Universidad Nacional de La Plata

Facultad de Ciencias Naturales y Museo

Estudio de la capacidad antimutagnica del

extracto acuoso de Baccharis articulata

(Lam.) Persson

Lic. Mara de las Nieves Rodrguez

Trabajo para optar por el ttulo de Doctor en Ciencias Naturales

Directores de Tesis: Dres. Leda Giannuzzi y Marcelo L. Larramendy

2013
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A mis hijas Paula y Nieves

A mis nietos Santiago, Clara, Pilar, Camilo y el pequeo Ulises

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AGRADECIMIENTOS

A mis directores de Tesis Dres. Leda Giannuzzi y Marcelo L. Larramendy, por ser la

gua para la realizacin de esta Tesis Doctoral

A Dra. Noemi Zaritzky y el Dr. Rodolfo Mascheroni, por haberme permitido realizar

mi Tesis Doctoral en el CIDCA

A las Dra. Noemi Zaritzky, por su apoyo crtico y enriquecedor. Y a su comprensin

en los momentos difciles de mi vida.

A la Dra. Cristina Aon, por sus consejos en los momentos en que los necesit

A la Dra. Etile Spegazzini, por haber clasificado el material utilizado en mi Tesis

Doctoral

A la Facultad de Ciencias Naturales y Museo, mi casa de estudios

A mis compaeros del CIDCA, a cada uno de ellos por ayudarme de diferente

manera, pero imprescindibles para concretar esta meta

A la Dra. Maria Mercedes Lojo, por compartir sus conocimientos, as como haber

trabajado juntas en la Ctedra de Gentica Microbiana

Al Dr. Mario Reta por ayudarme con las determinaciones en el HPLC

Al Dr. Ariel Vicente por su gua en las determinaciones de la actividad antioxidante

A Sebastian Real diseador grfico que me ayud desinteresadamente para hacer

mis separadores

A mis amigas, Luci Brandi, Alicia Murray, Norita Martinez, Fernanda Coll Crdenas,

Susana Ilhero, Mercedes Lojo y Lucrecia Ametrano por estar siempre

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NDICE

RESUMEN ................................................................................................................... 10

SUMMARY ................................................................................................................. 14

LISTADO DE PUBLICACIONES CIENTFICAS ............................................................... 17

ABREVIATURAS.......................................................................................................... 18

1. INTRODUCCIN ..................................................................................................... 23

1.1. El hombre y la alimentacin ............................................................................... 24

1.2. El hombre y las plantas medicinales ................................................................... 27

1.2.1. Elementos medicinales de las plantas ........................................................ 32

1.3. Quimio-proteccin .............................................................................................. 33

1.4. Fenoles y antioxidantes ...................................................................................... 35

1.5. Hierba medicinal: Baccharis articulata (Lam.) Persoon Carqueja ................... 38

1.6. Clasificacin y estructura general de B. articulata ............................................. 39

1.7. Componentes qumicos y propiedades generales de B. articulata (Lam.) Persoon

................................................................................................................................... 42

1.8. Actividad toxicolgica de las especies conocidas como carquejas ................. 44

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1.9. Estudios mutagnicos y antimutagnicos del gnero Baccharis ........................ 46

1.10. Mutagnesis...................................................................................................... 48

1.11. Mecanismos de reparacin .............................................................................. 51

1.12. Ensayo de Ames. ............................................................................................... 55

1.12.1. Salmonella ensayo microsomal: un ensayo de reversin ..................... 55

1.12.2. Lineamientos generales del Ensayo de Ames ........................................... 56

1.13. Secuencias blanco de ADN de las cepas de S. typhimurium ......................... 61

1.14. Antimutagnesis ............................................................................................... 62

2. HIPTESIS Y OBJETIVOS ........................................................................................ 67

2.1. Hiptesis ............................................................................................................. 68

2.2. Objetivo General ................................................................................................. 68

2.3. Objetivos Especficos .......................................................................................... 68

3. MATERIALES Y MTODOS ..................................................................................... 70

3.1. Sustancias Qumicas............................................................................................ 71

3.2. Soluciones y Medios de cultivo........................................................................... 72

3.3. Material utilizado: hierba medicinal B. articulata (Lam.) Persoon..................... 73

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3.4. Mtodo utilizado para la obtencin del extracto acuoso de B. articulata (EAB) 74

3.5. Determinacin de los polifenoles en el EAB por cromatografa lquida de fase

inversa (RF-HPLC) ....................................................................................................... 75

3.6. Evaluacin de la actividad antioxidante del EAB ................................................ 79

3.6.1.Procedimiento desarrollado para la determinacin de la actividad

antioxidante del EAB ............................................................................................. 80

3.7. Cepas bacterianas seleccionadas para la realizacin del Ensayo de Ames ........ 82

3.8. Confirmacin de las caractersticas genotpicas de las cepas de S. typhimurium.

................................................................................................................................... 84

3.9. Evaluacin del efecto txico del EAB y del cido clorognico frente a las cepas

de S. typhimurium ...................................................................................................... 86

3.9.1. Evalucin del efecto txico del EAB mediante el ensayo de incorporacin

en placa ................................................................................................................. 86

3.9.2. Evaluacin del efecto txico del EAB mediante el mtodo de pre-

incubacin ............................................................................................................. 87

3.9.3. Evaluacin del efecto txico del cido clorognico mediante el mtodo de

pre-incubacin ...................................................................................................... 87

3.10. Ensayos de mutagenicidad del EAB y del cido clorognico ........................... 88

3.10.1. Mutagenicidad del EAB ............................................................................. 88

3.10.2. Mutagenicidad del cido clorognico ....................................................... 90

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3.11. Evaluacin de los efectos antimutagnicos del EAB y del cido clorognico .. 91

3.11.1. Antimutagenicidad del EAB....................................................................... 91

3.11.2. Antimutagenicidad del cido clorognico ................................................ 93

3.12. Clculo de la capacidad antimutagnica: Indice de inhibicin ......................... 94

4. RESULTADOS ......................................................................................................... 96

4.1. Caracterizacin qumica, txica y mutagnica del EAB ...................................... 97

4.1.1. Determinacin de polifenoles en el EAB por cromatografa lquida de fase

inversa RP-HPLC .................................................................................................... 97

4.1.2. Evaluacin de la actividad antioxidante del EAB y del cido clorognico .. 99

4.1.3. Evaluacin de la toxicidad del EAB y del cido clorognico utilizando el

Ensayo de Ames .................................................................................................. 102

4.1.4. Evaluacin del efecto mutagnico del EAB y del cido clorognico

mediante el Ensayo de Ames .............................................................................. 105

4.2. Evaluacin del efecto antimutagnico del EAB empleando el Ensayo de Ames

................................................................................................................................. 107

4.2.1. Ensayo sin activacin metablica ............................................................. 108

4.2.2. Ensayo con activacin metablica ............................................................ 119

4.2.3. Comparacin de los mtodos de incorporacin en placa y de pre-

incubacin ........................................................................................................... 130

4.3. Evaluacin de la actividad antimutagnica del cido clorognico ................... 132

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4.4. Anlisis comparativo del efecto antimutagnico ejercido por EAB y el acido

clorognico .............................................................................................................. 134

4.4.1. Ensayo sin activacin metablica ............................................................. 134

4.4.2. Ensayo con activacin metablica ............................................................ 136

5. DISCUSIN ........................................................................................................... 138

5.1. Composicin qumica del EAB y evaluacin de la actividad antioxidante ........ 141

5.2. Evaluacin del efecto txico y mutagnico del EAB y del cido clorognico ... 147

5.3. Evaluacin de la actividad antimutagnica del EAB y del cido clorognico

frente a mutgenos de accin conocida empleando las cepas TA100 y TA98 con y sin

activacin metablica .............................................................................................. 150

5.3.1. Evaluacin del efecto antimutagnico del EAB utilizando dos variantes del

ensayo (incorporacin en placa y pre-incubacin) ............................................. 152

5.3.2. Comparacin de los efectos antimutagnicos del EAB y del cido

clorognico .......................................................................................................... 154

5.4. Posibles mecanismos de antimutagnisis del EAB frente a diferentes mutgenos

y cepas selecionadas ................................................................................................ 155

5.4.1. 2-AF ........................................................................................................... 155

5.4.2. 2-NF ........................................................................................................... 163

5.4.3. AZS ............................................................................................................. 167

6. CONCLUSIONES ................................................................................................... 170

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7. BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................... 177

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RESUMEN

El objetivo de esta Tesis Doctoral fue realizar la caracterizacin qumica y txica as

como analizar la mutagenicidad y antimutagenicidad del extracto acuoso de

Baccharis articulata (Lam.) Persoon (EAB). B. articulata, conocida como Carqueja,

es una hierba silvestre utilizada muy frecuentemente en la medicina folclrica

popular en Argentina y Sudamrica. La infusin de carqueja es ampliamente

consumida para el tratamiento de afecciones gastrointestinales por su capacidad

antiespasmdica y colagoga, entre otras.

Mediante caracterizacin qumica por cromatografa lquida de fase inversa (RF-

HPLC) se determinaron los compuestos fenlicos presentes en el EAB. Asimismo, se

analiz la actividad antioxidante del EAB, por determinacin de la concentracin

eficiente cincuenta (CE50) mediante la tcnica de DPPH* (2, 2-fenil1-picril hidracilo) y

se determinaron los porcentajes de inhibicin del EAB frente al radical DPPH*. El

anlisis qumico del EAB revel que el polifenol mayoritario fue el cido clorognico.

El contenido de cido clorognico en el EAB fu 2,050,11 mg/ml y su actividad

antioxidante present un valor de CE50 de 101,86 g/ml.

Los estudios de toxicidad, mutagenicidad y capacidad antimutagnica se realizaron

mediante el Ensayo de Ames empleando las cepas testigo Salmonella typhimurium

TA98 (mutante de corrimiento de marco de lectura) y TA100 (mutante de

sustitucin de bases). Los ensayos de toxicidad se llevaron a cabo por

determinacin de las unidades formadoras de colonias co-incubando el EAB con las

cepas testigo para evaluar concentraciones no txicas. Los ensayos de

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mutagenicidad y antimutagenicidad se realizaron con diferentes concentraciones

del EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) las cuales se incubaron con diferentes

concentraciones de mutgenos diagnstico: 2-nitrofluoreno (2-NF), azida sdica

(AZS), y 2-aminofluoreno (2-AF). Se implement el mtodo clsico de incorporacin

en placa y su modificacin de pre-incubacin. Para la evaluacin de la

antimutagenicidad se tomaron como parmetros los porcentajes de inhibicin (%I)

ejercidos por el EAB frente a la mutagenicidad inducida por los mutgenos

diagnstico (correspondiente al 100% de mutagenicidad).

Los resultados encontrados indicaron al aplicar el Ensayo de Ames, que el EAB no

result txico ni mutagnico en las concentraciones ensayadas (1,0 y 10,0

mg/placa) y en las condiciones de diseo experimental propuestos.

El EAB present en el Ensayo de Ames aplicado un %I de 100% frente al mutgeno 2-

AF al implementar el mtodo de pre-incubacin y con la cepa TA100, independiente

de las concentraciones ensayadas (1,0 y 10,0 mg/placa). Los valores mximos de

inhibicin del EAB ejercidos en la cepa TA98 frente al 2-NF se obtuvieron con 10,0

mg/placa de EAB y el Ensayo de Ames, con el mtodo de pre-incubacin, siendo el

%I de 91,0%. Frente a la AZS, la mxima inhibicin se obtuvo, en el Ensayo de Ames,

con el mtodo de pre-incubacin con un rango de %I de 40,0-41,0% para 1,0 y 10,0

mg/placa, respectivamente.

Asimismo, se evalu la capacidad antioxidante, txica, mutagnica y antimutagnica

del cido clorognico utilizando la misma metodologa implementada para el EAB

(DPPH* y el Ensayo de Ames). Los resultados mostraron que la capacidad

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antioxidante del cido clorognico result ser mayor que la del EAB con una CE50=

0,269 g/ml. El cido clorognico mostr ser no txico y no mutagnico en el Ensayo

de Ames, en las concentraciones ensayadas (0,05 y 0,50 mg/placa). Los estudios de

antimutagenicidad del cido clorognico mostraron que los %I mximos frente a 2-

AF se obtuvieron con la cepa TA98 (%I de 75,5) y con la cepa TA100 (%I de 84,0),

ensayando 0,50 mg/placa de cido clorognico mediante el mtodo de pre-

incubacin.

En base a estos resultados, se concluy que el EAB y el cido clorognico poseen

capacidad antioxidante y antimutagnica en los sistemas y condiciones

experimentales aplicadas.

La comparacin de la capacidad antimutagnica entre el EAB y el cido clorognico

indic que fue necesaria una concentracin cinco veces mayor de cido clorognico

contenido en la muestra de EAB para alcanzar una actividad antimutagnica similar

a la observada en el EAB.

Se concluy que la capacidad antimutagnica del EAB ocurra a travs de un

mecanismo antioxidante, influenciado por la presencia del cido clorognico y otros

compuestos presentes en el mismo.

En base a los datos obtenidos y la bibliografa existente se propone que los efectos

antimutagnicos ejercidos por el EAB frente a los mutgenos ensayados

respondera a un mecanismo llamado desmutgeno, donde la inhibicin ejercida

por el extracto posiblemente ocurra previamente a que los agentes mutagnicos

produzcan un dao total o parcial sobre el ADN.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 12

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Futuros estudios sobre los mecanismos moleculares implicados en el efecto

antimutagnico ejercido por el EAB frente a diferentes mutgenos resultan

necesarios y merecen ser estudiados en profundidad para dilucidar el posible

mecanismo propuesto en la presente Tesis Doctoral a partir de observaciones

realizadas en cepas bacterianas aplicando el Ensayo de Ames.

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SUMMARY

The purpose of this Doctoral Thesis is to characterize the chemical and toxic

properties as well as to analyze the mutagenic and antimutagenic effects of the

aqueous extract of Baccharis articulata (Lam.) Persoon (AEB). B. articulata, known

as "Carqueja" is a wild herb used frequently in popular folk medicine in Argentina

and South America. Carqueja infusion is widely consumed in the treatment of

gastrointestinal conditions due to cholagogue and antispasmodic properties, among

others.

Chemical characterization of the phenolic compounds present in the AEB was

performed by reverse phase liquid chromatography (RF-HPLC). AEB antioxidant

activity was evaluated by determining the effective concentration (EC 50) applying

the DPPH* technique (2, 2 difenyl 1-picrylhydrazyl) and the percentage of

inhibition of DPPH radical versus AEB was determined. The results revealed that

chlorogenic acid was the main and major polyphenol present in AEB reaching values

of 2.050.11 mg/ml. The antioxidant activity of this polyphenol showed an EC50

value of 101.86 mg/ml. Toxicity and mutagenicity studies as well as antimutagenic

capacity were analyzed using the Ames test employing two Salmonella typhimurium

strains: TA98 (mutant reading frame shift) and TA100 (base substitution mutant).

For toxicity assays, the colony-forming unit was determined by co-incubating the

strains with non-toxic AEB concentrations. Mutagenicity and antimutagenicity tests

were performed employing AEB within the 1.0-10.0 mg/plate concentration-range

against different concentration of diagnostic mutagens, namely, 2-nitrofluorene (2-

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

NF), sodium azide (AZS), and 2-aminofluorene (2-AF). Experiments were carried out

by using both plate incorporation and pre-incubation variants of the Ames test.

Antimutagenicity was estimated by the percentages of inhibition (%I) exerted by

AEB against diagnostic mutagen-induced mutagenicity (corresponding to 100.0 %I

of mutagenicity).

Results reveled that AEB was non-toxic as well as non- mutagenic in assayed

concentrations (1.0 and 10.0 mg/plate).

Results of AEB-induced antimutagenic activity at 1,0 and 10,0 mg/plate indicated

that the maximum percentage of inhibition was obtained in 2-AF-induced

mutagenicity on TA100 by the pre-incubation method , reaching values of 100 %I.

Inhibition exerted by 10.0 mg/plate of AEB in 2-NF-exposed on TA98 strain reached

maximum levels by pre-incubation method reaching values of 91.0 %I. For AZS,

maximum inhibition was obtained with the method of pre-incubation method

showing values of 40.0 %I and 41.0 %I, for 1.0 and 10.0 mg/plate AEB treated

cultures, respectively.

The antioxidant capacity as well as the toxic, mutagenic and antimutagenic

properties of the chlorogenic acid were also evaluated using the same methodology

applied for the AEB. The results showed that the antioxidant capacity of chlorogenic

acid was greater than that found for the AEB with an EC 50=0.269 g/ml.

Furthermore, the results demonstrated that chlorogenic acid non-toxic and non-

mutagenic at assayed concentrations (0.05 and 0.50 mg/plate). Antimutagenicity

studies of chlorogenic acid against 2-AF-induced mutagenicity showed the highest

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%I both on TA98 (75.5 %I) and TA100 (84.0 %I) strains at 0.50 mg/plate by pre-

incubation method.

Based on these results we concluded that both the AEB and chlorogenic acid

possess antioxidant and antimutagenic capacities.

Comparison between the antimutagenic capacity exerted by AEB and chlorogenic

acid indicated that five times higher concentration of the later is required to achieve

the same AEB-induced antimutagenic activity.

According to our results it could be suggested that the antimutagenic capacity of

the AEB is due probably exerted by an antioxidant mechanism(s) committed to the

presence of chlorogenic acid and other compound(s) present in the same extract.

Based on our observations and data previously reported, it could suggested that the

inhibition exerted by the AEB against mutagen-induced damage involve a

mechanism called "desmutagen" in which the inhibition most possibly occurs prior

to the induction of a total or partial damage on DNA.

