1. Las principales estrategias llevadas a
cabo hasta ahora son:
a. Intensificacin del tratamiento antirretroviral: El TARc actual no logra frenar
completamente la replicacin del VIH-1 ni las nuevas infecciones de clulas dianas. Por ello,
una intensificacin del TARc podra ayudar a reducir el tamao del reservorio viral. Hasta la
fecha, los ensayos clnicos realizados en esta lnea no han sido prometedores.
Intensificaciones con raltegravir o con maraviroc no han sido capaces de reducir el ADN
proviral o la viremia residual (9). Probablemente este fracaso sea debido a la poca capacidad
de estos frmacos para penetrar a travs de las barreras anatmicas, tales como los rganos
linfoides o el sistema nervioso central.
b. Terapia gnica: El caso del paciente de Berln ha generado un amplio inters en la bsqueda
de intervenciones curativas basadas en la ingeniera gentica y el uso de terapias celulares.
Puesto que realizar trasplantes alognicos con clulas madre de donantes naturalmente
resistentes a la infeccin por el VIH-1 no es una estrategia factible, la terapia gnica ha
tomado especial inters como estrategia alternativa para eliminar el VIH-1 de las clulas
infectadas o de generar clulas resistentes a la infeccin (10). De hecho, en 2012 se llevaron
a cabo algunos ensayos clnicos en fase 1 en los que se estudi el potencial efecto de
diferentes enzimas con actividad nucleasa que tenan como diana secuencias de ADN de los
genes que codifican para los correceptores virales (11-13) o en el genoma proviral (14,15).
Hasta ahora, los resultados publicados, muestran que las modificaciones genticas realizadas
a travs de este mecanismo son estables e inhiben la infeccin por el VIH-1 en modelos in
vitro y en ratones humanizados. Los ensayos clnicos en humanos estn en las primeras fases
de desarrollo y, hasta ahora, estos tratamientos parecen ser seguros y no causar efectos
adversos graves.
Hasta la fecha se han llevado a cabo varias investigaciones con el fin de estimular la
reactivacin viral en clulas T, incluyendo anticuerpos anti-CD3, citoquinas como TNF, IL-1,
IL-7 y mitgenos como los steres de forbol (19).
Adems, existe una gran diversidad de molculas pequeas con capacidad de reactivacin
viral como, por ejemplo, ingenoles (20), prostatina y briostatina (21) y los anlogos de 1,2-
diacilglicerol (22). La terapia de activacin inmune no debe inducir la activacin policlonal de
clulas T, por lo que molculas agonistas de la protena kinasa C (PKC) sin capacidad
tumorognica como la prostatina o la briostatina (22,23), mencionadas anteriormente,
podran cumplir claramente este criterio abriendo nuevas vas de investigacin para el
tratamiento de la latencia del VIH-1.
Hasta la fecha, los principales compuestos que se han utilizado como reactivadores de la
infeccin por el VIH-1 han sido:
Tabla 1. Ensayos clnicos y estrategias de cura funcional frente a la infeccin por el VIH-1
La poblacin de estudio de todos los ensayos son pacientes crnicamente infectados por VIH-1.
Abreviaturas: AR, antirretroviral; RAL, raltegravir; MVC, maraviroc; Vac Ad5, vacunacin con
adenovirus 5; NZF, nucleasa zinc-finger; CHP, clulas hematopoycticas progenitoras; IFN ,
interfern ; Pte, paciente; Ac, anticuerpos; TAR, tratamiento antirretroviral; ARN, ARN del VIH-1;
ADN, ADN del VIH-1. Cdigo del estudio obtenido de www.clinicaltrials.org.
Adems, como otros activadores de las PKC, la BRIO regula negativamente la expresin del
receptor y correceptor del VIH-1 (CD4 y CXCR4, respectivamente), inhibiendo la infeccin de
clulas T CD4+ (20,40) (Figura 1).
.
La briostatina es un frmaco aprobado por la Food and Drug Administration (FDA). Debido a
ensayos previos con esta molcula para evaluar su capacidad antitumoral o frente a la
enfermedad de Alzheimer, ya se dispone de datos relacionados con su farmacocintica y
toxicidad (41). Concentraciones de briostatina entre 2 y 3,2 g/ml en sangre se han asociado
con efectos secundarios tales como mialgia, fatiga, nusea y vmitos (42), aunque ensayos
clnicos de fase II han demostrado que la briostatina es segura a 2 g/ml en sangre (43). Otros
estudios han demostrado que la BRIO es capaz de reactivar el VIH-1 latente a concentraciones
de 50 nM, por lo que existira la posibilidad de llevar a cabo nuevos ensayos clnicos con dosis
ms bajas de BRIO. Se podran realizar varias aproximaciones para mejorar no slo los efectos
de la BRIO en cuanto a reactivacin y eliminacin del virus del organismo, sino tambin en
aspectos como la farmacodinmica y tolerabilidad en los pacientes. En este sentido, el trabajo
realizado por De Christopher y col. (44) es el primero en el que se describe el diseo de
molculas anlogas a la BRIO, comparables a este compuesto en actividad, pero con la
posibilidad de adaptarse a las necesidades clnicas. Por otra parte, Kovochich y col. (45),
desarrollaron una nanopartcula lipdica cargada con briostatina-2 y el inhibidor de la proteasa
del VIH-1 nelfinavir. En conjunto, estos trabajos demuestran la capacidad del mbito de la
nanotecnologa para proporcionar mejores mtodos para activar el VIH-1 latente e inhibir la
propagacin del VIH-1.
Los mecanismos moleculares que subyacen a la latencia del VIH-1 estn lejos de ser
completamente entendidos, por lo que cada vez es ms necesaria la identificacin de nuevos
frmacos capaces de reactivar el VIH-1 latente. As mismo, debido a la complejidad de los
mecanismos moleculares implicados en el establecimiento y mantenimiento de la latencia viral,
es probable que se necesite de la actividad combinada o sinrgica entre diferentes compuestos
que acten en diversas vas para reactivar de forma efectiva el VIH-1 latente en los diferentes
reservorios. Por ejemplo, se ha demostrado el efecto sinrgico de la BRIO con los inhibidores de
las HDAC para antagonizar el VIH-1 latente (39). Adems, existe una lnea de investigacin
centrada en la terapia de activacin inmune que defiende que la reactivacin del virus se podra
lograr mediante ciclos alternativos de terapia de activacin inmune ms intensificacin del TARc,
seguido de ciclos estndar del TARc. En esta lnea, la administracin de maraviroc en el cctel
NUEVAS APROXIMACIONES TERAPUTICAS FRENTE AL VIH-1:
ESTRATEGIAS DE ERRADICACIN Y VACUNAS 21
Hay dos tipos de vacunas frente al VIH-1 que se encuentran en distintos niveles de investigacin
y desarrollo: i) vacunas preventivas, enfocadas a personas no infectadas por el VIH-1, para
reducir el riesgo de infeccin o controlar y disminuir la carga viral tras la infeccin; ii) vacunas
teraputicas, orientadas a personas ya infectadas por el VIH-1, para controlar y eliminar el VIH-
1 desencadenando una inmunidad humoral y celular especfica.
El objetivo de inmunizar o vacunar consiste en adiestrar al sistema inmunolgico, prepararlo
para combatir a un patgeno determinado, incluso en algunos casos, antes de haber entrado en
contacto con l (vacunas preventivas). Con la vacunacin, utilizando distintos antgenos de un
patgeno determinado, el individuo desarrolla una inmunidad especfica, inmunidad que guarda
memoria frente a una futura infeccin llevada a cabo por el mismo patgeno, permitiendo que
la respuesta inmune sea ms efectiva. As, enfermedades como la polio, el sarampin o la
varicela se han erradicado prcticamente a nivel global.
Las vacunas son herramientas de salud pblica que histricamente han disminuido y erradicado
de forma drstica algunas enfermedades infecciosas. Aunque ninguna vacuna ha demostrado
tener una efectividad del 100%, algunas protegen frente a determinados patgenos entre el
70% y el 95%. Adems, la relacin coste-efecto, ofreciendo proteccin durante varios aos a los
individuos vacunados con una nica o muy pocas inmunizaciones hace que tengan un gran valor.
El disponer de una vacuna preventiva, efectiva frente al VIH-1 sera la estrategia ms eficaz para
acabar con el virus a largo plazo. En los crculos cientficos, la vacuna aparece como el mtodo
crucial para frenar el VIH/SIDA, a travs de una disminucin sostenida del nmero de infecciones
que lleve incluso a la erradicacin de la enfermedad (55,56). Sin embargo, la mayor parte de los
esfuerzos realizados con vacunas preventivas frente al VIH desde hace casi treinta aos han sido
estriles o poco efectivos (55,56-61).
Por otra parte, las vacunas teraputicas, orientadas a personas ya infectadas, tienen como
objetivo incrementar el control y la eliminacin del VIH-1 mediante el desencadenamiento de
una inmunidad humoral y celular especfica.
En estas inmunoterapias se estn utilizando varias estrategias con el objetivo de encontrar
antgenos recombinantes potentes que se puedan utilizar como inmungenos. Vacunas con
plsmidos que expresan antgenos virales como gag, nef, env o pol, protenas virales, mezclas
de pptidos o partculas virales inactivadas han sido alguno de los mtodos utilizados hasta
ahora (62-64). Tambin se han utilizado vectores virales modificados que expresan antgenos
del VIH-1, como Poxvirus, ModifiedVaccinia Ankara (MVA) o adenovirus, en algunos casos con
resultados poco concluyentes (65-67).
En los ltimos aos algunas inmunoterapias han llegado a diferentes fases de ensayos clnicos.
Sin embargo, solo uno de ellos, el ensayo clnico RV144 realizado en Tailandia, en el que se utiliz
un poxvirus que expresaba los genes de la gp120 y gp41 del subtipo E, gag y la proteasa del
subtipo B, y un boost con gp120 recombinante, mostr evidencias positivas (efecto moderado
del 31,2%) (67-69).
En el ensayo clnico RV144 se reclut a ms de 16.000 personas, por lo que los datos obtenidos
indicaban que podra ser posible una vacuna frente al VIH-1 y partiendo de esos resultados se
dise otro ensayo clnico denominado P5 (Pox Protein Public Private Partnership trial) con el
objetivo de incrementar la eficacia de la vacuna (70). Sin embargo, debido a la falta de
efectividad de las inmunizaciones con HVTN505 se concluy que eran necesarios ms recursos
para el posible desarrollo de nuevas vacunas (71,72). En mayo de este ao, el NIH ha anunciado
que financiar al HVTN. La decisin se ha basado en los datos provisionales del HVTN 100, un
ensayo clnico que se est llevando a cabo en Sudfrica con el objetivo de encontrar respuestas
inmunitarias, y la seguridad de la combinacin de vacunas modificadas. Los resultados son
NUEVAS APROXIMACIONES TERAPUTICAS FRENTE AL VIH-1:
ESTRATEGIAS DE ERRADICACIN Y VACUNAS 23
favorables, indicando que el avance del P5 justifica que se lleve a cabo el ensayo de eficacia del
HVTN 702. Se comenz a reclutar voluntarios en el HVTN 702 a finales del ao 2016, y se
analizar la seguridad y la eficacia en 5.400 participantes (73).
Respecto a la industria, Janssen sigue con sus planes de utilizar la combinacin de los vectores
Ad26, MVA y un boost de gp140 para iniciar un ensayo clnico de eficacia a finales del ao 2017
en mltiples pases. Actualmente estn en marcha tres ensayos clnicos de fase I/II en todo el
mundo. Este programa de investigacin es una alianza entre los Estados Unidos, NIH MHRP, IAVI
y el Centro Mdico Beth Israel Deaconess.
Hay ms de una treintena de ensayos clnicos con vacunas que emplean estrategias nuevas
aprobadas como posibles candidatos y distribuidas a lo largo de todo el mundo (70) (Tabla 2).
El intento de controlar el VIH de manera eficaz y sostenible depende en parte de la canalizacin
de la vacuna a una amplia gama de ensayos de diferentes enfoques. Ms all de los ensayos de
eficacia descritos anteriormente, hay una serie de conceptos nuevos que podran llegar a la fase
de ensayo clnico de forma ms rpida y con menor nmero de individuos reclutados, pero es
difcil predecir cul de los conceptos que se han descrito se mantendrn y por qu. Tambin se
debera saber si lo que se va a hacer en un futuro prximo es similar o diferente a otros enfoques
y cmo se toman las decisiones sobre los avances que se van obteniendo.
Tambin hay que tener en cuenta el impacto que estn teniendo en las terapias anti-VIH-1 los
nuevos anticuerpos neutralizantes de amplio espectro. Similares a los anticuerpos
neutralizantes encontrados en los individuos controladores de lite tienen una alta capacidad
de bloquear al VIH-1 (74-76). Estos anticuerpos neutralizantes podran utilizarse directamente
en el desarrollo de vacunas pasivas o como moldes para generar eptopos inmunognicos, que
expresados por vectores, pudieran desencadenar la produccin especfica de este tipo de
anticuerpos a travs de las clulas B, en lo que se conoce como inmunidad adaptativa. En
consonancia con esto, ensayos usando vectores que expresan algunos de estos anticuerpos
neutralizantes dirigidos frente a diversos eptopos de gp120, como la regin V3, presentaron
resultados positivos previniendo la infeccin por el VIH-1/SIV en primates no humanos y en
ratones humanizados (77,78).
Se piensa que los anticuerpos neutralizantes que bloquean la actividad de una amplia gama de
aislados del VIH-1 son la mejor estrategia en el desarrollo de una posible vacuna realmente
eficaz. Los cientficos han mapeado la forma y estructura de los anticuerpos neutralizantes y han
identificado los puntos de contacto y enlaces con la envuelta en trmeros. El comprender la
forma de los sitios de enlace para los anticuerpos neutralizantes es clave para el desarrollo de
una vacuna. Tambin se ha avanzado en el conocimiento de cmo los anticuerpos neutralizantes
maduran en el cuerpo y en el mapeo de la compleja gama de respuestas inmunes que conducen
a su aparicin natural. Cabe destacar el hecho de que muchos anticuerpos neutralizantes se
encuentran ligados a una regin conservada del virus, relativamente pequea (79-81).
unto con todas estas estrategias, tambin se han ensayado inmunoterapias basadas en clulas
dendrticas (CD) como mtodos de vacunacin frente al VIH-1 en diversos modelos animales y
en humanos (62,82-85). Estas clulas, con un papel esencial de nexo de unin entre la inmunidad
innata y la adaptativa, tienen la capacidad de captar y procesar antgenos proteicos y
presentarlos a travs de las molculas del MHC de clase I y II, permitiendo la estimulacin
especfica de linfocitos T CD8+ y CD4+, respectivamente (86,87). Las CD se pueden activar ex vivo
con varios antgenos derivados del VIH-1 e introducirlas de nuevo en el paciente VIH-1+,
desencadenando una respuesta inmune especfica y potenciada frente al VIH-1 (85-87). La
inmunoterapia basada en CD se ha utilizado previamente con xito en el tratamiento de otras
patologas como el cncer (88-91).
24 CAPTULO 2
En la infeccin por el VIH-1 las estrategias empleadas para estimular a las CD se basan en la
utilizacin de antgenos como pptidos, protenas completas, virus inactivados o clulas
apoptticas y tambin en transfecciones con ARNm o ADN expresando antgenos virales en
vectores virales (92-99). En todos los casos se obtuvieron resultados moderados en relacin con
la inhibicin del VIH-1. Los ensayos clnicos realizados con virus completos inactivados fueron
los que obtuvieron los mejores resultados. Lu y col., utilizaron virus autlogos inactivados por
aldritiol-2 y CD pulsadas con IL-4 y obtuvieron una supresin viral >90% en 8 de 18 pacientes
VIH+ vacunados (100). En otros ensayos clnicos realizados en Espaa, liderados por Garcia y col.,
en los que se puso en contacto a CD con virus autlogo inactivado por calor, se mostr un control
parcial del VIH-1 en los 12 pacientes VIH-1+ vacunados a las 24 semanas post-vacunacin (101-
103).
En el total de estos ensayos experimentales basados en inmunoterapias con CD se reclutaron
alrededor de 210 pacientes (150 en TARc y 60 nave al tratamiento). Aunque el perfil de
seguridad fue excelente y la inmunizacin gener respuestas especficas frente al VIH-1,
nicamente en cuatro de los estudios se observ una respuesta a la inmunizacin que permiti
controlar la viremia (62,97). Esto se podra deber a que estas terapias tienen numerosos puntos
crticos que se deben analizar minuciosamente a la hora de desarrollar inmunovacunas eficaces
basadas en las CD. Algunos de estos puntos son: i) la eleccin del antgeno diana; ii) el mtodo
de inactivacin del virus; iii) el procedimiento y obtencin de las CD ex vivo; iv) su estado de
maduracin y v) el mtodo de vacunacin (dosis de antgeno, ruta de administracin, frecuencia
de las inyecciones, etc.) (60,87,104,105).
Unidos a estos factores hay otros parmetros que dificultan enormemente el desarrollo de
vacunas eficaces frente al VIH-1. Uno de los factores primordiales es que la principal diana del
virus son las propias clulas del sistema inmune. Aunque en la primera etapa el sistema inmune
es capaz de combatir al virus, la progresiva prdida de linfocitos T CD4+ dificulta la aparicin de
potentes respuestas inmunes especficas frente al mismo. A este parmetro, se une la gran
capacidad que tiene el virus de mutar, que complica en gran medida la bsqueda de antgenos
dianas eficientes. En este sentido, se ha descrito una asociacin entre el control virolgico y las
respuestas especficas CD4/CD8 frente a la protena gag del virus, pero no frente a la protena
de la env, lo que apoya el que se lleven a cabo bsquedas de respuestas inmunolgicas frente a
las estructuras ms conservadas del VIH-1 (62,106,107). El desarrollo de secuencias mosaico de
antgenos diversos tambin podra suponer un arma a la hora de limitar la variabilidad y evitar
el escape inmunolgico. La utilizacin de adyuvantes que aumenten la calidad y la fuerza de la
respuesta, sin inducir una activacin del sistema inmune especfica, tambin es de gran
relevancia para mejorar las tcnicas de vacunacin actuales (55,61,108). No se deben olvidar los
numerosos medios de transmisin del VIH-1 como otra dificultad ms en el desarrollo de
vacunas efectivas. Adems, y en consonancia con la bsqueda de una "cura funcional" de la
infeccin por el VIH, parece esencial que, en el caso de las vacunas teraputicas, cuyo objetivo
es un control sostenido del virus en el tiempo, stas sean combinadas con frmacos antilatencia
y/o terapias gnicas que permitan una eliminacin total de los distintos reservorios virales (109).
Es posible que una vacuna frente al VIH-1 no sea una realidad en un futuro prximo. Sin
embargo, los diferentes esfuerzos realizados tanto por parte de organizaciones internacionales,
gobiernos y cientficos son pasos absolutamente necesarios en la bsqueda de una terapia
efectiva que permita poner freno a una enfermedad que mata anualmente a millones de
personas.
26 CAPTULO 2
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32 CAPTULO 3
CAPTULO 3
BIOLOGA DE LAS CLULAS DENDRTICAS Y SU APLICACIN EN EL
DISEO DE NUEVAS VACUNAS
1. INTRODUCCIN
Monocito
IL-4
IL-6/IL-10/IFN
GM-CSF + IL-4
+ M-CSF
Macrfago Clula dendrtica
Las citoquinas son el estmulo crtico para que los monocitos progresen hacia cada una de sus
alternativas de diferenciacin. La primera citoquina con la que los monocitos entren en contacto
es la que determina su programa de diferenciacin y perfil de respuesta frente a otras citoquinas
(16). La diferenciacin in vitro de monocitos a macrfagos o CD es un ejemplo de la dependencia
mencionada (Figura 2). Las citoquinas mas comnmente utilizadas in vitro para generar CD
derivadas de los monocitos son el GM-CSF y la IL-4 (17-19), mientras que los macrfagos se
diferencian en presencia de GM-CSF o MCSF (19). En humanos, la IL-4 facilita la diferenciacin a
CD e impide la generacin de macrfagos (17,21), y la presencia de IL-6 limita la generacin de
estas clulas y promueve la diferenciacin a macrfagos de manera dependiente de M-CSF (22).
Adems, el entorno celular y la presencia de estmulos externos, tambin participan en el
condicionamiento de la diferenciacin del monocito inducido por citoquinas (11,23).
Las CD se identificaron por primera vez en la epidermis, donde reciben el nombre de clulas de
Langerhans (Langerhans, 1868) y su deteccin en otros tejidos se llev a cabo por Ralph M.
Steinman y Zanvil A. Cohn en 1973 que describieron un tipo de clulas presente en los rganos
linfoides perifricos de ratn a las que denominaron "clulas dendrticas" o CD (24). En 1984
Van Voorhis y col. identificaron a las CD como un componente minoritario de las clulas
mononucleares de sangre perifrica (CMSP) en humanos (25), y se las caracteriz como las
clulas estimuladoras ms potentes en cultivos leucocitarios mixtos y en la activacin de
linfocitos citotxicos (26,27). Desde entonces el conocimiento de su biologa y actividades
funcionales ha progresado considerablemente, sobre todo tras el establecimiento de tcnicas
de cultivo in vitro que permiten la generacin de un gran nmero de CD a partir de monocitos o
progenitores hematopoyticos (28). Actualmente, las CD se consideran centinelas del sistema
inmune y CPA "profesionales", porque son las nicas CPA eficaces en activar a los linfocitos T
nave o vrgenes, por la elevada expresin de molculas del MHC, coestimuladoras y de adhesin
en su superficie. Las CD, con un papel esencial de nexo de unin entre la inmunidad innata y la
adaptativa, tienen la capacidad de captar y procesar antgenos exgenos y presentarlos a travs
de las molculas de MHC de clase I y II permitiendo la estimulacin especfica de linfocitos T CD8
BIOLOGA DE LAS CLULAS DENDRTICAS Y SU APLICACIN EN EL DISEO
DE NUEVAS VACUNAS 35
Las CD son particularmente abundantes en los sitios de entrada de patgenos, tales como la
piel, el tracto respiratorio, las mucosas, los pulmones y el intestino. Muchas de las funciones
innatas de las CD son crticas para controlar la infeccin y pueden influir en el inicio de la
respuesta innata adaptativa (31).
