VECTORES PARA LA TRANSFERNCIA DE ADN A CELULAS ANIMALES

RESUMEN

La transfeccin es un proceso que consiste en introducir nucletidos en una clula,

cuyo producto final es la transgnesis. En las ltimas dcadas se vienen desarrollando
diferentes tipos de mtodos como: biolgicos, fsicos y qumicos que han permitido
realizar esta introduccin de nucletidos hacia las clulas. En est revisin se
abordarn algunos aspectos importantes de los mtodos de transfeccin ms
utilizados en los ltimos aos, y su eficiencia en el desarrollo de la industria. Se
concluye con el anlisis de los debates ticos que se han ido generando dentro del
mbito de la biotecnologa animal.

INTRODUCCION

La transfeccin ha permitido expresar genes de inters en clulas eucariotas. Esta

capacidad ha posibilitado obtener un mejor entendimiento de la biologa celular, la
biologa molecular y la gentica de las clulas. Al expresar protenas en clulas de
animales, se ha podido entender aspectos detallados de la sntesis proteica, los efectos
de las mutaciones en su funcin en las protenas, las interacciones entre stas y las
interacciones intercelulares. Adems, esta tecnologa ha llevado al desarrollo de
animales transgnicos, a la fecundacin in vitro, y a la posibilidad de usar la
transferencia de genes para tratar desrdenes genticos (Iannacone 2007).

Los virus fueron por mucho tiempo la forma ms conveniente de transferir genes a
clulas mamferas. Graham & Van der Eb (1973), utilizaron el adenovirus 2 para
transfomar clulas de rata, mientras que Cepko et al. (1984) desarrollaron un
retrovirus murnico para la introduccin de secuencias de ADN en clulas mamferas. Si
bien los virus constituyen un medio eficiente para lograr la transfeccin in vitro, la
construccin de los vectores es laboriosa, consume tiempo, y tiene diversas
limitaciones para su uso in vivo.

La transfeccin por medio de vectores virales es altamente eficiente, otros mtodos

han sido desarrollados. Los trabajos realizados por Pagano et al. (1967) fueron
pioneros en su rea al lograr una alta transferencia de genes a

clulas mamferas utilizando dietilaminoetildextrano (DEAE-D) mezclado con ARN y

ADN (McCutchan & Pagano 1968). Despus, se demostr que otros mtodos tambin
son eficaces: la encapsulacin de ADN utilizando liposomas (Fraley et al. 1980, Fraley
et al. 1981), la fusin inducida por polietilenglicol del ADN en los eritrocitos fantasma
(Straus & Raskas 1980), la electroporacin (Neumann et al. 1982), los coprecipitados
de fosfato de calcio/ADN (Wigler et al. 1979), y los policationes/dimetil sulfxidos
(Kawai & Nishizawa 1984). No existe un mtodo indicado para todo tipo celular; sino,
la eficiencia de los mtodos utilizados vara con respecto a estos y en general, no
fueron muy eficientes y presentaban una alta toxicidad celular.

En la actualidad existen tres grupos grandes de mtodos de transfeccin que pueden

ser utilizados (Kim & Eberwine 2010): a) los mtodos biolgicos, b) los mtodos
qumicos y c) los mtodos fsicos.

MARCO TEORICO

1. Transferencia de ADN a clulas animales

microinyeccin directa, electroporacin, encapsulacin de ADN en membranas

artificiales (liposomas) seguido de su fusin con membranas celulares, vectores
basados en virus, YAC o mediada por clulas germinales. En general, el ADN
introducido por cualquiera de estos mtodos se integra en el genoma del hospedador.

La transferencia de genes depende de la introduccin de secuencias de ADN en el

ncleo de una clula somtica, germinal, clula huevo fecundada o una clula madre
embrionaria, seguido de la integracin del ADN en un sitio del cromosoma.

2. Vectores de transferencia gnica

Un vector de transferencia gnica es el vehculo empleado para introducir ADN en una

clula u organismo.

Existen dos grandes grupos de vectores, virales y no virales. Los primeros incluyen
todos aquellos que se han obtenido a partir de un virus tratando de eliminar sus
caractersticas patolgicas y de adaptarlos a su nueva funcin como transportadores
de material gentico heterlogo. Pretenden aprovechar la ventaja que aportan los
virus como vectores naturales que han sufrido procesos de evolucin complejos a lo
largo de millones de aos para optimizar la funcin de introductores de material
gentico en las clulas que invaden. Los vectores no virales siguen una estrategia de
sntesis en lugar de modificacin. Parten de estructuras sencillas conocidas e intentan
reconstruir desde la base un sistema completamente artificial que posibilite el
transporte efectivo de genes en el interior de la clula. Existen tambin vectores
biolgicos no virales (bacterianos) como portadores de genes teraputicos, pero son
los menos estudiados.
Las caractersticas de un vector ideal para poder adaptarlo luego a situaciones
concretas seran las siguientes:

Que sea reproducible.

Que sea estable .
Que permita la insercin de material gentico sin restriccin de tamao.
Que alcance concentraciones elevadas (> 108 partculas/ml) .
Que permita la transduccin tanto de clulas en divisin como
quiescentes.
Que posibilite la integracin especfica de gen.
Que reconozca y acte sobre clulas especficas .
Que la expresin del gen pueda ser regulada.
Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune.
Que pueda ser caracterizado completamente .
Que sea inocuo y minimice sus posibles efectos secundarios.
Que sea fcil de producir y almacenar a coste razonable.

El vector es una parte importante en el sistema de transferencia gnica, pero el

sistema consta de dos componentes: el vector (vehculo de transporte) y el
cargo (material a ser transportado). El cargo a su vez se subdivide en: el
efector (gen a introducir) y el soporte (los elementos que condicionan su
expresin).
El cargo suele ser una estructura de tipo plasmdico (ADN bicatenario y
circular), aunque puede ser de diversa naturaleza y complejidad, desde un
simple oligonucletido hasta un cromosoma artificial, que permite incorporar
una cantidad elevada de material gentico con capacidad de perpetuacin en el
tiempo.

El efector que se utilice depender del efecto que se persiga. Si se pretende

compensar, sustituir o reparar un gen daado, el efector debe ser una copia del
gen intacto o un elemento que permita su reparacin. Si se pretende inducir un
efecto biolgico concreto (eliminar especficamente un tipo de clulas, bloquear
la expresin de un virus, inducir una respuesta inmune), se pueden introducir
genes naturales que potencien dicho efecto o genes que originen nuevas
actividades que den lugar al efecto perseguido.