Further studies on the molecular mechanisms involved in the antimutagenic effect

exerted by the AEB against different mutagens are required and deserve to be

studied to elucidate the possible mechanism(s) proposed in this Doctoral Thesis.

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LISTADO DE PUBLICACIONES CIENTFICAS

Rodrguez M. N., Giannuzzi L., Reta M. and Larramendy M. L.. The antimutagenic

capacity of the aqueous extract of Baccharis articulata (Lam.) Persoon. Journal of

Toxicology and Environmental Chemistry 2010, 93: 251-260.

Congresos asistidos

Rodrguez M. N., Gianuzzi L. Zaritzky N. y Larramendy M. Evaluacin del efecto

mutagnico y antimutagnico del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.)

Persoon (Asteraceae, Astereae) usado en medicina tradicional en Argentina.

Presentado en XXX Congreso de Gentica (SAG). Tandil, Pcia. De Buenos Aires ,

Argentina 21-24 de septiembre 2008.

Rodrguez M. N., Giannuzzi L. Zaritzky N. y Larramendy M. Estudio de la capacidad

inhibitoria del extracto acuoso (infusin) de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

(Asteraceae, Astereae) usado en medicina tradicional en Argentina frente a

mutgenos de accin conocida. Congreso CYTAL, .AATA (Asociacin Argentina de

Tecnlogos en Alimentos). Concordia, Pcia. de Entre Ros, Argentina. 7-9 de octubre

2009.

Rodriguez M. N., Giannuzzi L., Zaritzky N. E. , Reta M. y Larramendy M. Capacidad

antimutagnica y antioxidante del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.)

Persoon. XIII Congreso CYTAL -AATA. Congreso Argentino de Ciencia y Tecnologa de

Alimentos y 4 Simposio Internacional de Nuevas Tecnologas. Buenos Aires, 19 al

21 de octubre de 2011.

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ABREVIATURAS

Lista de abreviaturas utilizadas

ACL: cido clorognico

AT: Adenina Timina

Atm: atmsferas

AAIF: N-2-(Acetilamino) 7- iodofluoreno

AAF: 2-Acetilaminofluoreno

a.C.: antes de Cristo

ADN: cido desoxiribonucleico

ANMAT: Administracin Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnologa Mdica

ANOVA: Anlisis de varianza

APSM: Atencin Primaria de Salud de la Provincia de Misiones

AZS: Azida sdica

B() P: Benzo () Pireno

C: Citosina

CA: California

CE50: Concentracin Eficiente 50

cm: centmetros

CMA: Codex Medicamentarius Argentino

CONICET: Consejo Nacional de Investigaciones Cientficas y Tcnicas

Co: Company

col.: colaboradores

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CQA: cido 5-cafeilqunico

DAD: Diode Array Detector (Arreglo de diodos)

d C.: despus de Cristo

DMSO: Dimetilsulfxido

DPPH: 2,2-difenil -1-picril hidracilo

DS: Desvo estndar

EAB: Extracto Acuoso de Baccharis articulata

EEUU: Estados Unidos de Norte Amrica

e.g.: exempli gratia

FACAF: Federacin Argentina de Cmaras de Farmacias

G: Guanina

g: gramos

G C: Guanina Citosina

G6P: Glucosa- 6- fosfato

HPLC: High-Performance Liquid Chromatography (Cromatografa lquida de alta

eficacia)

h: hora

ICH: International Commissions on Harmonization

IP: Incorporacin en Placa

IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry

L.: Linneo C.

L: Litro

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Lam.: Lamarck J. B.

LEMIS: Laboratorio Estatal de Especialidades Medicinales de Misiones

Less. : Lessing C. F.

LOD: Limit Of Detection (Lmite de deteccin)

LOQ: Limit Of Quantitation (Lmite de cuantificacin)

LPS: lipopolisacridos

M: Molar

mg: miligramos

min: minutos

Mm: micrmetro

mM: milimolar

mm: milmetros

ml: mililitros

mUA: mili Unidades de Absorbancia

N-OH-AAF: N-hidroxi-N-2- acetilaminofluoreno

NP: Nitropirenos

nm: Nanmetros

N: Nmero

NAT: N-acetiltransferasa

NPD: 4-Nitro-o-phenylenediamine

C: grados centgrados

OECD: Organization for Economic Cooperation and Development.

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OMS: Organizacin Mundial de la Salud

O/N: Over night (cultivo de la noche)

PI: Pre-incubacin

P/V: peso por volumen

R*: Radical libre

R2: Coeficiente de determinacin

RN3: alquil-azida

seg: Segundos

S.L.F.: Sociedad Latinoamericana de Fitomedicina

SOS: Sistema de reparacin propenso al error

TBARS: Thiobarbituric Acid Reactive Substances

TRAP: Total Radical-Trapping Antioxidant Parameter

UFC/ml: Unidades Formadoras de Colonias por mililitro

UNLP: Universidad Nacional de La Plata

UV-vis: Luz ultravioleta-visible

V: Voltio

Vf : Volumen final

-NADP: beta-Nicotinamida adenina dinucletido fosfato

%I: Porcentaje de inhibicin

: Longitud de onda

+S9: Con activacin metablica

-S9: Sin activacin metablica

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g: microgramos

g /placa: microgramos por placa

l: microlitros

2-NF: 2-Nitrofluoreno

2-AF: 2-Aminofluoreno

3-NFA: 3-Nitrofluorantreno

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1. INTRODUCCIN

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

1.1. El hombre y la alimentacin

Existe consenso entre los antroplogos que nuestros ancestros ms antiguos

tuvieron una dieta vegetariana basada en frutos, races, hojas, brotes y semillas,

junto a la miel, larvas de insectos y huevos, derivada de sus hbitos recolectores.

Con el transcurso del tiempo surge, hace aproximadamente 2 millones de aos, una

modificacin en los hbitos alimentarios en nuestros antecesores, reconocida como

la primera transicin alimentaria. Probablemente basada en una actividad

carroera antes que cazadora, la ingesta cada vez mayor de protena animal en la

dieta nos condujo hacia el omnivorismo, con un aporte mayor de protenas y cidos

grasos esenciales. Esta transicin alimentaria proporcion dos requisitos necesarios

para disponer de un intestino ms pequeo y el ahorrar energa para dedicarla al

desarrollo del cerebro (Campillo Alvarez, 2011).

Los trabajos de Aguirre (2007) indican que hace unos trece mil aos ocurri la

extincin de la megafauna (mamut, rinoceronte y tigre diente de sable, entre otros)

probablemente debida al cambio climtico as como a la depredacin humana. Esto

gener una merma en las actividades de caza mayor especializada, seguida de

cambios en la alimentacin reconocida como la segunda transicin alimentaria. En

este periodo, la dieta estaba basada fundamentalmente en animales de baja talla,

pescados y mariscos. Adicionalmente, en las llanuras, se domesticaron las plantas

dando origen a la agricultura. La cra de animales y el cultivo de cereales como el

maz, el arroz, el trigo, etc., fue sentando las bases de un nuevo sistema de

produccin y de consumo alimentario. Sin embargo, a pesar del aumento en la

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 24

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

cantidad de alimentos se redujo la variedad, restringindose la dieta a un alimento

principal generalmente un cereal o un tubrculo, complementado con el producto

del pastoreo. Esto trajo aparejado que, cuando faltaba el alimento principal

apareca el hambre, en cambio cuando faltaban sus complementos, la poblacin

quedaba condenada a la desnutricin crnica por falta de micronutrientes (Aguirre,

2007).

Con la llegada de la revolucin industrial se gener una nueva relacin entre la

poblacin y las nuevas formas de produccin, distribucin y consumo alimentario

reconocida como tercera transicin alimentaria. En los ltimos 100 aos las

sociedades industriales comenzaron a desarrollar y aplicar nuevas tecnologas en la

industria de los alimentos basados en la necesidad de aportar mayor cantidad de

alimentos a una poblacin que creca exponencialmente. El procesamiento de los

alimentos, el agregado de aditivos alimentarios as como el refinamiento en

azcares y otros hidratos de carbono han contribuido a la dieta actual. Esta

presenta mayor cantidad de alimentos pero tambin menor variedad. A modo de

ejemplo podemos mencionar la enorme reduccin de variedades vegetales

registradas con el devenir de los tiempos: de las 442 variedades de papas cultivadas

en los Andes Centrales, actualmente en el mundo slo se cultivan 5, y de las 28

variedades de higos se cultivan 3. Aproximadamente 30.000 especies (entre las

250.000 plantas superiores descriptas) fueron seleccionadas como comestibles,

siendo utilizadas 7000 de ellas; sin embargo, slo 150 han llegado a convertirse en

cultivos importantes. De estas especies 15 producen ms del 90% del total de

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alimentos: trigo arroz y maz, los cuales suministran dos tercios de toda la energa

alimentaria y algo ms de la mitad de las protenas de origen vegetal (Smil, 2003).

Esta dieta presenta deficiencias en cantidad y variedad de frutas, verduras, fibras, y

ciertos micronutrientes como son los minerales esenciales, ciertos cidos grasos

esenciales, vitaminas y micronutrientes que nuestros ancestros consuman. Ello ha

llevado a considerar a la dieta como uno de los factores que presentan mayor

contribucin a las enfermedades del hombre moderno.

Por otro lado, es reconocido que la dieta puede controlar favorablemente ciertas

funciones biolgicas en el hombre y animales y reducir el riesgo de ciertas

enfermedades. En los ltimos tiempos se ha introducido el concepto de alimentos

funcionales, considerando como tales a aquellos que pueden producir beneficios

sobre la salud, adems de su tradicional funcin nutritiva (Ashwell, 2005).

Se encuentra bien documentado que los factores de la dieta juegan un rol crucial en

la etiologa del cncer en humanos y grandes esfuerzos se realizan en el mbito

cientfico para identificar sustancias protectoras contenidas en los alimentos

(Mersch-Sundermanna y col., 2004). Es conocido que el consumo de vegetales y

frutas est relacionado inversamente respecto a la incidencia del cncer (Steinmetz

y Potter, 1996).

Cientos de compuestos protectores y anticarcinognicos de alimentos derivados de

plantas han sido detectados en las ltimas dcadas. Por ello, un resumen de la

relacin del hombre con las plantas, y en particular con las medicinales, resulta de

inters desarrollar en el marco del presente trabajo de Tesis Doctoral.

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1.2. El hombre y las plantas medicinales

Desde sus orgenes, la humanidad ha utilizado a las plantas como cobijo, alimento y

medicina. Las plantas o hierbas medicinales son especies vegetales cuyas partes o

extractos son empleados como medicamentos en el tratamiento de enfermedades.

La utilizacin de plantas con fines curativos se remonta a la poca prehistrica y su

uso se extendi en todas las culturas y civilizaciones hasta la actualidad.

En sus comienzos, los conocimientos acerca de las propiedades medicinales de las

plantas se fueron construyendo de la misma manera en que se iban conociendo las

plantas comestibles y las venenosas, ya sea de manera azarosa, accidental o

mediante la observacin de la conducta de los animales. De esta manera, los

primeros hombres conocieron el peligro que representaba el acnito (Aconitum

napelus), el veratro o elboro blanco (Veratrum albus), la nuez vmica

(Strychnux vomica), la coronilla (Coronilla glauca), la dedalera (Digitalis

purpurea), el estrofantus (Strophantus kombe) (Hernndez Rodrguez, 2001),

entre otros ejemplos.

En otras ocasiones, el conocimiento se desarroll mediante la experimentacin en

su propia persona. Desde los albores de la humanidad el hombre aprendi

mediante prueba y error que algunas hierbas resultaban ser tiles para combatir

enfermedades, siendo empleadas en rituales religiosos donde se consuman en

brebajes a los que se les asignaban poderes mgicos y sobrenaturales.

Estos conocimientos se fueron profundizando y transmitiendo de generacin en

generacin, dando lugar con el correr del tiempo a la medicina moderna.

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Posteriormente, Alcmen de Crotona (siglo VI a.C.), filsofo pitagrico dedicado a la

medicina, dio inicio a una etapa definida por la certeza de que la enfermedad se

originaba por una serie de fenmenos naturales susceptibles de ser modificados o

revertidos, pudindose considerar como la gnesis de la medicina moderna.

En el devenir del tiempo y a lo largo de distintas civilizaciones, la medicina y el

conocimiento de las propiedades teraputicas de las plantas se fue desarrollando

de manera ms estructurada y sistemtica. Hipcrates (siglo V IV a.C.),

considerado el padre de la medicina, rechaz las creencias populares que sealaban

como causantes de las enfermedades a los dioses, sealando que eran

consecuencia de factores ambientales, de la dieta y los hbitos de vida.

Por su parte, los antiguos egipcios (siglo III a.C.), utilizaron una numerosa cantidad

de productos obtenidos de los vegetales. El Papiro de Ebers (aprox. 1500 a.C.),

considerado el ms importante papiro mdico, reporta como medicamentos al

aloe (Aloe vera), la goma de acacia (Moringa oleitera), el aceite de ricino

(Ricinus communis L.), la adormidera (Papaver somniferum), la cscara de

granada (Punica granatum), la linasa (Linum usitatissimum), la escila (Urgina

martima), el apio (Apium graveolens), la hierbabuena (Mentha viridis), el anis

(Pimpinela anisum), el hinojo (Faeniculum vulgare), el azafrn (Carthamus

tinctorius), el beleo (Hyoscyanus niger) y el ajo (Allium sativum), entre otros

(Hernndez Rodrguez, 2001).

En el siglo I a.C., Dioscrides, botnico y farmaclogo de la antigua Grecia y mdico

de los ejrcitos de Nern, escribi seis libros llamados De Materia Mdica. En

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ellos menciona plantas medicinales conocidas por los griegos. Describe 600 especies

de vegetales e indica las virtudes que se les atribuan y la manera de administrarlas.

Durante 15 siglos fue considerada la ms importante obra de botnica y el principal

manual de farmacopea durante toda la Edad Media y el Renacimiento.

Asimismo, otros escritos famosos y valiosos para la ciencia mdica y teraputica han

sido el herbario chino Pan-Si-Tao, el Corpus Hippocraticum, el Canon Medico rabe,

los Vedas hindes y las farmacopeas medievales. A partir del siglo XVIII, las hierbas

comenzaron a ser exploradas por la ciencia, comenzndose a extraer y aislar las

sustancias qumicas activas, llamadas drogas.

Hoy en da, los laboratorios farmacuticos utilizan compuestos qumicos con accin

farmacolgica ya sea replicados en forma sinttica o extrados de plantas, muchas

de ellas reconocidas por culturas antiguas por sus efectos benficos. La base de los

fitofrmacos obtenidos a partir de plantas son las drogas vegetales y los diferentes

tipos de productos que de ellas se obtienen (Caigueral y col., 2003).

Sin embargo a efectos de evitar confusin en los conceptos, la OMS defini en 1978

a las plantas medicinales como cualquier planta que en uno o ms de sus rganos

contiene sustancias que pueden ser utilizadas con finalidad teraputica o que son

precursores para la semisntesis qumico-farmacutica. Tambin defini droga

vegetal como la parte de la planta medicinal utilizada en teraputica y los principios

activos como las sustancias responsables de la accin farmacolgica.

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Los medicamentos conocidos como fitofrmacos incluyen como material o droga

vegetal a las plantas terrestres y tambin a las algas. Asimismo pueden definirse

como fungifrmacos a los producidos a partir de hongos y levaduras.

El estudio y la utilizacin teraputica de fitofrmacos y fungifrmacos es abordado

por la fitoterapia (del griego fyton, 'planta', 'vegetal' y therapeia, 'terapia'), conocida

tambin como herbolaria (del latn herba, 'hierba').

Se define a la Fitoterapia como la ciencia que estudia la utilizacin de los productos

de origen vegetal con una finalidad teraputica, ya sea para prevenir, atenuar o

curar un estado patolgico (Caigueral y Vila, 2001). Su nombre lo acu el mdico

francs Henri Leclerc (1874 1955 d C) quien us por vez primera el trmino

fitoterapia en su obra Prcis de Phytothrapie. La Fitoterapia utiliza drogas

vegetales y preparaciones de dichas drogas en la forma farmacutica ms adecuada

para su administracin.

Por su parte, los usos populares de las plantas medicinales continan a travs del

empleo, principalmente, de infusiones y tisanas de venta libre en farmacias y

herboristeras. Al respecto, la Federacin Argentina de Cmaras de Farmacias

(FACAF), publica ms de 200 plantas medicinales con su accin teraputica.

En nuestro pas, el cdigo oficial que describe las drogas, medicamentos y

productos mdicos necesarios o tiles para el ejercicio de la medicina y la farmacia

corresponde a la Farmacopea Argentina o Codex Medicamentarius Argentino en

el cual se especifica lo concerniente al origen, preparacin, identificacin, pureza,

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

valoracin y dems condiciones que aseguran la uniformidad y calidad de las

propiedades de los medicamentos.

En el ao 2011 la ANMAT (Administracin Nacional de Medicamentos Alimentos y

Tecnologa Mdica) en el articulo 1, inciso a), define a los medicamentos

fitoterpicos como aquellos que contengan como principio activo drogas vegetales

puras y/o mezclas definidas de stas y/o preparados de drogas vegetales,

tradicionalmente usadas con fines medicinales, y que no contengan sustancias

activas qumicamente definidas o sus mezclas an cuando fuesen constituyentes

aislados de plantas, salvo los casos que as se justifiquen.