Las CD humanas son una poblacin heterognea en cuanto a fenotipo, localizacin anatmica y
funcin, y se clasifican en dos grupos segn su grado de parentesco con linajes celulares bien
establecidos: CD mieloides y CD plasmacitoides (32). Las CD mieloides identificadas por la
expresin de CD11c y la ausencia de CD123 (CD11c+ CD123-) estn distribudas prcticamente
en todos los tejidos y dependiendo de su localizacin tisular tienen diferentes nombres: clulas
de Langerhans en epidermis y mucosas, CD drmicas, CD tmicas, CD intersticiales en casi la
totalidad de rganos, etc. (31). Las CD mieloides circulantes representan solamente un 0.5% de
las CMSP totales (33). Sin embargo, las CD plasmacitoides o linfoides (CD11c- CD123+) proceden
de progenitores distribuidos en el timo y en reas T de los rganos linfoides secundarios (34), y
residen en ndulos linfticos, bazo, timo, mdula sea y sangre perifrica (35).
Las DC mieloides se originan a partir de progenitores de la mdula sea, que generan
precursores circulantes, cuya extravasacin a los tejidos da lugar a las CD inmaduras (CDi)
residentes. La capacidad fagoctica que tienen estas clulas les permite captar y procesar
contnuamente antgenos en el contexto de molculas del MHC y son clulas con elevada
capacidad de estimular clulas T vrgenes (32). Las CD plasmacitoides son mediadoras
importantes de la inmunidad anti-viral, y cuando se estimulan producen gran cantidad de IFNs
tipo I (36). Debido a su papel central en la inmunidad anti-viral, en un paciente con
mielodisplasia se asoci la deficiencia en CD plasmacitoides con una infeccin inusual por el virus
herpes simple (37).
Las CD reconocen patgenos a travs de receptores no clonales que se unen a estructuras
moleculares compartidas por muchos patgenos y que son los llamados PAMPR o PRR. Los
receptores de reconocimiento de patrones (PRR), reconocen patrones moleculares asociados a
patgenos (PAMP) y seales endgenas asociadas a dao tisular. El reconocimiento de PAMP
por las CD es el primer paso para desencadenar la respuesta inmune ya que el sistema inmune
innato se "activa" nicamente frente a las "seales de peligro" detectadas de forma especfica
por los PRR (38). Los PRR incluyen receptores de tipo Toll-like (TLR) 1-11 (39) y una variedad de
lectinas tipo-C (40). As, el lipopolisacrido bacteriano es reconocido por TLR4, mientras que el
DNA bacteriano y no metilado rico en CpG (CpG DNA) es reconocido por TLR9 etc. Los TLR activan
factores de transcripcin NFKB y, de este modo, cooperan en la activacin celular, en la
produccin de citoquinas y en la maduracin de las CD.
La expresin de TLR es especfica de diferentes CD lo que revela una importante
complementariedad entre las CD mieloides y las CD plasmacitoides, indicando que estas dos
subpoblaciones tienen funciones diferentes. En humanos, las CD mieloides expresan
TLR2,3,4,5,6 y 8 (41) mientras que las CD plasmacitoides expresan TLR-7 y TLR-9 (42). TLR-2 y 4
median la respuesta a ligando como las glicoprotenas de bacterias Gram-positivas y
micobacterias, mientras que TLR-3 se encuentra en el compartimento intracelular de monocitos
derivados de CMSP y CD mieloides (43) y se unen a cadenas doble de RNA, iniciadora de la
replicacin viral. Adems de TLR, las CD mieloides tambin expresan cantidades altas de
36 CAPTULO 3
respuesta a quimiocinas inflamatorias, lo que indica que son propensas a migrar a los rganos
linfoides secundarios (64).
La deteccin de "seales de peligro" a travs de los TLR y protenas NOD hace que las CD
"maduren" y migren hacia los rganos linfoides secundarios. Durante ese trayecto, disminuye la
capacidad de captura y el procesamiento de antgenos, e incrementa la expresin de molculas
coestimulatorias y MHC en membrana. En las reas T de los ndulos linfticos, las CD
interaccionan con los linfocitos T que portan TCR especficos para los antgenos que las CD
capturaron en los tejidos de origen, iniciando la respuesta inmune adaptativa (37). Las CD
maduras (CDm) presentan antgenos a los linfocitos T CD8+ y CD4+, y los linfocitos T CD4+ regulan
a su vez a otras clulas del sistema inmune, como los linfocitos T citotxicos CD8 y las clulas B
especficas de antgeno, o clulas no especficas de antgeno como macrfagos, eosinfilos y
clulas NK (65).
Las CD determinan el tipo de respuesta inmune que se va generar frente a un antgeno, ya que
son estas clulas las que determinan la polarizacin de los linfocitos Th nave o vrgenes hacia:
i) Th1, productores de IFN eficaces en eliminar patgenos intracelulales; ii) Th2, productores
de IL-4 y eficaces en eliminar patgenos extracelulares; iii) Th17, productores de IL-17 e
implicados en respuestas autoinmunes o iv) clulas T reguladoras (Treg), implicadas en procesos
inmunosupresores (31) (Figura 3).
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42 CAPTULO 4
CAPTULO 4
NANOTECNOLOGA, NANOMEDICINA E INFECCIN POR EL VIRUS DE LA
INMUNODEFICIENCIA HUMANA
1. INTRODUCCIN
Los avances tecnolgicos surgen debido a la necesidad de solucionar problemas o facilitar la vida
a las personas. La nanotecnologa es una rama de la ciencia ampliamente desarrollada en el
campo de la fsica, la informtica o la electrnica, y avanza con rapidez en la qumica y la
medicina (1). La nanotecnologa es el rea de estudio que comprende la sntesis y
caracterizacin de compuestos de tamao nanoscpico (1nm=10-9m). Para entender lo difcil
que es manipular la "nanoescala" y visualizar un "nanmetro", hay que tener en cuenta que 1
metro equivale a 1.000 milmetros, 1 milmetro son 1.000 micras y 1 micra son 1.000
nanmetros (Figura 1). La nanotecnologa y la nanociencia permiten desarrollar varias
herramientas y materiales como las nanocpsulas, nanopartculas, nanoporos, las micelas
polimricas, los nanocristales, nanotubos (2-5), etc. con propiedades excepcionales y mltiples
aplicaciones en distintas reas del conocimiento, que van desde la catlisis de procesos
industriales hasta su aplicacin en biomedicina.
La nanomedicina es la aplicacin mdica de la nanotecnologa. Por nanomedicina se entiende
todo aquel proceso de diagnstico, tratamiento y prevencin de enfermedades y lesiones
traumticas, que mitiguen el dolor y preserven la salud humana mediante el uso de
herramientas y dispositivos a una escala menor que un micrmetro, es decir, como se ha
descrito anteriormente, a nivel molecular (6). Cada vez son ms los problemas mdicos a los que
se aplican los conocimientos sobre nuevos materiales y dispositivos nanoestructurados. A medio
plazo, la biotecnologa y la nanomecnica permitirn avances mucho ms profundos en la
medicina molecular, consiguiendo as el desarrollo de la ingeniera de organismos y biorrobots
muy tiles en diferentes disciplinas, entre ellas, la salud. A medio plazo, en unos 5 o 10 aos, las
mquinas moleculares y nanorrobots formarn un nuevo armamento mdico, logrando una
gran herramienta sobre la enfermedad, la salud y el envejecimiento humano.
La nanomedicina agrupa dos reas importantes, el nanodiagnstico y la nanoterapia. La
deteccin precoz y el diagnstico rpido son imprescindibles para resolver numerosas
enfermedades, especialmente el cncer, donde si se identifica el tipo de cncer y la localizacin
de las clulas cancerosas, el pronstico de curacin puede ser cercano al 100%. Destaca el
diagnstico por imagen en el que se utilizan nanopartculas magnticas, metlicas y
semiconductoras (7-9).
NANOTECNOLOGA, NANOMEDICINA E INFECCIN POR EL VIRUS DE LA
INMUNODEFICIENCIA HUMANA 43
tejidos y en la prevencin de la formacin de cicatrices (24,25). Adems, hay estudios en los que
se han utilizado dendrmeros como agentes neutralizantes de toxinas (26), como eliminadores
de drogas y metales del cuerpo (27,28), como bioenzimas (29), biosensores (30), como
microbicidas (31-34) y finalmente en terapia gnica (35).
En los ltimos aos, la nanotecnologa ha emergido con gran fuerza como una nueva disciplina
que ofrece soluciones a las limitaciones que encontramos en el desarrollo de estrategias
preventivas frente al VIH (36-40). En el caso de su aplicacin biomdica, estos nanomateriales
(Figura 1) permiten la aparicin de novedosas drogas o compuestos con ventajas farmacolgicas
tiles en el diagnstico y terapia de varias patologas, como cncer o enfermedades infecciosas,
entre las que destaca el VIH (36-41).
para encapsular efavirenz (EFV) y aumentar su solubilidad (44,45), nanocpsulas polimricas que
permiten la liberacin dirigida de zidovudina (AZT) directamente en el citoplasma celular (46,47)
o nanopartculas lipdicas con briostatina (un activador de los linfocitos T CD4+) y nelfinavir
capaces de activar al virus latente e inhibir la propagacin viral. La aplicacin ms avanzada de
la nanotecnologa en la inmunoterapia frente al VIH es un parche drmico conocido como
DermaVir (48,49). Este dispositivo libera unas nanopartculas basadas en la conjugacin de
manosapolietilenamina (PEIm), glucosa y un plsmido de ADN que codifica para antgenos
virales. Estas nanopartculas pueden ser captadas por las clulas dendrticas (CD) a nivel de la
dermis, las cuales, tras migrar a los ganglios linfticos y estimular a linfocitos T desencadenan
una respuesta especfica. La terapia con DermaVir est en ensayo clnico Fase II, mostrando
excelente seguridad y tolerabilidad, emergiendo como el candidato de vacuna para el
tratamiento precoz de la infeccin por el VIH-1 [ http://geneticimmunity.com/dermavir.html].
Sin embargo, a pesar de las ventajas y aplicaciones de estas nanopartculas, algunas de ellas
presentan limitaciones que dificultan su traslacin a fase clnica. Entre estas limitaciones, est
la toxicidad, la aparicin de interacciones biolgicas no deseadas, su bioacumulacin, su
degradacin por enzimas celulares y extracelulares, su penetracin y absorcin en los distintos
tejidos o su alto coste de produccin, lo que supone un problema para su fabricacin a gran
escala (50).
Durante los ltimos aos, a travs de la nanotecnologa, se ha generado una nueva familia de
compuestos, denominados dendrmeros, que han mostrado y estn mostrando su potencial
como agentes teraputicos o como transportadores de diferentes molculas, levantando gran
inters en la biomedicina (51,52) (Figura 2).
Los dendrmeros, (dendri- = rbol; - mer = ramificacin), son macromolculas de tamao
nanomtrico, caracterizadas por su alta ramificacin y por su tamao definido y estructura
tridimensional. La principal ventaja de los dendrmeros es que al ser hperramificados, muestran
el grupo funcional deseado de forma multivalente repetido en la corteza, de manera que se
incrementa sinrgicamente su accin. A diferencia de los polmeros, altamente heterogneos
debido a una sntesis de difcil control, los dendrmeros son partculas monodispersas, que
forman estructuras esfricas altamente empaquetadas. La estructura de estos materiales tiene
un alto impacto en sus propiedades fsicas y qumicas.
La estructura de un dendrmero se divide en tres partes principales: i) el ncleo central o core:
es el tomo (o grupo de tomos) a partir del cual aparecen las primeras ramas. Es la unidad
central sobre la que se ramifican las sucesivas capas del dendrmero; ii) grupos de enlace: son
las unidades que estn enlazadas con el ncleo central y que a su vez enlazan con nuevos grupos
de la siguiente capa del dendrmero. Realizan tambin la funcin de punto focal sobre la que
parten las nuevas ramas o los grupos finales. Cada nueva capa de esta parte, determinar la
generacin del dendrmero y iii) la corteza: el armazn externo, los grupos terminales situados
en la parte ms superficial del dendrmero.
De esa manera, cuanto mayor sea el nmero de capas de los grupos de enlace, mayor ser la
generacin del dendrmero. As, un dendrmero de generacin 5 presentar 5 puntos focales
entre el ncleo y la superficie. A medida que la estructura dendrimrica vaya incrementando,
van apareciendo nuevos compartimentos, y a su vez, la corteza va creciendo, aumentando as la
cantidad de superficie multivalente (potenciales grupos reactivos) (Figura 2).
46 CAPTULO 4
G4
G3
G2
G1
Ramificacin
Ncleo
Justo por debajo de la superficie se genera un microambiente protegido del exterior. En dicho
lugar aparecen posibles lugares para encapsular y portar distintos tipos de molculas, por
ejemplo oligonucletidos y pptidos. En conclusin, se obtiene una de las funciones ms
NANOTECNOLOGA, NANOMEDICINA E INFECCIN POR EL VIRUS DE LA
INMUNODEFICIENCIA HUMANA 47
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54 CAPTULO 5
CAPTULO 5
SNTESIS Y CARACTERIZACIN DE DENDRMEROS
1. SNTESIS DEFINICIN
Los dendrmeros presentan una topologa generalmente esfrica mientras que los dendrones
tambin llamados cuas, son molculas ramificadas que tienen diferentes grupos funcionales
en el punto focal y en la periferia.
2. SNTESIS DE DENDRMEROS
En la sntesis convergente (6), el crecimiento del dendrmero se inicia desde la superficie hacia
el interior. En este caso, las molculas iniciales empleadas son tambin de estructura dendrtica
56 CAPTULO 5
y presentan una topologa cnica con una superficie multivalente y un grupo reactivo adicional
denominado punto focal. Estas molculas se pueden visualizar como segmentos de dendrmero
y se conocen como dendrones o cuas dendrticas. La formacin final del dendrmero se hace
por acoplamiento de varios dendrones a un ncleo polifuncional. En este caso, y con procesos
de purificacin adecuados, se pueden obtener dendrmeros sin defectos. El principal
inconveniente de este proceso sera la dificultad de obtencin de dendrmeros de generaciones
altas por la dificultad de acoplar las respectivas cuas al ncleo. Como contrapartida, esta
aproximacin tambin favorece la preparacin de dendrmeros asimtricos por la unin de
distintos dendrones a un ncleo en procesos controlados (7).
Respecto a los procesos de sntesis acelerada, hay que tener en cuenta varios parmetros, como
la eleccin de los bloques de construccin adecuados (building blocks), el nmero de reacciones
y procesos consecutivos sin aislar (one-pot). De esta manera han aparecido estrategias
conocidas como hipermonmero, crecimiento convergente de doble etapa, o crecimiento
exponencial doble (4).
Sin embargo, para acelerar realmente el proceso, es de mxima importancia minimizar el
proceso iterativo. Este objetivo se puede lograr a travs de la utilizacin de dos o ms reacciones
altamente selectivas que puedan coexistir durante el crecimiento dendrtico (reacciones
ortogonales) (4). En este sentido, predominan las reacciones tipo click (8), que incluyen
reacciones Diels-Alder, cicloadicin alquino-azida de Huisgen catalizada con cobre (CuAAC) y
adicin tiol-eno. Todas ellas se caracterizan por ser sencillas, cuantitativas y compatibles con un
gran nmero de grupos funcionales y disolventes.
H2N NH2
El crecimiento de dendrmeros PPI est limitado por la repulsin estrica, ya que cada
generacin dobla el nmero de grupos amino en la superficie de la anterior. La mayor
generacin obtenida ha sido la quinta. Actualmente, dendrmeros de tipo PPI se encuentran
disponibles comercialmente a travs de Aldrich Chemical Co. y DSM, The Netherlands.
SiH2H2Si
H2
Si Si
H2Si SiH2
1. BrMg 1. BrMg
SiH4 H2Si Si SiH2 Si Si Si
2. H2SiMeCl / cat. 2. H2SiMeCl / cat. H Si SiH2
2
Si Si
H2
G1-CBS-(SiH2)4
SiH2H2Si
G2-CBS-(SiH2)8
NO2
1.
H2N
O NH2
BocHN
O NO2
H2N O NHBoc NH O
O
HN HN
2. TFA
H2N HN
H2N
O
NH2
G2-PL-(NH2)4
Esquema 5. Sntesis de dendrones de naturaleza poli (L-lisina) propuesta por Denkewalter (22)
Para este tipo de compuestos, la metodologa sinttica es la habitual de los pptidos, con
aproximaciones en fase slida y combinacin de estrategias divergente y convergente, mtodos
ortogonales de proteccin y acoplamiento selectivo. De esta manera, tambin es posible la
heterofuncionalizacin de un ncleo dendrtico (25).
CO2Et
CO2Et CO2Et CO2Et
Na CO2Et CO2Et EtO2C
1. LiAlH4 / TsCl CO2Et
Br CO2Et
CO2Et
CO2Et CO2Et CO
2. EtO2C 2Et
CO2Et EtO2C CO2Et
Na CO2Et
Este tipo de compuestos son con toda seguridad los dendrmeros ms ampliamente estudiados
y se han preparado hasta la generacin diez. Adems, modificaciones del ncleo y las diaminas
empleadas en el crecimiento dendrtico han dado lugar a una gran variedad de sistemas tipo
PAMAM, alguno de los cuales se encuentran disponibles comercialmente.
CHO
S O
P
N O
N
CHO CH
Cl CHO
S P Cl S
Cl O Cl O S
1. H2N N P
SP O CHO Cl SP O C NNPO CHO
O O H O
2. NaO CHO
NaO CHO CHO
CHO HC
N CHO
G0-PD-(CHO)3 NO
P
S O
CHO
G1-PD-(CHO)6
Los dendrmeros de tipo poli(alquilster) estn siendo objeto de atencin reciente por
su facilidad de sntesis, variabilidad en su funcionalizacin y su degradabilidad en medio
biolgico (35). Su qumica se inici en 1996 por Hult (36) y posteriormente ha sido
ampliamente desarrollada por el grupo de Malkoch (35). La estructura de estos
compuestos emplea el cido 2,2-bis(metilol)propinico (bis-MPA) como bloque de
construccin y siguiendo diferentes metodologas ha sido posible alcanzar la sexta
generacin.
Finalmente, otra familia de dendrmeros desarrollados en los ltimos aos y que han
mostrado interesantes propiedades son los derivados de triazina, desarrollados por
Simanek (37). Su sntesis se basa en la sustitucin secuencial de los tomos de cloro
presentes en la triclorotriazina, que sirve de ncleo, con aminas. Este procedimiento
permite obtener dendrmeros de alta pureza y altos rendimientos adems de facilitar la
heterofuncionalizacin (38).
3.4. Microscopa
3.4.1 Microscopa de fuerza atmica (AFM)
La microscopa de fuerza atmica (AFM) permite caracterizar la topografa de una superficie de
dendrmeros adsorbidos sobre otra superficie como la slice. Medidas de AFM de dendrmeros
PAMAM (77) muestran los importantes efectos de sustrato y el pH de la solucin en la
deposicin frente a la altura, dimetro, y el volumen de estos dendrmeros (blandos y
deformables).
Esta tcnica tambin se ha utilizado para caracterizar nanocomplejos dendrmero-molcula
bioactivas, con el fin de determinar su tamao exacto. Los complejos formados por
oligonucletidos anti-VIH transportados por dendrmeros carbosilano (78) o doxorrubicina
sobre dendrmeros con cido poli(L-glutmico) (79), ambos caracterizados tambin por
microscopa electrnica de transmisin (TEM).
Los dendrmeros se pueden caracterizar por CE, pero tambin se pueden utilizar para mejorar
la separacin de los diversos compuestos a travs de esta tcnica. Gmez, de la Mata y col.
mostraron una mejor separacin y mayor resolucin de las protenas vegetales mediante el uso
de dendrmeros aninicos carbosilano como nanoaditivos en CE (84).
La combinacin de la electroforesis capilar y espectrometra de masas (CE/MS) ofrece la
posibilidad de detectar compuestos e ismeros estrechamente relacionadas. Stckigt y col. (85)
han separado e identificado sistemas dendrticos diaminobutano polidispersos (DAB) con
polinitrilos (DAB-dendr- (CN) 8) y la sntesis de subproductos mediante el acoplamiento en lnea
de la electroforesis capilar con un espectrmetro de masas con una fuente de ionizacin
electrospray (ESI).
Las tcnicas electroforticas tambin se utilizan comnmente para caracterizar diferentes
conjugados de dendrmero, tales como dendriplejos. La formacin de complejos y su estabilidad,
la carga y la relacin molar y la forma del ADN en el dendriplejo pueden ser estudiados mediante
la electroforesis de cidos nucleicos en gel de agarosa (86), Muoz Fernndez y col. (87) han
caracterizado dendrmeros carbosilano con grupos amino terminales desarrollados para
proteger y transportar pequeos ARN de interferencia (siRNA) unidos a dendrmero a travs de
interacciones electrostticas. La estabilidad y la fuerza del complejo fueron probadas realizando
ensayos de competicin de heparina en la electroforesis en gel de agarosa y en el sistema PAGE.