El soporte es la base para el control de la expresin del transgen e incluye

distintos tipos de elementos reguladores. El primero y fundamental es el
promotor, la zona de ADN anterior al gen donde se recluta la maquinaria de
transcripcin. La naturaleza del promotor condiciona el tipo de regulacin de la
expresin gnica. Se pueden utilizar promotores constitutivamente activos o
promotores especficos, que slo son activos en un tipo celular concreto. De la
misma manera se pueden emplear promotores inducibles, que requieren la
presencia de un elemento concreto para ejercer su funcin. ste puede ser un
agente de adiccin exgena (control externo) o un agente determinado por
caractersticas fisiolgicas especiales (como por ejemplo promotores activos
ante situaciones de hipoxia). Otros elementos del soporte que pueden ser
importantes dependiendo de la funcionalidad perseguida son los potenciadotes
y represores de los promotores, secuencias de aislamiento (insulators) que
impiden las influencias de secuencias reguladoras prximas, secuencias de
integracin (para permitir la inclusin del material exgeno dentro del genoma
de la clula hospedadora), secuencias de recombinacin homloga (para
permitir el intercambio de material gentico con el genoma hospedador con una
regin especfica), secuencias de empaquetamiento (para introducir el material
gentico en el interior de un vector viral), secuencias inmunoestimulantes
(secuencias bacterianas del tipo islas CpG no metiladas que sirven como
coadyuvantes en las vacunas de ADN)

Los vectores son los encargados de asegurar la estabilidad del material

gentico transportado y de vencer todas las barreras biolgicas hasta alcanzar
su destino final, el ncleo de la clula diana, donde tiene lugar la regulacin
gnica. Tambin de ellos va a depender la va de administracin a utilizar.

En los casos de transferencia gnica en individuos postnatales, el vector ha de

solventar barreras en su camino hacia su destino funcional. Entre estas
barreras se incluyen: la estabilidad en el medio extracelular (para evitar su
degradacin y eliminacin), el reconocimiento de la clula diana (generalmente
mediante un receptor especfico), su unin a la membrana, su internalizacin
en la clula (normalmente utilizando un sistema de transporte vesicular como la
endocitosis), el escape de los sistemas de degradacin intracelular (lisosomas)
y su entrada final al ncleo, donde debe desmantelarse para permitir que el
material gentico que transporta gane acceso a su ubicacin final y a la
maquinaria de transcripcin.

3. Transfeccin de clulas somticas animales

La transfeccin de clulas somticas es til para el cuidado medico y

veterinario de enfermedades genticas, y para otros propsitos teraputicos o
de mejoramiento de animales. La transferencia de genes a clulas somticas
puede hacerse en el laboratorio (ex vivo) o directamente a las clulas en el
cuerpo (in vivo). En la forma ex vivo, se extraen clulas del individuo para ser
transformadas (proceso por el cual se transfiere exitosamente un gen a una
clula) con el vector que contiene la versin normal del gen. Este mtodo tiene
la ventaja de que la transferencia de genes es ms eficiente y permite la
propagacin de las clulas transformadas para generar grandes cantidades. La
desventaja es que slo es utilizable para el individuo especfico del cual se
extrajeron esas clulas, adems de ser costoso por la gran manipulacin y
control de calidad requeridos. En el mtodo in vivo se administra el vector (que
contiene el gen normal) a los individuos. Este mtodo puede utilizarse con
muchos individuos, lo que disminuye su costo y la infraestructura necesaria,
pero resulta complicado de controlar y la eficiencia es mucho menor.
Los vectores son los vehculos microscpicos que se utilizan para transferir
genes a las clulas, a continuacin se exponen sus caractersticas y su
relevancia. Hay tres principales tipos de vectores: virales, no virales y fsicos.

Virales: El mtodo ms eficaz para llevar genes sanos a las clulas daadas
es por medio de virus que han sido adaptados como vectores. Los virus son
tiles ya que pueden penetrar naturalmente las clulas, insertando en ellas su
material gentico.

Sin embargo, antes de poder usarlos como vectores deben modificarse para
eliminar los genes virales que les permiten replicarse y causar enfermedad. A
estos virus se les llama virus modificados o atenuados, y entre los ms
utilizados como vectores se encuentran los retrovirus, adenovirus y virus
adeno-asociados. Tambin se han desarrollado poxvirus (especialmente el
virus de la vaccinia) para vacunas y terapias gnicas. Actualmente, los vectores
virales son los ms eficientes para transformar clulas, aunque no carecen de
desventajas: son de manufactura costosa, hay lmites a la cantidad de genes
(es decir, la longitud de los fragmentos de ADN) que pueden ser insertados en
los vectores y que pueden llegar a desencadenar una respuesta inmune
(inmunogenicidad).

No virales: Bsicamente se trata de inyectar el fragmento de ADN que

contiene el gen de inters directamente a las clulas o empacado dentro de
otras molculas como son los liposomas (pequeas vesculas de grasa que
pueden transportar sustancias al interior de las clulas). Los vectores no virales
son menos eficientes para transformar clulas, pero no tienen limites para el
tamao del inserto (el tamao del ADN que se va a inyectar), son menos
inmunognicos y ms fciles de elaborar.

Fsicos: Involucran sobre todo inyectores sin aguja y electroporacin. Los

inyectores sin aguja utilizan alta presin para insertar el ADN en clulas de la
piel o en clulas en cultivo, mientras que la electroporacin utiliza pulsos
elctricos que abren temporalmente agujeros en las membranas de las
clulas, permitiendo insertar el ADN. Los mtodos fsicos an son ineficientes
en la transformacin y tienen un rango limitado de aplicacin.

Los riesgos de la terapia gnica continan siendo difciles de cuantificar. Por

ello cada ensayo debe comenzar lentamente, con un control muy cuidadoso de
la dosis de vectores que contengan los genes que se pretende insertar. Estos
riesgos tomaron una nueva dimensin en el otoo de 1999, cuando un joven de
18 aos muri cuatro das despus de haber iniciado un tratamiento con terapia
gnica. Los mismos riesgos podemos asumir para el resto de especies
animales manipuladas genticamente.

4. Transgnesis

La transgnesis se puede definir como la introduccin de ADN extrao en un

genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a
todas las clulas en los organismos multicelulares. Generalmente, en animales,
el ADN extrao, llamado transgen, se introduce en zigotos, y los embriones que
hayan integrado el ADN extrao en su genoma, previamente a la primera
divisin, producirn un organismo transgnico; de modo que el transgn pasar
a las siguientes generaciones a travs de la lnea germinal (gametos).

Entre las aplicaciones de los animales transgnicos se pueden destacar:

La posibilidad de estudiar a nivel molecular el desarrollo embrionario y

su regulacin.
Manipular de forma especfica la expresin gnica in vivo.
Estudiar la funcin de genes especficos.
Poder utilizar a mamferos como biorreactores para la produccin de
protenas humanas.
La correccin de errores innatos de metabolismo mediante terapia
gnica.

La transgnesis se puede efectuar siguiendo dos estrategias comunes,

microinyeccin de zigotos y la manipulacin de clulas embrionarias, las cuales
se describen brevemente a continuacin:
1. Transgnesis por microinyeccin de zigotos
Desde que en 1982 se obtuviera un ratn transgnico, la produccin de
animales transgnicas es cada vez ms cotidiana, existiendo ya
animales transgnicos de las siguientes especies: ratn, rata, conejo,
cerdo, vaca, cabra y oveja.
La tcnica se realiza, fundamentalmente por microinyeccin y se realiza
de la siguiente forma:
o En la primera fase, se aslan un nmero grande de vulos
fertilizados. Se consigue sometiendo a las hembras a un
tratamiento hormonal para provocar una superovulacin.