En el Anexo 7 de la Farmacopea Argentina se exponen los lineamientos de buenas

prcticas dirigidos a su aplicacin en los productos fitoterpicos. Estos deben estar

preparados a partir de material de origen vegetal que pueden estar sujetos a

contaminacin o deterioro pudiendo variar su composicin y caractersticas. El

control de la materia prima, el almacenamiento y manufactura asume particular

relevancia debida a la naturaleza compleja y variable de estos productos, al nmero

de principios activos y a la escasa cantidad que se encuentran definidos. Por ello,

debe aplicarse un adecuado sistema de aseguramiento de la calidad en la

elaboracin y control de calidad de los productos fitoterpicos.

Asimismo, la farmacopea vigente registra diversas recetas para la elaboracin de

productos fitoterpicos, aislando sus principios activos o reproducindolos

mediante sntesis bajo diferentes formas farmacuticas, como cpsulas,

comprimidos, gotas, jarabes, tisanas, elxires, suspensiones, cremas, ungentos,

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

tinturas. La redaccin de monografas que cumplan con los parmetros

internacionales propuestos para la evaluacin de los fitoterpicos es llevada a cabo

por la Subcomisin de Medicamentos Fitoterpicos de la Farmacopea Argentina.

En ese sentido y a modo de ejemplo, el Laboratorio Estatal de Especialidades

Medicinales de Misiones (LEMIS) produce en el predio del Hospital Ramn Carrillo

cuatro fitomedicamentos (crema de calndula (utilizado en la renovacin celular en

pieles con cicatrices, estras o agrietas), comprimidos de cangorosa (utilizado en la

gastritis y lcera gtrica), jarabe de ambay (utilizado para tratar la tos y el catarro) y

gotas de carqueja (utilizado como hepatoprotector) autorizados por la ANMAT.

Actualmente se distribuyen gratuitamente en los centros de Atencin Primaria de

Salud de la provincia de Misiones para que los mdicos los receten a los pacientes.

1.2.1. Elementos medicinales de las plantas

Las clulas vegetales realizan procesos metablicos vinculados en forma directa con

el crecimiento y desarrollo de las plantas y resultan comunes en todo el reino

vegetal. Los productos metablicos de estos procesos se denominan metabolitos

primarios. Entre estos se encuentran las protenas, lpidos y carbohidratos,

aprovechados en la alimentacin humana.

Adicionalmente existen otros procesos que conducen a la formacin de los

denominados metabolitos secundarios. Presentan una distribucin ms restringida,

siendo frecuentes en una especie vegetal o grupo de especies. No presentan una

funcin reconocida en los procesos de fotosntesis, respiracin, transporte de

solutos, diferenciacin o formacin de protenas, hidratos de carbono y lpidos.

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Si embargo, cumplen importantes funciones ecolgicas en las plantas, constituyen

las defensas vegetales y son considerados en la actualidad un producto de la

evolucin. Es as como muchos de ellos inhiben el desarrollo de bacterias, hongos,

insectos y nematodos mejorando el crecimiento y la consistencia de la planta.

Tambin incluyen compuestos que pueden reducir la digestibilidad de la planta y la

palatabilidad de los herbvoros.

El estudio de estas sustancias presenta inters por su importancia como drogas

medicinales, antibiticos, insecticidas, venenos, saborizantes, aceites, ceras y otros

materiales utilizados en la industria (Taiz y Zeiger, 2006).

Adems, la creciente apreciacin de los diversos efectos biolgicos de los

metabolitos secundarios ha llevado a revalorizar el uso popular de las plantas y

hierbas medicinales como quimio-protectores para prevenir o combatir diversas

enfermedades. Este concepto se desarrollar en el siguiente punto.

1.3. Quimio-proteccin

Numerosos estudios indican que algunos componentes presentes en plantas y

alimentos pueden reducir el riesgo de enfermedades crnicas incluyendo el cncer.

A este tipo de componentes se les llaman quimio-protectores.

La quimio-proteccin contra el cncer implica la utilizacin de productos naturales,

sintticos o biolgicos que revierten, suprimen o previenen el desarrollo de tumores

(Kuno y col., 2012).

En los ltimos aos se ha incrementado el inters sobre compuestos reconocidos

como antimutgenos y promotores antitumorales. En relacin a los antimutgenos,

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

se ha informado un fuerte efecto antimutagnico en extractos de especies de

hierbas europeas (Natake y col., 1989), en plantas medicinales chinas (NiiKawa y

col., 1995), en vegetales y frutas (Morita y col., 1978), en diversos tipos de ts

(Kojima y col., 1989) y sus componentes (Watanabe y col., 1989).

En Japn, se han realizado pruebas a gran escala con extractos de plantas, que

condujeron a la identificacin de numerosos compuestos protectores (Kada y col.,

1984; Kada, 1984; Kada y col.,1987; Kada y Shimoi, 1987). Wattenberg y col., (1986),

estandarizaron estudios sistemticos de carcinognesis en roedores que resultaron

en el descubrimiento de los efectos protectores de los constituyentes del gnero

Brassica (Familia Brassicaceae) y otros vegetales (Wattenberg, 1987). Estos

*compuestos bioactivos* pertenecen a una variedad de diferentes grupos qumicos,

como los polifenoles, pigmentos alisulfilos, glucoinolatos, taninos, antocianinos,

flavonoides, fitoesteroles, proteasas inhibidoras y fitoestrgenos. Muchas de estas

sustancias, adems de sus propiedades antimutagnicas y anticarcinogenicas

presentan efectos beneficiosos, tales como activadoras del sistema inmune,

protectoras de enfermedades cardiovasculares, entre otras (Middleton y

Kandaswami, 1993). Muchos tipos de agentes antioxidantes, antiinflamatorios,

antiestrgenos, y antiandrgenos han resultado promisorios en la actividad quimio-

protectora (Martnez-Flrez y col., 2002; Bhattacharya, 2011). Un grupo de gran

inters en este aspecto de la quimio-proteccin al cncer, son los flavonoides,

compuestos generalmente no txicos que presentan una variedad de actividades

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

biolgicas (anti-alrgicos, anti-inflamatorios, anti-oxidantes, capturadores de

radicales libres, actividad antimutagnica, entre otras) (Kelloff, 1999).

1.4. Fenoles y antioxidantes

Los monofenoles, polifenoles y taninos constituyen uno de los grupos de

fitoqumicos presentes en casi todas las frutas, verduras, hierbas medicinales, as

como los granos de cereales que contienen cantidades apreciables de fenoles

naturales.

Los tres grupos ms importantes de compuestos fenlicos presentes en la dieta son

los flavonoides, los cidos fenlicos y los polifenoles. Los flavonoides constituyen el

mayor grupo de los fenoles vegetales y los cidos fenlicos forman un grupo diverso

que incluyen los derivados del cido hidroxibenzoico y del cido hidroxicinmico

(Tabla 1).

Los compuestos fenlicos de las plantas presentan entre sus propiedades las de ser

antioxidantes, ejercer efectos quelantes y modular la actividad de varios sistemas

enzimticos, de modo que actan mayoritariamente en la dieta como elementos

que promueven la salud ante factores qumicos y fsicos estresantes para el

organismo (Gee y Johnson, 2001).

Los antioxidantes son sustancias que tienen la capacidad de inhibir la oxidacin

causada por los radicales libres en la membrana de las clulas y proteger a los

diferentes rganos y sistemas.

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Tabla 1. Contenido de fitoqumicos fenlicos en algunos alimentos

Clase/subclase Fitoqumicos Contenido en alimentosa

FLAVONOIDES
Flavonoles Quercetina, Kaemferol, T hojas verdes (30-45 KgPS),
Miricetina t negro infusin (20 mg/L)
Flavonas Apigenina, Luteolina Apio (130 mg/Kg),
olivas (6-29 mg/Kg)
Flavanoles Pera (70-420 mg/Kg),
Catequina, Epicatequina t hojas verdes (128-226
Kg/PS)
Isoflavonas Granos de soja maduros secos
Genisteina, Daidzeina (888-2407 mg/Kg), harina de
soja (1036 - 1778 mg/Kg)
CIDOS FENLICOS cidos cafeico, Arndanos (1881-2112
Hidroxicinmico clorognico, ferlico y mg/Kg), jugo de manzana (9-
neoclorognico 114 mg/L)

Hidroxibenzicos cido elgico y glico Jugo de uva negra (75 mg/L)

TANINOS Vino tinto (2567 mg/L),
Catequinas, polmeros de vino blanco (239 mg/L),
Condensados epicatequina jugo de manzana (8-87 mg/L)
a
PS = Peso seco. Fuente: King y Young, 1999

Estas sustancias se forman en el reino vegetal a partir de fenilalanina y tirosina,

combinadas con unidades de acetato, son derivados benzo () pirenos. La

estructura bsica de un polifenol, es un anillo C el cual en C2 se une a un grupo fenil

como sustituyente. Estn formados por dos anillos aromticos A y B, unidos por un

anillo heterocclico C (Fig. 1). La estructura qumica de los compuestos fenlicos, es

la que les confiere su capacidad para actuar como captadores de radicales libres.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 36

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Fig. 1. Estructura bsica de un polifenol

El tipo de compuesto, el grado de metoxilacin y el nmero de grupos hidroxilo son

algunos de los parmetros que determinan esta actividad antioxidante.

Un amplio rango de polifenoles vegetales, son actualmente vendidos como

suplementos dietarios o como hierbas medicinales. Las plantas contienen mas de

8000 compuestos conocidos, abarcando desde simples fenoles, como el fenol en si

mismo y una variedad como los taninos etc. De los 8000 polifenoles conocidos,

solamente alrededor de 200 han sido testeados por sus propiedades mutagnicas

(Ferguson, 2001), la mayora en ensayos bacterianos (Nagao y col., 1981; Czeczot y

col., 1990).

Existe enorme inters en el conocimiento de los polifenoles presentes en las plantas

en particular en aquellos no-nutritivos, que muestran efectos antioxidantes, anti-

inflamatorios, anti-estrognicos, anti-mutagnicos y anti-carcinognicos, al menos

en sistemas in vitro o in vivo (Bravo, 1998; Harbone y Williams, 2000).

En los ltimos aos ha cobrado especial inters el estudio de la capacidad

antioxidante de polifenoles, especialmente de aquellos flavonoides, presentes en

diferentes vegetales utilizados en la medicina autctona.

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Entre estas, las llamadas vulgarmente carquejas o carquejillas (Gnero

Baccharis) son tradicionalmente plantas medicinales de mayor utilizacin, no slo

en nuestro pas sino tambin en todos los pases de donde es oriunda: Bolivia, sur

de Brasil, Chile, Paraguay, Uruguay y Per. La carqueja, cuyo nombre cientfico es

Baccharis articulata, es una de las especies consideradas de alto consumo, con una

demanda anual 77-127 Kg/ao (Fernndez, 2005) y es objeto de estudio de la

presente Tesis Doctoral.

1.5. Hierba medicinal: Baccharis articulata (Lam.) Persoon Carqueja

Baccharis es un amplio gnero perteneciente a la tribu Astereae, con ms de 400

especies distribuidas en el continente americano. Las especies de este gnero se

distribuyen mayormente en regiones de temperaturas clidas y tropicales como

Brasil, Argentina, Colombia, Chile y Mxico. En los ltimos aos se ha incrementado

la informacin sobre la estructura y actividad farmacolgica de estas especies (Abad

y Bermejo, 2007). Baccharis es un gnero de gran importancia en los productos

naturales utilizados por la medicina popular, folclrica y alternativa.

La "carqueja" forma parte actualmente de numerosos productos farmacuticos,

sobre todo como planta con actividad colagoga, colertica, digestiva (de la Sota,

1977; Verdi y col., 2005), antioxidante (Abad y col., 1999; Oliveira y col., 2003),

antiviral y antimicrobiana (Zanon y col., 1999; Feresin y col., 2003; Simionatto y col.,

2008), antiinflamatoria (Gonzales Dvalos, 2007), antifngica (Feresin y col., 2003;

Vivot Lupi y col., 2009), antidiabtica (Oliveira y col., 2005), antiartrtica (Coelho y

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

col., 2004), y diurtica (Moreira, 1862) bajo la forma de soluciones, extractos,

grageas y/o infusiones.

Las especies del gnero Baccharis ms utilizadas en Argentina, Uruguay y Brasil son:

B. trimera (Less.) D. C., B. crispa y B. articulata (Lam.) Persoon. Estas plantas se

encuentran monografiadas en la Sexta Edicin de la Farmacopea Nacional Argentina

(1966).

B. articulata as como otras hierbas (Equisetum giganteum cola de caballo, Lippia

turbinata poleo) son recolectadas en todo el territorio Argentino en su mayora

de bolsones silvestres (Lagrotteria y Affolter, 1999; Noher de Halac y col., 1986; de

la Sota, 1977). B. articulata es considerada una planta medicinal (Boelcke, 1981).

Sinnimos: Conyza articulata (Lam.); Molina articulata (Lam.) Lessing; Pingraea

articulata (Lam.) F.H. Hellwig.

Nombres vulgares: carqueja o carquejilla; en Paraguay es conocida tambin

con el nombre de jaguaret ka'a (voz en guaran que significa "yerba del leopardo").

B. articulata (Lam.) Persoon, es un arbusto abundante en las zonas templadas de

Uruguay, Brasil, Chile, Argentina y Paraguay.

1.6. Clasificacin y estructura general de B. articulata

Clasificacin botnica de B. articulata

Reino: Plantae

Divisin: Fanergama Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

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Orden: Aterales

Familia: Asteraceae

Subfamila: Asteroideae

Tribu: Astereae

Gnero: Baccharis

Especie: B. articulata

Descripcin botnica

B. articulata (Lam.) Persoon es un arbusto perenne dioico ramoso de 0,5-1,5 m de

altura. Sus tallos provistos de dos alas longitudinales angostas de 0,5-3 mm de

latitud. Las hojas reducidas a brcteas inconspicuas. Con captulos ssiles, solitarios

o dispuestos en glomrulos de 2-6, a su vez ordenados en un racimo simple o un

racimo de espigas terminal. Captulos pistilados con involucro acampanado de 4-5 x

4-5 mm; filarios en 34-4 series, obtusos, los exteriores ovados y los interiores

oblongos. Las flores numerosas de pice desigualmente dentado. Captulos

estaminados con involucro acampanado de 3-4 x 4 mm; filarios semejantes a los

pistilados (Fig 2). Flores numerosas; estilo con ramas separadas N=9. (Boelcke,

1981; Hieronymus, 1882; Giuliano, 2000).

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Fig.2. B. articulata: A: Rama florfera femenina XI; B: Captulo femenino; C: Flor femenina

X10; D: Aquenio X20; E: Captulo masculino X5; F: Flor masculina X10; Apice del estilo X20

(Troiani, 1985)

Normalmente las plantas de carqueja crecen en forma espontnea y silvestre. Son

recolectadas en campos o a orilla de los caminos. Esto podra llevar a la variacin de

su composicin qumica o a la variacin en su rendimiento, debido a mltiples

factores, como son: el lugar de procedencia, la edafologa del terreno, la poca de

recoleccin, las condiciones climticas del ao, el perodo vegetativo en que se

recolecta, etc.; por lo que este sistema de provisin hacia los centros de

procesamiento del material vegetal, se torna a veces poco confiable en calidad,

rendimiento y constancia. Sin embargo sus componentes qumicos base, se repiten

en la mayora de las revisiones cientficas.

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

1.7. Componentes qumicos y propiedades generales de B. articulata (Lam.)

Persoon

Los componentes qumicos principales de B. articulata se presentan en la Tabla 2.

Los principios activos de B. articulata son la cinarina (un compuesto aromtico

responsable del sabor amargo) y el acido clorognico. La cinarina le confiere una

actividad hipocolesterolemica. Se ha demostrado que aumenta la solubilidad del

colesterol de los depsitos patolgicos (ateromatosos) y junto con la cinaropicrina

presenta importante accin carminativa (antiespasmdica).

Tabla 2. Constituyentes qumicos de B. articulata

B. articulata (Lam.) Persoon

cidos y , Oleanolicos y crisosapnicos; santonina,

absintina, luteolina, quercetina, acetato de articulina,
Parte area genkwanina, acacetina; cicimaritina, salvigenina,
jaceidina, jaceosidina, lupeol chondrillasterol,
apigenina.
Barticulidiol, bacchotricuneatina A, diester malonato
acetato, -pineno, cis-cariofileno, - elemeno, -
guaieno, -caidineno, aroma dendreno.
Aceite de plantas femeninas: -pineno (14,7%),
Flores (aceites
spatulenol (27,3%) y -nerolidol (10,1%); para plantas
esenciales) masculinas: spatulenol (30,3%), -cariofileno (9,5%),
biciclogermacreno (8,9%) y -neroIidol (8,1%) ( Gianello
y col., 2000) (Zunino y col., 2004)
Terpenos (Zunino y col., 2004), flavonoides
(hispidulina), sesquiterpenlactonas y diterpenoides
(Bandoni y col., 1972) (Dai y col., 1993) y otros
compuestos fenlicos (Oliveira y col., 2003), cidos
Otros Compuestos
cafeilqunicos (Czok y col.,1971; Kiso, 1983), cido
cafeico y cido clorognico e isoclorognico (Palacios y
col.,1999)

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Se ha informado que estos compuestos son los responsables de aumentar 3,5 veces

el volumen de la bilis secretada, confirindole una gran actividad colertica y

colagoga (Cifuente y col., 2010). Evitan el xtasis vesicular y la accin de la

betaglucuronidasa que desconjuga la bilirrubina directa en insoluble y por lo tanto,

su precipitacin. Gracias a sus flavonoides (particularmente la hispidulina) y cidos

fenlicos posee una gran accin diurtica y antiedematosa sin prdida de iones

potasio. Aumenta la excrecin de urea a nivel renal y normaliza la urognesis

heptica.