Se comprob que el complejo dendrmero-ARN es resistente a la degradacin por RNasa y por
lo que el dendrmero ejerce un efecto protector del material gnico en presencia de RNasa.
nitrgenos protonados en el ncleo y en la primera capa, mientras que todos los grupos
aninicos estn desprotonados.
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72 CAPTULO 6
CAPTULO 6
DENDRMEROS CON NANOPARTCULAS INORGNICAS COMO NCLEO:
PREPARACIN, CARACTERIZACIN Y SU POTENCIAL USO EN
BIOMEDICINA
1. INTRODUCCIN
Las nanopartculas (NPs) son una clase interesante de objetos en la nanoescala que
recientemente estn recibiendo una atencin especial debido a su amplia gama de aplicaciones
(1). Estos materiales exhiben generalmente caractersticas relacionadas con el tamao que
difieren significativamente de aquellas que presentan dichos materiales en la escala
macroscpica. Su importancia se atribuye al hecho de que representan un enlace crtico entre
las tecnologas actuales y las futuras aplicaciones, principalmente en base a su tamao diminuto,
su gran relacin superficie/volumen y sus propiedades dependientes del tamao. Tanto las NPs
metlicas o semiconductoras como las estructuras hbridas formadas con material polimrico,
han sido sintetizadas y forman parte de la fabricacin de nuestros productos de la vida cotidiana
desde hace ms de una dcada (anteojos resistentes al rayado, pinturas que no se agrietan,
revestimientos anti-grafiti para paredes, protectores solares transparentes, tejidos repelentes
de manchas, ventanas autolimpiantesy revestimientos cermicos para las celdas solares) (2). En
la actualidad, existen nanocompuestos con aplicaciones de alto rendimiento en diversos
campos, como dispositivos electrocrmicos (3) y almacenamiento de energa (4) que hacen que
estos materiales hbridos adquieran mayor importancia.
Las NPs de oro forman parte de los nanomateriales ms estudiados desde hace un siglo debido
a sus extraordinarias propiedades pticas relacionadas con la absorcin del plasmn y
actualmente estn siendo muy utilizadas en diversas reas de la qumica, la biologa, la
ingeniera y la medicina debido a sus propiedades pticas, elctricas y catalticas (5). Estas NPs
han atrado el inters de los cientficos especialmente para su uso en terapia fototrmica (6),
biosensores (7), diagnstico por imgenes (8), y liberacin controlada (9). Las nanopartculas
magnticas (MNPs) tambin han generado un gran inters en el mundo cientfico,
especialmente en el mbito de la biomedicina y las tecnologas, en particular para su uso en
medios de almacenamiento magntico (10), biosensores (11), tintas y pinturas (12),
administracin de frmacos y agentes de contraste en imgenes de resonancia magntica (13).
Las NPs se sintetizan generalmente en solucin, tanto en medio orgnico como acuoso, y por lo
tanto requieren un recubrimiento para aumentar su estabilidad. Los procesos de agregacin que
se producen con frecuencia en los sistemas coloidales de NPs metlicas o semiconductoras
restringen severamente su utilizacin en diferentes aplicaciones. Por lo tanto, con el fin de
prevenir o retardar la agregacin, las NPs deben ser funcionalizadas con una delgada pelcula
que puede contener estabilizadores monomricos (tioles, carboxilatos, fosfatos o sulfatos),
polmeros sintticos o naturales (dextrano, polietileno glicol (PEG), polivinil pirrolidona, xido
de polietileno o quitosano), materiales inorgnicos (silicio o derivados), liposomas o incluso una
pelcula de molculas ms novedosas como son los dendrmeros y los dendrones. Los
DENDRMEROS CON NANOPARTCULAS INORGNICAS COMO NCLEO:
PREPARACIN, CARACTERIZACIN Y SU POTENCIAL USO EN BIOMEDICINA 73
dendrticas que se unen radialmente al ncleo estabilizando al coloide y por lo tanto impidiendo
su agregacin (vase la Figura 1). En este caso, las NPs son unidades estructurales del
dendrmero y no se encuentran atrapadas o encapsuladas en su cavidad interior (20). Los NCDs
protegidos por dendrones con un grupo tiol en el punto focal mostraron mayor estabilidad y
una clara mejora con respecto a las NPs encapsuladas en dendrmeros (21).
La generacin de los NCDs se obtiene por lo general aplicando alguna de las tres metodologas
sintticas ms conocidas (22) (vase la Figura 2). El mtodo directo emplea la reduccin de un
catin metlico en presencia de dendrones que llevan grupos funcionales adecuados en su
punto focal (a). Para la sntesis de NCDs con enlace metal-azufre se emplean por lo general
grupos tioles y/o disulfuros. En los ltimos aos se ha desarrollado un nuevo enfoque del
mtodo directo que implica la reduccin simultnea del catin metlico en presencia de
dendrones con un grupo diazonio en el punto focal; esta metodologa conduce a la formacin
de NCDs con enlaces metal-carbono (23). En contraste, el mtodo de intercambio de ligando (b)
es un mtodo indirecto que comprende reacciones en dos pasos: inicialmente la sntesis del
coloide estabilizada por una monocapa no dendrtica seguida en una segunda instancia por la
sustitucin de la capa orgnica por dendrones tiolados. Este mtodo tiene la ventaja de
mantener el tamao del ncleo sin cambios durante la reaccin de intercambio de ligandos,
pero su principal limitacin es la dificultad de obtener los dendrones tiolados. Por ltimo,
tambin se utiliza el enfoque convergente (c) en el que se emplean reacciones individuales o de
varios pasos para construir arquitecturas dendrticas.
DENDRMEROS CON NANOPARTCULAS INORGNICAS COMO NCLEO:
PREPARACIN, CARACTERIZACIN Y SU POTENCIAL USO EN BIOMEDICINA 75
El tamao y las caractersticas del material en los NCDs han sido recientemente investigadas a
fondo usando una variedad de tcnicas experimentales, como la espectroscopia, microscopa,
la electroqumica, la fotoqumica, etc. Los NCDs ms sintetizados tienen Au en el ncleo y
dendrones tiolados alifticos o aromticos en el exterior. Los ligandos dendrticos tambin se
han utilizado en la preparacin de NCDs con material magntico en el ncleo (especialmente
magnetita), Pd o Ag entre otros metales, o incluso semiconductores tales como CdSe. En cuanto
a la naturaleza de los ligandos ramificados, podemos citar varios pero los ms utilizados para la
construccin de los NCD son probablemente poli (amidoamina), poliarileter y polipropilenimina.
El diseo controlado de la arquitectura dendrtica a travs de la eleccin de los grupos qumicos
funcionales y de la extensin de la ramificacin dendrtica ejerce un control importante sobre
las propiedades finales de los NCDs. Kim (24) y Wang (25) han mostrado claramente que la
generacin de las molculas dendrticas puede controlar las dimensiones de los NCDs mediante
el uso de dendrones de ter aromtico con grupos tiol o 4-piridona en el punto focal. Yan y col.
(26) han informado tambin que las propiedades nicas de las molculas dendrticas de
arenotiol (arilmercaptanos) no slo poseen la capacidad de controlar el crecimiento del tamao
de las NPs de oro sino que dejan lista la superficie para su derivatizacin posterior. Los ligandos
de tipo Newkome usados para el recubrimiento durante la sntesis de NPs de oro tambin
determinan su solubilidad y estabilidad, as como las caractersticas del ncleo a travs de un
control dendrtico del tamao del NCD (27). Fox y col. (20) han utilizado dendrones de tipo
Frchet para estabilizar la superficie de NPs de oro mostrando que a medida que la generacin
dendrtica aumenta, la densidad de dendrones en los NCDs disminuye como consecuencia del
impedimento estrico de las ramas. Esto trae como consecuencia que existe una fraccin
importante de la superficie de oro no pasiva en los NCDs de mayor generacin, y por lo tanto
permanece disponible para una reaccin cataltica (20). Kumar y col. (28) tambin informaron
de la sntesis de NCDs utilizando Pd con dendrones de tipo Frchet funcionalizados con grupos
diazo obteniendo materiales promisorios para aplicaciones catalticas. Love y col. (29) han
76 CAPTULO 6
La nanotecnologa ofrece a los cientficos diversas oportunidades para explorar sus ideas en el
campo de la biomedicina. Nanopartculas de xido de hierro (32), puntos cunticos (33),
nanotubos de carbono (34), nanopartculas de oro (35) y nanopartculas de slicio (36) han sido
previamente investigadas para su posible aplicacin en diagnstico por imgenes y son
excelentes candidatas para la construccin de plataformas teransticas basadas en
nanopartculas. Por lo tanto, la nanomedicina y la teranstica estn emergiendo como un
paradigma teraputico prometedor que aplica tanto el diagnstico por imgenes como los
agentes teraputicos en un mismo paso; es decir, que en forma simultnea con la realizacin de
pruebas de diagnstico, se brinda una terapia y se controla su respuesta teraputica. Los
nanosistemas resultantes juegan un papel importante en la era emergente de la nanomedicina
y por ello una gran parte de los actuales esfuerzos en tareas de investigacin se han dedicado a
este objetivo.
Una ventaja en la construccin de sistemas con funcionalidades integradas es que muchas de
estas nanoplataformas ya contienen, por s mismas, el agente de contraste necesario para el
diagnstico por imgenes. La qumica superficial bien desarrollada de los NCDs hace que sea
fcil la inclusin de frmacos en su interior y por eso los vuelve promisorios como posibles
nanosistemas teransticos (37). Las mediciones de resonancia magntica in vitro (e incluso in
vivo) han demostrado que la utilizacin de las nanopartculas dendronizadas mejora el contraste
obtenido respecto a las nanopartculas recubiertas con otros polmeros comerciales no
dendrticos (14).
Las nanopartculas de slice mesoporosa (NSMs) han sido ampliamente estudiadas y las mismas
han sido propuestas como candidatos prometedores para numerosas aplicaciones en
biomedicina (38). Recientemente, Pan y col. (39) han reportado el diseo, preparacin,
caracterizacin y evaluacin de bioseguridad de las NSMs funcionalizadas con pptidos. Estos
nanohbridos fueron preparados por modificacin de la superficie de los NSMs a travs de una
reaccin directa del grupo azido con dendrones peptdicos y se ha evaluado su citotoxicidad in
vitro y su toxicidad in vivo mostrando buena biocompatibilidad ya que no hay evidencia de
efectos colaterales significativos en los rganos normales de ratones sanos (39). Otras
nanopartculas, tales como xidos de hierro y nanopartculas de oro han mostrado ser tambin
plataformas muy tiles para construir nanoportadores teransticos ya que combinan ambas
funciones teraputicas y de diagnstico dentro de una sola nanoestructura; sin embargo, su
superficie debe ser funcionalizada apropiadamente para las aplicaciones in vivo (40). La
derivatizacin de la superficie puede proporcionar sitios de unin adecuados para diversos
ligandos y/o para el transporte de frmacos.
DENDRMEROS CON NANOPARTCULAS INORGNICAS COMO NCLEO:
PREPARACIN, CARACTERIZACIN Y SU POTENCIAL USO EN BIOMEDICINA 77
Son varios los factores cruciales que deben tenerse en cuenta al desarrollar una plataforma para
nanomedicina (41):
(I) identificacin de un objetivo especfico a nivel molecular,
(II) la eleccin del candidato adecuado para el recubrimiento del nanocomponente,
(III) el diseo del sistema de transporte,
(IV) la caracterizacin de su tamao y forma nanomtricos,
(V) la actividad biolgica (in vivo o in vitro) y su evaluacin farmacolgica.
En todo caso, el estado superficial de las NPs funcionalizadas depende en gran medida de su
ruta de sntesis y de las estrategias utilizadas para su funcionalizacin, hacindolas adecuadas
(o no) para sus futuras aplicaciones mdicas.
Los sistemas multifuncionales hbridos con tamaos que varan tpicamente entre 1 y 100 nm
capaces de suministrar un agente bioactivo en el sitio de destino con una mejor actividad
teraputica que la forma libre del biocomponente reciben el nombre de "nanotransportadores"
(41). En particular, ya se han estudiado algunas NPs como una estrategia interesante para
suministrar frmacos convencionales, protenas, vacunas o cidos nucleicos como el ADN o ARN.
Para que funcione como nanotransportador, los sistemas de liberacin de frmacos deben
proporcionar algunos atributos positivos respecto a la droga libre", por ejemplo, la mejora de
la solubilidad, la estabilidad in vivo y la biodistribucin (42). Las NPs de oro son capaces de captar
biomolculas grandes sin restringirse a s mismas como portadores de frmacos slo para
molculas pequeas; adems, el control del tamao y la posibilidad de seleccionar una
adecuada funcionalidad para el reconocimiento especfico las convierte en sistemas eficientes
para la liberacin controlada de biomolculas. Tanto las NPs de oro como otros materiales
coloidales aptos para sistemas de liberacin de frmacos pueden modificar la cintica, la
distribucin en el cuerpo y la liberacin del frmaco para una droga especfica (43). Por lo
general, son de tamao similar a los componentes y las protenas celulares tpicos, y por lo tanto
puede pasar por alto barreras mecnicas naturales que posiblemente conducen a la reaccin
adversa del tejido (44). En particular, las NPs de oro cargadas positivamente son de inters en
cuanto a la captacin celular (45). Su naturaleza catinica induce interacciones electrostticas
con entidades cargadas negativamente, tales como las membranas celulares, ADN plsmido,
siRNA, o bien nanopartculas de anticuerpos (46). A pesar que las NPs aprobadas clnicamente
han mostrado consistentemente una buena capacidad para reducir la toxicidad del frmaco, su
uso no siempre se ha traducido en mejora de los resultados clnicos. Esto ha llevado al desarrollo
de NPs "multifuncionales", donde capacidades adicionales como la selectividad y la mejora en
su uso para imgenes por contraste debe ser agregada (47). Generalmente las NPs son
consideradas como material no txico y biocompatible, pero Pan y col. (48) han informado que
NPs de oro de 1,4 nm de dimetro que contienen trifenilfosfinamonosulfonato son an ms
citotxicas que nanopartculas de 15 nm de composicin qumica similar. Estos resultados
destacan la importancia de un tamao ptimo de los nanoportadores. Por otra parte, Stobiecka
y col. (49) han demostrado que la principal ventaja de los recubrimientos de polmeros de L-
lisina en NPs de oro est relacionada con la ausencia de toxicidad para la liberacin del ligando
en procesos de transferencia de genes, en contraste con las NPs de oro funcionalizadas con
grupos tiol. Papp y col. (50) han mostrado que NPs de oro pequeas funcionalizadas
qumicamente usando dendrones de glicerol con cido silico como grupo terminal genera
coloides estables que muestran buena actividad para la inhibicin de la infeccin por el virus de
la influenza. Como la unin de la protena hemaglutinina a la superficie de la clula husped est
mediada por los receptores de cido silico, se cree que la interaccin multivalente con NPs
funcionalizadas con cido silico puede inhibir competitivamente la infeccin viral (50).
78 CAPTULO 6
Las diversas posibilidades funcionales de los NCDs permite una amplia variedad de enfoques
para el diseo de nano transportadores (Figura 3). Gopidas y col. informaron de la sntesis de
NCDs con corazn de oro solubles en agua que presentan propiedades micelares capaces de
encapsular cloruro de pinacianol (51). Estas propiedades hacen que los NCDs sean candidatos
ideales como nanoportadores; los frmacos hidrfobos pueden ser cargados en nanovehculos
a travs de interacciones no covalentes en el interior hidrofbico sin necesidad de sufrir una
modificacin estructural para su liberacin (52). Del mismo modo, se puede utilizar la
conjugacin covalente a los NCD a travs de enlaces escindibles para entregar a la clula
profrmacos y el medicamento puede ser liberado entonces por estmulos externos o internos.
Significativamente, los estmulos internos funcionan de una manera biolgicamente controlada,
mientras que los estmulos externos proporcionan un control espacio-temporal sobre la
liberacin (53). Independientemente del mtodo utilizado, la capacidad de adaptacin de los
NCDs es crucial para la liberacin interna o externa. Comnmente, un frmaco conjugado
covalentemente a un nanotransportador es ms adecuado para la administracin de un frmaco
dirigido especficamente, mientras que un frmaco que forma un complejo de inclusin con el
nanotransportador se libera fcilmente y es activo in vitro (54). Por ejemplo, la conjugacin
directa de pptidos funcionales de NPs de oro proporciona una serie de propiedades adaptables
que pueden modular sus funciones dentro de las clulas vivas. Las distribuciones intracelulares
de las partculas cambian desde el ncleo hasta el retculo endoplsmico, aumentando la
densidad de pptidos para nanopartculas de dimetro constante o aumentando el dimetro de
las NPs manteniendo una densidad de pptidos constante, lo que conduce a una menor
absorcin celular (55). Hay un gran inters en el desarrollo de sistemas de administracin de
frmacos que puedan permitir un transporte eficiente y especfico de medicamentos para los
tejidos afectados por una enfermedad.
Figura 3. Esquema de las diferentes vas de accin como nanovehculos de los NCDs
DENDRMEROS CON NANOPARTCULAS INORGNICAS COMO NCLEO:
PREPARACIN, CARACTERIZACIN Y SU POTENCIAL USO EN BIOMEDICINA 79
del tamao crtico. Estos atributos pueden ser explotados para proporcionar una plataforma
eficaz y selectiva para la liberacin intracelular selectiva de algunas sustancias.
Como grupo de investigacin integrante del proyecto "Desarrollo de una vacuna frente al VIH-
1: Estudio de los cambios en la biologa de clulas dendrticas humanas tras interaccin de
distintos sistemas de liberacin de pptidos del VIH", proyecto CYTED 214RT0482, nuestro
aporte al proyecto es el diseo, sntesis y optimizacin de NCDs adaptadas para su aplicacin
como nanotransportador de molculas orgnicas. Para tal fin, se utilizaron nanopartculas de
oro y magntica que fueron funcionalizadas en su superficie con dendrones biocompatibles
especficamente sintetizados. El objetivo principal de la dendronizacin es el aporte de
estabilidad coloidal a las nanopartculas y funcionalidad superficial para que permitan en una
etapa posterior, la unin covalente de molculas especficas, como drogas de uso teraputico,
molculas solubilizantes, ligandos diana o molculas sensibles a estmulos. El proyecto se ha
dividido en dos temas principales de estudio, que se describen a continuacin.
AuCl4 NaBH4
Etanol
Los NCDs obtenidos fueron caracterizados por espectroscopia FT-IR, espectroscopia UV-Vis,
resonancia magntica nuclear (RMN) y microscopia electrnica de transmisin (TEM). Para la
caracterizacin IR de los NCDs sintetizados se compararon los espectros del disulfuro puro y del
82 CAPTULO 6
correspondiente NCD. Por otra parte, tambin se realizaron los espectros de RMN del disulfuro
puro y del correspondiente NCD. Ambas tcnicas mostraron que los NCD sintetizados poseen el
dendrn G1-COOH como ligando. El espectro UV-Vis realizado evidenci la presencia de la banda
plasmnica LSPR de baja intensidad cuyo mximo se ubica a 540nm. Los resultados obtenidos
indican que las NPs obtenidas son aproximadamente esfricas y de un tamao inferior los 15nm.
Por su parte, la microscopa TEM ha mostrado ser muy til para determinar fcilmente el tamao
de las NPs metlicas. Las imgenes TEM muestran que, efectivamente, las NPs sintetizadas son
cuasi esfricas y de un tamao menor a los 10nm, en concordancia con los estudios UV-Vis.
Una vez caracterizados los NCD, se procedi a la funcionalizacin de los mismos con arginina.
Para ello se llevaron a cabo dos metodologas. La primera consisti en la unin covalente de la
arginina a travs de la formacin de un enlace amida con los cidos carboxlicos del dendrn,
utilizando EDC y NHS como activantes. Por otra parte, se procedi a la unin electrosttica de la
arginina con los NCD, incubando durante 30 minutos los NCD en una solucin de arginina en
buffer fosfato (pH=7) (Figura5).
NH O
NHS/EDC
+ H 2N N OH
H
NH2 Or
30 min PBS
Arg =
HO
O
= HO
H
O N S
O O
OH
Una vez finalizados los estudios de caracterizacin de todos los sistemas, stos se estn
probando en ensayos biomdicos por otros grupos pertenecientes a la RED CYTED.
Tanto para la sntesis de MNP-urea-G2S como para MNP-NH-G2Si, los anlisis de potencial Z
indicaron que el valor aumenta de 0 mV para MNP-NH2 a ~33 y ~47 mV, respectivamente (Figura
8). Este cambio en el potencial se debe a la presencia de las cargas positivas en la periferia de
los dendrones. Las imgenes tomadas por microscopia electrnica de transmicin (TEM)
indicaron que la forma de las MNP no se ven modificadas, y el tamao y forma permanece
estable bajo las condiciones de reaccin.
En la Figura 9 (izq) se muestran los espectros FTIR de las MNPs modificadas con el silano y las
dendronizadas. Se observa la presencia de las bandas caractersticas de la nanopartcula original
(core) dada por la vibracion del enlace Fe-O a ~590 cm-1 de la magnetita. En los espectros
correspondientes a las MNPs dendronizadas se observan las bandas caractersticas del dendrn
a ~1050 cm-1 debido al enlace Si-O-Si simtrico; los picos intensos entre ~1100-1020 cm-1
corresponden a las aminas secundarias. Adems, se observ el aumento y desdoblamiento de
la banda C-N a 1618 cm-1, que demuestra la presencia de ambas estructuras. Segn los anlisis
TGA (Figura 9), se deduce que la incorporacin y el aumento de la materia orgnica en las MNP-
NH2 fue de aproximadamente un 20% respecto al peso total de las nanoparticulas.