La fertilizacin puede hacerse in vitro o in vivo.

o En la segunda fase, los zigotos obtenidos se manipulan

uno a uno y con una micropipeta a modo de aguja, se
introduce una solucin que contiene ADN.
o En la tercera fase, estos vulos son reimplantados en
hembras que actuarn como nodrizas permitiendo la
gestacin hasta trmino.
Por ltimo, tras el destete de los recin nacidos, stos se chequean,
para ver si ha ocurrido la incorporacin del transgn.

2. Transgnesis por manipulacin de clulas embrionarias.

Una estrategia ms poderosa para la transgnesis implica la
introduccin de ADN extrao en clulas embrionarias totipotentes
(clulas ES) o clulas embrionarias madres (clulas EM).
Estas clulas se toman del interior de la blstula en desarrollo y se
pasan a un medio donde se tratan con distintos productos con lo que se
conseguir que las clulas no se diferencien, y se mantiene su estado
embrionario.
El ADN extrao se introduce en las clulas ES mediante diversas
tcnicas, posteriormente las clulas transfectadas son reintroducidas en
una blstula y sta reimplantada en una hembra.
Con esta tcnica los neonatos son quimeras; pero mediante el cruce de
stas se consiguen animales transgnicos con aquellas quimeras que
hayan incorporado el transgn en su lnea germinal.
El ganado transgnico que se emplea para producir protenas
teraputicas, debe contener en el ADN extrao de sus clulas, adems
del gen codificante de la protena, una secuencia o promotor que haga
que se exprese dicho gen en unas determinadas clulas solamente.
Por ejemplo, si se quiere que la protena se produzca junto con la leche,
el transgn se fusiona con una secuencia reguladora de una protena de
la leche, con lo que la protena slo se formar en las clulas de
glndulas mamarias.
Esto es lo que se hizo con la oveja Tracy en 1992, la primera oveja que
produjo una protena humana, la alfa-antitripsina bajo la direccin del
promotor ovino de la beta-lactoglobulina. Dicha protena se produce en
una cantidad de 35 g/l, la cual se emplea para curar el edema pulmonar.
Lo mismo se ha hecho para la famosa cerda Genie, que fabrica en su
leche la protena C humana que controla la coagulacin sangunea y es
necesaria para los hemoflicos.

Adems de estas tcnicas existen otras alternativas que se describirn

ms adelante, y algunas de las cuales son una combinacin.

Transferencia gnica con transposones

Los transposones se definen como elementos transponibles que
contienen genes adicionales a parte de los necesarios para la
transposicin y estn dentro de secuencias repetidas. Dentro de esta
categora se encuentran los trasposones compuestos de procariotas,
familia Tn3, elemento P de Drosophila, secuencias Alu de mamferos,
retrotrasposone.
Clasificacin de los elementos transponibles
 Estructura bsica de los trasposones

Los trasposones son secuencias de material genmico que tienen la capacidad del
saltar fuera y dentro del genoma. Son capaces de autorreplicarse e integrarse
aleatoriamente en nuevos sitios dentro del genoma (trasponerse o saltar). Pueden
entrar en plsmidos y ser propagados por ellos. Estas propiedades les confieren la
capacidad de ser transferidos exitosamente en clulas y genomas extraos.

La ingeniera gentica puede manipular estos trasposones para llevar a cabo

transferencia horizontal de genes. La transferencia horizontal de genes es la
transferencia de material gentico entre clulas y genomas que pertenecen a especies
no relacionadas, por procesos distintos a la reproduccin. Un ejemplo de ello es el uso
de los trasposones de salmnidos para la transferencia gnica en vertebrados. Los
trasposones de vertebrados de la familia Tc1/mariner contienen como mnimo un gen
nico que codifica la enzima trasposasa flanqueada por dos repeticiones terminales
invertidas (tir). Cada una de las tir posee uno o varios sitios de 20-30 p.b. de
interaccin con la trasposasa. La trasposasa interacciona con estos sitios para cortar el
trasposn, luego interacciona con secuencias presentes en el genoma en otro locus y
pega el trasposn en el nuevo locus. En vertebrados todos los trasposones que se han
detectado estn inactivados por mutaciones. Sin embargo recientemente se ha
obtenido un trasposn activo de salmnidos mediante mltiple mutagnesis dirigida.
Dicho transposn denominado Bella durmiente o Sleeping beauty (SB) se puede
usar en todos los vertebrados analizados hasta el momento como vehculo de
incorporacin de nuevos genes y para inactivar genes en el genoma por insercin.
Esquema de un procedimiento para integrar genes en clulas usando trasposones.

Transferencia gnica con vectores virales

Los vectores virales son todos aquellos que han sido obtenidos a partir de un virus,
tratando de eliminar sus caractersticas patolgicas y adaptarlos a una nueva funcin
como transportadores de material gentico heterlogo. Pretenden aprovechar las
ventajas que aportan los virus como vectores naturales que han sufrido procesos de
evolucin complejos a lo largo de millones de aos para optimizar su funcin de
introductores de material gentico en las clulas que invaden. Para modificar un virus
y transformarlo en un vector de transferencia gnica en animales, el primer paso es
bloquear su capacidad de propagacin eliminando los genes responsables de su
replicacin. El segundo paso es la eliminacin de parte del genoma viral para crear
espacio para introducir el material gentico de inters (gen o genes, ms los elementos
de control). Se han de eliminar genes que no sean esenciales, y especialmente aquellos
que puedan resultar txicos o perjudiciales para el individuo a manipular.

La ventaja de los vectores virales en la gran eficacia de transferencia y la posibilidad,

en algunos casos, de integrar el transgen en el genoma de la clula hospedadora. Por
otro lado presentan desventajas como su falta de especificidad celular en la mayora
de los casos, la limitacin del tamao (debido a que han de empaquetarlo en la
cpsida), su elevada inmunogenidad y el riesgo biolgico que conllevan (reconstitucin
de partculas replicativas por recombinacin, y oncogenidad inducida por integracin
inespecfica.

Se han usado retrovirus y lentivirus como vectores para integrar transgenes en

genomas animales. Esta tcnica se ha usado en ratones con xito y se ha extendido a
gallinas, vacunos y suinos.

Vectores retrovirales:

Los retrovirus son virus de ARN con envuelta. Poseen una elevada eficacia de
transduccin en un gran nmero de tipos celulares, son capaces de integrarse de
forma estable en el genoma de las clulas que infectan sin expresar ninguna protena
viral inmunognica, y son relativamente poco patognicos, con excepcin de algunos
como el VIH. La mayora de ellos derivan del virus de la leucemia murina (MuLV).

En general, su principal limitacin es que slo pueden transducir eficazmente clulas

en divisin, ya que el acceso al ncleo del complejo de preintegracin requiere la
ruptura de la membrana nuclear. Hay un tipo de retrovirus, los lentivirus, que si que
pueden infectar e integrarse en clulas quiescentes, como el VIH y SIV, pero el riesgo
inherente al uso de los mismos limita su aplicacin.

