Universidad Nacional del Callao

Facultad de Ingeniera Qumica

Curso: Laboratorio de Microbiologa

Profesora: Ing. Sonia Herrera

Integrantes:
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2014
 Identificacin de Bacterias

Identificacin de Bacterias
I. OBJETIVO:

Identificar bacterias Gram positivas y Gram negativas.

II. FUNDAMENTO TERICO:

TINCION DE GRAM

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en

microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su
nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se
utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder
realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose
Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram
negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo.

Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de
las bacterias Gram positivas y Gram negativas.

La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de
la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipo-teicoico, y
ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglucano
(tambin conocido como murena).

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Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se

encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a
la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a
una membrana exterior por lipo-protenas. La membrana exterior est hecha de
protena, fosfolpido y lipo-polisacrido.

Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas

diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material
que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en
mucha mayor proporcin que las Gram negativas.

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la

membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por
ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es
demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se
form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin
azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms
resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del
solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que
impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la
coloracin azul-violcea.

BACTERIA GRAM NEGATIVA

En microbiologa, se denominan bacterias Gram negativas a aquellas bacterias que no se

tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram, y lo hacen de un color rosado
tenue: de ah el nombre de "Gram-negativas" o tambin "gran negativas".

Esta caracterstica est ntimamente ligada a la estructura de la envoltura celular, por lo

que refleja un tipo natural de organizacin bacteriana. Son uno de los principales grupos
de bacterias y cuando se tratan como taxn se utiliza tambin el nombre de Negi-
bacteria. Las restantes son las bacterias Gram positivas.

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Las bacterias Gram-negativas presentan dos membranas lipdicas entre las que se localiza
una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-positivas
presentan slo una membrana lipdica y la pared de peptiglicano es mucho ms gruesa.
Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tincin de Gram.

Muchas especies de bacterias Gram-negativas causan enfermedades. Los cocos Gram-

negativos causan la gonorrea (Neisseriagonorrhoeae), meningitis (Neisseriameningitidis)
y sntomas respiratorios (Moraxellacatarrhalis), entre otros. Los bacilos Gram-negativos
incluyen un gran nmero de especies. Algunos de ellos causan principalmente
enfermedades respiratorias (Haemophilusinfluenzae, Klebsiellapneumoniae ,
Legionellapneumophila, Pseudomonasaeruginosa), enfermedades urinarias
(Escherichiacoli, Proteusmirabilis, Enterobactercloacae, Serratiamarcescens) y
enfermedades gastrointestinales (Helicobacter pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella
typhi). Otros estn asociadas a infecciones nosocomiales (Acinetobacterbaumanii).

Estructura

La envoltura celular de las bacterias Gram-negativas est compuesta por una membrana
citoplasmtica (membrana interna), una pared celular delgada de peptidoglicano, que
rodea a la anterior, y una membrana externa que recubre la pared celular de estas
bacterias. Entre la membrana citoplasmtica interna y la membrana externa se localiza el
espacio periplsmico relleno de una sustancia denominada periplasma, la cual contiene
enzimas importantes para la nutricin en estas bacterias.

La membrana externa contiene diversas protenas, siendo una de ellas las porinas o
canales proteicos que permiten el paso de ciertas sustancias. Tambin presenta unas

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estructuras llamadas lipo-polisacridos (LPS), formadas por tres regiones: el polisacrido

O (antgeno O), una estructura polisacrida central (KDO) y el lpido A (endotoxina).

BACTERIA GRAM POSITIVA

En microbiologa, se denominan bacterias Gram positivas a aquellas bacterias que se

tien de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram: de aqu el nombre de "Gram-
positivas" o tambin "gran positivas". Esta caracterstica est ntimamente ligada a la
estructura de la envoltura celular por lo que refleja un tipo natural de organizacin
bacteriana. Son uno de los principales grupos de bacterias, y cuando se tratan como
taxn se utiliza tambin el nombre de Posi-bacteria. Las restantes son las bacterias Gram
negativas.

La envoltura celular de las bacterias Gram-positivas comprende la membrana

citoplasmtica y una pared celular compuesta por una gruesa capa de peptidoglicano,
que rodea a la anterior. La pared celular se une a la membrana citoplasmtica mediante
molculas de cido lipo-teicoico. La capa de peptidoglicano confiere una gran resistencia
a estas bacterias y es la responsable de retener el tinte durante la tincin de Gram. A
diferencia de las Gram-negativas, las Gram-positivas no presentan una segunda
membrana lipdica externa a la pared celular y esta pared es mucho ms gruesa.

Incluyen especies tanto mviles (va flagelos) como inmviles con forma de bacilo
(Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Lactobacillus, Listeria) o coco (Staphylococcus,
Streptococcus); con gruesas paredes celulares o sin ellas (Mycoplasma). Algunas especies
son fotosintticas, pero la mayora son hetertrofas. Muchas de estas bacterias forman
endosporas en condiciones desfavorables. Realmente, no todas las bacterias del grupo
son Gram-positivas (no se tien por la aplicacin de ese mtodo), pero se incluyen aqu
por su similitud molecular con otras bacterias Gram-positivas.