Figura 9. Espectro FT-IR (izq) y TGA (der) para MNP-NH2 (lnea verde), MNP-NH-G2Si (lnea violeta) y
MNP-urea-G2S (lnea roja)
Una vez finalizados los estudios de caracterizacin de todos los sistemas, los mismos sern
utilizados para estudios de interaccin con pptidos y ensayos de citotoxicidad en clulas por
varios grupos de la RED CYTED.
En resumen, en este captulo se han revisado los avances ms recientes en el uso de los NCDs
como nanotransportadores para la administracin de frmacos destacando la importancia de
las molculas dendrticas en la estabilizacin de los coloides. Estas nanopartculas hbridas
(orgnica/inorgnica) han surgido como una solucin simple para construir sistemas
"teransticos" que actualmente se encuentran bajo una intensa investigacin.
Por otro lado, se ha mostrado en forma sinttica los objetivos y resultados alcanzados en
nuestro proyecto especfico de estudio en el tema de NCDs.
Esperamos que estas plataformas puedan ofrecer un rendimiento superior en aquellas terapias
mdicas que requieren el transporte a travs de las barreras del tejido, ya que las interacciones
multivalentes son un factor crucial en la explotacin del efecto de permeabilidad mejorada. Esta
razn claramente podra justificar el mayor costo de sntesis de las molculas dendrticas.
Adems, se han discutido temas relacionados a la modificacin superficial, la ramificacin de los
ligandos y su efecto en las caractersticas del nanotransportador. Un control preciso de la
cantidad y la distribucin de los grupos funcionales en las superficies internas y externas de los
NCDs ayudara a incrementar la carga de frmacos hidrofbicos y controlar su tiempo de
liberacin. Sin lugar a dudas, el progreso en el diseo de los NCDs junto con el desarrollo en su
aplicacin en biomedicina brindar resultados exitosos en los prximos aos.
Agradecimientos:
Los autores agradecen a los organismos que gentilmente financiaron este trabajo: SECyT(UNC), ANPCyT,
CONICET y CYTED 214RT0482.
DENDRMEROS CON NANOPARTCULAS INORGNICAS COMO NCLEO:
PREPARACIN, CARACTERIZACIN Y SU POTENCIAL USO EN BIOMEDICINA 85
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88 CAPTULO 7
CAPTULO 7
ESTUDIOS IN SILICO PARA EL DISEO DE DENDRIPLEXES
1. INTRODUCCIN
sustancias en diferentes micro-ambientes. Es aqu donde los estudios in silico son una
herramienta muy importante para poder explicar y analizar desde el punto de vista estructural,
a nivel atmico, los complejos pptido-dendrimero (dendriplexes). Para esto es importante
mencionar que se requiere del desarrollo de nuevos campos de fuerza para estudiar los modelos
en 3D de dendrimeros, para que puedan evaluarse en un entorno virtual (in silico) como
potenciales agentes acarreadores de frmacos, siRNA, DNA, antgenos peptdicos, etc. (17,18).
Para llevar a cabo una seleccin de los mejores candidatos de dendrimeros como potenciales
agentes nanotransportadores, se pueden emplear tcnicas in silico como el acoplamiento
molecular, dinmica molecular, as como estudios mecanico-cunticos. Esto permite acortar el
tiempo necesario para identificarlos por mtodos experimentales, lo que conlleva a una
inversin menor en recursos materiales y humanos (7). De los diferentes nanotransportadores,
los dendrmeros PAMAM han sido de los ms estudiados para aplicaciones biomdicas, sin
embargo, existen muchos tipos de dendrmeros, dentro de los ms comunes estn los: PPI o
polipropileniminas, poli-lisina (polipptidos), polisteres, triazinas, carbosilano, fosfo-
dendrmeros, etc. Por otro lado, los pptidos inmunognicos pueden generarse a travs de
estudios in silico con diferentes caractersticas como conservacin, localizacin en protena-
clula as como su composicin en aminocidos, esto ltimo para favorecer su unin sobre los
dendrimeros.
Este captulo se centra de forma general en dendrmeros, pptidos, complejo pptido-
dendrimeros (dendriplex) y su potencial uso como sistemas de nanovacunas utilizando
herramientas in silico.
Los dendrmeros son polmeros arborescentes de origen sinttico, su patrn ramificado les
confiere diversos cambios conformacionales que permiten encapsular y/o retener en su
superficie o en cavidades internas molculas de diverso peso molecular y propiedades
fisicoqumicas (Figura 1).
Los ligandos (frmacos, pptidos, cidos nucleicos, etc) pueden ser de naturaleza diversa desde
el punto de vista qumico-estructural, por lo que estos complejos ligando-dendrmero pueden
ser reversibles a diferentes valores de pH, temperatura, concentracin de sales; actuando los
dendrimeros como nanotransportadores y dispensadores de tales ligandos al actuar como
sistemas de liberacin sostenida (19). Las propiedades de los dendrmeros como
nanotransportadores pueden ser modificadas en funcin al tamao, los grupos funcionales
internos y de superficie de los mismos. Esto ha permitido sintetizar diferentes tipos de
dendrmeros, estas modificaciones estructurales tambin permiten disear dendrmeros para
hacer que lleguen de forma dirigida a sitios especficos (blancos biolgicos) de una forma
selectiva, esto se logra al acoplarlos a farmacforos o anticuerpos monoclonales. La adicin de
estos sistemas de direccionamiento a los blancos correspondientes se hace modificando los
grupos funcionales localizados en la superficie de los dendrmeros (19). En este sentido, se
pueden mejorar las propiedades fisicoqumicas y ADME de los ligandos encapsulados y algunas
veces de los dendrmeros. Al estudiar los dendrmeros con herramientas in silico se pueden
predecir sus propiedades fisicoqumicas y guiar sus modificaciones qumico-estructuales. En
este contexto, la modelizacin de dendrmeros (estudios in silico) puede ser la piedra angular de
estos desarrollos, donde el desarrollo de campos de fuerza cobra una relevancia significativa
debido a que son una limitante por el tipo de molculas con un patrn qumico, muchas veces
desconocido.
Los campos de fuerza ("force field", Figura 2) son un conjunto de ecuaciones que provienen de
informacin estructural de los sistemas de estudio, lo que incluye ngulos, distancias y datos de
uniones covalentes y no covalentes, lo cual en conjunto forman las fuerzas y energas que
representan el entorno natural al que est expuesta cualquier molcula en funcin del tiempo.
Estas fuerzas generan en su conjunto cambios en la energa potencial de los tomos de cualquier
molcula, incluyendo los dendrmeros. Como se mencion, se pueden dividir en fuerzas de
enlace (torsin, rotacin, tensin, etc), y no enlazantes (puentes de hidrgeno, electrostticas,
fuerzas de Van der Waals, etc). Los campos de fuerza ms empleados en dendrmeros PAMAM
son CHARMM (20) y de los ms recientemente reportados son MARTINI coarsegrained (CG) (21).
Para identificar el campo de fuerza a usar en dendrimeros, se seleccionan aquellos que puedan
tener mejores aproximaciones a las condiciones experimentales como SAXS (smallangles X-
rayscattering) (23), informacin que es usada para validar los estudios de dinmica molecular a
travs del anlisis de los radios de giro.
De acuerdo con la literatura, para los dendrmeros PAMAM G2-G6, los campos de fuerzas que
corresponden a valores de radio de giro ms cercanos a los resultados experimentales obtenidos
por SAXS (23). Por lo que con esta informacin se pueden generar campos de fuerza importantes
para el estudio de movilidad y generacin de confrmeros de los dendrmeros, esto a travs de
estudios de mecnica molecular y dinmica molecular (24). Por otro lado, estn los estudios de
mecnica cuntica, los cuales no suelen ser empleados dendrmeros completos, esto debido al
92 CAPTULO 7
costo computacional. En lugar de esto se emplean fragmentos pequeos del mismo (ramas),
que eventualmente se utilizarn para la construccin del modelo completo del dendrmero en
3D, este modelo pre-optimizado tendr la ventaja de requerir menor tiempo computacional
para la minimizacin energtica y de identificacin de propiedades mecnico-cunticas,
llegando en menor tiempo al equilibrio energtico, usado particularmente para ver
transferencia electrnica, entre otras propiedades (25).
Una de las propiedades de los dendrimeros es la alta flexibilidad, esto es por su elevado nmero
de enlaces rotables, lo que genera una poblacin amplia de rotmeros, esto puede ser un
problema dado que algunos programas de acoplamiento molecular estn parametrizados para
un nmero mximo de enlaces rotables, como Autodock (26). Lo que limita su uso para estudios
de acoplamiento molecular, por lo que el dendrmero tendr que permanecer rgido y el ligando
(pptido) se mantiene flexible. En este sentido Autodock Vina y el servidor HEX
(http://hex.loria.fr/) pueden emplearse para estudios de acoplamiento molecular con pptido.
Desafortunadamente, CLUSPRO (https://cluspro.bu.edu/login.php) no reconoce a molculas no
proteicas como receptores, por lo que los dendrmeros no pueden emplearse para estudios de
acoplamiento molecular en este servidor. El espacio conformacional del dendrmero depende
del entorno, en este sentido las conformaciones en un entorno fisiolgico cobran inters, motivo
por el que es necesario simular un ambiente lo ms semejante al fisiolgico, donde el
dendrmero pueda efectuar sus conformaciones de acuerdo a su naturaleza, por lo que los
estudios de dinmica molecular pueden ser de gran utilidad. Con estos estudios se determina y
evala el radio de giro delos dendrmeros PAMAM G2, parmetro que va cambiando en relacin
al tiempo y es dependiente de varios factores como la constante dielctrica (dependiente del
solvente). Por este motivo, los datos obtenidos en conformaciones del dendrmero en el vaco
pueden corresponder a conformaciones no fisiolgicas y a un error en la interpretacin de
resultados. Sin embargo al utilizar disolventes explcitos o implcitos (molculas individuales del
disolvente y fuerzas aleatorias respectivamente), se obtienen cambios mnimos en el radio de
giro. Concluyendo que se pueden hacer aproximaciones ms simplificadas con solventes
implcitos, esto implica un menor costo computacional. Una aproximacin ms interesante son
los mtodos hbridos. Estos emplean un entorno de solvente explcito en una regin del
dendrmero mientras en la otra se aplica un entorno de solvente explcito, sin embargo, esto se
ha dejado de usar, por la robustez que el equipo de cmputo ha venido desarrollando.
Adems de la dinmica molecular, otros mtodos que se pueden emplear para hacer
simulaciones con dendrmeros son la dinmica browniana y estudios de Montecarlo (27). Con
los estudios de dinmica molecular se logra adquirir informacin relevante del dendrmero
desde un punto de vista natural, tiene un elevado costo computacional, sin embargo, el estudio
obtiene informacin estructural de acuerdo a las leyes de Newton, adems obtiene
aproximaciones de la energa potencial y cintica. In silico se pueden emplear diferentes valores
de temperatura, presin y tiempo. De esta forma se puede predecir la trayectoria de los tomos
a diferentes tiempos encontrando un patrn de movilidad que puede ser perturbado en
diferentes condiciones, las cuales pueden orientar y sugerir el tipo de molculas que pueden ser
acarreadas por el dendrimero. Adems del radio de giro, existen otras caractersticas que
pueden estudiarse de los dendrmeros como el RDF (Radial Distribution Function) (20). Este
parmetro se puede utilizar para evaluar molculas de agua, iones, frmacos, pptidos, etc., que
estn en el interior del dendrmero, donde un pico indica el desplazamiento de estas molculas
hacia el exterior, lo que significa que el dendrmero puede liberar las molculas encapsuladas
en su interior, esto ha sido empleado para determinar el efecto que tienen los grupos
funcionales de la superficie del dendrmero referente a su capacidad de liberacin de molculas
como el cido flico. En este sentido, se puede optimizar el diseo de agentes de liberacin
sostenida de frmacos, antgenos y hormonas. Esto se puede complementar calculando el
tamao y volumen de las cavidades del dendrmero y compararlo con la medida de los ligandos.
De esta forma se puede determinar cuntas molculas se pueden unir a la superficie de las
ESTUDIOS IN SILICO PARA EL DISEO DE DENDRIPLEXES 93
cavidades del dendrmero. Para esto se han realizado clculos de reas accesibles a solventes
(Solvent Accessible Surface Area, SASA) y volumen excluyente del solvente (Solvent Excluded
Volumen, SEV) (28).
En los sistemas virtuales (in silico) es necesario crear un entorno semejante al biolgico, usando
cajas de agua virtuales, con sales y modelos 3D de dendrmeros, con niveles de protonacin
acorde al pH del entorno acuoso, considerando el sistema o entorno biolgico correspondiente.
Estos cambios de pH pueden inducir cambios conformacionales de dendrmeros, lo que puede
formar estados llamados de puerta abierta, lo que hace posible la internalizacin de ligandos
o su unin en los grupos funcionales de la superficie del dendrmero (Figura 1). Otras
condiciones del entorno que influyen en el comportamiento de la superficie externa e interna
del dendrmero para que sea accesible a los ligandos son temperatura, presin, saturacin, etc
(29). Para determinar el tipo de unin (encapsulacin o unin a la superficie) se emplea
acoplamiento molecular (ampliamente conocido como docking). De esta forma se pueden
estudiar qu tipo de ligandos pueden ser aceptados y en qu cantidad, por el dendrimero. Sin
embargo, si se requiere ver la estabilidad estructural de esos complejos, posteriormente se
pueden realizar estudios de dinmica molecular, y de esa forma ver la estabilidad del complejo.
El acoplamiento molecular permite determinar las interacciones no covalentes que los ligandos
efectan al unirse al dendrmero, esto permite identificar los grupos funcionales del dendrmero
que contribuyen principalmente a una mayor afinidad por el ligando, o bien identificar los
grupos funcionales del ligando que contienen mayor afinidad por el dendrmero (Figura 3).
Adicionalmente, a partir de estas observaciones se puede hacer un diseo racional y en
consecuencia identificar qu tipo de dendrmeros son los mejores candidatos para ser
nanoacarreadores de ligandos con ncleos qumicos especficos. O bien cuales ligandos, se
encapsulan mejor en cierto tipo de dendrmeros.
dendrmero con ncleos ricos en cadenas alifticas, mientras que aquellos ms hidroflicos
tendrn ms afinidad por las superficies de los dendrimeros, que generalmente son de carcter
hidroflico por su componente rico en heterotomos (N, O, S). Esto permite tener sistemas que
sean ms solubles en medio acuoso, pero que tambin puedan ser capaces de pasar membranas
lpidicas. Las simulaciones virtuales permiten describir interacciones dendrmero-frmaco en
medio acuoso a diferentes pH, lo que permite explorar e identificar las mejores condiciones para
facilitar el encapsulamiento de frmacos, pptido y otras biomolculas as como determinar la
estabilidad del complejo, todo en funcin de la energa libre de Gibbs, la cual debe de resultar
negativa (exergnica) resultante del complejo, donde valores ms negativos indican una mayor
afinidad y en consecuencia una mayor estabilidad (30).
Los complejos dendrmero-pptido tienen potencial uso como nanovacunas (32) al emplear
dendrmeros adyuvantes, al mismo tiempo los dendrmeros pueden liberar el pptido en el
interior de las clulas presentadoras de antgenos (CPA), pero antes de que esto ocurra, el
dendrimero es capaz de mantener protegido al pptido del ataque de las proteasas. Los
ESTUDIOS IN SILICO PARA EL DISEO DE DENDRIPLEXES 95
Sin embargo, la pregunta sera, como identificar los pptidos inmunognicos?, para lo que en
el siguiente apartado se describir brevemente este proceso utilizando herramientas in silico.
Tabla 1. Criterios utilizados para la seleccin de epitopes (Tesis de Paola Kinara Reyes)
*= Prediccin de epitopes inmunognicos considerando servidores en lnea
98 CAPTULO 7
Considerando que un pptido en principio puede tener grados de afinidad variable para distintos
alelos MHC, es deseable seleccionar aquellos pptidos que puedan ser reconocidos con alta
afinidad por la mayor cantidad de alelos MHC reportados. Esta condicin se conoce como
promiscuidad inmunolgica. De esta manera se asegura que el pptido tenga una alta cobertura,
es decir una alta capacidad de proteger al mayor nmero posible de individuos dentro de la
poblacin.
Por otro lado, debido a la variabilidad gentica dentro de una poblacin de patgenos, es usual
que un pptido en particular puede estar presente en una variante gentica, pero ausente o
alterado en otras variantes. Para asegurar que la vacuna proteja contra la mayor cantidad de
variantes genticas de un patgeno, es necesario seleccionar aquellos pptidos que estn
altamente conservados dentro de la poblacin de patgenos.
En cada especie, existe una gran diversidad de MHC, los cuales se agrupan en diferentes
haplotipos (Tesis Gema Lizeth Ramrez). Las herramientas inmunoinformticas se han
desarrollado mayormente para predecir afinidad hacia haplotipos de MHC. Esto permite
seleccionar eptopes potenciales para un margen de poblacin limitada o ms amplia.
Estas herramientas inmunoinformticas ayudan a determinar porciones inmunognicas de
protenas con caractersticas particulares que incrementan la probabilidad de que sean
protectoras.
Con el fin de validar los hallazgos por las tncicas inmunoinformticas mencionadas, estos
pptidos son sometidos a estudios de acoplamiento molecular sobre los MHC I/II (Figura 6), para
estimar la geometra de la unin y el nivel de afinidad (32).
Una aproximacin de este tipo, lo constituye la simulacin por dinmica molecular, la cual
permite estimar la energa libre de unin y la estabilidad pptido-CPH (32-34). Los estudios de
dinmica molecular han permitido obtener clculos de energa de complejos CPH-II-epitopes,
identificando la contribucin de cada uno de los pockets del CPH-II (P1-P11) lo que permite
explorar el reconocimiento y estabilizacin del complejo, este proceso de reconocimiento es
crucial durante la presentacin del antgeno (eptopo peptdico) a linfocitos TCD4 y para la
seleccin de eptopes candidatos a vacunas. Los estudios de dinmica molecular se pueden
ESTUDIOS IN SILICO PARA EL DISEO DE DENDRIPLEXES 99
crucial durante la presentacin del antgeno (eptopo peptdico) a linfocitos TCD4 y para la
seleccin de eptopes candidatos a vacunas. Los estudios de dinmica molecular se pueden
hacer empleando modelos 3D obtenidos de los CPHs de bases de datos de protenas
previamente cristalizadas y sometidas a estudios de difraccin de rayos X "Protein Data Bank".
Sin embargo, la protena como modelo 3D es una estructura rgida, por lo que para poder
entender su funcionamiento a nivel estructural, y relacionar esta informacin estructural con la
actividad biolgica, la simulacin de dinmica molecular permite que la protena adquiera
movilidad, emulando las condiciones experimentales (pH, temperatura, concentracin de sales,
etc). Esto permite explorar mltiples conformaciones de la protena. Sin embargo, cuando las
protenas de estudio son protenas integrales de membrana, estudiar solo la parte soluble en
agua puede llevar a falta de los efectos propios del entorno, determinante de sus cambios
conformacionales, que pueden ser importantes para estabilizar los complejos protena ligando.
En este sentido el CPH-II, es una protena que tiene una regin embebida en una membrana
lipdica y una regin hidro-soluble expuesta en la cara extracelular de la clula presentadora de
antgeno (33). Afortunadamente, las simulaciones de dinmica molecular pueden hacerse con
el modelo 3D de la protena sin membrana, y adems un modelo 3D empleando la membrana
biolgica, lo que genera datos ms cercanos a lo experimental. Esto ltimo se logra al simular la
protena completa con la cadena pesada embebida en una membrana biolgica (33). Los
resultados han mostrado una mayor estabilidad en el complejo CPH-II-pptido cuando se
emplea el CPH-II, con sus cadenas pesadas embebidas en la membrana lipdica en comparacin
al modelo 3D de CPH-II de la fraccin soluble y sin membrana.
Previo a la simulacin del complejo CPH-II-membrana-eptopo peptdico, es necesario realizar
estudios de acoplamiento molcular protena-protena empleando servidores online, en este
sentido el ms empleado en la literatura es CLUSPRO (https://cluspro.bu.edu). Para realizar el
acoplamiento molecular se puede usar el receptor (CPH-II), como una molcula rgida, mientras
que el ligando (epitope peptdico) se mantiene flexible, permitiendo explorar la unin de
diferentes confrmeros del eptopo peptdico en el CPH-II, y seleccionar el pptido que se une
con mayor afinidad al CPH-II. Sin embargo, para tener ms variables apegadas a la naturaleza,
se puede emplear el blanco en diferentes conformaciones (Figura 7).
La unin del pptido no es arbitraria, depende de las superficies accesibles al solvente y de las
interacciones no covalentes de los grupos funcionales de las cadenas laterales, de los
100 CAPTULO 7
Gibbs, donde valores ms negativos indican una mayor afinidad y estabilidad del complejo
eptopo peptdico-MHC-II (33). El acoplamiento molecular es un estudio que permite determinar
la afinidad y estabilidad de un complejo ligando-receptor. Es solo una primera aproximacin de
afinidad y estabilidad, esto es debido a que durante el acoplamiento, el receptor (CPH-II) se
mantuvo rgido y en un espacio sin disolvente, el motivo de hacer estas omisiones fue para
disminuir el gasto computacional y el tiempo de simulacin. Para refinar el valor de la diferencia
de energa libre de Gibbs y obtener un valor ms cercano a la realidad sobre la estabilidad del
complejo epitope-peptdico. Para esto es necesario simular todo el complejo de forma flexible,
rodeado de molculas de disolvente. Las simulaciones se hacen a diferentes intervalos de
tiempo dependiendo que se quiere estudiar. Para estudiar las conformaciones de una protena
(excluyendo estudios de desnaturalizacin o de folding) las simulaciones se realizan en
intervalos de nanosegundos.