Anlisis fitoqumicos realizados de las partes areas del gnero Baccharis, han

llevado al aislamiento de flavonoides, sesquiterpenos y diterpenoides (Bandoni y

col., 1972; Dai y col., 1993), adems de la presencia en extractos hidroalcoholicos

de cidos cafeilqunicos, como cido cafico, clorognico (cido 3-cafeilqunico) e

isoclorognico (mezcla de tres cidos dicafeilqunicos isomricos: 3,4; 3,5 y 4,5-

dicafeilharisqunico) (Czok y col., 1971; Kiso y col., 1983; Palacios y col., 1999).

Los estudios han demostrado que el gnero Baccharis es rico en polifenoles y

considerando la diversidad de especies del gnero (500 spp.) (Verdi y col., 2005), es

considerado una fuente de hierbas medicinales y aromticas con componentes

bioactivos, (Juliani y col., 2007).

Sin embargo, toda planta que quiere ser incorporada en el mercado en forma de

drogas o como insumo industrial o agrcola, debe evaluarse desde el punto de vista

de su accin txica o genotxica para prevenir efectos adversos en la salud humana

o animal.

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Existe un conjunto de ensayos genotxicos que tienen por objeto obtener

informacin acerca de la actividad txica de un compuesto y evaluar el probable

riesgo mutagnico y/o cancergeno con un aceptable grado de confianza.

El documento denominado Genotoxicidad elaborado por la Conferencia

Internacional sobre Armonizacin de los Requisitos Tcnicos para el Registro de

Productos Farmacuticos para Uso Humano en julio de 1997 (OMS) establece una

batera estndar o de ensayos de genotoxicidad.Este Comit de Armonizacin

sugiere la realizacin de no menos de tres ensayos, uno in vitro que detecta

mutaciones gnicas en bacterias, otro in vitro que detecte alteraciones

cromosmicas en clulas de mamferos y otro in vivo que detecte dao

cromosmico en clulas hematopoyticas en roedores.

Por otra parte, otros estudios como son los vinculados a la actividad txica as como

los efectos adversos en el hombre y animales de laboratorio resultan importantes

en la evaluacin de las plantas medicinales. En particular, los referidos a B.

articulata resultan relevantes para evaluar en profundidad sus propiedades

medicinales.

1.8. Actividad toxicolgica de las especies conocidas como carquejas

Desde el punto de vista toxicolgico, las tres especies de Baccharis conocidas como

carqueja han sido estudiadas por varios autores.

Los primeros estudios fueron los ensayos de toxicidad aguda realizados por Rocha

(1943) utilizando B. articulata (Lam.). La administracin oral de 3 g/kg de la infusin

liofilizada en ratones no provoc signos de toxicidad, muerte, ni alteraciones

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 44

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

macroscpicas en los rganos estudiados. Posteriormente, los estudios de Alonso

(1998) mostraron la ausencia de efectos adversos y/o txicos en humanos luego de

varios das de administrar infusiones de B. crispa Sprengel. Adicionalmente,

Gorzalczany y col. (1999) informaron que Baccharis no produca cambios de

comportamiento ni modificaciones en la conducta de los animales de laboratorio

estudiados.

Por otra parte, los ensayos realizados en roedores con B. trimera (Less.) no

revelaron efectos txicos (Gamberini y col., 1991; Lapa y col., 1992). Investigadores

de la Universidad de San Pablo (Brasil) llevaron a cabo un estudio a doble ciego de

toxicidad oral (aguda y crnica) en ratas, administrando infusiones en base a 2

gramos de planta en 40 ml. Los resultados observados al finalizar las pruebas no

mostraron seales de toxicidad ni cambios en los perfiles hematolgicos de los

animales estudiados (Pedrazzi y col., 1997).

Lo anterior indica que las especies del gnero Baccharis no presentan efectos

txicos y adversos en ensayos de toxicidad en animales. Sin embargo, es de gran

importancia realizar estudios de mutagenicidad que contribuyan a la evaluacin

completa tendiente a la utilizacin de la planta en forma segura y eficaz.

En los ltimos aos, el nmero de estudios sobre las propiedades fitoterapeuticas

de diversas plantas se ha incrementado notablemente. Estos incluyen estudios

sobre las actividades mutagnicas y anti-mutagnicas y su correlacin con la

presencia de ciertas sustancias encontradas en la composicin fitoqumica de las

plantas, tales como grupos de flavonoides ( Czeczot y col., 1990; Edenharder y Tang,

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 45

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

1997; Beudot y col., 1998; Fernandez de S Ferreira y Ferra Vargas, 1999), taninos

(Kada y col., 1985; Horn y Ferra Vargas, 2003) y alcaloides (Campesato y col.,

1997).

Los compuestos fitoqumicos tales como los flavonoides y taninos (presentes en el

gnero Baccharis) han sido descriptos en la literatura como los causantes de

actividades tanto mutagnicas como antimutagnicas. Esta aparente contradiccin

en las respuestas involucra complejas acciones biolgicas que pueden ser

dependientes de las dosis, del compuesto empleado, de la estructura y afinidad

qumica y su posible potencial para actuar como inductores o inhibidores de

enzimas o sus metabolitos involucrados en la desactivacin de mutgenos.

1.9. Estudios mutagnicos y antimutagnicos del gnero Baccharis

Los estudios de mutagenicidad con esta planta son escasos. Fachinetto y Tedesco

(2009) evaluaron el potencial efecto citotxico de infusiones acuosas de B. trimera y

B. articulata (15 mg/ml y 75 mg/ml) sobre el ciclo celular de Allium cepa. Los

resultados indicaron que los extractos de estas especies mostraron efecto

antiproliferativo y mutagnico en las concentraciones estudiadas, no observando

diferencias de estos efectos en las etapas de desarrollo de la planta. Estos autores

concluyeron que es posible verificar la presencia de actividad antiproliferativa y

mutagnica en las especies estudiadas, lo que indica que su uso por la poblacin

requiere ms atencin. Sin embargo, recomiendan profundizar los estudios con el

objeto de evaluar con mayor precisin los riesgos potenciales de mutgenos

presentes en los extractos acuosos de B. trimera y B. articulata.

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Los ensayos genticos, realizados con la cepa S. typhimurium con prueba de

microsoma, permiten una rpida deteccin de compuestos

mutagnicos/antimutagenos y probablemente, de sustancias cancergenas, a un

menor costo (Mortelmans y Zeiger, 2000). En este sentido, Borgo y col., (2004)

demostraron los efectos mutagnicos de extractos acuosos de B. articulata (Lam.)

Persoon mediante el Ensayo de Ames en las cepas TA98, TA100 y TA102. Esta

actividad se observ en un rango de concentraciones de 250 a 500 mg/placa del

extracto de B. articulata con el mtodo de incorporacin en placa. Sin embargo, en

presencia de actividad metablica del hgado de mamferos fue detectada, una

importante disminucin del efecto mutagnico, persistiendo slo la respuesta

mutagnica en la cepa TA98. Los autores concluyen que otros estudios resultan ser

necesarios para confirmar esta propiedad y sus consecuencias en la salud humana.

Por otra parte, existen estudios de antimutagenicidad realizados a partir de las

partes areas de especies del gnero Baccharis (Nakasugi y Komai, 1998). Estos

autores encontraron que el extracto metanlico de la especie B. trimera (Less.)

reduce fuertemente la mutagenicidad del 3-amino-1-metil-5H-pirido [4,3-b]-indol,

en S. typhimurium TA98 en presencia de la fraccin microsomal de hgado de rata.

Los antimutgenos fueron purificados por cromatografa lquida de alta presin y la

actividad antimutagnica de estos compuestos fue detectada mediante el Ensayo

de Ames. Se identificaron cuatro sustancias activas en el extracto metanlico como

5,4'-dihidroxi-7-metoxiflavona (genkwanin), 5,4'-dihidroxi-6,7-dimetoxiflavona

(cirsimaritin), 5,7,4'-trihidroxi-6 -metoxiflavona (hispidulin), y 5,7,4 '-

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

trihidroxiflavona (apigenina). Estas flavonas son importantes sustancias activas en la

carqueja.

Lo anteriormente expuesto resalta la necesidad de realizar nuevos estudios

referidos a la actividad mutagnica y antimutagnica de esta planta as como

evaluar los posibles compuestos involucrados en las actividades detectadas.

Debido a la complejidad de estos mecanismos resulta de inters incorporar en el

presente trabajo de Tesis Doctoral, una revisin de los conceptos de mutagnesis y

antimutagnesis.

1.10. Mutagnesis

La mutagnesis es el proceso por el cual se produce un cambio heredable que

afecta al material gentico. Puede producirse espontneamente o ser inducida por

agentes fsicos o qumicos (como la temperatura, sustancias qumicas, luz

ultravioleta o radiaciones ionizantes) y puede ocurrir en clulas somticas o

germinales. Es tambin importante destacar que determinados tipos de mutaciones

pueden resultar de la interaccin de agentes con dianas distintas del ADN, como por

ejemplo el huso mittico.

Para convertirse en un cambio hereditario la modificacin debe dar lugar a un

cambio en la informacin gentica y ser transmitida a futuras generaciones de

clulas u organismos. Una vez que una clula ha sufrido un dao primario en el ADN

puede responder de distintas maneras:

a) La clula puede reparar el dao y restaurar la molcula de ADN a su estado

original, en cuyo caso no existe mutacin.

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

b) La clula puede morir, por ejemplo si la lesin en el ADN impide su replicacin.

En este caso la posibilidad de que la mutacin ocurra queda eliminada.

c) La clula puede ser capaz de reparar el dao al ADN, pero no a su estado original

o cometer errores en la replicacin del ADN daado. Estos procesos pueden dar

lugar a alteraciones estables en la secuencia de nucletidos que pueden ser

transmitidos a las clulas hijas como mutaciones.

Las consecuencias derivadas de la aparicin de mutaciones dependen de si las

clulas afectadas son germinales o somticas.

La reversin es una de las propiedades de las mutaciones. Si la secuencia ha sido

cambiada a una secuencia diferente, en algunos casos ese cambio puede volver a la

secuencia original a travs de una mutacin subsecuente. Los organismos que

revierten una mutacin, son llamados revertantes. Los rangos de reversin

representan, de esta manera, el grado en que la secuencia de ADN est mutada y

regresa a su tipo salvaje. Son cambios en la secuencia de nucletidos en uno o unos

pocos segmentos codificadores de un gen. Pueden ocurrir por sustitucin de pares

de bases (sustitucin de una base por otra) o por la adicin o delecin de una o ms

bases alterando la secuencia de bases y por lo tanto cambiando el marco de lectura.

Mutaciones puntuales o gnicas

Se describirn con detalle las mutaciones dado que sern herramientas de

aplicacin en el presente trabajo de Tesis Doctoral. La Tabla 3 muestra diversos

tipos de mutaciones gnicas reconocidas.

Mutacin de corrimiento de marco de lectura

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

El mayor porcentaje de las mutaciones espontneas son las mutaciones de

corrimiento de marco de lectura. Esta mutacin ocurre cuando un par de bases o

algunos pares de bases son removidos o adicionados al ADN, causando un

corrimiento en la traduccin de los genes restantes. Esto ocurre porque el cdigo

gentico consta de un triplete de bases, y cualquier adicin o sustraccin que no sea

mltiplo de 3, causar un corrimiento en el marco de lectura. Las mutaciones de

corrimiento casi siempre inactivan la protena, porque cada aminocido de la

protena donde se produce la mutacin estar equivocado.

Las mutaciones de corrimiento de marco de lectura, tienen la propiedad de revertir,

si un par de bases est ausente, entonces una base puede ser insertada para

restaurar y corregir la lectura correcta y viceversa. Ms frecuentemente las

mutaciones de corrimiento cuando no revierten, son suprimidas por la adicin o

sustraccin de un par de bases cercanas al sitio original de la mutacin, que

restaura la lectura correcta (corrimiento de lectura por supresin).

Los mutgenos con estas propiedades son llamados de corrimiento de marco de

lectura a causa de una lectura errada de ARN mensajero sintetizado de la cadena

molde alterada del ADN.

Mutacin de Intercambio de pares de bases

Diferentes mutaciones tendrn diferentes consecuencias en la funcin de una

protena. El intercambio de un par de bases puede ser el resultado de un error en la

replicacin, recombinacin o durante la reparacin. Las sustituciones ocurren

cuando una base es remplazada por otra (transiciones y transversiones). Las

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

mutaciones de intercambio de bases, pueden tambin revertir. Si un par de bases

ha sido cambiado por un par diferente, puede la misma volver a su estado normal a

travs de una mutacin subsecuente.

1.11. Mecanismos de reparacin

La continuidad de las especies de una generacin a otra es un atributo de una de

sus caractersticas bigicas ms importantes, su plasticidad. Si el ADN no fuera

estable y su replicacin tan fidedigna, no existira evolucin biolgica. Los errores

que suceden durante la replicacin, no son slo atributo del ADN. Muchos factores

ambientales pueden daar esta molcula. Los daos qumicos pueden ser muy

deletreos para la clula si su ADN no est capacitado para replicar por encima del

dao, y as no podr multiplicarse. En el caso de ser capaz de replicarse por encima

del dao, causar mutaciones, muchas de las cuales sern deletreas y otras letales

(Snyder y Champness, 2007).

La clula tiene mecanismos de reparacin para el dao que ocurre sobre el material

gentico. No todos los mecanismos de reparacin en la clula son especficos y

algunos sistemas reparan diferentes tipos de dao.

Existen dos sistemas de reparacin involucrados directamente en las caractersticas

genotpicas de las cepas de Salmonella typhimurium utilizadas para la deteccin de

mutagnesis. Algunas de estas cepas son deficientes en el sistema de reparacin

por escisin (uvrB-) y poseen el sistema de reparacin con error SOS (responsable

de la mutagnesis) exacerbado, ya que se encuentra en doble dosis, en el genforo

bacteriano as como en los plsmidos pKM101 y pAQ1 (plsmidos multicopia).

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Tabla 3. Tipos de mutaciones gnicas

En el ADN Resultados en el ADN

Transiciones PuPu o PiPi
Sustitucin de bases
Transversiones PuPi o PiPu

Desaminacin de bases o quitar un Citosina es particularmente susceptible

grupo amino CitosinaUracilo
Formas reactivas del oxigeno, tales
Oxidacin de las bases como perxido y radicales libres
reaccionan con las bases y las alteran
Produce mutaciones de corrimiento de
Inserciones o deleciones de marco de lectura
nucletidos
Es la repeticin de un segmento de ADN
Duplicaciones del interior de un gen
Se produce la rotura del enlace
Depurinizacin glucosdico entre la base nitrogenada y
el azcar, formando sitios apurnicos
Un segmento de ADN del interior de un
Inversiones gen se invierte
Un segmento de un gen cambia de
Transposiciones posicin para estar en otro lugar
distinto del mismo gen o en otro lugar
del genoma
Fuente: Snyder y Champness, 2007

Sistema de reparacin por escisin de nucletidos

Debido a que el mecanismo de reparacin por escisin de nucletidos, es una lnea

de defensa muy importante ante determinados tipos de agentes que producen

dao al ADN, incluyendo la irradiacin UV, las mutaciones en estos genes

determinan que las clulas sean mucho ms sensibles a stos agentes. Los mutantes

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

defectivos en este sistema de reparacin mueren a bajas dosis de irradiacin con

mayor frecuencia que el tipo salvaje (Tabla 4) (Snyder y Champness, 2007).

El anlisis genmico comparativo ha encontrado que estos genes son ortlogos en

todas las especies de eubacterias, as como algunos miembros de Archea. Los

productos de los genes uvrA, uvrB y uvrC, slo estn involucrados en el sistema de

reparacin por escisin, mientras que otros incluyendo los genes polA y uvrD, son

requeridos por otros sistemas de reparacin.

Los genes del sistema de reparacin por escisin (uvrA, uvrB y uvrD), estn casi

siempre expresados en pequeas cantidades y se expresan en grandes cantidades

despus de que el ADN est daado. Este es un mecanismo de supervivencia que

asegura que las protenas de reparacin sean expresadas cuando son necesarias.

Debido a que este es un sistema inducible por la presencia de dao en el ADN, los

genes uvr, llamados genes din (dao inducible) incluyen recF, recA, umuC, y

umuD y muchos genes din, uvrA, uvrB, y uvrD, que forman parte del reguln SOS.

La mutacin uvrB-, determina el desenlace y la expresin de los genes involucrados

en el sistema de reparacin propenso al error (SOS), responsable de la mutagnesis.

Debemos destacar que en las clulas bacterianas de S. typhimurium, ambos

sistemas (reparacin por escisin y SOS) se encuentran en doble copia o multicopia

(genoma bacteriano y en el plsmido). Esto genera una mayor sensibilidad al

desencadenamiento de la mutagnesis

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Tabla 4. Genes involucrados en UvrABC, endonucleasas del sistema de reparacin

por escisin

Gen Funcin del producto del gen

uvrA Protena de unin con el ADN

uvrB Forma un complejo con el ADN; ruptura en el extremo 3 de la lesin
uvrC Se une al complejo UvrB-ADN; ruptura en el extremo 5 de la lesin
uvrD Helicasa II: ayuda a remover el dao conteniendo oligonucletidos
polA Pol I: rellena slo el hueco de la hebra simple
lig Ligasa: sella la ruptura en la hebra simple
Fuente: Snyder y Champness, 2007

Sistema de reparacin propenso al error SOS

El dao sobre el ADN conduce a la induccin de genes cuyos productos son

requeridos para la reparacin del ADN. Hay una clase de genes que se inducen

luego de producido un dao en el ADN, denominados genes din, que incluye los

genes que codifican productos que forman parte del sistema de reparacin por

escisin de nucletidos y el de recombinacin. Los productos de otros genes din

ayudan a la clula a sobrevivir al dao de otra forma.