Otro inconveniente que tiene el uso de retrovirus como vectores es la poca estabilidad
de las partculas y su baja tasa relativa de produccin. Esto ha sido parcialmente
resuelto con la sustitucin de la protena de la envuelta por la glicoprotena G del virus
de la estomatitis vesicular que posibilita la obtencin de ttulos de hasta 109 p.i. /ml y
estabiliza las partculas.

Debido a que estos virus tienen un rango de infectividad muy amplio, cuando se quiere
transducir selectivamente una poblacin celular, se le incorporan ligandos heterlogos
o anticuerpos monocatenarios que generan nuevas especificidades. Son vectores que
poseen protenas quimricas en la envuelta.

Contrario a la percepcin de muchos, los primeros animales transgnicos fueron

producidos hace ya casi 30 aos mediante la microinyeccin de ADN viral (SV40) en la
cavidad del blastocele de embriones de ratn (Jaenish y Mintz, 1974). Los prximos
intentos involucraron embriones de ratn infectados con el retrovirus Moloney de la
leucemia murina (MoMuLV), lo que result en la transmisin estable hacia la lnea
germinal (Jaenish, 1976). Esto se logr reemplazando genes que no son esenciales para
el virus por genes heterlogos, aprovechando as la capacidad de los virus de infectar
un amplio espectro de clulas y con una gran eficiencia. Una de las grandes
desventajas de este mtodo radica en que la integracin del ADN se produce en
diferentes etapas del embrin en desarrollo, lo que implica que el ADN no se integra
en todas las clulas somticas o en la lnea germinal y por lo tanto no hay transmisin
del transgen a la descendencia. Adems, los animales generados por este mtodo
tienen a menudo ms de un sitio de integracin, lo cual ocurre cuando ms de una
clula del embrin es infectada por el virus (Palmiter y Brinster, 1985). Esto implica
que las lneas de ratones transgnicos deben ser cruzadas para segregar los diferentes
loci conteniendo el transgen y poder as aislar lneas con un sitio de insercin nico.
Finalmente, los vectores retrovirales poseen una limitada capacidad de ADN forneo
que puede ser acomodado, alrededor de 8 kb, lo cual imposibilita muchos
experimentos especialmente con secuencias genmicas humanas que pueden superar
ampliamente este tamao.

Vectores Adenovirales

Los adenovirus son virus de DNA sin envuelta con un genoma bicatenario hasta 36 kb.
Se han seleccionado los serotipos 2 y 5 para la obtencin de vectores por no estar
asociados con ninguna enfermedad severa ni originar tumores en animales. Pueden
transducir un nmero bastante amplio de tipos celulares distintos, tanto clulas en
divisin como post-mitticas, con una eficacia muy elevada. El genoma viral se
mantiene epismico, lo que permite una expresin gentica transitoria. Originalmente
la capacidad del vector para incorporar ADN era de hasta 8 kb. Recientemente se ha
conseguido eliminar casi todo el genoma viral, manteniendo las secuencias de
empaquetamiento y las secuencias terminales, rindiendo vectores que pueden
incorporar hasta 35 kb a los que se les ha denominado vectores sin tripas (gutless).
La eliminacin de material genmico viral adems de aumentar la capacidad del vector
de incorporar ADN, disminuye el riesgo de induccin de respuesta inmune. La mayora
de la poblacin ha sido infectada en algn momento por adenovirus y presenta una
respuesta inmune inicial. Una de las mayores ventajas de estos virus es su alta
reproductividad con ttulos de hasta 1010 p.i./ml, y su gran estabilidad, que les
permiten ser concentrados adicionalmente para alcanzar valores de 1012 p.i./ml. Su
falta de especificidad celular se compensa con el desarrollo de estrategias de
redireccionalidad. Quimeras que introducen ligandos especficos en protenas de la
cpside y molculas biespecficas que reconocen tanto la cpside viral como el
receptor seleccionado.

Vectores de virus adenoasociados

Los virus adenoasociados son parvovirus humanos no patolgicos. Son pequeos virus
sin envuelta con un genoma de ADN monocatenario, capaces de infectar un gran
nmero de clulas de origen diverso, tanto en divisin como en su estado quiescente.
Pueden integrarse en la clula hospedadora en un lugar especfico del genoma,
eliminando la posibilidad de mutagnesis insercional. Otra ventaja en la carencia de
respuesta inmune observada in vivo. Tiene una reducida capacidad de transporte
(4,5 kb) y su reproduccin es tediosa porque necesitan un virus de apoyo (adenovirus o
herpesvirus), los cuales son difciles de eliminar completamente. Originalmente se
descubri que al eliminar parte del genoma viral para introducir el transgen se perda
la capacidad de integracin especfica. Recientemente se ha descubierto que la
protena Rep78, en presencia de los ITRs, es capaz de potenciar la integracin
especfica en el genoma celular y podra solucionar este problema. La falta de
especificidad celular ha sido solucionada empleando estrategias de molculas
biespecficas.

Vectores virales de transferencia gnica

Vectores virales quimricos

Consiste en la combinacin de varios vectores para compensar las limitaciones que

tienen por separado, y aprovechar las ventajas ms destacables que poseen de forma
individual. Un ejemplo es la quimera adenovirus-retrovirus, en la que se utilizan dos
tipos de vectores adenovirales: uno incorpora la maquinaria de empaquetamiento
retroviral, y el otro introduce el material gentico equivalente a un vector retroviral. Se
aprovecha la eficacia de transduccin de los vectores adenovirales para cotransfectar
con ambos vectores, transformando las clulas diana en productoras de vectores
retrovirales. Los vectores as generados son capaces de infectar clulas vecinas e
integrarse en su genoma.

5. Transplante de ncleos y clones

a) Clonacin

Las tcnicas para llevar a cabo clonacin celular artificial requieren un proceso de
elaboracin o de manipulacin que permite obtener copias idnticas o casi idnticas
de las clulas madre o progenitoras utilizadas. Si el producto o embrin se transfiere a
un tero, se produce la implantacin en el endometrio y se desarrolla un nuevo ser
(clonacin reproductiva). Pero si se transfiere a un medio de cultivo, el embrin dar
origen a clulas madre embrionarias con la potencialidad para diferenciarse hacia
cualquier tipo de clula adulta (clonacin teraputica).