En resumen, las propiedades qumico-estructurales de regiones inmunognicas de protenas
(eptopes) y su posible encapsulacin en dendrmeros se puede guiar a travs del uso de
herramientas in silico. Este tipo de abordaje permite determinar qu caractersticas
fisicoqumicas deben de tener los dendrmeros para acarrear frmacos o pptidos, esto a travs
de sus correspondientes modelos en tercera dimensin (3D). De esta forma, se pueden hacer
dendriplexes (complejos pptido-dendrmeros) con posible uso como nanovacunas de una
forma eficiente y robusta. Por otro lado, a travs de los estudios in silico se pueden identificar
regiones inmunognicas de protenas, que sean conservadas, que estn expuestas en la
superficie de los microorganismos y que sean capaces de acoplarse a los complejos principales
de histocompatibilidad. Adicionalmente, por estudios in silico se pueden estudiar las formas y
re-arreglos conformacionales, hacer estudios de acoplamiento molecular pptido-dendrmeros
y luego estudios de dinmica molecular. De esta manera se determina, cuntos pptidos pueden
ser acarreados por un dendrmero, liberados bajo ciertas condiciones y adems de determinar
si este dendriplex es estable en condiciones fisiolgicas. Una vez efectuado esto, se identifican
los ms promisorios para despus conducir a su sntesis y caracterizacin qumica.
En conclusin, las herramientas computacionales e inmunoinformticas, ayudan a identificar
regiones potencialmente inmunognicas de protenas de microorganismos patgenos, lo cual
puede ser de ayuda en el inmunodiagnstico y en el desarrollo de vacunas. Estas herramientas
traen consigo un considerable ahorro de tiempo y recurso, con un porcentaje de xito alto.
Con los estudios in silico es posible disear y desarrollar dendriplexes para diseo de
nanovacunas, primero identificando regiones inmunognicas de pptidos de protenas blanco y
posteriormente hacer los complejos pptido-dendrmero.
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ESTUDIOS DE LA INTERACCIN PPTIDO-DENDRMERO A TRAVS DE
SIMULACIONES COMPUTACIONALES 103
CAPTULO 8
ESTUDIOS DE LA INTERACCIN PPTIDO-DENDRMERO A TRAVS DE
SIMULACIONES COMPUTACIONALES
1. Universidad Andres Bello, Facultad de Biologa, Center for Bioinformatics and Integrative Biology
(CBIB), Av. Repblica 239, Santiago, Chile
1. INTRODUCCIN
permite modular finamente la eficiencia con la que se libera un pptido en un sistema biolgico
complejo. Es as que, para poder comprender a nivel molecular estas interacciones se utiliza el
mtodo de DM, que es el nico mtodo de qumica computacional capaz de tratar al dendrmero
en un medio acuoso explcito, con la resolucin espacial y temporal requeridas para visualizar
en detalle las interacciones entre los polmeros esfricos y los pptidos.
Actualmente, se han desarrollado diversas aproximaciones computacionales para el estudio de
los fenmenos a escala molecular que ocurren en sistemas compuestos por dendrmeros y
diferentes molculas (3), los cuales dependen del tamao del sistema, el tiempo de simulacin
y las capacidades de cmputo disponibles. Sin embargo, algunas de estas tcnicas son difciles
de implementar, por lo tanto existen muy pocos estudios tericos relevantes en el rea de
simulacin molecular de complejos dendrmero-pptido, y gran parte de los estudios
computacionales dedicados a este tipo de sistemas involucran al dendrmero PAMAM de
poliamidoamina.
Estudios de modelado molecular conducidos por diferentes grupos han contribuido a entender
los principales mecanismos de encapsulacin y liberacin de frmacos generando un gran
inters (4). Estos estudios han evidenciado una eficiente interaccin de dendrmeros con
frmacos, molculas pequeas, DNA y quantum dots (Figura 1).
Para tal efecto, se construy el modelo molecular del dendrmero PAMAM-OH, dividiendo los
dendrmeros en tres partes: el core de etilendiamina, los dendrones internos de amidoamina y
los grupos hidroxilos terminales. Cada seccin fue parametrizada separadamente, utilizando el
campo de fuerza general de CHARMM (C. Genff) (12) y la plataforma PARAMCHEM (13). Los
componentes se conectaron para formar un dendrmero completo mediante scripts elaborados
por nuestro grupo. Mientras, el modelo molecular de Ang-(1-7), secuencia DRVYIH, se obtuvo
usando la herramienta Molefacture Protein Builder del software Visual Molecular Dynamics
(VMD) (14). La topologa, parmetros y cargas del pptido, se obtuvieron desde el campo de
fuerza de protenas CHARMM27 (15).
Cada estructura fue situada separadamente en una caja de agua TIP3P (16) y luego sometida a
una minimizacin de energa usando el software NAMD (11) y el algoritmo de gradientes
conjugados hasta lograr una convergencia. Subsecuentemente, ambos sistemas fueron
equilibrados mediante simulaciones MD para obtener una estructura relajada.
Posteriormente, se llevaron a cabo simulaciones de docking molecular usando la herramienta
AutoDock4.2 (17) para obtener el complejo dendrmero-pptido. Las cargas parciales fueron
asignadas usando el campo de fuerza CHARMM. De este modo, tres pptidos Ang-(1-7) fueron
acoplados por separado en el interior de las cavidades del dendrmero. El complejo dendrmero-
pptido fue inserto en una caja de agua TIP3P con una concentracin de sal de 150 mM de NaCl
para simular las condiciones fisiolgicas. Se llev a cabo una etapa de minimizacin de energa
del sistema y luego una dinmica molecular por 60 ns de tiempo para estudiar el
comportamiento molecular y las interacciones entre el dendrmero neutro y el pptido Ang-(1-
7). A partir de los resultados tericos y experimentales, se determin que el dendrmero es capaz
de proteger al pptido y mejorar sus funciones biolgicas in vivo (figura 3).
De esta forma, se puede observar que diferentes estrategias de simulacin pueden conducir a
entender el comportamiento molecular de diferentes complejos de dendrmeros, a travs del
uso de tcnicas computacionales que permiten un exhaustivo muestreo conformacional y de un
anlisis estadstico de las principales interacciones que guan este proceso, adems de las
propiedades energticas que controlan los procesos de ensamblaje entre dendrmeros y
pptidos.
106 CAPTULO 8
Figura 3. Representacin del complejo dendrmer-pptido a (A) 0 ns, (B) 30 ns, y (C) 60 ns de simulacin,
sealando la forma del dendrmero y localizacin de Ang-(1-7) en las cavidades de la superficie del
dendrmero. (Los pptidos se representan en celeste, y el dendrmero en verde)
ESTUDIOS DE LA INTERACCIN PPTIDO-DENDRMERO A TRAVS DE
SIMULACIONES COMPUTACIONALES 107
La tcnica de docking molecular ha sido ampliamente usada en protenas para acoplar diferentes
ligandos en un sitio especfico, permitiendo determinar su modo de unin. En las ltimas
dcadas, el nmero de publicaciones relacionadas a docking ha aumentado considerablemente.
Sin embargo, dependiendo del problema, existen muchas variables a considerar para obtener
un buen resultado de docking.
Los orgenes del docking vienen del concepto llave y cerradura utilizado en el diseo racional
de frmacos. De este modo, dependiendo del software que se va a utilizar es diferente el
algoritmo que se aplicar para resolver el problema (18).
Los programas de docking ms utilizados son AutoDock (17), GOLD (19) y GLIDE (20), debido a
que son de libre acceso y ms conocidos.
Los programas de docking difieren no slo en el algoritmo que utilizan para obtener un modo
de unin llave-cerradura, sino tambin en la funcin de puntuacin que utilizan, lo que lleva a
obtener distintos valores de afinidad de unin ligando-receptor.
Para comenzar el docking molecular es necesario contar con dos estructuras moleculares:
ligando y receptor. Si estas estructuras no estn disponibles en alguna base de datos para su
descarga en formato PDB, MOL2 o SDF, se deben modelar mediante herramientas
computacionales y luego validar a travs de mtodos de simulacin molecular. Una vez que las
estructuras se encuentran optimizadas desde el punto de vista energtico, se lleva a cabo el
proceso del docking, donde se deben tomar en consideracin las siguientes variables:
A la fecha, las simulaciones all-atom a gran escala pueden involucrar hasta millones de tomos
de sistemas tan complejos como la cpside de un virus (22). Se han realizado una amplia
variedad de estudios de este tipo, siendo el grupo de Goddard uno de los primeros en
caracterizar dendrmeros PAMAM de generacin 1 a 11 mediante dinmica molecular y el
campo de fuerza Dreiding (23). Varios estudios subsecuentes de Maiti y col. (24,25) y Pavan y
col. (26-28) han caracterizado la interaccin de dendrimeros PAMAM con cidos nucleicos,
especialmente siRNA, utilizando el campo de fuerza AMBER.
Investigar las propiedades dinmicas y energticas de unin entre un dendrmero y una o ms
molculas husped en un solvente explcito, puede tomar del orden de cientos de
nanosegundos, lo cual, en general, permite un adecuado muestreo conformacional de estos
sistemas (29,30).
En base a lo anterior, es indispensable contar con un campo de fuerza para realizar una dinmica
molecular, el cual describa apropiadamente la energa potencial de un sistema atmico.
Los mtodos de campo de fuerza ignoran los movimientos de los electrones y calculan la energa
de un sistema slo como funcin de las posiciones de los ncleos. Por lo tanto, los mtodos de
campo de fuerza (o mecnica molecular) son usados reiteradamente en sistemas con un gran
nmero de tomos y a la vez, inapropiados si se desea estudiar propiedades que dependen de
la distribucin de electrones en una molcula.
Un campo de fuerza debe considerar, al menos, los parmetros enlazantes de potenciales de
enlace, ngulos y diedros, y las interacciones no enlazantes de atraccin y repulsin de Lennard-
Jones y electrostticas de Coulomb, las cuales han sido definidas para molculas orgnicas,
protenas, cidos nucleicos, lpidos y carbohidratos.
Existen varios campos de fuerza que pueden ser adaptados para el estudio de dendrmeros en
solucin mediante dinmica molecular, entre los que destacan CHARMM, AMBER, CVFF, OPLS-
AA, Dreiding y GROMACS (29,3135). Adems, se han creado iniciativas que han contribuido a
la fabricacin de modelos moleculares de diferentes generaciones de dendrmeros PAMAM,
como el "Dendrimer Building Toolkit" desarrollado por Maingi y col. (36).
Cuando un campo de fuerza no tiene los parmetros de una molcula de inters, nos vemos
enfrentados a una problemtica limitante. La parametrizacin, permite determinar mediante
clculos tericos los parmetros de interaccin adecuados dentro de un sistema molecular. Por
lo tanto, se han desarrollado diferentes plataformas web para asignar directamente los
parmetros desde molculas existentes o fragmentos moleculares, los cuales se encuentran
depositados en una base de datos de compuestos parametrizados previamente por un campo
de fuerza especfico. Entre las plataformas ms conocidas se encuentran Param Chem (13) y
MATCH (37), para el campo de fuerza CHARMM, y PRODRG (38) y "Constructor de Topologa
Automatizado" (39), para el campo de fuerza GROMOS.
Sin embargo, existen fragmentos moleculares que no se encuentran parametrizados en las bases
de datos, por lo tanto se han desarrollado programas que permiten la construccin de los
parmetros a partir de clculos de mecnica cuntica (QM) tales como Antechamber (40) o
Force Field Toolkitde VMD.
Las molculas que exceden el nmero mximo de tomos permitidos por las aplicaciones web
o programas, tales como polmeros o dendrmeros, pueden ser divididos en fragmentos. Cada
fragmento representa una unidad repetitiva dentro de la molcula, por lo tanto, cada seccin
es parametrizada separadamente. Posteriormente, cada parte es conectada de tal modo que
forma la molcula completa.
ESTUDIOS DE LA INTERACCIN PPTIDO-DENDRMERO A TRAVS DE
SIMULACIONES COMPUTACIONALES 109
Primera Ley de Newton o ley de la inercia: sostiene que en ausencia de fuerzas externas,
todo cuerpo continuar en estado de reposo o de movimiento rectilneo uniforme a
menos que acte sobre l una fuerza que le obligue a cambiar dicho estado.
siendo m y r la masa y la posicin de la partcula . La fuerza que acta sobre dicha partcula
est dada por el inverso aditivo del gradiente de potencial U(rN), donde rN = (r1, r2,...N)
representa el set completo de coordenadas atmicas 3N. La energa potencial est representada
por un campo de fuerza. Al estar todos los tomos del sistema de forma explcita, no hay que
tratar con fuerzas aleatorias o de friccin, simplificando la integracin de la ecuacin anterior.
Para permitir efectos de superficie en los lmites de un sistema de simulacin, a menudo se
utilizan condiciones peridicas de borde y as se evitan los artefactos en la superficie. De este
modo, si una molcula se escapa de un lado de la caja aparece en el otro borde extremo y se
mantiene el nmero de tomos del sistema. A su vez, este tipo de simulaciones permite calcular
interacciones electrostticas de amplio rango utilizando el mtodo Particle Mesh Ewald (PME),
que es un mtodo numrico rpido para el clculo de la suma de Ewald.
En dinmica molecular, el integrador es un sistema Hamiltoniano, que corresponde a la suma
de los trminos cintico y potencial. De este modo, existen varios mtodos para realizar la
integracin numrica de las ecuaciones de movimiento de Newton paso por paso. Conocindose
las posiciones y velocidades de las partculas en el tiempo t y las posiciones del paso anterior t -
t, es posible calcular sus valores al tiempo t + t, utilizando el algoritmo de Verlet, ya sea
mediante el mtodo original o el de leapfrog.
El tamao del paso de integracin t es importante, pues si es muy pequeo puede cubrir una
regin pequea del espacio-fase, pero implica un alto costo computacional. Si el paso de
integracin es demasiado grande, pueden ocurrir inestabilidades y la trayectoria obtenida ser
muy diferente a la real.
Mediante Langevin Dynamics, es posible representar un acoplamiento del sistema a un bao de
calor y por lo tanto, provee un medio para mantener y controlar la temperatura.
Las simulaciones que utilizan el ensemble NPT (nmero de partculas, presin y temperatura
constante) requieren condiciones peridicas de borde. La presin es controlada ajustando
110 CAPTULO 8
Esta estrategia de simulacin de grano grueso se utiliza para observar fenmenos moleculares
a gran escala de tiempo o si el nmero de tomos del sistema excede los lmites
computacionales a disposicin. Comnmente, este mtodo es efectivo para obtener
informacin estructural del auto-ensamblaje de complejos dendrmero-husped, ya que se
reduce el grado de libertad y se puede llegar a tamaos y escalas de tiempo mucho ms grandes
(44), sin embargo, este mtodo no ha sido ampliamente explorado.
Este mtodo se puede ver como una reduccin de la informacin (estructural e interacciones)
de escala atomstica a un modelo de baja resolucin que mantiene las principales caractersticas
fsicas del sistema de inters pero de una forma simplificada.
Una de las ventajas de estas simulaciones es que se puede extraer informacin relevante a partir
de la simulacin, sobre las propiedades macroscpicas que gobiernan la fsica de los modelos
moleculares. Mientras que su gran desventaja, es que no permite observar las interacciones
intermoleculares tales como puentes de hidrgeno o puentes salinos.
Para conservar la fidelidad qumica de las molculas en las simulaciones, se debe asignar un
campo de fuerza, siendo MARTINI el ms empleado para sistemas biolgicos (45), el cual a partir
de una molcula definida y de sus coordenadas determina la posicin de la esfera de acuerdo a
los tomos pesados que agrupa en un mismo conjunto y de esta forma cada esfera representa
las propiedades qumicas de los tomos agrupados.
En los modelos de grano grueso MARTINI existen 18 tipos distintos de esferas estndar (ms
otras 18 para anillos) clasificados de acuerdo a sus cargas e hidrofobicidad. Cada seccin de una
macromolcula es asignada a una esfera con un tipo que corresponde a las propiedades de dicha
seccin. Para encontrar un modelo coarse-grained exacto, los modelos deben ser validados
comparndolos con modelos all-atom. Los descriptores que se pueden comparar entre los
modelos son el radio de giro (Rg) y energa libre de solvatacin e interaccin.
De este modo, coarse-grained es un mtodo que proporciona un gran paso en el modelado
molecular y simulacin de sistemas complejos reales y a su vez, genera una relacin entre las
interacciones atomsticas (altamente detalladas) y el promedio de los descriptores
termodinmicos.
Modelos coarse-grained del dendrmero de poliamidoamina (PAMAM) han sido desarrollados
primeramente por Lee and Larson (46) para estudiar la formacin de poros en membranas DPPC,
utilizando agua explcita bajo la filosofa MARTINI. En el mismo artculo, se estudiaron
dendrmeros con diferentes grados de acetilacin, mostrando que aquellos que conservaban un
ESTUDIOS DE LA INTERACCIN PPTIDO-DENDRMERO A TRAVS DE
SIMULACIONES COMPUTACIONALES 111
mayor nmero de cargas positivas eran ms propensos a formar poros en la membrana. Estudios
posteriores del mismo grupo mostraron una comparacin entre dendrmeros nativos,
acetilados y otros conjugados con polietilenglicol (PEG) en la capacidad de permeabilizar
membranas (47). El impacto de la funcionalizacin de dendrmeros con aminocidos como
arginina e histidina, a pH cido y neutro, tambin fue estudiado con este tipo de mtodos
coarse-grained (48). Este tipo de mtodos tambin se ha empleado para estudiar el auto-
ensamblaje de dendrmeros de naturaleza anfiflica (49,50). Nuestro grupo ha desarrollado
recientemente un estudio acerca de cmo estos dendrmeros son capaces de formar micelas y
como la generacin y la cola alqulica afectan el tamao y la forma de estos agregados, as como
tambin su interaccin con RNA pequeo de interferencia (siRNA) (51).
Utilizando simulaciones de dinmica molecular "coarse-grained", se ha estudiado la capacidad
de pptidos anfiflicos para formar auto-ensamblados en agua. En dos de estos estudios,
realizados por Thota y col. (52,53), se ha considerado el campo de fuerza MARTINI para simular
un pptido FA32, compuesto de 32 aminocidos, y derivados del mismo. En este tipo de
simulaciones, se pueden explorar grandes escalas de tiempo, y as se realizaron dinmicas de 5
s de duracin, en las cuales se observ que los pptidos forman micelas. Aminocidos
hidrofbicos como Ala y Phe permanecieron en el ncleo hidrofbico, mientras que Lys se
mantuvo en la parte ms externa de la micela e His en la interfaz core-superficie. El proceso de
autoensamblaje fue analizado en trminos de nmero de clusters, radio de la micela, ncleo y
cscara, y perfiles de densidad de los residuos.
Estos mtodos proporcionan una atractiva herramienta para analizar la energa libre de unin
de un sistema simulado en solucin. Se han utilizado diferentes mtodos para determinar la
energa libre de unin entre un dendrmero y diferentes molculas cargo, tales como el mtodo
MM-GBSA, PMF y ABF.
1
= 1
2
cavidad solvente-solvente y los trminos de interaccin atractiva de van der Waals solvente-
soluto (58), cuya suma es proporcional al rea de superficie accesible al solvente (SA) de la
molcula soluto, con un trmino de tensin superficial como factor de escalamiento lineal (5).
El mtodo MM-GBSA, es econmico en trminos de cmputo y riguroso al comparar el estado
del complejo en la obtencin de la energa libre de unin. Difiere con el mtodo MM-PBSA en
que se utiliza la solucin numrica de la ecuacin de Poisson-Boltzmann en lugar del formalismo
Born generalizado (59).
La energa libre de unin se calcula usando la tcnica MM-GBSA a travs de la siguiente ecuacin
(60):
=
= + +
Donde g(r) corresponde a la funcin de distribucin radial entre las dos partculas.
Ahora bien, teniendo en consideracin que el trmino PMF se ha ampliado al uso de
coordenadas de reaccin mucho ms complejas, se ha determinado una ecuacin generalizada
para una coordenada de reaccin . De este modo, la relacin entre la energa libre y la funcin
ESTUDIOS DE LA INTERACCIN PPTIDO-DENDRMERO A TRAVS DE
SIMULACIONES COMPUTACIONALES 113
(1 ) (0 ) =
Es posible calcular dA/d reconociendo que es, en efecto, igual al siguiente promedio estadstico:
=
Donde el subndice indica que el promedio es calculado para un valor fijo de en un punto
determinado. Este promedio corresponde a una fuerza generalizada actuando en la coordenada
de reaccin , entendindose que no es una partcula y la fuerza que acta en l no es real.
Para calcular dA/d, es necesario evaluar derivadas parciales tales como H/, la cual estima la
razn entre el cambio energtico y el parmetro de orden. Es necesario para ello definir
coordenadas generalizadas de la forma (, q1,..., qN-1). Este tipo de coordenadas son necesarias
para establecer las posiciones de todos los tomos participantes (62).