Muchos genes din son regulados por la respuesta SOS, llamada as, porque este

mecanismo rescata las clulas que han sufrido un dao severo en el ADN y los genes

bajo este tipo de reparacin son llamados genes SOS.

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Las cepas de S. typhimurium utilizadas en el Ensayo de Ames nos permiten inferir

cual sera el probable mecanismo de accin involucrado, as como que tipo de

mutacin fue producido por algn agente estudiado.

El ensayo de Salmonella (deteccin de mutagnesis) ha sido utilizado como gua del

potencial mutagnico de una variedad de compuestos tanto de aquellos que estn

en la naturaleza, as como los artificialmente introducidos al ambiente. Debido a

que ser utilizado en el presente trabajo de Tesis, los fundamentos del mtodo se

describen a continuacin.

1.12. Ensayo de Ames.

1.12.1. Salmonella ensayo microsomal: un ensayo de reversin

Las bacterias son organismos cuya gentica puede ser fcilmente manipulada lo

cual permiti el diseo de muchos modelos para el entendimiento de los procesos

de la vida (Snyder y Champness, 2007). Por ello, es posible detectar mutgenos

empleando una serie de bacterias especialmente diseadas.

El Ensayo de Ames es utilizado ampliamente en el mundo como una evaluacin

primaria del potencial mutagnico de sustancias qumicas y drogas en general. Para

luego completar las pruebas en lneas celulares y en animales de laboratorio.

Cuando un compuesto o cualquier sustancia es considerada mutagnica, existe una

alta posibilidad de prediccin de carcinognesis (Zeiger y col., 1990). Sin embargo,

los estudios empleando modelos animales son relativamente costosos y consumen

mucho ms tiempo. Muchas sustancias qumicas carcinognicas causan dao en el

ADN, y son mutagnicas para los sistemas bacterianos, as como tambin para

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 55

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

humanos. Por lo tanto, los sistemas bacterianos pueden ser utilizados como

pruebas iniciales para determinar si ciertos qumicos podran ser potencialmente

carcinognicos.

Los sistemas bacterianos presentan ventajas prcticas y tericas en la deteccin de

mutgenos como ser: genoma pequeo (cerca de 4x106 pares de bases), gran

nmero de organismos expuestos (cerca de 109 /placa) y la seleccin positiva de los

organismos mutados.

Existen directivas de organismos internacionales, e.g., Organization for Economic

Cooperation and Development (OECD), The International Commissions on

Harmonization (ICH), tendientes a la armonizacin del Ensayo de Ames y de esta

forma asegurar la uniformidad de los procedimientos a nivel mundial.

1.12.2. Lineamientos generales del Ensayo de Ames

El Ensayo de Ames, tambin llamado ensayo Salmonella/microsomal, ensayo de

reversin de la mutacin (Salmonella/microsomal assay, (reversin mutagenic

assay), fue desarrollado por el Dr. Bruce Ames y sus colaboradores (Ames y col.,

1973; Snyder y Champness, 2007). Es un sencillo ensayo bacteriano utilizado en la

deteccin de mutgenos qumicos. Es un ensayo de genotoxicidad in vitro tendiente

a cuantificar el dao ocasionado al material gentico. La prueba utiliza cepas de S.

typhimurium construidas por ingeniera gentica, capaces de detectar mutaciones

gnicas por corrimiento de marco de lectura o por sustitucin de pares de bases del

ADN. Para la deteccin de sustancias promutagnicas, se incluye en el ensayo la

fraccin microsomal de hgado de rata, un sistema de activacin metablica, que

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

permite la evaluacin de metabolitos de la muestra problema, ya que el sistema

bacteriano no lo posee.

En la Tabla 5 se resumen las caractersticas fenotpicas y genotpicas de las cepas de

S. typhimurium empleadas en el Ensayo de Ames. Estas cepas poseen una mutacin

en el gen que codifica para el aminocido histidina (his-) y como consecuencia no les

permite crecer a las clulas en ausencia de este aminocido (bacterias mutantes de

requerimiento, auxtrofas: incapaces de crecer en medio mnimo). Nuevas

mutaciones en el sitio o cercanas a estos genes mutados pueden restaurar la

funcin de los genes y as permitir que las clulas crezcan como el tipo salvaje

(reversin espontnea o reversin inducida).

Adems de sta mutacin, se pueden adicionar otras mutaciones que incrementan

la deteccin de mutgenos y las convierten en bacterias muy sensibles para la

deteccin de mutagnesis. Existen cepas de S. typhimurium que llevan mutaciones

en el gen rfa, genes responsables de la sntesis de lipopolisacaridos (LPS),

convirtiendo la pared celular de la bacteria ms permeable a compuestos de gran

tamao molecular. Adems se puede incorporar una delecin en el sistema de

reparacin por escisin uvrB, (uvrB-), incrementando an ms la sensibilidad para la

deteccin del proceso de mutagnesis. El gen mutado uvrB- elimina el sistema de

reparacin por escisin, de esta manera hay ms lesiones en el ADN y se

incrementa la sensibilidad y deteccin por parte del sistema SOS, reparacin

propensa al error. A su vez, esta mutacin se extiende a un bio-gen (bio-) que no

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revierte, de manera que esta bacteria requiere D-biotina para crecer. Algunas cepas

llevan un Factor R, pKM101 (plsmido resistente a la ampicilina).

El plsmido pKM101 de S. typhimurium incrementa qumica y espontneamente la

mutagnesis aumentando el sistema de reparacin con error, que se encuentra

normalmente en este organismo (Mc Cann y col., 1975; Walker y Dobson, 1979).

La resistencia al antibitico ampicilina sirve como marcador para detectar la

presencia del plsmido.

El plsmido, adems, lleva los genes mucAB homlogos de los genes umuAD, del

genforo bacteriano asociados a la respuesta de reparacin con error SOS.

La cepa TA102, adems del plsmido pKM101, tiene un plsmido multicopia pAQ1 y

una insercin de la mutacin hisG428, amplificando as los sitos blanco que

incrementan la capacidad de la cepa de detectar agentes de intercambio por

entrecruzamiento en el ADN (Mortelmans y Stocker, 1997).

El nmero de colonias de las cepas testigo de S. typhimurium con capacidad

independiente de la histidina son determinadas en experimentos de mutagnesis y

se expresan como nmero de revertantes espontneas por placa. Las colonias

revertantes son visibles claramente, con un fondo uniforme con bacterias

auxtrofas. Cada cepa testigo revierte espontneamente con una frecuencia que es

caracterstica para cada cepa (Tabla 5). Las clulas bacterianas cuando son

inducidas por diferentes agentes (e.g., qumicos, radiaciones, frmacos, aceites,

alimentos, aire), pueden indicar la presencia de un efecto mutagnico, cuando

aumenta el nmero de revertantes por encima de la reversin espontnea.

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

El ensayo se realiza con controles positivos utilizando mutgenos de accin

conocida. Se considera que una sustancia es mutagnica cuando duplica el nmero

de la reversin espontnea correspondiente a las cepas testigo seleccionada para la

prueba (Maron y Ames, 1983).

Tabla 5. Genotipos y fenotipos de las cepas S. typhimurium

b c d
Cepa Mutacin Mutacin LPS Plsmido Reversin
a
uvrB-bio defectuoso Espontnea
TA1535 uvrB- rfa Sin plsmido 5-20
hisG46
TA100 uvrB- rfa pKM101 120-200
-
TA1538 uvrB rfa Sin plsmido 5-20
hisD3052
TA98 uvrB- rfa pKM101 30-50
TA1537 hisC3076 uvrB- rfa Sin plsmido 5-20
TA97 hisD6610 uvrB- rfa pKM101 100-200
TA97a uvrB- rfa pKM101 90-180
TA104 uvrB- rfa Sin plsmido 300-400
hisG428
+
TA102 uvrB rfa pKM101, 240-320
pAQ1
a
uvrB Una delecin a travs del gen uvrB-bio, en todas las cepas excepto en la cepa

TA102, bLPS: mutacin de la barrera de lipopolisacridos de la membrana celular

bacteriana, cPlsmido: pKM101, pAQ1, dreversin espontnea/placa

Activacin metablica (fraccin microsomal S9)

Numerosos productos qumicos necesitan ser modificados in vivo para que

alguno(s) de sus derivados tenga(n) actividad mutagnica. Esta es la principal

limitacin de cualquier sistema bacteriano de deteccin de mutgenos, ya que el

sistema bacteriano no reproduce la metabolizacin llevada a cabo por un organismo

eucariota superior, que puede activar o desactivar, una sustancia determinada. Se

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

conoce el hecho que carcingenos in vivo como la aflatoxina B1 o el benzo ()

pireno, slo arrojan resultados positivos en el ensayo de mutagenicidad de S.

typhimurium cuando son activados por la fraccin microsomal S9, activacin que

simula la accin metabolizadora de un hgado de mamferos, ya que el sistema

bacteriano carece de estas enzimas. La fraccin microsomal S9 es un

homogeneizado, generalmente, de hgado o rin de rata y estas enzimas

microsmicas contenidas en la fraccin pos-microsomal S9 (conjunto de vesculas,

tbulos y grnulos relacionados con el retculo endoplasmtico granular y el aparato

de Golgi) cuya actividad es dependiente de NADPH, NADP y glucosa -6-fosfato

(Mortelmans y Zeiger, 2000).

De Flora (1978) reporta evidencias in vitro indicando que algunos compuestos que

son mutagnicos per se en S. typhimurium pueden parcialmente o totalmente ser

desactivados en presencia del homogeneizado de hgado. Este concepto, es de

fundamental importancia y deber ser tenido en cuenta en el anlisis de los

resultados para evitar falsos negativos. Algunos carcinognicos qumicos, como son

las aminas aromticas o hidrocarburos aromticos policclicos son biolgicamente

inactivos, sin embargo, se activan por metabolizacin a su forma activa (pro-

mutgenos). En humanos el sistema oxidativo citocromo P450 est presente

fundamentalmente en clulas de hgado, pulmn y rin y es capaz de metabolizar

a un nmero grande de sustancias qumicas a su forma electroflica, volvindolos

reactivos al ADN.

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Algunos de los metabolitos intermedios son potentes mutgenos en el ensayo de

Ames. Debido a que el sistema bacteriano no posee la capacidad metablica del

mamfero, es que el ensayo utiliza un sistema exgeno de activacin metabolica

(fraccin microsomal S9), de manera que es agregado junto con los qumicos a

ensayar y la bacteria (Mortelmans y Zeiger, 2000; Maron y Ames, 1983). Por este

motivo es extremadamente indispensable realizar todos los ensayos, con y sin

activacin metablica.

1.13. Secuencias blanco de ADN de las cepas de S. typhimurium

La mutacin hisG46, marcador en la cepa TA1535 y TA100 testigo S. typhimurium,

resulta de la sustitucin de leucina (GAG/CTC) por prolina (GGG/CCC). Esta

mutacin es revertida al estado salvaje por mutgenos que causan sustitucin de

pares de base, mutaciones principalmente de los pares GC. La mutacin hisD3052

llevadas por las cepas TA1535 y TA98 es una mutacin -1 de corrimiento de marco

lectura, que afecta la lectura en cercanas de la secuencia repetida C-G-C-G C-G-C-G.

La reversin de la mutacin hisD3052 al tipo salvaje es inducida por varios

mutgenos como el 2-Nitrofluoreno (mutgeno de corrimientos de marco de

lectura) y varios compuestos nitrosos aromticos derivados de amino-carcingenos.

La cepa TA1537, que lleva la mutacin hisD3076 tiene una mutacin +1 corrimiento

de marco de lectura prximo al sitio de secuencias repetidas C-C-C- y revierten al

estado salvaje por mutaciones de corrimiento de marco de lectura, que no es

fcilmente detectado por el marcador hisD3052, como es la 9-aminoacridina (Ames

y col., 1973). La mutacin hisD6610 en la cepa TA97 tambin lleva una mutacin

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

(citosina) de tipo +1 corrimiento de marco de lectura resultando en un corrimiento

de 6 citosina (C-C-C-C-C-C-). Esta cepa parece ser ms sensible para algunos

mutgenos que aquellos que revierten la cepa TA1535 y TA98 (Levin y col., 1982).

Los sitios blanco del ADN, para la descripcin anterior, slo contiene el par de

bases GC. En contraste, existen las cepas TA102 y TA104 que fueron desarrolladas

para contener pares de base AT en el sitio mutado hisG428 (Mortelman y Zeiger,

2000). La mutacin se encuentra en el plsmido multi-copia pAQ1 en la cepa TA102

y en el cromosoma bacteriano en la cepa TA104. El plsmido le confiere resistencia

a la tetraciclina, con el fin de ser un marcador de la presencia del plsmido. La

mutacin hisG428 es una mutacin ocre, TAA en el gen hisG, que puede ser

revertido por seis cambios de pares de base posibles, transiciones y transversiones.

Estas mutaciones tambin revierten por mutgenos que causan dao oxidativo. En

la cepa TA102, el sistema de reparacin detecta agentes como la bleomicina y la

mitomicina que producen entrecruzamiento (Levin y col., 1982; Sanabruch y

Walker, 1980; Walker y Dobson, 1979).

1.14. Antimutagnesis

Antimutagnesis es el evento que conduce a contrarrestar o eliminar los daos

mutagnicos provocados por componentes de diversos orgenes presentes en el

ambiente, que constituyen un factor de riesgo para el material gentico y los

pueden conducir finalmente a un proceso neoplsico (Kada, 1984 ).

El trmino Antimutagnesis fue utilizado inicialmente por Novik y Szilard en el ao

1951 cuando descubrieron que la presencia de nucletidos normales de purina en

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un medio de crecimiento reduca significativamente la frecuencia de mutaciones de

resistencia a fagos en la poblacin bacteriana (Novick y Szilard, 1951, 1952).

Kada en el ao 1984 postul que la antimutagnesis es el proceso mediante el cual

se reduce la frecuencia de mutaciones espontneas o inducidas. Tomando en

cuenta este concepto, la accin antimutagnica de un compuesto queda definida

como la caracterstica o accin de esta sustancia para disminuir o evitar el dao al

ADN celular (Kada, 1984).

Los antimutgenos pueden ser agrupados en dos grandes categoras: a) los agentes

bloqueadores, que impiden que los carcingenos alcancen o reaccionen con los

sitios diana y b) los agentes supresores, que previenen la evolucin de los procesos

neoplsicos (Wattenberg, 1981).

De Flora en 1997, plante que los agentes bloqueadores son inhibidores de la

iniciacin de la tumorignesis, mientras que los agentes supresores pueden ser

identificados como inhibidores de la promocin/ progresin de dicho proceso.

En el ao 1987, Kada y sus colaboradores clasificaron a los antimutgenos en dos

categoras a) desmutgenos y b) bio-antimutgenos (Fig. 3 y 4), clasificacin usada

actualmente (Kada y col., 1987).

El trmino desmutgeno se refiere a aquellos agentes que actan en forma directa

con el mutgeno, modificndolo, ya sea en su estructura qumica o bioqumica,

trayendo consigo reacciones de metabolizacin dentro del organismo antes que el

mismo alcance la molcula blanco (Fig. 3). Otros desmutgenos inhiben la accin

del sistema enzimtico P450 involucrado en la activacin de mutgenos.

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Los bio-antimutgenos (Fig. 4) incrementan la fidelidad en la replicacin,

promueven la reparacin del dao sobre el ADN y estn involucrados en la

estimulacin de la reparacin libre de errores y en la inhibicin del sistema de

reparacin con error SOS (Wall y col., 1988). Son agentes biolgicamente activos

que interfieren con las funciones celulares que determinan los procesos de

mutagnesis o reparacin del ADN, esto lleva a una disminucin de la frecuencia de

las mutaciones tanto inducidas como espontneas.

El empleo de los mtodos microbianos hacen posible distinguir antimutgenos

(agentes que trabajan in vitro sobre los mutgenos).

Desmutgenos
Agente mutagnico

*
Clula normal

ADN

Fig. 2. Esquema representativo de la posible accin protectora de los desmutgenos

En los mamferos, es bastante dificultoso saber si un agente ha suprimido la

mutagnesis, modificando un mutgeno antes de interactuar con el ADN celular o

interfiriendo con algn aspecto del metabolismo celular.

Para evaluar la actividad antimutagnica, el Ensayo de Ames nos permite cuantificar

el efecto quimio-protector de diferentes sustancias cuyos compuestos son capaces

de impedir o bloquear la mutagnesis.

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Bio-antimutgeno

*
mutgeno

Fig. 3. Esquema representativo de la posible de accin de los bio-antimutgenos sobre el

ADN.

La evaluacin se hace mediante la presencia de testigos o controles positivos, pro-

mutgenos o mutgenos de accin conocida.

Esto hace que el sistema bacteriano capaz de revertir la mutacin del gen histidina

(his-), inducido por un mutgeno o promutgeno, quede bloqueado por algn

mecanismo en la clula.

La mayora de los estudios vinculados a las propiedades antimutagnicas, quimio-

preventivas y anti-carcinognicas, as como estudios epidemiolgicos realizados en

humanos, han sido focalizados en los ts negro y verde (Yamada y Tomita,1994).

Han sido ampliamente estudiadas la propiedades anti-cancergena de los ts, as

como la potencialidad de los polifenoles en los ts negro y verde y su capacidad en

la inhibicin de tumores (Hirose y col., 1993).

Escasa es la informacin bibliogrfica internacional referida al efecto

antimutagnico de B. articulata, planta objeto de estudio de la presente Tesis

Doctoral. Como se mencion anteriormente, el efecto antimutagnico del extracto

metanlico de B. trimera (Less.) ha sido informado empleando el Ensayo de Ames .