b) Mtodos de clonacin
1. Particin. En esta tcnica se utilizan embriones octocelulares, en estado de
preimplantacin. A partir del embrin seleccionado, se toman mitades o
secciones que posteriormente se introducen dentro de zonas pelcidas
naturales o artificiales. A continuacin, se efecta la implantacin del producto
en el endometrio. El nmero mximo de clulas del embrin, no puede ser
superior a 8, porque a partir de este momento, se inicia la expresin del
genoma embrionario. Los individuos obtenidos son prcticamente idnticos
entre s, aunque diferentes a los progenitores, por lo cual se considera que son
el equivalente de los gemelos monocigticos. Esta tcnica, empleada por
Wilmut en 1999, se ha seguido ampliamente para la clonacin de animales de
granja. Como ejemplos de esta tcnica estn las ovejas Megan y Morag, del
Roslin Institute obtenidas en el 2000
2. Clonacin por transferencia nuclear de clulas somticas (SCNT: Somatic Cell
Nuclear Transfer). Esta tcnica se basa en la habilidad de inyectar o fusionar
vulos carentes de ncleos con ncleos diploides derivados de clulas
somticas en cultivo. Estas clulas pueden ser transfectadas de manera estable
y proporcionar cientos de animales idnticos en una generacin. La
transferencia nuclear se describi por primera vez en 1952 en anfibios y
consisti en extraer el material gentico de un ovocito para posteriormente
introducirle el material gentico de una clula del animal a clonar. Los trabajos
pioneros de Briggs y King (1957) demostraron que los ncleos de clulas al
estado de blastocisto eran capaces de dirigir el desarrollo embrionario normal
de ovocitos reconstituidos y generar una rana adulta a partir de estas clulas.
En la dcada de los ochenta se realizaron exitosamente transferencias
nucleares en la mayora de los mamferos como conejos (Stice y Robl, 1988),
cerdos (Prather, y col., 1989), bovinos (Prather y col., 1987) y ovejas (Willadsen,
1986; Smith y Wilmut, 1989). Estos experimentos se realizaron por medio de la
disociacin de blastmeros embrionarios (clulas embrionarias no
diferenciadas) y su posterior transferencia nuclear. Sin embargo, los intentos
por realizar transferencia nuclear con clulas ms diferenciadas fueron
infructuosos, lo que llev a pensar que el ADN de clulas diferenciadas no
poda reprogramarse, surgiendo entonces el dogma de que el proceso de
diferenciacin celular era irreversible. Este dogma se derrumb el 27 de
febrero de 1997, fecha en que Ian Wilmut y sus colegas del Instituto Roslin, en
 Edimburgo, Escocia, explicaron en la revista Nature cmo haban creado a la
oveja Dolly .

Dolly: El primer mamfero clonado por transferencia nuclear desde una clula
diferenciada.

Se ha obtenido una notable eficiencia en el desarrollo de los embriones as

clonados hasta el estado de blastocisto, cuando el ncleo inyectado se encuentra
 en fase M (Wakayama T 1998, Li X, Li Z, 2003). En cualquier caso, una clonacin
exitosa requiere reprogramar el ncleo de la clula somtica donante, debido a
que la cromatina ha sufrido previamente transformaciones epigenticas
incompatibles con el desarrollo embrionario, que incluyen la desacetilacin de las
histonas y la metilacin del ADN.

3.Paraclonacin. Consiste en inyectar ncleos de clulas madre embrionarias en

cultivo, dentro de oocitos enucleados y, a veces, de cigotos nucleados. Los
blastmeros se obtienen a partir de varias fuentes como la masa celular interna o
el trofoectodermo de embriones preimplantados y sus ncleos son transferidos
dentro de oocitos enucleados6. Los individuos obtenidos son casi idnticos entre s,
aunque diferentes a los padres del embrin que aport el ncleo transferido. Se ha
demostrado que la supervivencia de los clones formados a partir de clulas madre
embrionarias en el instante del nacimiento o hasta la edad adulta, es 10 a 20 veces
mayor que en los derivados de clulas somticas. Por otra parte, los clones
derivados de clulas madre embrionarias tienen mejores posibilidades de reactivar
completamente genes claves para el desarrollo embrionario -tales como oct4 y
10oct4- y as constituir una poblacin de clulas verdaderamente totipotenciales.
Sin embargo, las clulas madre embrionarias, aunque requieren un menor grado
de reprogramacin que las clulas somticas, presentan una elevada inestabilidad
epigentica en cultivos in vitro. La inestabilidad se refleja en una expresin
aberrante de la huella gentica, de modo que, cuando estas clulas se utilizan
como donantes para la clonacin reproductiva, el fenotipo fetal y placentario de
los clones, exhibe graves patrones de anormalidad. Sin embargo, cuando se
emplean como fuente de ncleos para la clonacin teraputica, en apariencia no
ocurre este error, pues, durante la reprogramacin, se seleccionan tan slo las
clulas competentes.

6. Transfeccin Estable.
Para la generacin de lneas celulares estables el transgen de inters debe ser
co-transfectado con un marcador de seleccin que produzca resistencia a una
droga. Para cada ensayo de transfeccin estable se debe monitorear de
manera cuidadosa la integracin del transgen en el genoma de la clula blanco.
En un experimento de transfeccin tpico se debe permitir a las clulas
recuperarse de la transfeccin por un periodo de 24 a 72 horas en la ausencia
de seleccin. Esto permite a la clula expresar la cantidad necesaria de la
enzima de resistencia para proteger a las clulas transfectadas establemente
contra la droga. Despus de 48 o 72 horas de la transfeccin el medio de
cultivo debe ser cambiado y reemplazado con medio nuevo
complementado con la droga. La seleccin se produce dentro de las primera a
las tercera semana posterior a la transfeccin con cambios frecuentes del
medio de cultivo selectivo. Finalmente la integridad y nmero de copias del gen
debe ser determinado por Southern Blot.
El mtodo ms utilizado en la investigacin clnica para lograr una transfeccin
estable es el de la transfeccin mediada por virus, tambin conocida como
transduccin (Pfeifer & Verma, 2001). Este mtodo es altamente eficiente
debido a la naturaleza viral de la integracin en el genoma del husped. Por
ejemplo, se ha utilizado el virus de la leucemia murine (MLV) como vector viral
para establecer la expresin sostenible de genes de inters en humanos
(Roesler et al. 2002). El MLV integra su ADN en el genoma del hospedero, el
cual es posteriormente expresado. El ADN del MLV integrado se replica con el
genoma del hospedero, lo que permite la expresin sostenible del gen de
inters.
Diagrama esquemtico de dos transfecciones diferentes. A. Transfeccin
estable. El ADN forneo (rojo) es llevado al ncleo al pasar por la
membrana celular y nuclear. El ADN es integrado al ADN genmico
(negro) y expresado de manera sostenible. B. Transfeccin transitoria. El
ADN forneo es transportado dentro del ncleo pero no es integrado en el
genoma. El mARN (azul) tambin es llevado al citosol, en donde es
traducido. Los hexgonos representan las protenas expresadas a partir
de los cidos nuclicos transfectados. Las flechas negras muestran el
transporte del cido nuclico. Tomado de Recillas-Targa (2006).

La citotoxicidad y la inmunogenicidad representan las mayores desventajas de

la transfeccin mediada por virus. La introduccin del vector viral puede causar
una reaccin inflamatoria y una mutacin insercional, debido a que ciertos
vectores virales se integran de manera azarosa al genoma del hospedero, lo
cual puede afectar a genes supresores de tumores, activar oncogenes, o
interrumpir genes esenciales (Woods et al. 2003). Otra desventaja de este
mtodo es que la cpside de un virus tiene espacio limitado para que un gen
extrao pueda ser infectivo.