En 2014, Mandal y col. (63) calcularon el potencial de fuerza media entre dos dendrmeros
PAMAM G4, uno protonado y otro no-protonado. Como coordenada de reaccin utilizaron la
distancia entre los centros de masa de los dendrmeros. La distancia entre los centros de masa
fue restringida mediante un potencial armnico. El muestreo de la interaccin entre los
dendrmeros se realiz sobre 50-70 ventanas igualmente espaciadas, con un equilibrado de 1-2
ns cada una. Las estructuras resultantes por cada ventana fueron usadas como punto de partida
para las siguientes. De este modo, se observ un mnimo global en el perfil del PMF de los
dendrmeros no-protonados, que representa la naturaleza de atraccin en la interaccin de
estos dendrmeros, mientras que la interaccin de los dendrmeros protonados es repulsiva.
El patrn de liberacin de cuatro drogas: cido saliclico y L-alanina, de naturaleza soluble, y
fenilbutazona y primidona, insoluble, a partir del dendrmero PAMAM G5 fue estudiado a travs
de un potencial de fuerza media (PMF) utilizando el mtodo de umbrellas ampling y el campo
de fuerza AMBER, a pH neutro y bsico. Mediante estos anlisis, fue posible determinar que las
drogas solubles son liberadas con mayor facilidad que las drogas insolubles (64). "Umbrellas
ampling" tambin ha sido ocupado para estudiar la adsorcin de dendrmeros PAMAM en
membranas POPC y POPG (65).
114 CAPTULO 8
() () 1 ln||
= =
Donde V(x) corresponde a la funcin de energa potencial del sistema, mientras denota al
determinante del Jacobiano para la transformacin de coordenadas Cartesianas a generalizadas
del set de coordenadas x, dado que ste y el parmetro de orden no son variables
independientes.
En tanto avanza una simulacin de dinmica molecular, la fuerza instantnea actuando sobre el
parmetro de orden se acumula en bins o cajas pequeas de tamao , para finalmente proveer
una estimacin de la derivada dA/d. A medida que ocurre el muestreo en el espacio de fase, el
valor estimado para dA/d se va refinando de manera progresiva.
Si esta fuerza media fuese removida del sistema, sera posible obtener un muestreo uniforme a
lo largo del parmetro de orden . El mtodo ABF efecta esta labor adicionando una fuerza de
sesgo externa, opuesta a la que est actuando en . Esta fuerza de sesgo FABF, es igual a dA / d
(70). El resultado de la aplicacin de este sesgo es que no existe fuerza promedio actuando
en y como consecuencia, el paisaje energtico se aplana, y de esta forma, el sistema logra
propagarse nicamente gracias a sus propiedades de difusin.
Una de las razones que permite a ABF lograr la convergencia ms rpido que otras tcnicas es
que al contrario de lo que sucede en simulaciones restringidas, el sistema es capaz de
evolucionar libremente y explorar todos los estados entre A y B, con igual probabilidad (62). Las
simulaciones restringidas no permiten un muestreo eficiente de la coordenada de reaccin y
por lo general, se quedan atrapadas en las barreras energticas existentes entre los estados A y
B.
Al contrario de otros mtodos, como umbrella sampling, ABF no requiere un conocimiento
previo del potencial de sesgo. La fuerza de sesgo es estimada localmente a partir de las
conformaciones muestreadas del sistema, y actualizada continuamente mientras la simulacin
progresa. Es decir, el sesgo es aplicado tan pronto como se han recogido suficientes muestras
en un determinado bin (o subdivisiones de una ventana). Umbrella sampling, por su parte,
requiere el conocimiento de la funcin de densidad de probabilidad a travs del rango completo
de .
La eficiencia del clculo de energa libre otorgado por ABF depende de una adecuada eleccin
de la coordenada de reaccin, capaz de garantizar el muestreo de todos los grados de libertad,
ya sea utilizando uno o ms parmetros de orden, y as alcanzar rpidamente la convergencia
del clculo (70).
Es importante verificar la convergencia del clculo de ABF, y para ello pueden considerarse tres
criterios. El primero dice relacin con la uniformidad del muestreo. El mtodo ABF por definicin
asegura que cada punto del espacio de fase debe ser muestreado con igual probabilidad, y por
ello es indispensable que el nmero de muestras por bin sea similar para cada una de dichas
sub-ventanas.
ESTUDIOS DE LA INTERACCIN PPTIDO-DENDRMERO A TRAVS DE
SIMULACIONES COMPUTACIONALES 115
El segundo criterio trata de la verificacin del perfil de energa. En un clculo que ha alcanzado
la convergencia, el perfil energtico no debera cambiar de un nanosegundo a otro.
Por ltimo, el tercer criterio indica la verificacin de la continuidad de los perfiles de fuerza. La
fuerza es una funcin continua de , y por ello en un clculo convergido los perfiles de fuerza
deben ajustarse entre ventanas.
Este mtodo ha sido utilizado para estudiar la interaccin del dendrmero PAMAM G3 con cido
nicotnico, mostrando que a un pH neutro la interaccin con la droga es ms favorecida que a
pH cido, lo cual puede favorecer la liberacin de la droga en un medio cido como el del
estmago.
Como conclusiones, diferentes estrategias de simulacin molecular permiten comprender el
comportamiento molecular de un complejo formado por dendrmeros, mediante el uso de
tcnicas computacionales, las cuales realizan un muestreo conformacional y estadstico de las
principales interacciones que gobiernan la unin entre molculas o describen procesos de
ensamblaje.
Actualmente, diversos grupos de investigacin integran diferentes tcnicas de simulacin
molecular en sus estudios de interaccin dendrmero-frmaco, obteniendo muy buenos
resultados comparados a los datos experimentales. Sin embargo, hasta ahora no hay estudios
de interaccin molecular dendrmero-pptido mediante simulacin molecular, lo cual se
transforma en un potencial nicho de estudio.
Las diferentes tcnicas de simulacin molecular nos permiten estudiar diferentes problemticas
dependiendo del sistema en estudio y las capacidades de cmputo disponible. De esta forma, si
se quiere estudiar la forma de unin de un compuesto en una molcula o la zona donde se une,
se puede utilizar el mtodo de Acoplamiento Molecular. Si se quiere determinar las
interacciones intermoleculares entre las molculas y cmo estas interacciones cambian a travs
del tiempo se usa el mtodo de Dinmica Molecular all-atom. Y finalmente, si se quiere evaluar
la interaccin entre mltiples nanopartculas u observar cmo estas molculas se
autoensamblan a escalas de tiempo considerablemente altas, puede considerarse el mtodo de
simulacin molecular de Grano Grueso o coarse-grained.
La novedad de estas tcnicas ha permitido a la comunidad cientfica generar nuevas
herramientas que permiten estudiar la energa libre de unin entre un dendrmero y diferentes
molculas cargo simuladas en solucin. De este modo, entre los mtodos propuestos para estos
estudios se encuentran MM-GBSA, PMF y ABF.
Es as como el desarrollo de estas tcnicas y avance de las nuevas investigaciones permitirn
abrir paso a nuevos estudios enfocados en el descubrimiento de nuevas nanopartculas capaces
de interactuar con diferentes frmacos, cidos nucleicos o pptidos dirigidos hacia nuevas
aplicaciones teraputicas.
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TOXICOLOGA ASOCIADA AL USO DE NANOPARTCULAS 119
CAPTULO 9
TOXICOLOGA ASOCIADA AL USO DE NANOPARTCULAS
1. INTRODUCCIN
Han transcurrido ms de diez aos desde que Oberdrster et al., definieron y perfilaron la
nanotoxicologa como una nueva disciplina encargada del estudio de efectos adversos en los
organismos vivos causados por nanodispositivos y nanoestructuras (1). Ese mismo ao, un grupo
de expertos se pusieron de acuerdo en desarrollar estrategias de estudio para identificar los
riesgos asociados a nanomateriales (2), apuntando que son las propiedades fisicoqumicas de
los mismos, normalmente no incluidas en los estudios de toxicidad, las que configuran sus
posibles propiedades nocivas. Esto ha llevado a que en los ltimos aos se haya propuesto unos
mnimos en la caracterizacin de los nanomateriales con fines de evaluacin de riesgo. Sin
embargo, surge como duda si estamos preparados para adoptar normas internacionales con
fines reguladores, de modo que se siguen proponiendo distintos mtodos para la evaluacin del
riesgo de nanopartculas (NP) (3).
En primer lugar, debemos definir que es una nanopartcula. En relacin al tamao, son aquellas
partculas comprendidas entre 1 y 1000 nm, sin embargo las partculas de menos de 100 nm
tienen mayor riesgo txico, y por ello la FDA considera nanopartcula solo a estas ltimas (4).
Cuanto menor sea el tamao de las nanopartculas <1 m, ms se adhieren y mayor es su punto
de saturacin o solubilidad. Ambos parmetros justifican la definicin de nanopartcula como
aquella comprendida entre 1 y 1000 nm. Sin embargo, aquellas nanopartculas con tamao
superiores a 100 nm solo pueden entrar en la clula y ser nocivas por fagocitosis (macrfagos),
mientras que las nanopartculas de menos de 100 nm son internalizadas por endocitosis por
cualquier clula, con mayor riesgo de toxicidad. Para complicar an ms la situacin, se han
encontrado partculas entre 150 y 500 nm que pueden acceder a la clula va endoctica mediada
por clatrina o caveolina (5). De tal modo que denominar nanopartcula desde el tamao de 100
nm es meramente con fines reguladores.
actividad se ha observado que un pequeo nmero de protenas del suero que incluyen la
apolipoprotena B-100 (ApoB-100), junto con el potencial zeta del nanomaterial recin
sintetizado, son los parmetros que correlacionan la asociacin interaccin nanopartcula-clula
y la entrada celular (55).
fluidos fisiolgicos relevantes (66) y iv) periodos prolongados de tiempo para evaluar la
exposicin crnica (66). En un cultivo 3D, la exposicin celular a NP es dependiente del
transporte de las mismas a travs de la masa celular (65). Adems, cuando se dispersan NP en
fluidos biolgicos, en comparacin con los medios de cultivo, las NP se comportan de modo
diferente con tendencias de aglomeracin, cambia la tasa de disolucin inica, y la
internalizacin celular (66).
Dado que el diseo y sntesis de NP tiene un crecimiento exponencial, es preciso disear
plataformas in vitro de alto rendimiento de evaluacin de citotoxicidad, respuesta a estrs,
respuesta inmunolgica, modulacin en la expresin de genes y protenas, y la caracterizacin
de la interfaz de nano-celular (67-69). Una tecnologa emergente es un chip de microfludos con
cmaras perfundidas que incorporan modelos celulares (70-72). Estos sistemas abordan
aspectos claves tales como la interacciones clula-clula, la introduccin de flujo dinmico, la
adicin de sustratos porosos, y la opcin de incorporar cultivos 3D, por lo que simulan un
entorno fisiolgico ms relevante que el estndar en cultivos in vitro (73,74), lo cual podra
suponer un avance en la evaluacin de la seguridad del uso de NP.
Un efecto no deseado de las NP es el deterioro de las actividades fagocticas. Los SWCNT impiden
la correcta fagocitosis de clulas apoptticas por parte de los macrfagos (79). Observaciones
similares se han hecho para las partculas ultrafinas de carbono, que impediran la fagocitosis
por los macrfagos alveolares humanos (80). Por lo tanto, la inhalacin de NP podra conducir a
una mayor susceptibilidad a patgenos. De hecho, la eliminacin de bacterias se ve retardada
en ratones expuestos a SWCNTs va farngea (81). Los macrfagos expuestos a NP muestran
deterioros en su capacidad para pasar de un estado de activacin M1 a M2, asociado con una
disminucin de la actividad fagoctica (82).
Varios estudios han demostrado que los nanotubos de carbono son susceptibles a la
degradacin por peroxidasas (83). Mieloperoxidasa (MPO) es un componente del sistema
microbicida de los fagocitos, especialmente neutrfilos, y por lo tanto una parte importante de
la respuesta inmune innata. MPO se expresa en neutrfilos humanos primarios y es capaz de
biodegradar SWCNT (84). Las trampas extracelulares producidas por los neutrfilos activados
pueden "capturar" y digerir SWCNT de manera dependiente de MPO (85). Tambin se ha
demostrado en la peroxidasa de eosinfilos (EPO) (86). Los SWCNT tambin pueden ser
degradados en los macrfagos, a travs de una va oxidativa superxido/peroxinitrito (87). Por
lo tanto, las clulas del sistema inmunolgico innato en ratones y en seres humanos son capaces
de degradar no slo microbios, sino tambin los nanomateriales a base de carbono.
detrs de los efectos inflamatorios que se producen a largo plazo asociados con la exposicin de
NP (93,94).
Como conclusiones, la caracterizacin de nanomateriales es una asignatura hasta ahora
pendiente en la evaluacin de la toxicidad. La OCDE ha editado en 2016 una gua que ayude a la
comunidad cientfica estableciendo las tcnicas a emplear dependiendo del tipo de NP que se
vaya autilizar.
http://www.oecd.org/officialdocuments/publicdisplaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(201
6)7&doclanguage=en.
La interaccin de nanomateriales con fluidos biolgicos del lugar de entrada determinan la
composicin de la corona, originando una nueva entidad de la NP que a menudo se ha
infravalorado, pero que es crucial para determinar la toxicidad.
La generacin de NP est en la generacin I, pero es esperable que en un futuro no lejano
lleguemos a alcanzar generacin IV, es decir NP que permitan el diseo molecular de dispositivos
a la carta. Para que la nanotoxicologa evolucione al ritmo previsto es necesario que se
desarrollen plataformas de alto rendimiento que permitan establecer algoritmos de prediccin
de toxicidad y riesgo de exposicin tanto ambiental como humana.
Los macrfagos y otras clulas presentadoras de antgenos como las CD juegan un papel clave
en la liberacin tanto de frmaco frente a enfermedades infecciosas como el VIH donde actan
como reservorio viral como tambin en la liberacin de antigno vacunal capaz de inducir
respuesta productora de anticuerpos neutralizantes.
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130 CAPTULO 10
CAPTULO 10
MTODOS DE ESTUDIO DE TOXICIDAD DE XENOCOMPUESTOS IN VIVO
1. INTRODUCCIN
La experimentacin animal se define como una actividad que tiene como misin evidenciar o
aclarar fenmenos biolgicos sobre especies animales determinadas. La toxicologa descriptiva
recopila informacin toxicolgica mediante la experimentacin con animales. Entre los objetivos
bsicos de los estudios toxicolgicos se encuentra el contribuir al conocimiento de los peligros
o toxicidad intrnseca de las sustancias, los mecanismos moleculares y las dianas biolgicas sobre
las que actan, la diferente susceptibilidad txica de especies, sexos y grupos poblacionales, la
cintica y el metabolismo en los organismos, la sensibilidad y especificidad de los medios
diagnsticos y, finalmente, integrar toda la informacin disponible para estimar el riesgo que
conlleva el uso de dichas sustancias en diferentes aplicaciones, estableciendo niveles de
seguridad en la exposicin a las mismas. En definitiva, los estudios toxicolgicos se ocupan de la
prediccin de las consecuencias no deseadas de la interaccin de los xenobiticos con los seres
vivos.
Un hecho que marc un antes y un despus en los requisitos de seguridad de los medicamentos
recin comercializados fue el desastre de la Talidomida. Este terrible suceso supuso un punto
de inflexin en los requerimientos de seguridad pre-comercializacin, establecidos por las
autoridades sanitarias espaolas para los nuevos medicamentos (1). Dichos estudios, con fines
reguladores, se realizan siguiendo protocolos de ensayo estandarizados y el cumplimento de las
buenas prcticas de laboratorio y de las normativas de proteccin de los animales de
experimentacin (1).
Una evaluacin toxicolgica completa significa que la toxicidad del compuesto debe ser probada
mediante diversos ensayos que, segn su duracin, podramos dividir en:
a) Toxicidad aguda: El objetivo de este tipo de estudio consiste en la completa caracterizacin
de los efectos biolgicos agudos de un compuesto qumico; no slo su letalidad (dosis que causa
la muerte en la especie animal elegida), sino tambin su efecto sobre los rganos diana y los
signos clnicos, as como aportar los datos suficientes para poder identificar el sndrome de
intoxicacin aguda en seres humanos. Estos estudios tambin proporcionan informacin sobre
el clculo de las dosis que se pueden emplear en el estudio de toxicidad por la administracin
repetida en animales. Para este tipo de ensayos se suelen emplear grupos homogneos de
animales que, en una nica toma, reciben dosis crecientes de la sustancia problema,
observndose la sintomatologa y la posible letalidad que aparece como consecuencia de su
accin txica. La seleccin de la dosis inicial se realiza atendiendo a las propiedades fsico-
qumicas de la sustancia, las predicciones de relacin estructura-actividad, los datos existentes
de otras pruebas de toxicidad y el uso previsto de la sustancia.
En este tipo de estudios, los grupos de animales deben ser homogneos por edad, sexo y peso.
Es necesario mantener a todos en un ambiente idntico (desde 5 das antes del ensayo) y
efectuar la administracin en ayunas a la misma hora, para evitar influencias ambientales y/o
de los ritmos circadianos. La observacin de los efectos en los animales nunca sobrepasa a los
MTODOS DE ESTUDIO DE TOXICIDAD DE XENOCOMPUESTOS IN VIVO 131
catorce das. Las especies a utilizar suelen ser el ratn y la rata; pero cuando se desea calcular la
dosis mxima tolerada, tambin se usan conejos, perros y primates (2). Los estudios de toxicidad
aguda permiten establecer una correlacin entre la magnitud del efecto y la dosis administrada;
conocer, de modo estadstico, la dosis capaz de provocar la muerte en el 50% (DL50) de los
animales tratados; indicar las recomendaciones a tener en cuenta en el planteamiento de
aquellos estudios toxicolgicos que requieren una duracin ms prolongada y predecir los
efectos txicos que podran darse en el ser humano.
b) Toxicidad subcrnica: Los estudios de toxicidad subcrnica tienen como objetivo reconocer
y valorar todos aquellos efectos que aparecen como consecuencia de una exposicin peridica
a un compuesto qumico (3,4). Para estos estudios se eligen dos especies animales: ratas o
ratones entre los roedores; perros o monos entre los que no lo son. Los estudios de toxicidad
subcrnica proporcionan informacin sobre: los principales efectos txicos de la sustancia; los
rganos diana implicados; la cintica de biotransformacin del xenobitico; la naturaleza
retardada o acumulativa de los efectos txicos; la posible reversibilidad de los efectos
observados y la dosis a utilizar en los estudios de toxicidad crnica.
c) Toxicidad crnica: Los estudios sobre toxicidad crnica se realizan con el objeto de visualizar
aquellos efectos txicos que aparecen como consecuencia de la administracin diaria de un
compuesto qumico, aunque sea a dosis reducidas, durante un largo periodo de tiempo. Son
ensayos diseados para poner de manifiesto los efectos txicos que tienen un largo tiempo de
latencia, como los efectos cancergenos, o bien son consecuencia de procesos acumulativos. El
periodo de exposicin oscila entre 6 meses y dos aos dependiendo de la va de administracin
y la especie animal empleada. En cuanto a la eleccin de la dosis, la mayora de las disposiciones
reglamentarias exigen que la dosis mxima administrada sea la dosis mxima tolerable (DMT),
que corresponde a la dosis mxima de una sustancia, introducida en el organismo, que no mata
a ninguno de los individuos analizados. Generalmente se investigan una o dos dosis ms,
habitualmente el 25 y el 50% de la DMT (5).
Los estudios de toxicidad crnica determinan la posible carcinognesis, genotoxicidad,
embriotoxicidad, diferentes parmetros bioqumicos y hematolgicos, pruebas de
sensibilizacin y de adicin, fototoxicidad, reacciones alrgicas, etc, as como estudios de
comportamiento y peso de los animales tratados (5). As mismo en ellos se realizan estudios
histopatolgicos de los principales rganos y se determina la localizacin y distribucin del
txico o de sus metabolitos. Estos estudios tambin proporcionan informacin sobre: la latencia
de los efectos txicos; la posible reversibilidad de los efectos observados; la dosis umbral, es
decir, la dosis mxima que no produce efectos txicos, que sirve de base para fijar varios
parmetros importantes como la dosis diaria admisible y los lmites de tolerancia (5).
que sean tolerados por el conejo en una dosis que no exceda 10 mL por Kg inyectados por va
intravenosa en un plazo que no supere los 10 minutos. La prueba debe realizarse en un rea
separada designada exclusivamente para la prueba de pirgenos y en unas condiciones
ambientales similares a aquellas en las que los animales se encuentran para evitar cualquier
perturbacin. Treinta minutos antes de la inyeccin de la dosis de prueba se deber determinar
la temperatura de control de cada conejo. nicamente se deber utilizar como conejos control
aquellos cuyas
Las preparaciones de cromosomas se hacen entonces a partir de las clulas de la mdula sea
recogidas en una solucin hipotnica, se fijan, se extienden sobre un portaobjetos, se tien y se
analizan las clulas en metafase para detectar aberraciones cromosmicas (Figura 2). Cada
grupo tratado y control debe incluir al menos 5 animales analizables cada uno. Las sustancias de
ensayo se administran preferiblemente en una sola toma. Las muestras deben ser tomadas en
dos momentos distintos tras el tratamiento, el primer intervalo de muestreo es de 12-18 horas
despus del tratamiento. Como el tiempo necesario para la absorcin y el metabolismo de la
sustancia de ensayo, as como su efecto sobre la cintica del ciclo celular puede afectar el tiempo
ptimo para la deteccin de aberraciones cromosmicas, se recomienda tomar otra muestra 24
horas despus del tratamiento.