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Los autores concluyen que a pesar de no haber determinado cual de las cuatro

flavonas aisladas en el extracto metanlico resultaron ser desmutgenos o

bioantimutgenos, se sospecha que son desmutagenos debido a que una de ellas,

luteolina, fue informada como fuerte desmutgeno frente al mutgeno Trp-P-2 y no

bioantimutgeno (Nakasugi y Komai, 1998) .

Por todo lo expuesto, resulta relevante estudiar el efecto antimutagenico y esbozar

posibles mecanismos de accin antimutagnica de B. articulata empleando el

Ensayo de Ames.

Se plantea la siguiente hiptesis de trabajo.

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2. HIPTESIS Y OBJETIVOS

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2.1. Hiptesis

El extracto acuoso de B. articulata (Lam.) Persoon, planta medicinal popular

(Boelcke, 1981) empleada en Argentina predominantemente como infusin,

presenta actividad antimutagnica y esta capacidad est relacionada con sus

propiedades antioxidantes.

2.2. Objetivo General

Evaluar la actividad antimutagnica del extracto acuoso de B. articulata (Lam.)

Persoon mediante el Ensayo de Ames y analizar los componentes del extracto

acuoso con actividad antioxidante.

2.3. Objetivos Especficos

Estudiar la composicin de polifenoles presentes en el extracto acuoso de B.

articulata (Lam.) Persoon por cromatografa lquida de fase inversa RP-HPLC.

Evaluar la actividad antioxidante del extracto acuoso de B. articulata (Lam.) Persoon

y de uno de sus compuestos mayoritarios (cido clorognico) mediante el ensayo de

inhibicin del radical DPPH*.

Evaluar el efecto txico del extracto acuoso de B. articulata (Lam.) Persoon y del

cido clorognico, utilizando dos variantes del Ensayo de Ames (incorporacin en

placa y pre incubacin) frente a las cepas de S. typhimurium TA100 y TA98 con y sin

agregado de fraccin microsomal.

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Evaluar el efecto mutagnico inducido por el extracto acuoso de B. articulata (Lam.)

Persoon y por el cido clorognico utilizando dos variantes del ensayo de

mutagnesis de S. typhimurium (incorporacin en placa y pre incubacin) frente a

las cepas TA100 y TA98 con y sin agregado de fraccin microsomal.

Evaluar el efecto antimutagnico del extracto acuoso de B. articulata (Lam.)

Persoon utilizando dos variantes del Ensayo de Ames (incorporacin en placa y pre-

incubacin) y del cido clorognico (mtodo de pre-incubacin), frente a las cepas

TA100 y TA98 con y sin activacin metablica empleando mutgenos de accin

conocida.

Comparar los efectos antimutagnicos del extracto acuoso de B. articulata (Lam.)

Persoon y del cido clorognico.

Proponer posibles mecanismos de accin antimutagnica de B. articulata (Lam.)

Persoon.

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3. MATERIALES Y MTODOS

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

3.1. Sustancias Qumicas

Los reactivos y drogas utilizadas en los ensayos generales fueron: 2-nitrofluoreno

(2-NF, CAS N 607-57-8), 2-aminofluoreno (2AF, CAS N 153-78-6), azida sdica

(AZS, CAS N 26628-22-8), dimetil sulfoxido (DMSO, CAS N 67-68-5), 2, 2-Difenil-2-

picril hidrazilo (DPPH, CAS N 1898-66-4), quercetina (CAS N 117-39-9.100), rutina

(CAS N 7621-88-7), cido clorognico (CAS N 327-97-9.100), kaempferol (CAS N

520-18-3) y cido cafeco (CAS N 331-39-5) adquiridos de Biochemicals (California).

Metanol (CAS N 67-56-1) y cido frmico (CAS N 64-18-61) fueron adquiridos de la

firma Mallinckrodt (Paris, KY, EEUU).

Los reactivos para el desarrollo del Ensayo de Ames fueron: Nutrient Broth Oxoid

N2 (NB N2, CM0067), adquirido en la empresa Hamshire, (Inglaterra).

Agar bacteriolgico tipo A (CAS N 9002-18-0), proveniente de Merck KgaA,

(Darmstadt, Alemania). Ampicilina (CAS N 69-53-4), tetraciclina (60-54-8) D-biotina

(CAS N 58-85-5), L- histidina-HCl (CAS N 71-00-1) y cristal violeta (CAS N 548-62-

9) fueron provistos por Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EEUU). D- Glucosa (CAS N 50-

99-7), cloruro de sodio (CAS N 7647-14-511), sulfato de magnesio heptahidratado

(CAS N 10034-99-8) y cido ctrico (CAS N 77-92-91) fueron provistos por Sigma-

Aldrich (St. Louis, MO, EEUU). Fosfato de potasio dibsico anhidro (CAS N 7758-11-

4) y fosfato de amonio sdico tetrahidratado (CAS N 7783-13-3) fueron adquiridos

en la empresa Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). Cloruro de magnesio (CAS N

7791-18-6), cloruro de potasio (CAS N 7447-40-7), glucosa-6-fosfato (CAS N 56-73-

5), -nicotinamida adenina dinucletido fosfato (CAS N 24292-60-2), fosfato de

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sodio dihidrogenado (CAS N10049-21-5) y fosfato de sodio dibasico (CAS N 7632-

05-5), fueron adquiridos en Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EEUU).

La fraccin microsomal S9 fue adquirida a la empresa Moltox Molecular Toxicology

Inc. (Booen, NC, EEUU).

3.2. Soluciones y Medios de cultivo

Solucin L-histidina HCl - D-biotina (0,5 mM 0,5 mM)

Solucin Vogel Bonner (50X): solucin acuosa de sulfato de magnesio

heptahidratado 10 g/L, cido ctrico 100 g/L, fosfato de potasio dibsico anhidro

500 g/L, fosfato de amonio sdico tetrahidratado 175 g/L

Buffer fosfato 0,2 M

Solucin fisiolgica: Cloruro de sodio 7 g/L

Solucin de L-histidina HCl 2 g/L

Solucin de D-biotina 0,5 mM

Solucin de ampicilina 0,02 N

Solucin de tetraciclina 0,02 N

Los medios de cultivo fueron:

Caldo Nutritivo: Nutrient Broth N 2 25 g/L

Medio Mnimo: D-glucosa 20 g/L, agar bacteriolgico Tipo A 15 g/L, Vogel Bonner

(50X) 20 ml/L

Medio permisivo: D-glucosa 20 g/L, agar bacteriolgico tipo A 15 g/L, Vogel Bonner

(50X) 20 ml/L, solucin de L-histidina HCl 2 x 10-2 g/L, solucin de D-biotina 7,32 x

10-4 g/L y solucin de ampicilina 2,5 x 10-2 g/L

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Agar blando: agar bacteriolgico tipo A 6 g/L, cloruro de sodio 5 g/L

Preparacin de mezcla S9 para los ensayos con activacin metablica

Para los ensayos con activacin metablica se prepar una solucin mezcla de:

solucin salina de cloruro de magnesio - cloruro de potasio (1,63 g/L - 2,46 g/L ),

glucosa-6-fosfato 1,41 g/L, adenina dinucletido fosfato 3,06 g/L, buffer fosfato 0,1

M (pH=7). A esta solucin se le incorporaron 40 ml/L del extracto microsmico de

hgado de rata (S9).

3.3. Material utilizado: hierba medicinal B. articulata (Lam.) Persoon

El material utilizado consisti en hojas y troncos secos de B. articulata (Lam.)

Persoon. Las muestras comerciales [1000 g (Fig. 5)] fueron adquiridas en una

farmacia homeoptica de la ciudad de la Plata (Prov. Buenos Aires, Argentina). Este

material provena de Villa Dolores, Prov. Crdoba, Argentina, siendo la empresa

distribuidora Herbores (Capital Federal, Pcia. Buenos Aires, Argentina)

El material fue identificado por la Dra. Etile Spegazzini del Laboratorio de Frmaco

Botnica de la Facultad de Ciencias Exactas, Universidad Nacional de la Plata

(UNLP). Espcimen depositado (N 1107, 0906) en el herbario del Museo de

Farmacognosia Carlos Spegazzini, Facultad de Ciencias Exactas, UNLP, Buenos

Aires , Argentina.

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Fig. 4. Bolsas con hojas y troncos secos de B. articulata (1000 g)

3.4. Mtodo utilizado para la obtencin del extracto acuoso de B. articulata (EAB)

Para la preparacin del EAB se procedi a pesar 30 g del material (hojas y troncos

secos) y se llev a volumen con 100 ml de agua destilada estril caliente (85C),

simulando una infusin teiforme. La infusin se mezcl y tritur para

homogeneizarlo con una procesadora hogarea a temperatura ambiente. La mezcla

preparada se tamiz con un colador grueso y luego se filtr con papel ( 90 mm,

Whatman, Merck KGaA (Darmstadt, Alemania). El filtrado se centrifug tres veces a

9000xg (4C, 30 min) utilizando una centrifuga AvantiTM J-25, (Beckman Coulter,

Fullerton, CA, USA). El sobrenadante se coloc en bandejas de plstico formando

una pelcula de 1 a 2 mm de espesor y se coloc a - 80C, con la finalidad de

preparar el material a ser liofilizado.

Para la liofilizacin se utiliz un equipo Heto FD4 (Argentina), bajo las siguientes

condiciones de liofilizacin: -50 0,2C, con bomba rotativa a paleta R26; caudal

5,7m/h; presin de vaco 2x10-3 atm (marca Vacuubrand, Alemania). El material

liofilizado se fraccion en tubos de ensayo preservndolo a -20C hasta su uso.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 74

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La preparacin de las soluciones de trabajo se realizaron utilizando 2 g del material

liofilizado el que fue resuspendido en 10 ml de agua destilada estril a 85C. Esta

suspensin se fraccion en alcuotas homogeneizadas de 1 ml, las que se

preservaron a -20C hasta su empleo experimental. Previamente a la realizacin de

los ensayos, el material se filtr a travs de membranas osmticas de 0,45 m y

25 mm de dimetro.

3.5. Determinacin de los polifenoles en el EAB por cromatografa lquida de fase

inversa (RF-HPLC)

El anlisis del contenido de polifenoles en el EAB se realiz aplicando el mtodo de

cromatografa lquida de fase inversa (RF-HPLC). Para ello, se emple un

cromatgrafo liquido Hewlett Packard 1100 (CA, USA) equipado con bomba binaria,

inyector automtico, degasificador de vaco y detector de arreglo de diodos (DAD)

conectado a la estacin de trabajo (PC equipada mediante programa computacional

adquisidor de datos), empleando una columna (250 x 4,6 mm2, dimetro interno)

conteniendo partculas de Zorbax 300 SB-C18 de 5 Mm y conectada a una columna

guarda.

Se emple un gradiente de elucin escalonado a un caudal de 0,9 ml/min. La fase

mvil contenida en el reservorio A consisti de una mezcla de agua ultrapura

(Milli-Q, Millipore Co., Bedford, MA, USA), metanol y cido frmico (79,7:20,0:0,3) y

en el reservorio B una mezcla de metanol y cido frmico (99,7:0,3). El gradiente

empleado se describe en la Tabla 6. Finalmente la composicin de la fase mvil

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 75

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

retorn a 0% B en 5 min y se mantuvo 10 min adicionales para equilibrar la columna

antes de la prxima inyeccin.

Se utilizaron los siguientes polifenoles: cido clorognico, rutina, kaempferol, cido

cafeico y quercetina como estndares para la identificacin de los compuestos

presentes en el extracto. Las soluciones fueron filtradas antes de la inyeccin a la

columna cromatogrfica empleando membranas de nylon de 0,22 .

En la Tabla 7 se reproducen las concentraciones de los estndares usados y su

tiempo de retencin. Sobre la base de las longitudes de onda de los mximos de las

bandas de absorcin UV-vis se seleccionaron para el anlisis de los cromatogramas

dos longitudes de onda: 330 nm para los compuestos menos retenidos o ms

hidroflicos (cido clorognico y cido cafeico) y 360 nm para los ms hidrofbicos o

ms retenidos (rutina, quercetina y kaempferol).

Tabla 6. Gradiente de elucin empleado en la corrida cromatogrfica

Tiempo (min) %A %B

15 100 0

15 90 10

10 70 30

10 40 60

2 20 80

Fase Mvil: (A) Agua, metanol y cido frmico (79,7:20,0:0,3) y (B) metanol y cido frmico

(99,7:0,3)

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Tabla 7. Concentraciones y tiempos de retencin de los estndares utilizados en la

determinacin de polifenoles por cromatografa lquida de fase inversa

Concentracin Tiempo de retencin

Compuesto
(mg/ml) (min)
Quercetina 0,103 44,52

Rutina 0,105 36,48

cido clorognico 0,101 11,92

Kaempferol 0,108 44,47

cido cafeico 0,107 12,88

La muestra de EAB (30 l) fue inyectada en el equipo de RF-HPLC por triplicado.

Adicionalmente, se realizaron los cromatogramas de las muestras en estudio con el

mtodo del sobreagregado de los estndares puros a los efectos de verificar la co-

migracin por el incremento del rea del pico cromatogrfico correspondiente.

La cuantificacin de los compuestos detectados en el EAB se realiz a partir de las

curvas de calibracin de los estndares, usando el rea de los picos expresada en

mili Unidades de Absorbancia (mUA) obtenidas luego de la inyeccin de diferentes

volmenes de los estndares (Tabla 8).

El lmite de deteccin (LOD) de la metodologa se calcul a partir de la desviacin

estndar (sy/x) y de la pendiente (b1) de la curva de calibracin empleando la

siguiente frmula propuesta por la IUPAC, que toma como parmetro el valor del

desvo estndar de los compuestos residuales (ecuacin 1).

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Tabla 8. Curvas de calibracin de los estndares realizada mediante RP-HPLC

Compuesto Ordenada al Pendiente R2 (coeficiente Nmero

origen (rea) (rea mg/ml) de de
determinacin) muestras
cido 18,67039 483692500 0,989 5
clorognico
cido cafeico -169,00094 858035629 0,987 5

Rutina -31,188012 19853769 0,994 6

Quercetina -7,768463 407623999 0,962 6

Kaempferol -98,416040 481012433 0,989 6

ecuacin (1)

Dnde:

sy/x = desviacin estndar de los residuos en las rectas de calibrado

El desvo estndar de los compuestos residuales se calcul a partir de la frmula

descripta en la ecuacin 2.

ecuacin (2)

Dnde:

b1: Pendiente de la recta de calibrado; N: Nmero de patrones de calibrado; xi: Cada

una de las concentraciones de patrones calibrados, m: nmero de rplicas de cada

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 78

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

patrn de calibrado (n=3); : Media de las concentraciones de los patrones de

calibrado.

3.6. Evaluacin de la actividad antioxidante del EAB

La capacidad anti-rradical libre o antioxidante del EAB fue determinada usando el

radical 2,2-difenil -1-picril hidracilo (DPPH*) como indicador de actividad. Este

radical tiene un electrn desapareado y en solucin metanlica es de color azul-

violeta, decolorndose hacia el amarillo plido al reaccionar con una sustancia

antioxidante (Fig. 6). En su forma estable el radical absorbe a una longitud de onda

de 515 nm. Al ser reducido por un antioxidante (AH) u otra especie radical R*, la

absorbancia a esta longitud de onda desaparece por el cambio de color. De esta

forma, la evolucin de la reaccin redox puede monitorearse por la disminucin en

la medida de la absorbancia a 515 nm. Las reacciones qumicas Redox

caractersticas del proceso de inhibicin de radical DPPH* se presentan a

continuacin:

DPPH*+AHDPPH-H + A*

DPPH*+ R*DPPH-R

La cuantificacin de la actividad antioxidante se realiz siguiendo el protocolo de

Brand-Willams y col. (1995). La tcnica se basa en dejar reaccionar los compuestos

con supuesta actividad antioxidante con el radical DPPH* en solucin metanlica. La

inhibicin del radical libre se cuantifica a travs de la medida de la absorbancia a

515 nm.

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

3.6.1.Procedimiento desarrollado para la determinacin de la actividad

antioxidante del EAB

La evaluacin de la capacidad antioxidante del EAB se llev a cabo empleando 2 g

del material liofilizado. El mismo fue diludo con agua estril hasta 10 ml

(concentracin final 200 mg/ml) y a partir de all se prepar una dilucin 1/100 que

constituy la solucin de trabajo (2 mg/ml).

Como control positivo se utiliz el cido clorognico (0,3 mg/ml) en una dilucin

1/100 (0,003 mg/ml).

Violeta Amarillo

Fig. 5. Descripcin de la reaccin qumica de inhibicin del radical DPPH*

Las curvas de Inhibicin se prepararon utilizando diluciones de la solucin de

trabajo de EAB y del cido clorognico (1/100) en agua destilada agregando

volmenes crecientes hasta alcanzar un volumen final de 1 ml, segn se describe en

la Tabla 9.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 80

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Las reacciones de inhibicin se prepararon en un volumen final de 3 ml, mezclando

2 ml de una solucin 40 ppm del radical DPPH* en metanol y 1 ml de la solucin de

antioxidante (preparada segn se describe en la Tabla 9). Para el blanco patrn de

referencia (0% de inhibicin) se utiliz 1 ml de metanol con 2 ml del DPPH*. La

mezcla se incub 90 min a efectos de permitir el desarrollo de la reaccin (cambio

de color prpura al amarillo).