7. Aplicaciones de la Transfeccin.
 La transfeccin es una herramienta para la modificacin gentica.
Gracias a sus mltiples mtodos es posible realizar innumerables
aplicaciones como:
Estudios genticos: genes 'knockout' o 'knockdown' para estudiar su
expresin fenotpica.
Terapia gnica: Cura de enfermedades.
Protenas recombinantes: Uso de animales como bio-fbricas.
Alimentostransgnicos:Modificacionesge
n t i c a s principalmente para alimentacin.
Biorremediacin: Reduccin del impacto ambiental de la
industria ganadera.
Mascotas transgnicas: Peces brillantes, gatos hipoalergnicos,
etc.

A continuacin analizaremos cada una de ellas utilizando ejemplos

realizados en empresas y universidades.
8. Estudios Genticos
La transfeccin puede ser til para el estudio del funcionamiento de
genes. Esto se puede realizar por varios medios: introduciendo un gen
de otro organismo (transgensis), mediante un knockout o knockdown
que anule la expresin de un gen (Cryan & Mombereau 2004),
aumentando la expresin del gen de estudio (Yanni 2004), o alterando la
estructura
de la protena que codifica (Ripps et al. 1995).
De esta manera, este procedimiento ha permitido la realizacin de
estudios sobre el funcionamiento de diversos genes humanos,
principalmente con fines mdicos. Estas investigaciones incluyen el
anlisis de la influencia gentica en trastornos psicolgicos y
neurodegenerativos, mediante la evaluacin del fenotipo producido
utilizando mecanismos de transfeccin (principalmente utilizando
modelos murinos). As vemos que la transfeccin ha permitido evaluar el
impacto de la reduccin de la enzima SOD-1 en la neurodegeneracin
producida en la Esclerosis Lateral Amiotrfica (ELA) (Ripps et al. 1995).
Asimismo, ha permitido el estudio de la relacin de diversos receptores
de neurotransmisores como la depresin (Cryan & Mombereau 2004), el
autismo, la esquizofrenia, el Alzheimer, la enfermedad de Huntington,
entre otros (Bucn & Abel 2002).
La transfeccin tambin ha permitido evaluar el impacto de los genes en
la regulacin enzimtica del metabolismo de lpidos, r e l a c i o n a d a c
o n e n f e r m e d a d e s cardiovasculares como la aterosclerosis (Yanni
2004).
9. Terapia Gnica.
 La terapia gnica es una importante aplicacin de la transfeccin a la
medicina. Muchos de sus usos continan en experimentacin in vitro o
en animales, sin embargo, este campo tiene un gran potencial:
Cncer.
Enfermedades congnitas.
Curacin de heridas, quemaduras y otras afecciones epiteliales

La terapia gnica se puede emplear para curar diversos tipos de cncer

mediante mltiples mtodos. Uno de estos mtodos es el de vacunacin anti-
tumoral. Este consiste en utilizar la transfeccin para producir antgenos
asociados al crecimiento tumoral. Adems, se puede utilizar esta tecnologa
para inducir la produccin de citoquinas que inhiban la angiognesis.
Asimismo, se puede usar para inducir el metabolismo de protoxinas por las
clulas tumorales, haciendo que los medicamentos contra el cncer sean de un
impacto ms directo y controlado (Vile et al. 2000).

La terapia gnica puede asimismo ser utilizada para suprimir o controlar

enfermedades congnitas, o aliviar sus sntomas, evitando a su vez los efectos
secundarios que podra producir el uso de frmacos (Spink & Geddes 2004).
En el caso de quemaduras, cortes, o afecciones epiteliales provocadas por
diversas enfermedades (como el acn o el lupus eritematoso), muchas veces,
la curacin es lenta y deja muchas cicatrices debido a la ausencia o a la baja
produccin de factores de crecimiento. La transfeccin en tejidos epiteliales,
probada a la fecha slo en cultivos celulares y ratones, ha comprobado ser til
tanto para fomentar la regeneracin de dichos

tejidos, como para inducir su vascularizacin y reducir las cicatrices (Branski et

al. 2006, Strulovici et al. 2007).