Se deben ensayar no menos de tres concentraciones subtxicas de compuesto, con sus
correspondientes controles negativos y positivos. El ndice mittico se determinar como una
medida de la citotoxicidad en, al menos, 1.000 clulas por animal, en todos los animales tratados
(incluidos los controles positivos) y animales de control negativos sin tratar. Este nmero podra
ser menor si se observan numerosas aberraciones. Dado que los procedimientos de preparacin
de los portaobjetos provocan con frecuencia la rotura de una metafase y la perdida de
cromosomas, las clulas analizadas deben contener un nmero de centrmeros igual a 2n+2
(10).
Hay varios criterios para determinar un resultado positivo: i) un aumento relacionado con la
dosis en el nmero relativo de clulas con aberraciones cromosmicas; ii) un claro aumento en
el nmero de clulas con aberraciones en un grupo de una sola dosis en un solo tiempo de
muestreo; iii) un aumento de la poliploidia que puede indicar que la sustancia de ensayo es
capaz de inducir aberraciones cromosmicas numricas; iv) un aumento de la endorre-
duplicacin que puede indicar que la sustancia de ensayo es capaz de inhibir la progresin del
ciclo celular. Una sustancia de ensayo que no cumple ninguno de los criterios anteriores se
considera no mutagnica en esta prueba. En el caso de necesitar una mayor profundizacin a
nivel molecular acerca del tipo de efecto producido se aplican tcnicas como, por ejemplo, la
134 CAPTULO 10
"fluorescence in situ hybridazation" o FISH que, utilizando sondas moleculares especficas para
determinadas regiones cromosmicas, permite precisar puntos de roturas, regiones frgiles,
etc. No obstante, cuando lo que se est descartando es una posible actividad clastognica
general, no hace falta recurrir a dichas tcnicas.
Los eritrocitos deben estar distribuidos homogneamente, presentando un color rojo los
eritrocitos maduros y un fuerte color azul las formas inmaduras (eritrocitos policromticos). Se
realiza un recuento de 1.000 eritrocitos policromticos por animal para detectar la presencia de
microncleos. Como un control importante, es necesario registrar por separado el nmero de
eritrocitos rojos maduros micronucleados. El resultado se considera positivo cuando se observa
un incremento estadsticamente significativo en el nmero de microncleos encontrados en el
grupo tratado respecto al control negativo (13).
3. ESTUDIOS DE CARCINOGNESIS
4. ESTUDIOS DE EMBRIOTOXICIDAD
Desde el punto de vista de la proteccin de la salud pblica es importante conocer los datos
acerca del comportamiento txico de los compuestos sobre el desarrollo, y para ello se dispone
de diferentes mtodos. Los ensayos con animales de laboratorio para evaluar la toxicidad de los
xenobiticos qumicos sobre la reproduccin se realizan tanto con fines reguladores, para la
comercializacin de medicamentos y otros productos qumicos, como en investigacin para
comprender los mecanismos de toxicidad. La tragedia de la talidomida supuso el verdadero
comienzo del desarrollo de los ensayos de toxicidad de la reproduccin (7).
Los ensayos ms utilizados habitualmente son los siguientes (19): i) test de fertilidad y de
reproduccin que evalan la capacidad reproductiva de hembras y machos (desarrollo de los
gametos, fertilidad, viabilidad pre y post-implantacin, parto y lactancia); ii) test de
teratogenicidad que evalan la viabilidad y morfologa (externa, visceral y esqueltica) del feto
inmediatamente antes del nacimiento y iii) test perinatal que evala la supervivencia postnatal,
morfologa externa y crecimiento.
En cuanto a la especie animal, no existe, a priori, ninguna que sea un modelo ideal para predecir
el riesgo en el ser humano. Hasta el momento, se han utilizado diferentes especies, entre las
que se encuentran ratas, ratones, conejos, cobayas, gatos, perros y monos. En cada caso, se
deber elegir aquella especie animal en la que el compuesto se distribuya, metabolice y
atraviese la placenta de la manera ms similar a como ocurre en la especie humana.
ltimamente se estn utilizando embriones de pez cebra (Danio rerio) (Figura 3), los cuales son
los preferidos para la evaluacin de la seguridad in vivo, ya que presentan varias ventajas que
reducen el nmero de animales a estudiar, la desviacin de los resultados y el perodo de
experimentacin: i) el pez cebra tiene un tamao pequeo, que es adecuado para el cultivo de
alta densidad; ii) el desarrollo del embrin es rpido (72 horas desde la fecundacin); iii) necesita
slo tres meses para alcanzar la madurez sexual; iv) la cantidad de huevos producida es enorme
(300 a 500 por hembra); v) los embriones son transparentes, lo que permite el estudio a tiempo
real de los efectos de las sustancias de estudio sobre el desarrollo embrionario y la adquisicin
directa de imgenes de los fenotipos patolgicos in vivo sin necesidad de biopsia y vi) puede
absorber frmacos de molculas pequeas a travs de smosis. Adicionalmente, las
investigaciones de genmica en pez cebra se desarrollan rpidamente permitiendo un
conocimiento cada vez ms profundo del proceso de desarrollo embrionario, lo que ha llevado
a concluir que la similitud de genes es del 70% entre el hombre y el pez cebra incluyendo
fenotipos genticos y sitios de unin de drogas similares a los de los humanos (20,21).
Los embriones de pez cebra recogidos se exponen por separado y al azar bajo diferentes
soluciones del compuesto a estudiar. Se observan los embriones durante 5 das seguidos sin
cambiar la solucin para determinar correspondientes tasas de mortalidad, malformaciones y
eclosiones. La toxicidad es estimada por los efectos del tratamiento en estudio y la sustancia
MTODOS DE ESTUDIO DE TOXICIDAD DE XENOCOMPUESTOS IN VIVO 137
utilizada como control en el desarrollo de los embriones a travs del microscopio estereoscpico
(Figura 3). Se suelen incluir como efectos letales: coagulacin del huevo, inactivacin de la
gstrula, ausencia de somites, ausencia de movimiento autnomo tras 48 horas desde la
eclosin del huevo, ausencia de eclosin. Como efectos no letales se consideran: baja tasa de
eclosin, la tasa de malformacin, edema pericrdico, malformacin en el eje axial, incapacidad
de inflar la vejiga natatoria, malformacin de la vescula tica, pigmentacin, malformacin
ocular, malformacin de la aleta de la cola, aparicin de una masa en el cuerpo y ausencia de
movimiento autnomo tras 24 horas desde la eclosin del huevo. El porcentaje de mortalidad a
las 96 y 120 horas post-fecundacin y de malformacin a las 120 horas post fecundacin se
calcula segn las siguientes frmulas teniendo en cuenta que el nmero de embriones
malformados incluye todo tipo de malformaciones y muerte (22,23).
% =
% =
5. INMUNOTOXICIDAD
Los xenobiticos pueden causar efectos importantes sobre el sistema inmunitario. La evaluacin
de los efectos de los compuestos qumicos sobre el sistema inmune se puede realizar en dos
fases: a) en una primera fase, se realiza un estudio general de inmunotoxicidad, que se puede
realizar formando parte de los ensayos convencionales de toxicidad, siempre y cuando se incluya
en dichos estudios el anlisis de parmetros de inmunotoxicidad. En este tipo de ensayos los
animales no estn expuestos a antgenos ni se infectan con bacterias o parsitos para ver cmo
funciona su sistema inmune, es decir, no se realizan ensayos funcionales y b) en una segunda
fase, dependiendo de los resultados obtenidos en la primera, se realizaran un conjunto de
ensayos ms especficos y funcionales sobre la funcin inmune utilizando estmulos
inmunognicos frente a los cuales debe responder el sistema inmune.
Formando parte de los estudios generales de toxicidad, para detectar posibles efectos sobre el
sistema inmune, se pueden realizar las siguientes determinaciones (24): i) frmula y recuento
sanguneo; ii) niveles plasmticos de inmunoglobulinas IgM, IgG e IgA; iii) peso y estudio
histolgico de los rganos linfoides: timo, bazo, ndulos linfticos, tejido linfoide, asociado a los
bronquios o al intestino (24); iv) examen morfolgico de la mdula sea; v) estudios de
inmunocitoqumica y citometra de flujo para detectar posibles variaciones en las
subpoblaciones celulares o la presencia de determinados componentes plasmticos, como
inmunoglobulinas en las clulas plasmticas.
Si se obtuvieran resultados que sugirieran dao en el sistema inmune se pasara a realizar tests
funcionales para determinar la inmunidad adquirida humoral como es el anlisis de las clulas
formadoras de placas (CFP) que mide la capacidad del husped para desencadenar una reaccin
por anticuerpos frente a un antgeno especfico, lo cual requiere el concurso coordinado de
varias clulas inmunitarias diferentes: macrfagos, clulas T y clulas B. Por tanto, cualquier
efecto sobre estas clulas puede repercutir intensamente sobre la capacidad de las clulas B
para elaborar anticuerpos dirigidos especficamente contra un antgeno. El anlisis de las CFP se
puede evaluar in vivo usando suero de la sangre perifrica de ratones inmunizados y utilizando
un anlisis de inmunoabsorcin ligado a enzimas (ELISA).
138 CAPTULO 10
6. FOTOTOXICIDAD
A lo largo de la vida, la piel est expuesta a todas las ondas del espectro electromagntico,
incluidas las radiaciones ultravioleta (UV), la luz visible, los rayos infrarrojos del sol, la luz
artificial y las fuentes de calor. En general, la radiacin solar que llega a la tierra con mayor poder
para provocar lesiones cutneas es la que abarca longitudes de onda que van desde los 290 a
los 700 nm. Para que cualquier forma de radiacin electromagntica produzca alteraciones
biolgicas, primero tiene que absorberse. La absorcin de la luz en las estructuras profundas y
ms vitales de la piel depende de los cromforos existentes, del grosor de la epidermis y del
contenido en agua, que es diferente en cada regin del cuerpo. La melanina y los aminocidos
de los cromforos son capaces de absorber la radiacin UV-B (290 a 320 nm). Biolgicamente,
el cromforo ms importante es el ADN, por lo que la lesin causada por la radiacin puede
tener consecuencias duraderas para la estructura y la funcin de los tejidos.
La fotoirritacin es una respuesta no inmunolgica de la piel inducida por la luz a travs de una
sustancia qumica fotoreactiva. La exposicin a la sustancia qumica fotoreactiva puede ser
causada mediante la aplicacin directa a la piel o a travs del sistema circulatorio tras la
administracin sistmica. Las reacciones de fotoirritacin se asemejan a las reacciones de
irritacin primaria en que pueden ser provocadas despus de una sola exposicin, en contraste
con las reacciones fotoalrgicas, que requieren una exposicin previa antes de evocar una
respuesta. Un producto qumico fotoactivo puede ser el frmaco original, un metabolito o un
excipiente en un producto farmacutico. Las reacciones de fotoirritacin aguda pueden
parecerse a las quemaduras solares y pueden variar desde un eritema leve a la aparicin de
ampollas y el desprendimiento de las capas ms externas de la piel. A pesar de que un porcentaje
relativamente pequeo de la poblacin puede mostrar sntomas clnicos de fotoirritacin, un
porcentaje mucho ms grande puede tener efectos inmediatos subclnicos.
La fotoalergia es una reaccin adquirida, de origen inmunolgico ante una sustancia qumica
activada por la luz. La aparicin de una respuesta fotoalrgica a una sustancia qumica es
idiosincrtica (altamente dependiente de la reactividad inmune especfica del husped). Los
compuestos que provocan una respuesta a la fotoirritacin tambin pueden ser capaces de
iniciar una reaccin fotoalrgica. Los datos obtenidos en animales y seres humanos sugieren
que, al menos, algunos fotoirritantes aumenan la carcinognesis de piel asociada a UV. Los
datos sobre la correlacin existente entre latitud, exposicin a radiacin UV y el riesgo de
aparicin de cncer en seres humanos sugieren que un aumento en la exposicin UV tan
pequeo como 20 por ciento podra resultar en un aumento de 4 veces en la frecuencia de
aparicin de carcinoma de clulas basales.
Histricamente, la mayora de los frmacos administrados por va sistmica no han sido
sometidos a pruebas controladas para determinar su capacidad de inducir fotoirritacin. Sin
embargo, un nmero considerable de frmacos son capaces de producir efectos fototxicos en
los seres humanos. Por ello, se deberan realizar ensayos de fotoirritacin a corto plazo en
animales, tal vez seguidos por los estudios de fotoirritacin y fotoalergia en los seres humanos,
para todas las sustancias farmacolgicas y componentes de la formulacin que absorben los
rayos UVB, UVA o radiacin visible (290-700 nm) y bien son aplicados directamente sobre la piel
o los ojos o que se distribuyen de manera significativa en una de estas reas cuando se
administran por va sistmica.
Algunos frmacos provocan una reaccin de fotosensibilidad que no est relacionada con la
absorbancia en el espectro UV del frmaco administrado. Estos mecanismos secundarios
incluyen la perturbacin de la sntesis del grupo hemo y el aumento de la formacin de otras
molculas endgenas con capacidad de absorber la luz. Adems de ser capaz de absorber la
radiacin UV o visible, el frmaco (o metabolitos) debera alcanzar en la piel o el ojo niveles
suficientes para causar reacciones de fotoirritacin. Estudios de distribucin tisular de los
MTODOS DE ESTUDIO DE TOXICIDAD DE XENOCOMPUESTOS IN VIVO 139
7. PRUEBAS HEMATOLGICAS
Para valorar el efecto txico de xenocompuestos sobre el tejido sanguneo se realizan las
siguientes pruebas (26,27): i) recuento de glbulos rojos (RBC) por unidad de volumen de sangre;
ii) concentracin de hemoglobina (Hb); c) hemoglobina corpuscular media (HCM) o cantidad
media de Hb presente en cada hemate; iii) concentracin corpuscular media de Hb (CHCM), que
es la concentracin (no la cantidad) de Hb en cada hemate; iv) valor hematocrito (Htc): mide el
porcentaje del volumen de sangre ocupado por los glbulos rojos; v) recuento de glbulos
blancos (WBC); vi) recuento de plaquetas; vii) recuento de neutrfilos, viii) recuento de
linfocitos; ix) tiempo de protombina que mide lo que tarda en coagular la muestra de plasma
tras aadirle factor tisular y calcio. El tiempo de protombina sirve para evaluar la va extrnseca
y la va comn de la coagulacin. Los resultados de la prueba varan dependiendo del origen
biolgico del factor tisular, por lo que es preciso realizarla en condiciones estndar; x) tiempo
de trombina que mide el tiempo que tarda en coagular el plasma tras aadir trombina; explora
especficamente la formacin de fibrina; xi) tiempo de tromboplastina parcial activada que mide
el tiempo que tarda en coagular una muestra de plasma tras aadirle calcio, fosfolpidos (ej
cefalina, que se usa como sustituto in vitro de los fosfolpidos plaquetarios) y caolin (activador
del factor XII). Evala la va intrnseca y la va comn de la hemostasia secundaria; xii) recuento
de reticulocitos que se expresa en trminos porcentuales con respecto al nmero total de
hemates maduros, y es de gran inters para valorar la intensidad y la eficacia de la eritropoyesis.
Dado que dicho porcentaje puede aumentar tanto si existe un incremento real de reticulocitos
como si desciende el nmero de eritrocitos maduros, es preferible corregir el resultado
ponindolo en relacin con el hematcrito. De esta forma se obtiene un nuevo parmetro: el
ndice reticulocitario (IR); xiii) prueba de la activacin total del complemento mediante la tcnica
de Western Blot. Se trata de un examen rpido semicuantitativo del plasma de los roedores tras
la exposicin al xenocompuesto. Los pptidos de escisin del componente C3 del complemento
se identifican tras la electroforesis en gel, transferencia e incubacin con anticuerpos especficos
anti-C3 (26).
Finalmente, se puede realizar una prueba de hemlisis. Para ello se obtiene sangre de roedores
sanos la cul es anticoagulada con heparina sdica. Los eritrocitos se separan a partir del plasma
de la sangre por centrifugacin a 1500g durante 5 minutos a 4 C. Posteriormente, se lavan tres
veces con solucin salina fisiolgica, y se resuspenden en solucin salina fisiolgica para obtener
una suspensin de eritrocitos al 2% (v/v) que se utiliza inmediatamente despus de su
aislamiento. La suspensin de RBC al 2% se trata con diferentes concentraciones del compuesto
a estudiar y se incuba durante 2 horas a 37 C con agitacin suave. Como control negativo, se
incuba la suspensin de RBC con solucin salina fisiolgica usando exactamente el mismo
proceso. Como control positivo (hemlisis completa), se incuba la suspensin de RBC con Triton
X-100 (10%, v/v). Por ltimo, la suspensin de RBC se centrifuga a 1.000 xg durante 10 minutos
140 CAPTULO 10
% = 100 ( 0 )/(100 0 )
Donde Abs, Abs0, y Abs100 son respectivamente las absorbancias de las muestras de ensayo, la
suspensin tratada con solucin salina fisiolgica, y la suspensin de hemlisis completa tratada
con Triton X-100 (10%, v/v) (28,29).
8. PARMETROS BIOQUMICOS
9. ESTUDIOS HISTOPATOLGICOS
Si, mediante los mtodos anteriores, se observa un patrn de posible dao en uno o varios
rganos concretos, se llevarn a cabo estudios histopatolgicos mediante microscopa ptica y,
en su caso, electrnica para determinar el lugar y naturaleza de las lesiones. De esta manera se
podr confirmar si existe dao despus de sospechas a travs de los datos obtenidos en los
estudios bioqumicos (33,24).
Los estudios de comportamiento son muy relevantes en Toxicologa debido a que muchos
txicos producen alteraciones de comportamiento con anterioridad a otras variaciones en
parmetro clnicos. El animal de eleccin para estos estudios es la rata, seguida de los primates.
El test de cribado ms utilizado en los estudios de comportamiento es el test de Irwin que
consiste en un procedimiento observacional sistemtico que se utiliza para determinar los
efectos adversos de una nueva sustancia sobre el comportamiento general y evaluar su posible
neurotoxicidad. Para ello, se determina un perfil comportamental determinando: i) el grado de
alerta o estupor; ii) la actividad motora; iii) un perfil neurolgico a travs de observar excitacin
central, iv) incoordinacin motora, v) tono muscular; vi) reflejos y vii) un perfil autonmico a
travs de signos pticos, secreciones y signos generales como piloereccin, hipotermia o color
de la piel (Figura 4).
El manejo racional de las tcnicas anteriormente expuestas permite obtener informacin
relevante sobre las posibles acciones txicas de un xenocompuesto que se pretende llevar a un
entorno clnico con una posible aplicacin teraputica. No obstante, tal y como se ha indicado
anteriormente, un resultado negativo en estas pruebas de toxicidad no representa la certeza
absoluta de que no aparezca toxicidad en humanos una vez que el uso del compuesto se
generalice tras una indicacin teraputica. Por ello, es importante tener una idea clara del papel
que juega este tipo de estudios en el proceso de aprobacin de un nuevo compuesto teraputico
por las agencias reguladoras y el papel que pueden aportar estas tcnicas para minimizar los
posibles riesgos para los pacientes, una vez que el compuesto ha sido aprobado para su uso
teraputico (35).
Agradecimientos:
Este trabajo ha sido financiado por proyectos del MINECO (BFU2014-59009-P) y CYTED (214RT0482).