Tabla 9. Concentracin del EAB y del cido clorognico en la solucin antioxidante

usada en las reacciones de inhibicin (expresada en g/ml)

Volumen Incorporado1
25 l 40 l 50 l 55 l 75 L 80 l 100 l
cido clorognico g/ml 0,075 0,120 0,150 0,165 0,225 0,240 0,300

EAB g/ml 50 80 100 110 150 - -

1
Corresponde a la cantidad incorporada en el volumen final de 1 ml usado como solucin

antioxidante

Transcurrido este perodo se midi la absorbancia a una longitud de onda de 515

nm en espectrofotmetro UV-VIS (Shimadzu UV mini-1240, Kyoto, Japn). Con los

valores de las absorbancias obtenidas se determin el porcentaje de inhibicin o

captacin de radicales (%I) a partir de la medida de absorbancia de la reaccin de

acuerdo a la frmula propuesta por Kulisic y col. (2004), la que se reproduce en la

ecuacin 3.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 81

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

A2 - A3
%I 1 - x100 ecuacin (3)
A1

Dnde:

A1 = Absorbancia del blanco patrn de referencia (0% de inhibicin); A 2 =

Absorbancia de la muestra; A3 = Absorbancia del blanco de la muestra (sin DPPH*).

Sobre la base del valor de estos ndices se estimaron los equivalentes de cido

clorognico en el EAB.

La actividad antioxidante del EAB, se evalu mediante el parmetro denominado

Concentracin Eficiente Cincuenta (CE50) que resulta ser la concentracin necesaria

para alcanzar una inhibicin del radical libre del 50%.

Los valores de CE50 para el cido clorognico y para el EAB se calcularon a partir de

las rectas de regresin que vinculan el porcentaje de inhibicin con la concentracin

de antioxidante incorporado a la mezcla de reaccin. Sobre la base de los CE50

obtenidos en los dos casos, se estimaron los mg de cido clorognico equivalentes

en el EAB. Los ensayos se realizaron por duplicado y en paralelo.

3.7. Cepas bacterianas seleccionadas para la realizacin del Ensayo de Ames

Para los ensayos de confirmacin de los genotipos se usaron las cepas bacterianas

S. typhimurium TA98 (cepa que detecta corrimiento de marco de lectura), TA100 y

TA102 (cepas que detectan intercambio de pares de bases). La cepa TA102 fue

utilizada a los efectos de verificar la presencia de la mutacin uvrB, presente en las

cepas TA98 y TA100 (mutacin en el sistema de reparacin por esicin), ya que esta

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 82

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cepa (TA102) posee el sistema de reparacin intacto (uvrB+) (acpite 3.8.). Para la

evaluacin de la toxicidad, mutagenicidad y antimutagenicidad se usaron las cepas

bacterianas S. typhimurium TA98 y TA100. Las mismas fueron adquiridas en la

empresa Moltox Molecular Toxicology Inc. (Booen, NC, EEUU) cuyos genotipos se

describen en la Tabla 5 (Maron y Ames, 1983).

Las cepas de S. typhimurium fueron remitidas por la empresa Moltox en pequeos

discos liofilizados y refrigerados. Para la produccin de los inculos primarios, los

discos se colocaron en 5 ml de medio de cultivo nutritivo (N2, Oxoid) los que se

incubaron a 37C durante 48 h a los efectos de obtener una densidad de 1-2 x 109

clulas/ml. Una vez obtenida esta poblacin celular, la muestra se fraccion en

criotubos de 1 ml, tomando alcuotas de 90 l e incorporando 910 l de

dimetilsulfxido (DMSO) para la crio preservacin de las muestras (Maron y Ames,

1983). El inculo primario se conserv a -80C.

La preparacin de las placas maestras se realiz a partir del inculo preservado de

las cepas de S. typhimurium a -80C. Para ello se tom una muestra del material

congelado empleando un ansa estril y se sembr por agotamiento en superficie en

placas con medio permisivo (conteniendo ampicilina), usado como presin de

seleccin para garantizar la presencia del plsmido pKM101 (cepas TA98 y TA100).

Para la cepa 102 se utiliz medio permisivo conteniendo ampicilina y tetraciclina

(2,0 x 10-3 g/L) utilizado como presin de seleccin para garantizar la presencia del

plsmido pKM101 y pAQ1, respectivamente. Las placas se incubaron 12-24 h a 37C.

Un vez crecidas, se tomaron 3 o 4 colonias las que se resuspendieron en 0,3 ml de

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 83

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solucin fisiolgica y la suspensin se utiliz para realizar tres o cuatro estras

paralelas en medio permisivo con ampicilina o ampicilina y tetraciclina,

dependiendo de la cepa utilizada. Estas placas se utilizaron para preparar los

cultivos de trabajo, renovando las mismas cada dos meses (Maron y Ames, 1983).

3.8. Confirmacin de las caractersticas genotpicas de las cepas de S.

typhimurium.

Mutacin rfa

La mutacin rfa causa la prdida parcial de la barrera de polisacridos de la

membrana bacteriana generando un fenotipo altamente rugoso para las colonias

bacterianas. Esta mutacin incrementa la permeabilidad de la pared celular

favoreciendo la deteccin de mutgenos (Maron y Ames, 1983).

La presencia de la mutacin rfa fue confirmada mediante el ensayo de sensibilidad

al cristal violeta en placas con medio nutritivo (Ames y col., 1973). Se coloc 0,1ml

de un cultivo bacteriano de la noche (overnigth) en un tubo con 2,50 ml de agar

blando, luego se sembr en la placa de agar nutritivo . Cuando el agar se solidific

un poco, se coloc un pequeo filtro estril conteniendo cristal violeta en el

centro de la placa y se incub en estufa a 37C durante 24 h.. Luego se procedi a la

observacin de las placas:

Si la cepa posee la mutacin rfa se observa alrededor del filtro una zona clara de

inhibicin que indica muerte celular (Fig. 7).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 84

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Fig. 6. Fotografa de placas con las cepas de S. typhimurium, donde se observa una placa

con colonias normales y una placa con la zona clara formada alrededor del filtro,

conteniendo cristal violeta.

Mutacin uvrB

El gen uvrB forma parte del opern uvr que interviene en el mecanismo de

reparacin por escisin. La presencia de la mutacin en las cepas fue confirmada a

travs de la sensibilidad a la luz ultravioleta (UV) (Ames y col., 1973).

Se realizaron estras paralelas a partir de cultivos saturados (1-2 x109 clulas/ml) de

las cepas TA98, TA100 (cepas uvrB-) y la cepa TA102 (cepa uvrB+) en agar de medio

permisivo. Para la seleccin de la cepa testigo TA102 uvrB+ se utiliz medio

permisivo conteniendo tetraciclina 2,0 x 10-3 g/L. La placa, con las tres estras

representadas por cada cepa bacteriana (TA98, TA100, TA102) se expuso bajo

lmpara germicida durante 30 seg (15 V) a una distancia de 33 cm, tapando

transversalmente la mitad de la placa con papel aluminio para que slo una parte

quedara expuesta a la radiacin. Luego se incub en oscuridad a 37C durante 24 a

48 h. Se pudo observar claramente la muerte de las colonias correspondientes a las

cepas TA100 y TA98 (cepas defectuosas uvrB-) mientras que la cepa TA102 (uvrB+)

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 85

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

repar el dao en el ADN bacteriano producido por las radiaciones UV, evidenciado

por falta de prdida de viabilidad.

3.9. Evaluacin del efecto txico del EAB y del cido clorognico frente a las cepas

de S. typhimurium

Se evalu el efecto txico del EAB utilizando el Ensayo de Ames con las cepas TA98 y

TA100 mediante dos metodologas: ensayo de incorporacin en placa y pre-

incubacin con y sin activacin metablica.

El efecto txico del cido clorognico se evalu empleando el mtodo de pre-

incubacin con y sin activacin metablica.

3.9.1. Evalucin del efecto txico del EAB mediante el ensayo de incorporacin en

placa

Para el ensayo de la viabilidad bacteriana se prepararon diluciones seriadas

partiendo de un cultivo de la noche (overnight) (16-20hs) de las cepas testigo

seleccionadas (TA98 y TA100) de modo de obtener un factor de dilucin de 1/105.

En un tubo conteniendo 2,5 ml de agar blando fundido y mantenido a 45C se

agregaron: 0,1 ml de la dilucin bacteriana, 0,5 ml de mezcla S9 o 0,5 ml de solucin

tampn de fosfatos 0,2 M. Seguidamente se agregaron 5,0 o 50,0 l del EAB a

efectos de arribar a una concentracin final del mismo de 1,0 y 10,0 mg/placa. El

control negativo se realiz reemplazando el EAB por DMSO. Las mezclas se agitaron

mediante vortex y se sembr en forma directa sobre placas de agar nutritivo. Las

mismas se incubaron a 37C durante 48 h. Luego se procedi al conteo y clculo de

las unidades formadoras de colonias (UFC/ml).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 86

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

3.9.2. Evaluacin del efecto txico del EAB mediante el mtodo de pre-incubacin

Para el ensayo de viabilidad por el mtodo de pre-incubacin se prepararon

diluciones seriadas de un cultivo de la noche (overnight) de las cepas testigo

seleccionadas (TA98 y TA100) de modo de obtener un factor de dilucin de 1/10 5.

Seguidamente, 0,1 ml de la dilucin bacteriana se mezclaron con 0,5 ml de mezcla

S9 0,5 ml de buffer fosfato 0,2 M. Luego se agregaron 5,0 50,0 l del EAB a

efectos de arribar a una concentracin final de 1,0 y 10,0 mg/placa. La mezcla se

llev a un volumen final de 700 l con agua destilada estril y se incub durante 1 h

a 37C. Al finalizar este tiempo, la mezcla en su totalidad (Vf=700 l) se incorpor a

2,5 ml de agar blando fundido (45C) y se sembr en placas conteniendo medio

nutritivo, las cuales se incubaron a 37C durante 48 h. Luego se procedi al conteo y

clculo de las unidades formadoras de colonias (UFC/ml). El control negativo se

realiz reemplazando el EAB por DMSO.

La toxicidad tambin fue evaluada rutinariamente en cada ensayo por observacin

visual directa del fondo bacteriano en las placas con medio selectivo antes de que

se consuman las trazas de histidina segn lo recomendado (Verschaeve y Van

Staden, 2008).

3.9.3. Evaluacin del efecto txico del cido clorognico mediante el mtodo de

pre-incubacin

Para analizar la toxicidad del cido clorognico frente a las cepas de S. typhimurium

(TA98 y TA100) se utiliz el mtodo de pre-incubacin,con y sin activacin

metablica.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 87

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Se prepar una solucin madre (con agua destilada) de cido clorognico de 10

mg/ml y se sembraron 5 y 50 l/placa, para arribar a una concentracin final de

0,05 y 0,50 mg/placa. Se sigui la metodologa descripta en el punto 3.9.2

remplazando el EAB por cido clorognico.

3.10. Ensayos de mutagenicidad del EAB y del cido clorognico

3.10.1. Mutagenicidad del EAB

La evaluacin de la posible mutagenicidad del EAB se realiz mediante el Ensayo de

Ames (Maron y Ames, 1983), utilizando las cepas TA100 y TA98, con y sin activacin

metablica. Se desarrollaron dos mtodos: el mtodo de incorporacin en placa y el

mtodo modificado de preincubacin.

Ensayo de incorporacin en placa

Para el desarrollo de ste mtodo, se sigui el siguiente procedimiento: en tubos

conteniendo 2,5 ml de agar blando (a 45C), L-histidina HCL D- biotina (0,5 mM

0,5 mM) se adicion 0,1 ml de un cultivo de toda la noche (overnight) de las cepas

testigo seleccionadas (TA98 o TA100) y 0,5 ml de mezcla S9 (ensayos con activacin

metablica) o buffer fosfato pH 7,4 (ensayos sin activacin metablica).

Seguidamente se agregaron 5,0 50,0 l de EAB para lograr una concentracin final

de 1,0 y 10,0 mg/placa respectivamente. Esta mezcla se homogeneiz mediante

vortex y se sembr en placas con medio mnimo, incubndose a 37C durante 48 h.

Luego se procedi al conteo de las colonias revertantes his+.

En todos los ensayos se realizaron los controles negativos sin el agregado de

extracto (revertantes espontneas). Como controles positivos y de acuerdo a las

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 88

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

condiciones del ensayo, se realizaron las curvas dosis respuesta de los mutgenos

diagnstico que se indican en la Tabla 10.

Tabla 10. Dosis y condiciones usadas para los mutgenos empleados como

controles positivos en los distintos ensayos

Activacin
Cepa Mutgeno Dosis g/placa
Metablica
2- NF 0,25; 0,50; 1,25; 2,50 NO
TA98
0,25; 0,50; 1,25; 2,50 SI
2- AF
AZS 0,50; 2,50; 5,00 NO
TA100
2-AF 0,25; 0,50; 1,25; 2,50 SI

Ensayo de pre-incubacin

Para la realizacin del ensayo con pre-incubacin se sigui el protocolo sugerido por

Mortelmans y Zeiger (2000) y Yen y col. (2001) con modificaciones menores. Se

prepar una mezcla de pre-incubacin con 0,1 ml de un cultivo (overnight) (TA98 o

TA100), 0,5 ml de mezcla S9 o buffer fosfato pH 7,4 (con y sin activacin metablica

respectivamente). Seguidamente se agreg 5,0 o 50,0 l de EAB para arribar a una

concentracin final de 1,0 y 10,0 mg/placa respectivamente. El volumen final se

ajust en 700 l con agua estril DMSO. Despus de incubar en estufa a 37C

durante 1 h (sin agitacin), el total de la mezcla de incubacin (Vf=700 l) se agreg

a un tubo con 2,5 ml de agar blando, conteniendo L-histidina HCl D-biotina (0,5

mM 0,5 mM), se homogeniz en vortex y luego se verti en placas conteniendo

medio mnimo.
Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 89
Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Despus de incubar a 37C durante 48 h se procedi al conteo de las colonias

revertantes his+.

En las mismas condiciones se analiz la respuesta de los mutgenos diagnsticos

usados como controles positivos que se indicaron en el punto anterior (ver Tabla

10), incluyndose tambin el control negativo sin el agregado de extracto

(revertantes espontneas).

Se consider mutagnico cuando el valor de las revertantes inducidas por el EAB,

result el doble del valor obtenido con el control negativo (revertantes

espontneas).

Los ensayos se realizaron por duplicado y los datos fueron expresados como el valor

medio desviacin estndar de la media correspondiente al nmero de colonias

por triplicado.

3.10.2. Mutagenicidad del cido clorognico

La evaluacin de la mutagenicidad del acido clorognico, se realiz con las cepas

TA100 y TA98 empleando el mtodo de incorporacin en placa y el mtodo de pre-

incubacin de forma similar a la descripta para el EAB.

Para su desarrollo se prepar una solucin acuosa de 10,0 mg/ml de cido

clorognico y se sembraron 5 y 50 l para arribar a una concentracin final de 0,05

y 0,50 mg/placa (en placas de medio mnimo). Asimismo, se realizaron los controles

negativos correspondientes a las revertantes espontneas sin cido clorognico as

como los controles positivos que se corresponden con los referidos en la Tabla 10.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 90

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Se sigui la metodologa descripta (mtodo de incorporacin en placa y pre-

incubacin) en el punto 3.10.1 remplazando el EAB por el cido clorognico.

Los ensayos se realizaron por duplicado y los datos fueron expresados como el valor

medio desviacin estndar de la media correspondiente al nmero de colonias

por triplicado.

3.11. Evaluacin de los efectos antimutagnicos del EAB y del cido clorognico

3.11.1. Antimutagenicidad del EAB

La evaluacin de la posible antimutagenicidad del EAB se realiz mediante el Ensayo

de Ames (Maron y Ames, 1983). Se utilizaron dos mtodos: el de incorporacin en

placa y el de preincubacin.

Mtodo de incorporacin en placa

La evaluacin de la posible capacidad antimutagnica del EAB se realiz empleando

los mutgenos indicados en la Tabla 10 a las concentraciones y en las condiciones

indicadas en dicha Tabla.

Para el ensayo de incorporacin en placa se sigui el siguiente protocolo: 0,1 ml de

un cultivo (overnight) de S. typhimurium TA98 y TA100, se co-incubaron con las

diferentes concentraciones de los mutgenos diagnstico descriptos en la Tabla 10

y con 5,0 y 50,0 l de EAB para alcanzar una concentracin de 1,0 y 10,0 mg/placa.

Seguidamente se incorporaron 0,5 ml de mezcla S9 buffer fosfato pH=7,4 (con y

sin activacin activacin metablica). La mezcla se agreg a 2,5 ml agar blando

fundido (45C) conteniendo L-histidina HCL- D-biotina (0,5 mM 0,5 mM). La

mezcla se homogeniz mediante vortex y se sembr en placas con medio mnimo,

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 91

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

incubndose a 37C durante 48h. Luego se procedi al conteo de las colonias

revertantes his+.

Para cada condicin se incorporaron los controles negativos (Revertantes

espontneas y revertantes espontneas con el agregado de EAB (Control negativo

de la muestra).

Los controles positivos consistieron en las curvas de dosis -respuesta de los

mutgenos descriptos en la Tabla 10 los que corresponden al 100% de

mutagenicidad de cada concentracin.

Mtodo de pre-incubacin

Para realizar el ensayo con el mtodo de pre-incubacin se prepar una mezcla con

0,1 ml de un cultivo de la noche (overnight) (TA98 TA100) co-incubado con las

diferentes concentraciones de los mutgenos diagnstico descriptos (Tabla 10) y

con 0,5 ml de mezcla S9 o buffer fosfato pH 7.4 (con y sin activacin metablica).