10. Protenas Recombinantes

Uno de los principales objetivos de la modificacin gentica de animales es la
produccin masiva de protenas. Al buscarse en estos casos la produccin, en
lugar de la expresin en el animal en s, la modificacin gentica en estos
casos se enfoca en la leche de diversos mamferos (ovejas, cabras, vacas,
chanchos, entre otros). Esta produccin masiva se concentra en protenas
humanas de aplicacin biomdica como algunos factores de coagulacin,
fibringeno, colgeno, enzimas y anticuerpos de origen humano; adems de en
la produccin de protenas de origen viral que podran servir para inmunizar a
las personas ante diversas enfermedades (Durocher et al. 2002, Kling 2009).
Una de estas protenas con fines teraputicos, ATryn (Antitrombina III),
producida en cabras transgnicas creadas por la empresa GTC
Biotherapeutics, fue diseada para combatir la trombosis. Esta fue la primera
de estas protenas en ser aprobada para su comercializacin en Agosto del
2006 por la Comisin Europea, luego de un reporte positivo de parte de la
EMEA (Agency de Medicinas Europea) (Schmidt 2006). Posteriormente, luego
de ms ensayos, La FDA acept su comercializacin en EEUU en el 2009 (
Fox 2008, Kling 2009).
11. Mascotas transgnicas
La transfeccin permite la obtencin de mascotas con caractersticas
deseables comercialmente que, sin embargo, no se encuentren en estado
natural. Estos han creado un nuevo nicho de mercado con un enorme potencial
de crecimiento (Iannacone 2007).
Un ejemplo muy interesante de mascotas transgnicas es el de los peces
transgnicos. Inicialmente, Gong y colaboradores en la Universidad de
Singapur, modificaron peces cebra(Danio rerio) para expresar las protenas
fluorescentes GFP (protena verde fluorescente), YFP (protena amarillo
fluorescente) y RFP (protena rojo fluorescente) que actan en asociacin con
el gen mylz2, produciendo diferentes peces de distintos colores fluorescentes.
En 2003, la Universidad de Singapur realiz un trato con Yorktown
Technologies, que comenz a comercializarlos como mascotas bajo el nombre
comercial de GloFish luego de una evaluacin de su posible impacto
ambiental y alimenticio llevado a cabo por la FDA, 2003. Adems de estos,
existen peces Medaka (Oryzias latipes) fluorescentes, creados por
investigadores de la Universidad de Taiwan y comercializados en dicho pas
(Gong et al. 2003; Scotto & Serna 2013) .
Otro caso importante de mascotas genticamente modificadas es el de los
gatos hipoalergnicos, actualmente en desarrollo por la empresa Felix Pets en
EEUU. La expresin de la protena Fel-dI (principal alrgeno, responsable del
90% de los casos de alergia a gatos en humanos) se puede inhibir, silenciando
el gen que la produce mediante la insercin de una secuencia llamada neo-r en
el primer o segundo intrn del gen (Avner et al. 2012, Butt et al. 2012).
12. TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE
Generalidades de la tecnologa del DNA recombinante. El trmino DNA
recombinante hace referencia a la creacin de nuevas combinaciones de
segmentos o de molculas de DNA que no se encuentran juntas de manera
natural. Aunque el proceso gentico de la recombinacin produce DNA
recombinante, este trmino se reserva a las molculas de DNA producidas por
la unin de segmentos que provienen de diferentes fuentes biolgicas. La
tecnologa del DNA recombinante utiliza tcnicas que provienen de la
bioqumica de los cidos nucleicos unidas a metodologas genricas
desarrolladas originalmente para la investigacin de bacterias y de virus. La
utilizacin del DNA recombinante es una herramienta poderosa para el
aislamiento de poblaciones puras de secuencias especficas de DNA a partir de
una poblacin de secuencias mezcladas. Los procedimientos bsicos incluyen
una serie de pasos:
1. Los fragmentos de DNA se generan utilizando unas enzimas denominadas
endonucleasas de restriccin, que reconocen y cortan las molculas de DNA
por secuencias nucleotdicas especficas.
2. Los fragmentos producidos mediante la digestin con enzimas de restriccin
se unen a otras molculas de DNA que sirven de vectores. Los vectores
pueden replicarse autnomamente en una clula husped y facilitan la
manipulacin de la molcula de DNA recombinante recin creada.
3. La molcula de DNA recombinante, formada por un vector que lleva un
segmento de DNA insertado, se transfiere a una clula husped. Dentro de
esta clula, la molcula de DNA recombinante se replica, produciendo docenas
de copias idnticas conocidas como clones.
4. Al replicarse las clulas husped, las clulas descendientes heredan el DNA
recombinante, crendose una poblacin de clulas idnticas, que llevan todas
la secuencia clonada.
5. Los segmentos de DNA clonados pueden recuperarse de las clulas
husped, purificarse y analizarse.
6. Potencialmente, el DNA clonado puede transcribirse, su mRNA puede
traducirse, y el producto gnico puede aislarse y examinarse.
Fabricacin del DNA recombinante.
El desarrollo de las tcnicas de DNA recombinante ofrece nuevas
oportunidades para la investigacin, ya que simplifica la obtencin de grandes
cantidades de DNA que codifican genes especficos, y facilita las
investigaciones de la organizacin, estructura y expresin gnicas. Esta
metodologa tambin ha dado un impulso al desarrollo de la naciente industria
biotecnolgica, que est suministrando un nmero creciente de productos al
mercado. El DNA recombinante produce grandes cantidades de copias de
segmentos de DNA especficos, incluyendo genes.
Enzimas de restriccin.
La piedra angular de la tecnologa del DNA recombinante es un tipo de
enzimas denominadas endonucleasas de restriccin. Estas enzimas, aisladas
en bacterias, reciben este nombre debido a que limitan o previenen las
infecciones vricas degradando el cido nucleico invasor. Las enzimas de
restriccin reconocen una secuencia especfica de nucletidos (denominada
sitio de restriccin) de una molcula de DNA de doble cadena, y cortan el DNA
por esa secuencia. El premio Nobel de 1978 se otorg a Werner Arber,
Hamilton Smith y Daniel Nathans por su investigacin sobre las enzimas de
restriccin. Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de
enzimas de restriccin diferentes.

La enzima de restriccin Eco RI reconoce y se une a la secuencia palindrmica

GAATTC. El corte del DNA en este sitio produce colas de cadena sencilla
complementarias. La colas de cadena sencilla resultantes pueden unirse con
colas complementarias de otros fragmentos de DNA para formar molculas de
DNA recombinante.
Las enzimas de restriccin se denominan segn el organismo en el que se
descubrieron, utilizando un sistema alfanumrico. La enzima Eco RI proviene
de Escherichia coli ; Hin dIII se descubri en Hemophilus influenzae . Hay dos
tipos de enzimas de restriccin
Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posicin
aleatoria a cierta distancia del sitio de restriccin. No se utilizan
normalmente en la investigacin de DNA recombinante ya que el sitio
de corte no es preciso.
Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia especfica y cortan
las dos cadenas de la molcula de DNA con absoluta precisin dentro
de la secuencia reconocida.
Se usan ampliamente en investigacin de DNA recombinante puesto que
cortan en sitios especficos. Las secuencias reconocidas por las enzimas de
Tipo II son simtricas (palindrmicas), es decir, la secuencia de una de las
cadenas leda en direccin 5' 3' es la misma que la secuencia de la cadena
complementaria leda tambin en direccin 5' 3'. La enzima Eco RI corta las
cadenas de manera escalonada dentro del sitio de reconocimiento, dejando
extremos de cadena sencilla. Estas colas, que tienen secuencias nucleotdicas
idnticas, son pegajosas (cohesivas), ya que pueden unirse a colas
complementarias de otros fragmentos de DNA mediante puentes de hidrgeno.
Si molculas de DNA de diferente origen comparten los mismos sitios de
reconocimiento palindrmicos, ambas tendrn colas complementarias de
cadena sencilla cuando se traten con una endonucleasa de restriccin. Si estos
fragmentos se ponen juntos bajo determinadas condiciones, los fragmentos de
DNA de distinto origen pueden formar molculas recombinantes estableciendo
puentes de hidrgeno entre los extremos cohesivos. Luego se utiliza la enzima
DNA ligasa para unir covalentemente los esqueletos azcar-fosfato de los dos
fragmentos, producindose as una molcula de DNA recombinante.
Otras enzimas de restriccin de Tipo II, como Sma I, cortan el DNA formando
fragmentos romos. Los fragmentos de DNA con extremos romos tambin
pueden unirse y formar molculas recombinantes, pero primero deben
modificarse. La enzima desoxinucleotidil transferasa terminal se utiliza para
crear extremos de cadena sencilla mediante la adicin de colas de
nucletidos. Si a uno de los DNA se le aade una cola de polidA, y al otro DNA
se le aade una cola de poli-dT, se forman colas complementarias, y los
fragmentos pueden unirse mediante puentes de hidrgeno. Entonces, por
ligacin, pueden formarse molculas recombinantes.

Las molculas de DNA recombinante pueden formarse a partir DNA cortado

con enzimas que dejan
extremos romos. En este
mtodo se utiliza la enzima
desoxinucleotidil transferasa
terminal para crear colas
complementarias mediante la
adicin de fragmentos de poli-
dA y de poli-dT. Estas colas
sirven para unir el DNA de
diferentes fuentes y para crear
molculas de DNA
recombinante, que son unidas
covalentemente por
tratamiento con la DNA ligasa.