142 CAPTULO 10
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144 CAPTULO 11
CAPTULO 11
BSQUEDA DE NUEVAS APROXIMACIONES TERAPUTICAS FRENTE AL
VIH-1: NANOTECNOLOGA Y CLULAS DENDRTICAS
M Angeles Muoz-Fernndez1, Rosa Reguera2, Alba Martn Moreno1, Ezequiel Ruiz-
Mateos3, Yolanda M Pacheco3, Enrique Vacas1, Manuel Leal3
1. INTRODUCCIN
En la infeccin por el VIH-1 se han utilizado un gran nmero de antgenos virales para estimular
a las CD, siendo el principal reto la eleccin del antgeno adecuado debido a la gran diversidad
gentica del virus y a su capacidad de generar resistencias. Hasta ahora, las diferentes
estrategias utilizadas para determinar la mejor utilizacin de pptidos en modelos de
inmunoterapia han sido:
i) La utilizacin de secuencias del VIH autlogo (uso de las especies virales procedentes de cada
hospedador).
ii) El uso de CD cargadas con viriones VIH-1 derivados de virus autlogo del individuo VIH-1+
(13,14); destacar que en ambos casos, estas terapias personalizadas son muy costosas y podran
suponer una barrera de acceso en los pases en desarrollo.
iii) La carga de las CD con preparados apoptticos de clulas T infectadas por el VIH, asociadas y
no al virin, que podran ser procesados por las vas del complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC) clase I y II para la estimulacin de clulas T.
iv) El uso de exosomas, nanopartculas secretadas como orgnulos de membrana nicos
derivadas de clulas infectadas por el VIH (15).
v) El uso de protenas virales recombinantes, que en teora sera una forma de inmunoterapia
relativamente segura y sencilla que podra abarcar antgenos de todo el proteoma viral. Pero
hay que tener en cuenta que es muy costoso conseguir cantidades de protena suficientes para
su uso clnico y adems los antgenos son presentados preferentemente a travs de la va del
MHC clase II. Por otra parte, uno de los problemas principales asociados con vacunas en la
utilizacin de protenas purificadas es que, generalmente, son poco inmunognicas y se
necesitan adyuvantes para incrementar la respuesta inmunolgica. Sin embargo, hay estrategias
que incrementan la inmunogenicidad de pptidos antignicos VIH-1 e impiden el escape viral,
como por ejemplo la seleccin de pptidos mosaico que contienen secuencias conservadas de
protenas de diferentes subtipos del VIH-1 (16,17). El diseo bioinformtico de estos mosaicos
antignicos permite cubrir toda la diversidad del VIH-1 (18). La obtencin de pptidos
inmunognicos de amplio espectro o anticuerpos neutralizantes aislados de cohortes de
pacientes controladores de lite y/o de pacientes virmicos pero que controlan al VIH-1 de
manera eficaz es otro punto importante (19). Tambin hay que tener en cuenta la seleccin de
146 CAPTULO 11
regiones antignicas superpuestas que aunque no son conservadas estn asociadas a baja carga
viral y actividad in vitro e in vivo (20).
vi) La utilizacin de subunidades de protenas de 9 a 11 aminocidos de antgenos asociados al
tumor que se presentaran a travs del MHC clase I. Este enfoque, basado en la experiencia
previa del uso de inmunoterapias en cncer, es seguro y relativamente econmico. De tal forma
que la mayora de los ensayos clnicos de vacunas con CD para el tratamiento de tumores los
han utilizado, pero un punto importante a tener en cuenta es que exige que los pptidos sean
especficos del haplotipo del MHC de clase I del paciente.
vii) La utilizacin de CD transfectadas con ARNm que codifique para las protenas del VIH-1, ya
que pueden estimular clulas T CD8+ y T CD4+ antgeno-especficas in vitro (21,22). Pero hay que
tener en cuenta que los cidos nucleicos son ms sensibles a la degradacin que los pptidos o
las protenas, y la transfeccin con ARN o ADN produce un descenso notable de la viabilidad de
las clulas, lo que limitara su uso in vivo a pesar de su eficacia in vitro. Por otra parte, los mRNAs
sintticos se han convertido en productos biofarmacuticos que se utilizan en vacunas frente a
tumores, infecciones bacterianas e infecciones vricas (23,24). Existen datos, fundamentalmente
en inmunoterapia tumoral, que demuestran no slo la seguridad de estas vacunas, sino tambin
la induccin de respuestas inmunes antitumorales (25). Los mARN presentan una serie de
propiedades que los hacen muy atractivos ya que se pueden producir en un periodo de tiempo
corto y pueden codificar cualquier protena de inters incluyendo antgenos artificiales. Adems,
a diferencia de otros vectores genticos actuan a nivel intracitoplasmtico, sin necesidad de
integrarse siendo su tiempo de accin transitorio y disponiendo de una actividad intrnseca
coadyuvante ligera. De tal forma, que en la infeccin por el VIH-1, hay resultados que
demuestran que se pueden utilizar los mARN de protenas del virus autlogo vehiculizados por
CD, como vacuna teraputica (26). Actualmente hay en marcha un ensayo clnico de vacunacin
teraputica de individuos VIH-1+ usando mARN, "Therapeutic TriMix/mARN vaccine in Chronic
HIV-1 Infected Patients on Antiretroviral Therapy" (27,28). La novedad es que los TriMix/mARN
se administran directamente en los ndulos linfticos, sin necesidad de modificar ex vivo las CD
autlogas, utilizando lo que se denomina una modificacin in vivo de las CD (27,28). El producto
es una combinacin de secuencias de mRNA que cumplen dos objetivos prioritarios: el primero
proporcionar un inmungeno en forma de antgenos del VIH-1 capaz de inducir una activacin
especfica de los linfocitos T que confiera una inmunidad protectora (secuencia mARN
HIVACAT_T) y, el segundo, tener suficiente capacidad coadyuvante proporcionando estmulos
adecuados para inducir tanto una activacin de las CD presentadoras de antgeno como una
estimulacin de las clulas T especficas (secuencia mARN TriMix). La secuencia del inmungeno
mRNA HIVACAT_T se ha diseado de forma racional seleccionando 16 segmentos de 10-70
amino cidos de longitud que codifican dianas, con eptopos relativamente conservados, en las
protenas Gag, Pol, Vif y Nef del VIH-1, asociadas a respuestas inmunolgicas eficaces y a un
mejor control de la replicacin viral (29). Por lo que respecta al coadyuvante, est formado por
una combinacin de mARN, denominados TriMix, los cuales codifican para una forma
constitutiva del receptor "Toll-like" 4 (caTLR4) y el ligando de CD40 (CD40L), que inducen la
maduracin de las CD, favoreciendo la presentacin antignica, y la molcula CD70, la cual tras
unirse al receptor CD27 presente en la superficie de los linfocitos T, actuar como coestimulador
de las clulas T, favoreciendo la activacin y generacin de clulas de memoria. Ya se ha
demostrado que la combinacin de mRNA del TriMix induce una activacin potente de las DC e
induce respuestas T antgeno-especficas (30-32). As mismo, tambin se ha propuesto como
una estrategia en el desarrollo de vacunas teraputicas la expresin en CD de plsmidos de ADN
que codifican para los antgenos del VIH-1 (33). Nuevas investigaciones en este sentido han
mejorado la eficacia de la liberacin del ADN del VIH a las CD por el acoplamiento del ADN a
micropartculas biodegradables como son los poli-beta amino steres (34).
BSQUEDA DE NUEVAS APROXIMACIONES TERAPUTICAS FRENTE AL VIH-1:
NANOTECNOLOGA Y CLULAS DENDRTICAS 147
Las CD se estn ya utilizando como estrategia teraputica frente a la infeccin por el VIH-1 en
modelos animales y en individuos VIH-1+ (41-45). El tipo ms potente de clulas presentadoras
de antgeno (CPA) profesionales son las CD de origen mieloide, debido en gran parte a la
produccin de citoquinas inflamatorias producidas durante la infeccin. Estas CD son centinelas
que detectan las seales del dao y actan como nexo entre la respuesta inmunolgica innata
y la adaptiva. Debido a la excepcional habilidad de las CD mieloides para activar la inmunidad de
las clulas T en respuestas a patgenos microbianos, estas clulas se utilizan como herramientas
in vivo y ex vivo para inmunoterapia del cncer o infecciones virales, incluida la infeccin por el
VIH (44,46,47) (Figura 1). Las CD adems regulan funciones importantes en la infeccin por el
VIH-1, como la produccin de anticuerpos VIH-1 especificos que median la neutralizacin del
virus, la citotoxicidad, la lisis dependiente del complemento y otras actividades antivirales. La
utilizacin de CD en inmunoterapia es de gran relevancia para que se aprovechen las vas
naturales de reconocimiento de antgenos del VIH-1. La razn fundamental para utilizar la
inmunoterapia con CD es conseguir controlar la infeccin del virus de la manera ms eficaz.
Las CD tienen la capacidad de procesar protenas a travs de la va de presentacin MHC clase I
para estimulacin de las clulas T CD8+ y la va MHC clase II para activacin de las clulas T CD4+.
Las vacunas basadas en CD son unas de las vacunas teraputicas ms potentes para inducir
respuestas inmunitarias o control de la replicacin viral (14,28,42,47). Esto se puede deber, a
que la eficacia de la induccin de clulas T de una vacuna est determinada tanto por el antgeno
como por la disponibilidad y la maduracin de las CD. En realidad, las vacunas basadas en DC,
como ya se ha mencionado, estriban en la habilidad de estas clulas en capturar y presentar los
antgenos a los linfocitos T CD4+ y T CD8+, induciendo una respuesta inmunolgica celular eficaz
capaz de controlar la replicacin del virus (48). Las inmunoterapias basadas en CD se han
aplicado de forma satisfactoria en cncer (49-51), siendo "Sipuleucel" la nica vacuna basada en
CD aprovada por la FDA para el tratamiento de cncer de prstata (52,53). Sin embargo, y a
pesar de estos hallazgos, existen an muchos inconvenientes asociados a este tipo de vacunas.
En primer lugar, la generacin de DC a partir de monocitos autlogos es un proceso delicado,
muy laborioso y costoso que requiere de una experiencia previa adecuada, por lo tanto, su uso
suele estar limitado a centros altamente especializados. En segundo lugar, cada paciente
necesita de la preparacin de su propia vacuna, es decir, se precisan vacunas individualizadas,
hecho que limita la comercializacin de este tipo de vacunas, y por lo tanto, el potencial inters
de la industria farmacutica. Por ltimo, dado que la vacuna consiste en clulas vivas utilizadas
148 CAPTULO 11
como vehculo del antgeno, tanto la conservacin como el transporte son casi impracticables,
con lo que no se plantea la exportacin y utilizacin en pases con recursos limitados. Por todo
ello, se requiere del desarrollo de una vacuna teraputica que mantenga la potencia y eficacia
de las vacunas basadas en CD pero que supere los desafos anteriormente citados para poder
considerar su uso generalizado.
Terapia gnica
Poly(amidoamine) Liberacin de drogas
(PAMAM) dendrimer Antiviral
Imagen molecular
Nano escala
Terapia gnica
Poly(propyleneimine) Liberacin de drogas
(PPI) dendrimer Imagen molecular
Terapia gnica
Peptide dendrimer
Liberacin de drogas
Mimetismo protenas
Antiviral
Anticancer
Terapia gnica
Liberacin de drogas
Carbosilane Antibacterianos
dendrimers Antivirales
Phosphorus
dendrimers Terapia gnica
Liberacin drogas
Agente teraputico
Antimicrobiano
Antifngico
Antivirales
Polyglycerol
dendrimers
Liberacin
Triazine
dendrimers
Los dendrmeros carbosilano, con un esqueleto basado en el carbono y el silicio, tienen unas
caractersticas moleculares adecuadas para considerar su uso en aplicaciones biomdicas, y ser
utilizados como vectores no virales (61-72). Se distinguen de otros dendrmeros en la alta
apolaridad de su ncleo central y en la alta movilidad de las ramas perifricas. Se ha demostrado
su funcin como transportadores de siRNA y de oligonuclotidos en terapia gnica frente al VIH-
1, en cncer, en enfermedades prinicas, en Alzheimer (73) y como microbicidas para la
prevencin de nuevas infecciones por el VIH-1 (74-79) (Figura 1). Otro grupo con un gran
potencial como transportadores en sistemas biolgicos son los fosforo-dendrmeros (80-82). La
presencia de tomos de fsforo en los puntos de ramificacin de estas estructuras es
particularmente importante debido a la versatilidad que ello ofrece en el diseo de estos
compuestos, as como en las propiedades de los mismos (81,82). Los fosforo-dendrmeros han
demostrado potencial como agentes transfectantes en terapia gnica (65,80), aunque tambin
se han empleado para el tratamiento de procesos inflamatorios en modelos in vivo
experimentales de artritis reumatoide (83,84). As mismo, los fosforo-dendrmeros de tipo
violgeno han mostrado propiedades antifngicas, antibacterianas y antivirales (85).
Los glico-dendrmeros o dendrmeros decorados con azcares presentan una serie de ventajas,
ya que estas molculas aumentan su biocompatibilidad y adems permiten su interaccin con
lectinas y otras molculas en la superficie de las clulas del sistema inmunolgico. Diferentes
glico-dendrmeros ya se han usado con xito como agentes antivirales o como agentes para el
transporte de molculas cargadas como pptidos, o cidos nucleicos (78,86).
Otros tipos de macromolculas dendrticas utilizados son los dendrmeros polipropilenimina
(PPI) (87) y polilisina (88). Por ejemplo, generaciones pequeas de dendrmeros PPI se han
utilizado en transfeccin en ensayos in vitro con baja toxicidad, aunque las generaciones altas
originan altas toxicidades que limitan su uso. Recientemente, se ha publicado el xito de las
microesferas de PLGA (un ster polmero convencional) con pptidos derivados de antgenos de
tumores solubles, mostrando que las CD mantienen su habilidad para activar de forma in vitro
BSQUEDA DE NUEVAS APROXIMACIONES TERAPUTICAS FRENTE AL VIH-1:
NANOTECNOLOGA Y CLULAS DENDRTICAS 151
las clulas T (89). Se han publicado otros ejemplos relacionados con el uso de dendrmeros en
esta direccin (90,91).
Tambin hay que tener en cuenta el papel relevante que juegan las nanopartculas (NP) en el
mbito de la biomedicina (Captulo 6, Dra. Strumia), teniendo un gran nmero de aplicaciones
dependiendo de sus caractersticas (NP metlicas o semiconductoras, estructuras hbridas
formadas con material polimrico, NP de oro, NP magnticas o NP de slice mesoporosa). Los
estudios con NP de Poly (-glutamin acid) y poly (d,l-lactic-co-glycolic acid) han mostrado su
eficacia como vehculos para liberar antgenos en CD, siendo un sistema seguro, bien tolerado y
capaz de inducir un respuesta inmunolgica celular y por lo tando pudindose utilizar en vacunas
frente al cncer (92-94).
Por otra parte, hay que tener en cuenta que la respuesta clnica desarrollada por los pacientes
es todava muy baja, principalmente debido a que la migracin de las CD generadas ex vivo para
alcanzar los ndulos linfticos es poco eficiente. Esto se podra implementar adyuvando la
vacuna con citoquinas pro-inflamatorias, aunque normalmente promueve una estimulacin
inmunolgica no especfica y con efectos no deseables. Otro punto importante a tener en cuenta
en estas vacunas ex vivo con nanopartculas-CD o dendrmeros-CD es que deben ser
individualizadas, su desarrollo depende de las caracterscas del individuo VIH-1+.
BSQUEDA DE NUEVAS APROXIMACIONES TERAPUTICAS FRENTE AL VIH-1:
NANOTECNOLOGA Y CLULAS DENDRTICAS 153
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BIOBANCO VIH HGM: SU PAPEL EN INVESTIGACIN Y ENSAYOS CLNICOS 159
CAPTULO 12
BIOBANCO VIH HGM: SU PAPEL EN INVESTIGACIN Y ENSAYOS CLNICOS
BioBanco VIH HGM, Madrid, Espaa. Seccin Inmunologa, Laboratorio InmunoBiologa Molecular,
Hospital General Universitario Gregorio Maran, Madrid, Espaa. Instituto de Investigacin
Sanitaria Gregorio Maran. Madrid, Espaa. CIBER BBN, Bioingenieria, Biomateriales y
Nanomedicina, Madrid, Espaa.
En los ltimos aos las plataformas tecnolgicas (todas las -micas: genmica, protemica.., de
nanotecnologa, biobancos) destinadas a dar soporte a la investigacin estn tomando cada
vez ms relevancia como actores implicados en el avance de la ciencia y el conocimiento. Esto
se debe al papel fundamental de estas plataformas en el desarrollo de proyectos colaborativos
multicntricos y de estudios a gran escala que precisan para su desarrollo de infraestructuras
capaces de procesar y/o analizar grandes series de casos.
Para el avance de la ciencia biomdica es de vital importancia la disponibilidad de material
biolgico, procedente de pacientes, asociado a datos identificativos, clnicos y epidemiolgicos
de los donantes. Este material debe procesarse y preservarse en condiciones que aseguren su
homogeneidad, calidad y trazabilidad a largo plazo y en este punto es donde cobran especial
relevancia los denominados bancos de material biolgico o biobancos. Los biobancos son
plataformas de apoyo a la investigacin cuya misin es contribuir al avance del conocimiento
cientfico a travs de la gestin, la recepcin, el procesamiento, la criopreservacin y la cesin,
con fines investigadores, de muestras biolgicas y datos asociados procedentes de pacientes.
De este modo los biobancos actan como nexo de unin entre donantes, clnicos e
investigadores, con el propsito de lograr un tratamiento seguro y eficaz del material
almacenado. Su papel es fundamental para garantizar la homogeneidad, trazabilidad y calidad
de las muestras y de los datos asociados, y facilitar la accesibilidad de la comunidad cientfica a
los recursos disponibles, asegurando una utilizacin racional, tica y legal del material
almacenado. Slo de este modo se pueden poner a disposicin de la comunidad cientfica, y de
la industria farmacutica y biotecnolgica, muestras biolgicas e informacin de inters
asociada que ofrezcan las garantas suficientes y que contribuyan a fomentar la competencia y
la excelencia de la investigacin.
Para poder optimizar al mximo su contribucin, los biobancos deben llevar a cabo un proceso
exhaustivo de planificacin a largo plazo (1), que implica una gran inversin de tiempo y
recursos, ya que el almacenamiento de muestras biolgicas y de datos asociados plantea
cuestiones tcnicas y legales (2) complejas que afectan a: la recoleccin del material, su
trasporte, su identificacin y registro, su trazabilidad, procesamiento y conservacin, el
tratamiento informtico de los datos clnicos e identificativos asociados a las muestras, el
control de la calidad de los materiales almacenados, y la cesin con fines investigadores de las
muestras y datos disponibles.
160 CAPTULO 12
112 aislados primarios de VIH-1, de los cuales el 35,7% pertenecen a pacientes con
infeccin aguda o reciente, el 46,4% son de pacientes VIH de nuevo diagnstico, el
14,3% proceden de pacientes con infeccin crnica y del 3,6% restante no se dispone
de informacin sobre la infeccin.
Estos reactivos constituyen una herramienta de gran inters que contribuye a la creacin de
sinergias y colaboraciones entre distintos grupos de investigacin y a la optimizacin de la labor
cientfica, evitando la duplicidad de esfuerzos.
Para constatar la importancia y relevancia que supone contar con el BioBanco VIH como
plataforma de apoyo a la investigacin biomdica, podemos referirnos a determinados
indicadores de la produccin cientfica derivada de su actividad, como son los proyectos y los
ensayos y estudios clnicos participados. Gracias a su actividad, se han realizado 64 proyectos de
investigacin de alto nivel sobre la infeccin por el VIH, tanto nacionales como internacionales,
a los que se ha cedido muestras de alta calidad y valor cientfico que han dado lugar a 126
artculos cientficos. Posteriormente, del trabajo derivado de estos estudios se han registrado
11 patentes basadas en aplicaciones de dendrmeros en biomedicina.
Desde sus inicios en 2004 hasta el 1 de julio de 2016, el BioBanco VIH ha recibido 76 solicitudes
de cesin de muestras, 73 fueron valoradas favorablemente por los Comits Externos de este
biobanco y 3 no superaron la fase de evaluacin. De los 73 proyectos evaluados favorablemente,
2 se anularon a peticin de los investigadores antes de la cesin del material biolgico, 7 estaban
en fase de evaluacin por parte de los Comits o en preparacin de las muestras, 26 haban
162 CAPTULO 12
finalizado y a los 38 restantes ya se les haba entregado el material biolgico solicitado y estaban
en fase de desarrollo.
Desde el ao 2004 hasta julio de 2016 se cedieron 25.881 viales de 8.417 muestras a 64
proyectos de investigacin, de las que 3.283 alcuotas se cedieron durante el ao 2015, en que
se recibieron 9 nuevas solicitudes de cesin de muestras a proyectos basados en el VIH. Los
datos del ao 2015, suponen un record histrico en la actividad del BioBanco VIH, lo que da una
panormica de su evolucin como principal plataforma de servicio y apoyo a la investigacin con
material biolgico humano en el rea de la inmunovirologa (Figura 1).
60
50
40
30
20
10
0
2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015
ANUAL ACUMULADO
2. AREA
AREADE
DEESTUDIO
ESTUDIO
10%
10% 11%
11%
15%
15% 15%
15%
Pediatra
Pediatra
Observacionales
Observacionales
Inmunologa
Inmunologa
Virologa
Virologa
49%
49% Hepticos
Hepticos
8% Genticos
35%
Caracterizacin
41% molecular
Estudios
16% funcionales
Desarrollo de
vacunas
Figuras 2 y 3. rea de aplicacin y tipo de proyectos con colaboracin del BioBanco VIH
4. PRODUCCIN CIENTFICA
40
30
20
10
0
2010 2011 2012 2013 2014 2015
TOTAL DE PUBLICACIONES PUBLICACIONES NANOMEDICINA
PENTA 16. Short-Cycle Therapy (SCT) (5 days on/2 PENTA Foundation, VII Programa Marco e
days off) in young people with chronic HIV-infection. industria farmacutica
10
0
2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014 2015
Figura 6. Ensayos Clnicos con colaboracin del BioBanco VIH. Histrico 2004-2015
5. REFERENCIAS
1. Riegman PH, Dinjens WM, and Oosterhuis JW (2007). Biobanking for interdisciplinary clinical research.
Pathobiology 74(4): p. 239-44.
2. Garcia-Merino IM, Consuegra I, Jimnez JL, Muoz-Fernndez M (2015). Specific legislation on biobanks in
Spain. Biopreserv Biobank 13(3): p. 207-11.
3. Mahajan SD, Aalinkeel R, Law WC, Reynolds JL, Nair BB, Sykes DE, Yong KT, Roy I, Prasad PN, Schwartz SA (2012).
Anti-HIV-1 nanotherapeutics: promises and challenges for the future. Int J Nanomedicine 7: p. 5301-14.
4. Volberding PA and SG (2010). Deeks, Antiretroviral therapy and management of HIV infection. Lancet 376(9734):
p. 49-62.
5. Garcia-Merino I, de Las Cuevas N, Jimenez JL, Gallego J, Gomez C, Prieto C, Serramia MJ, Lorente R, Muoz-
Fernandez MA (2009). The Spanish HIV BioBank: a model of cooperative HIV research. Retrovirology 6: p. 27.
6. Isabel M Garca Merino, Irene Consuegra Fernndez, Jos Luis Jimnez Fuentes and M ngeles Muoz-
Fernndez (2013). The Spanish HIV HGM BioBank (SHIVBB). Biobanking & Biopreservation 11(4).
7. Pgina web del BioBanco VIH. http://hivhgmbiobank.com [Consultada por ltima vez el 24 de octubre de 2016].
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