La clula bacteriana est rodeada por una envoltura que, observada al microscopio
electrnico, se presenta como una capa gruesa y homognea, denominada pared celular.
Luego en seccin (corte) se observa una estructura semejante a dos lneas paralelas
separando una capa menos densa; esto corresponde a la membrana plasmtica. Entre la
membrana plasmtica y la pared celular se encuentra el peri-plasma o espacio peri-
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plasmtico. En el interior de la membrana plasmtica se encuentra el citoplasma que est

constituido por una disolucin acuosa, el citosol, en el cual se encuentran ribosomas y
otros agregados de macromolculas, y en el centro se ubica la zona menos densa llamada
nucleoide, que contiene una madeja de hebras difcil de resolver (distinguir) y cuyo
principal componente es el ADN.

La pared externa de la envoltura celular de una bacteria Gram positiva tiene como base
qumica fundamental el peptidoglicano, que es un polmero de N-acetil-2-D-glucosamina,
unido en orientacin -1,4 con N-acetil murmico, a ste se agregan por el grupo lactilo
cuatro o ms aminocidos. Esta molcula se polimeriza gran cantidad de veces, de modo
que se forma una malla especial, llamada sculo de murena. Dicho compuesto es de vital
importancia para conservar la forma y darle rigidez a la clula bacteriana (si este
compuesto no existiese, la clula reventara debido a su gran potencial osmtico).

Las siguientes caractersticas estn presentes generalmente en una bacteria Gram-

positiva:

Membrana citoplasmtica.
Capa gruesa de peptidoglicano.
cidos teicoicos y lipo-teicoicos, que sirven como agentes quelantes y en ciertos
tipos de adherencia.
Polisacridos de la cpsula.

Si algn flagelo est presente, este contiene dos anillos como soporte en oposicin a los
cuatro que existen en bacterias Gram-negativas porque las bacterias Gram-positivas
tienen solamente una capa membranal.

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III. MATERIALES E INSTRUMENTOS:

- Mechero Bunsen
- Asa de siembra esterilizada
- Pipetas
- Lugol
- Lavado con acetona: agua (80) y acetona (20)
- Violeta
- Safranina
- Placas portaobjeto
- Agua destilada

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

Se usaron microorganismos de las siguientes muestras:

PREPARACION DE LA MUESTRA
1. - Limpiar las placas portaobjetos , dejarlo secar, una vez seco pasarlo por el mechero 2 o 3
veces.
2.- Calentar el asa de inoculacin hasta que este al rojo
3.- Tomar la porcin de la muestra que se va a examinar por medio de un asa.
4.- Colocar la muestra sobre un portaobjetos limpio y sin grasa
***Como la muestra est en un medio slido, colocar una gotita de agua destilada sobre el
portaobjetos.
6.- Extender con el asa la gotita para obtener un frotis delgado y uniforme. Secar al aire.
7.- Calentar nuevamente el asa para esterilizarla.

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8.- Fijar con calor suave sobre la flama del mechero, pasndolo a travs de la llama con la
muestra hacia arriba, de tal forma que pueda tolerarlo sobre el dorso de la mano.

PASOS A SEGUIR EN LA TCNICA DE GRAM

1.- Preparar las placas con el microorganismo retirado de Manitol Salado y Mueller.
2.- Cubrir con cristal violeta (una gota) durante un minuto.
3.- Lavar los portaobjetos con una corriente suave de agua.
4.- Cubrir los frotis con yodo lugol durante 1 minuto.
5.- Lavar como se indic en el paso (4).
6.- Decolorar con acetona hasta que no escurra lquido azul.
7.- Lavar inmediatamente como se hizo en el paso (4).
8.- Cubrir el frotis con safranina durante 1 minuto.

V. RESULTADOS Y CONCLUSIONES:

Muestra Resultado Foto Conclusiones

Debido a que
las muestras
Microorganismos quedaron
Tincin de
obtenidos del teidas de color
Gram color
Manitol Salado y azul, podemos
azul
Mueller decir que son
bacterias Gram
Positivas

VI. RECOMENDACIONES:

Se debe extraer una muestra pequea y extenderla con mucho cuidado hasta
conseguir una capa fina.

Al sellar la muestra acercndola a la llama del mechero, evitar que se caliente

demasiado, para no afectar la estructura y forma normal de los
microorganismos.

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VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

http://frootlupiz.blogspot.com/2009/11/bacterias-gram-positivas-y-gram.html

http://media.axon.es/pdf/65248.pdf

http://es.slideshare.net/ms_cgabriel/identificacin-bacteriana-microbiologia-
presentation

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