Vectores Despus de unirse a un vector o vehculo de clonacin, un segmento

de DNA puede llegar a entrar en una clula husped y replicarse o clonarse.
Los vectores son, esencialmente, molculas de DNA transportadoras. Para
servir de vector, una molcula de DNA debe tener unas determinadas
caractersticas:
1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA
que transporta.
2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restriccin,
presentes slo una vez en el vector. Estos sitios de restriccin se cortan con
una enzima de restriccin y se utilizan para insertar segmentos de DNA
cortados con la misma enzima.
3. Debe tener algn marcador de seleccin (normalmente genes de resistencia
a antibiticos o genes de enzimas que la clula husped no tiene) para poder
distinguir las clulas husped que transportan el vector de las que no lo
contienen.
4. El vector de la clula husped debe ser fcil de recuperar. Actualmente se
utilizan tres tipos principales de vectores: los plsmidos, los bacterifagos y los
csmidos.
Plsmidos. Los plsmidos son molculas de DNA de doble cadena
extracromosmicas de origen natural que tienen un origen de replicacin (ori+)
y que se replican autnomamente en las clulas bacterianas. Para poder
utilizarlos en ingeniera gentica, se han modificado o diseado muchos
plsmidos de manera que contengan un nmero limitado de sitios de restriccin
y genes de resistencia a antibitico s especficos. El vector pBR322 fue uno de
los primeros plsmidos diseados que se utiliz en DNA recombinante. Este
plsmido tiene un origen de replicacin (ori+), dos genes de seleccin
(resistencia a los antibiticos ampicilina y tetraciclina), y algunos sitios de
restriccin nicos.
Mapa de restriccin del plsmido pBR322, que muestra las localizaciones de
los sitios de las enzimas de restriccin que cortan el plsmido por un solo sitio.
Estos sitios pueden utilizarse para insertar los fragmentos de DNA a clonar.
Tambin se muestran las localizaciones de los genes de resistencia a
antibiticos
Dentro del gen de resistencia a tetraciclina hay sitios de restriccin nicos para
las enzimas Bam HI, Sph I, Sal I, Xma III y Nru I, y dentro del gen de
resistencia a ampicilina hay sitios de restriccin nicos para las enzimas Rru I,
Pvu I y Pst I. Si se introduce pBR322 en una clula bacteriana sin plsmidos y
sensible a antibiticos, la clula se convertir en resistente a la tetraciclina y a
la ampicilina. Si se inserta un fragmento de DNA en los sitios de restriccin Rru
I, Pvu I, o Pst I, se inactivar el gen de resistencia a ampicilina, pero el gen de
resistencia a tetraciclina seguir activo. Si este plsmido recombinante se
transfiere a una clula bacteriana que no contenga plsmidos, las clulas que
contengan el plsmido recombinante podrn identificarse, ya que sern
resistentes a tetraciclina y sensibles a ampicilina.
Con el paso del tiempo se han desarrollado vectores plasmdicos ms
sofisticados, que ofrecen diversas caractersticas tiles. Uno de estos
plsmidos, que deriva de pBR322, es el pUC18, que tiene las siguientes
caractersticas:
El plsmido tiene la mitad de tamao que pBR322, lo que permite
insertar fragmentos de DNA ms largos.
pUC18 se replica produciendo unas 500 copias por clula, lo que
significa unas 5 10 veces ms que las que produce pBR322.
Tiene un gran nmero de sitios de restriccin nicos, agrupados en una
regin denominada sitio de clonacin mltiple (poliylinker).
El plsmido contiene un fragmento de un gen bacteriano denominado
lacZ , y el sitio de clonacin mltiple est insertado dentro de ste
fragmento del gen. El gen lacZ normal codifica la -galactosidasa,
enzima que corta molculas de azcar. Cuando pUC18 se introduce en
una clula husped bacteriana que tiene el gen lacZ mutante, se
produce -galactosidasa funcional. La presencia de -galactosidasa
funcional en una colonia bacteriana puede detectarse mediante un
ensayo colorimtrico. Las clulas bacterianas que contienen pUC18
forman colonias de color azul cuando crecen en un medio que contiene
una sustancia denominada X-gal. Si hay DNA insertado en el sitio de
clonacin mltiple, se interrumpe el gen lacZ y se forman colonias
blancas. Las colonias blancas, resistentes a ampicilina, contienen
plsmidos con DNA insertado.
 El plsmido pUC18 ofrece varias ventajas como vector de clonacin.
Debido a su pequeo tamao, puede aceptar fragmentos de DNA
relativamente grandes; se replica hasta un alto nmero de copias, y
tiene un gran nmero de sitios de restriccin en el sitio de clonacin
mltiple, localizado dentro del gen lacZ . Las bacterias que contienen
pUC18 producen colonias de color azul si crecen en un medio que
contenga X-gal. El DNA insertado en el sitio de clonacin mltiple
interrumpe el gen lacZ , resultando en colonias blancas, lo que permite
la identificacin directa de las colonias que tienen insertos de DNA
clonados.

Bacterifagos lambda (fago ) y M13.

Lambda es un bacterifago muy utilizado en experimentos de DNA
recombinante. Se han identificado y cartografiado todos los genes de lambda,
y se conoce toda la secuencia nucleotdica de su genoma. El tercio central de
su cromosoma es prescindible, y puede reemplazarse por DNA exgeno sin
afectar la capacidad del fago para infectar clulas y formar calvas. Se han
desarrollado ms de 100 vectores basados en el fago lambda, eliminando
diversas porciones del grupo gnico central.
Para clonar utilizando el fago lambda, se corta el DNA del fago con una
enzima de restriccin (por ejemplo, EcoRI), lo que produce un brazo izquierdo,
un brazo derecho y una regin central. Se aslan los brazos y se ligan
(utilizando la DNA ligasa) a un segmento de DNA obtenido tras cortar DNA
genmico con la misma enzima de restriccin (en este ejemplo, con EcoRI).
Las molculas recombinantes resultantes pueden introducirse en clulas
husped bacterianas por transfeccin. Primero, se permeabilizan las clulas
husped mediante un tratamiento qumico, y se mezclan con las molculas
ligadas. Los vectores que contienen el inserto entran en las clulas husped,
donde dirigen la sntesis de fagos infectivos, llevando cada uno de ellos el
inserto de DNA. Como alternativa, se mezcla el DNA de lambda que contiene
el inserto con los componentes proteicos del fago; de esta mezcla se forman
partculas fgicas infectivas. Los fagos pueden amplificarse hacindolos
crecer en placas sembradas con bacterias, donde se formarn calvas, o bien
infectando clulas en un medio lquido y recogiendo las clulas lisadas.

Tambin se utilizan otros bacterifagos como vectores, entre los que destaca el
fago de cadena sencilla M13. Cuando M13 infecta a una clula bacteriana, la
cadena sencilla (cadena +) se replica y produce una molcula de doble cadena
denominada forma replicativa (RF). Las molculas RF pueden considerarse
similares a los plsmidos, pudindose insertar DNA exgeno en sitios de
restriccin nicos presentes en el DNA del fago. Cuando se reinsertan en
clulas bacterianas, las molculas RF se replican y producen cadenas sencillas
(+), en las que hay una cadena del DNA insertado. La clula hace salir los
clones de DNA de cadena sencilla que produce M13, que pueden recuperarse
y utilizarse directamente para su secuenciacin, o como molde para
alteraciones mutacionales de la secuencia clonada.