Seguidamente se agregaron 5,0 50,0 l de EAB para arribar a una concentracin

final de 1,0 y 10,0 mg/placa respectivamente. El volumen final se ajust en 700 l

con agua estril o DMSO y se mezcl mediante vortex. Despus de incubar en

estufa a 37C durante.1 h (sin agitacin), el total de la mezcla de incubacin (Vf=700

l) se agreg a un tubo con 2,50 ml de agar blando, conteniendo L-histidina HCl- D-

biotina (0,5 mM 0,5 mM), y se sembr en placas conteniendo medio mnimo

(Maron y Ames, 1983). Los controles positivos y negativos fueron los descriptos en

el mtodo de incorporacin en placa. En paralelo se realizaron las curvas de dosis-

respuesta con los mutgenos en el rango de concentracin presentado en la Tabla

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 92

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

10 y las cepas correspondientes a los efectos de determinar el nmero de

revertantes por placa, como referencia del 100% de actividad mutagnica. Los

ensayos se realizaron por duplicado y los datos fueron expresados como el valor

medio desviacin estndar de la media correspondiente al nmero de colonias

por triplicado de las placas. Un esquema general del procedimiento se presenta en

la Fig. 8.

3.11.2. Antimutagenicidad del cido clorognico

La evaluacin de la antimutagenicidad del acido clorognico se realiz empleando

solamente el mtodo de pre-incubacin. Se seleccion este mtodo, debido a su

mayor sensibilidad informada en estudios previos de antimutagenicidad

encontrados en bibliografa internacional (Matsushima y col., 1980). A su vez se

eligi la mayor concentracin de los mutgenos ensayados, a efectos de comparar

la actividad antimutagnica del cido clorognico con el equivalente del cido

clorognico presente en el EAB (10,0 mg/placa). Se seleccionaron dos

concentraciones: una concentracin de cido clorognico (0,10 mg/placa), valor

determinado por el mtodo de HPLC (acpite 4.1.1) y otra concentracin cinco

veces mayor (0,50 mg/placa).

Para su desarrollo se prepar una solucin acuosa de 2 mg/ml de cido clorognico

y se sembraron 50 l/placa para arribar a una concentracin final de 0,10 mg/placa

y una solucin acuosa de 10 mg/ml de cido clorognico para arribar a una

concentracin final de 0,50 mg/placa. Se sigui la metodologa descripta en el punto

3.11.1 (Mtodo de pre-incubacin) reemplazando el EAB por el cido clorognico.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 93

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Se utilizaron los mutgenos 2-nitrofluoreno, 2-aminofluoreno y azida sdica en una

nica concentracin de 2,5 g/placa.

Los ensayos se realizaron por duplicado y los datos fueron expresados como el valor

medio desviacin estndar de la media correspondiente al nmero de colonias

por triplicado.

Sembrar con gar blando (45C) his/biot. 0.05 mM

Sin S9 mezcla

Pre-incubacin
0.5 ml buffer
mutgeno 1h 37 C
0.1 ml Bacteria

0.5 ml buffer
muestra + mutgeno
0.1 ml bacteria Pre-incubacin

1h 37 C

Con S9 mezcla

0.5 mlS9 mezcla

mutgeno Pre-incubacin
0.1 ml bacteria
1h 37 C

0.5 ml buffer
muestra+ mutgeno
0.1 ml bacteria Pre-incubacin

1h 37 C

Fig. 7. Diseo experimental general del mtodo de pre-incubacin

3.12. Clculo de la capacidad antimutagnica: Indice de inhibicin

La inhibicin de la actividad mutagnica inducida por los mutgenos diagnsticos en

presencia de EAB y cido clorgnico fue calculada mediante la ecuacin 4, frmula

propuesta por Pedreschi y Cisneros-Zevallos (2006) y Cario-Corts y col. (2007).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 94

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

ecuacin (4)
(muestra mutgeno) muestra
%Inhibicin 100 x[1 ( )]
mutgeno control negativo
Dnde:
Muestra + mutgeno: corresponde a las revertantes/placa hallados en los

experimentos realizados con EAB o cido clorognico en presencia de mutgeno.

Muestra: corresponde a las revertantes/placa hallados en los experimentos

realizados empleando EAB o cido clorognico sin mutgeno.

Mutgeno: corresponde a las revertantes/placa con mutgeno slo.

Control negativo: corresponde a los revertantes espontaneas.

La mutagenicidad inducida por cada mutgeno diagnstico en ausencia de las

muestras fue definida como 100%.

El error del porcentaje de inhibicin (%I) de la antimutagnesis se realiz aplicando

el anlisis de la propagacin del error segn lo propuesto por Himmelblau (1970).

3.13. Anlisis estadstico

El anlisis estadstico fue realizado mediante anlisis de varianza ANOVA, y ensayo

de "t" de Student (utilizando el programa estadstico SYSTAT 12.0), considerando

como resultado positivo al doble del nmero de revertantes/placa en relacin a las

placas control. El nivel de significancia seleccionado fue de p0,05 y p0,01.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 95

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4. RESULTADOS

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 96

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

4.1. Caracterizacin qumica, txica y mutagnica del EAB

4.1.1. Determinacin de polifenoles en el EAB por cromatografa lquida de fase

inversa RP-HPLC

Para la identificacin de los polifenoles presentes en el EAB se utilizaron como

estndares cido clorognico, rutina, kaempferol, cido cafeico y quercetina. De

acuerdo a las curvas de calibracin realizadas, el lmite de deteccin del mtodo

empleado para el acido clorognico, rutina, kaempferol, cido cafeico y quercetina

fue de 0,0024, 0,0019, 0,0026, 0,0035 y 0,0047 mg/ml, respectivamente.

En la Fig. 9 se puede observar el cromatograma obtenido del anlisis del EAB. De

acuerdo con el tiempo de retencin y el correspondiente espectro UV-vis de los

picos observados comparado con los estndares utilizados slo fue posible

identificar uno de los picos que muestra correspondencia con el pico caracterstico

del cido clorognico. Ninguno de los otros picos observados coincidi con los

tiempos de retencin o el espectro de los estndares puros utilizados. Los picos no

identificados, podran corresponder a compuestos derivados del cido clorognico

segn fuera publicado oportunamente (Palacios y col., 1999).

Con el objeto de cuantificar al cido clorognico identificado en el EAB se realiz la

curva de calibracin de este compuesto, cuantificacin que se presenta en la Tabla

11. A partir de la curva de calibracin del cido clorognico, se calcul el valor de

cido clorognico por ml de EAB, la que result ser de 2,050,11 mg/ml de EAB.

Teniendo en cuenta la concentracin inicial usada (2 mg/ml), este valor indicara

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 97

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

que el contenido de cido clorognico sera 1mg por cada 100 mg de material seco

(1%).

Como se observa en la Fig. 9, hay diversos picos que no han sido identificados.

Teniendo en cuenta el rea de stos picos, el cido clorognico aportara el 25% de

la absorbancia total analizada.

3000

2500
cido clorognico

2000
mUA

1500

1000

500

0
0 10 20 30 40 50
t (min)

Fig.8. Cromatograma del EAB. La corrida fue realizada a 330 nm (lneas negras) y 360 nm

(lneas rojas)

De acuerdo a los resultados de la curva de calibracin se estim un lmite de

deteccin (LOD) para este compuesto de 0,024 mg/ml y un lmite de cuantificacin

(LOQ) de 0,073 mg/ml.

Otro punto importante a considerar en la caracterizacin del EAB fue evaluar su

actividad antioxidante y considerando que el cido clorognico constituye el

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 98

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principal polifenol presente en el EAB, tambin se realizaron estudios tendientes a

evaluar la actividad antioxidante del compuesto.

Tabla 11. Ecuacin de regresin obtenida para el cido clorognico

Compuesto Ecuacin de regresin R2 DS N

cido clorognico y =(386471173)x-(194149) 0,995 231 11

R2: coeficiente de determinacin, DS Desviacin estndar, N: nmero de muestras utilizadas

en la regresin

4.1.2. Evaluacin de la actividad antioxidante del EAB y del cido clorognico

Se evalu la actividad antioxidante del EAB y del cido clorognico mediante la

cuantificacin de la inhibicin del radical DPPH* (radical 2,2-difenil -1-picril

hidracilo).

El mtodo DPPH* evala la capacidad antioxidante de cualquier compuesto capaz

de atrapar radicales libres.

En las Figuras 10 y 11 se muestran los porcentajes de inhibicin (I%) de captacin de

radicales libres del DPPH*, en funcin de la concentracin de EAB y de cido

clorognico, respectivamente.

La ecuacin de regresin correspondiente al %I del radical libre DPPH* para el EAB

fue y= 0,507x -1,6146 con coeficiente de determinacin R2= 0,9906, donde x es la

concentracin del EAB en g/ml. Puede observarse que en el rango de

concentracin estudiada (50- 150 g/ml) el %I se encuentra entre 24,5% y 76,1%

(Fig. 10).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 99

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

La ecuacin de regresin correspondiente al %I del radical libre DPPH*para el cido

clorognico fue y= 220,1x-9,3555 con un coeficiente de determinacin R2 = 0,9363,

donde x es la concentracin del cido clorognico expresada en g/ml.

A partir de estas rectas de regresin, entrando con %I de 50%, se puede estimar el

valor de CE50.

Una manera de informar el poder antioxidante en los extractos naturales es a travs

de la concentracin eficiente (CE50). Sin embargo, sta no ha sido an

estandarizada, utilizndose frecuentemente la actividad antioxidante de

compuestos puros como valor de referencia.

En nuestro ensayo, la determinacin de la capacidad antioxidante tom como

patrn de referencia al cido clorognico. Este estudio mostr un valor de CE 50 de

101,86 g/ml y de 0,269 g/ml para el EAB y para el cido clorognico,

respectivamente.

El valor de la CE50 del cido clorognico frente al DPPH* resulto ser menor que la

obtenida para el EAB lo que indica que se requiere una concentracin menor de

cido clorognico para lograr el 50% de la eficiencia inhibitoria.

Estos resultados indican claramente que el EAB presenta una marcada actividad

antioxidante respaldada por otros estudios informados en la bibliografa

internacional, empleando sta y otras variedades del gnero Baccharis, aspecto,

relevante para su caracterizacin desde el punto de vista de su actividad biolgica.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 100

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

100
Porcentaje de inhibicin

50

0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Concentracin del EAB (g/ml)
F

Fig. 9. Porcentajes de inhibicin del radical libre DPPH* en funcin de la concentracin del

EAB.

100
Porcentaje de inhibicin

50

0
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35
Concentracin de cido clorognico (g/ml )

Fig. 10. Porcentaje de inhibicin del radical libre DPPH* en funcin de la concentracin de

cido clorognico

Sin embargo, otros aspectos deben ser igualmente evaluados para profundizar su

caracterizacin. Entre stos, la toxicidad y la mutagenicidad del EAB y del cido

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 101
Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

clorognico (polifenol mayoritario del EAB) utilizando el Ensayo de Ames como

modelo experimental, resultan ser relevantes en este sentido y cuyos resultados se

presentan en los acpites siguientes.

4.1.3. Evaluacin de la toxicidad del EAB y del cido clorognico utilizando el

Ensayo de Ames

La viabilidad de las cepas de S. typhimurium en presencia del EAB, as como en

presencia del cido clorognico resultan imprescindibles de ser evaluadas y

determinadas en una etapa previa a la evaluacin de la mutagenicidad y la

antimutagenicidad de los mismos empleando el Ensayo de Ames. Este estudio

previo tiene como finalidad seleccionar el rango de concentraciones del EAB y del

cido clorognico que no presenten un efecto txico sobre las cepas blanco. Se

debe tener en cuenta que si el compuesto en estudio es levemente mutagnico,

pero altamente txico, debe encontrarse un rango de concentraciones en la cual la

potencial mutagenicidad no quede enmascarado por la toxicidad de los compuestos

en estudio (Maron y Ames, 1983). Del mismo modo, resulta importante evaluar la

toxicidad de los mismos sobre las cepas de S typhimurium debido a que la toxicidad

podra confundirse o enmascarar un posible efecto antimutagnico ejercido por el

EAB o el cido clorognico, o ambos, en los ensayos de antimutagenicidad.

En la Tabla 12 se presentan los recuentos de colonias viables de S. typhimurium

luego del tratamiento con el EAB utilizando el Ensayo de Ames como modelo

experimental, con los mtodos de incorporacin en placa y pre-incubacin. Para el

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 102

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

cido clorognico, especficamente, se ensay el efecto txico empleando

solamente el mtodo de pre-incubacin (Tabla 13).

Los resultados obtenidos (Tabla 12) indican que no se observaron diferencias

significativas en la viabilidad de las cepas TA98 y TA100 luego del tratamiento con

el EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) en relacin a los respectivos controles (p>0,05).

Tampoco se observaron diferencias significativas en la viabilidad

independientemente del mtodo ensayado (incorporacin en placa o pre-

incubacin).

El anlisis de la viabilidad despus del tratamiento con acido clorognico en el

rango de concentraciones estudiadas (0,05 y 0,50 mg/placa) sobre las cepas TA98 y

TA100 no mostr diferencias significativas respecto a los controles (p>0,05) (Tabla

13).

Los resultados encontrados demuestran que tanto el EAB como el cido clorognico

en el rango de concentraciones seleccionadas no resultaron ser txicos para las

cepas de S. typhymurium TA98 y TA100.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 103

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Tabla 12. Ensayo de toxicidad del EAB para las cepas TA100 y TA98 utilizando los

mtodos de incorporacin en placa y pre-incubacin

Mtodo de Incorporacin en placa

Recuentos de colonias de S. typhymurium (UFC/ml x 106)
EAB (mg/placa) Cepa TA98 Cepa TA100
0,0 284 38015
1,0 303 3938
10,0 295 3825
Mtodo de Pre-incubacin
Recuentos de colonias de S. typhymurium (UFC/ml x 106)
0,0 325 39810
1,0 278 37710
10,0 335 40915
Los resultados son la media DS, n= 6

Tabla 13. Ensayo de toxicidad del cido clorognico para las cepas TA100 y TA98

utilizando el mtodo de pre-incubacin

Mtodo de Pre-incubacin
Recuentos de colonias S. typhymurium (UFC/ml x 106)
cido clorognico TA98 TA100
mg/placa
0,00 376 4039
0,05 428 38712
0,50 384 39914
Los resutados son la media DS, n= 6 resultados

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 104

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

4.1.4. Evaluacin del efecto mutagnico del EAB y del cido clorognico mediante

el Ensayo de Ames

El siguiente paso fue determinar el posible efecto mutagnico del EAB y del cido

clorognico. Para estos ensayos se utiliz un rango de concentracin final de 1,0 y

10,0 mg/placa para el EAB y de 0,05 y 0,50 mg/placa para el cido clorognico.

Los controles positivos empleados corresponden a los presentados en la Tabla 10

(Acpite 3.10.de Materiales y Mtodos). Las Tablas 14 y 15 presentan los resultados

encontrados en los ensayos de mutagenicidad, para el EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) y

el cido clorognico (0,05 y 0,50 mg/placa), respectivamente.

Los controles negativos (revertantes espontneas his+) respondieron a los rangos

establecidos para el Ensayo de Ames (Tabla 5, acpite 1.12. de Materiales y

Mtodos). Debe considerarse que cada laboratorio, presenta un rango propio de

reversin de las colonias, el que es aceptado siempre y cuando sea repetible para

cada ensayo realizado independientemente del xenobitico empleado.

Los controles positivos se comportaron en todos los casos de acuerdo a lo esperado

a los datos bibliogrficos (Maron y Ames, 1983).

Los resultados obtenidos no indicaron diferencias estadsticamente significativas

entre el nmero de las revertantes espontneas his+ (control negativo) de S.

typhimurium y las obtenidas al incubar con 1,0 y 10,0 mg/placa del EAB para cada

cepa estudiada con y sin activacin metablica (p>0,05) (Tabla 14). Tambin pudo

observarse que no hubo diferencias estadsticamente significativas en el nmero de

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 105

 Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

revertantes/placas dependientes de los mtodos empleados (incorporacin en

placa o pre-incubacin) (p>0,05).

En forma similar, para cada cepa estudiada, no se encontraron diferencias

estadsticamente significativas entre las revertantes espontneas his+ (control

negativo) de S. typhimurium y las revertantes obtenidas al incubar con el cido

clorognico con y sin activacin metablica (0,05 y 0,50 mg/placa) (p>0,05) (Tabla

15).

Tambin se puedo observar que no se encontraron diferencias estadsticamente

significativas segn el mtodo (incorporacin en placa o pre-incubacin) (p>0,05).

Tabla 14. Evaluacin de la mutagenicidad inducida por el EAB, utilizando el Ensayo

de Ames, con las cepas TA98 y TA100 en los ensayos de incorporacin en placa y

pre-incubacin.

Incorporacin en placa Pre-incubacin

EAB Cepa TA98 CepaTA100 Cepa TA98 Cepa TA100
Concentracin -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9

a
0,0 mg/placa 215 375 18315 21658 242 468 21922 17912
1,0 mg/placa 149 384 18521 14415 318 303 180,322 13629
10,0 mg/placa 194 326 18512 17518 282 303 20811 15131

2AF 2,5 g/placa 233416* 219025* 22855* 180817*

2NF 2,5 g/placa 865104* 6245*
AZS 2,5 g/placa 2516364* 216833*
+S9, con activacin metablica; -S9, sin activacin metablica; a, revertantes espontneos;
Incorporacin en placa Pre-incub
EAB p<0,05.
*, revertantes inducidas (mutgenos) Cepa TA98 CepaTA100 Cepa TA98
Concentracin -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9

a
0,0 mg/placa 215 375 18315 21658 242 468
1,0 mg/placa 149 384 18521 14415 318 303
Los resultados 10,0 mg/placa
encontrados nos 194
permiten 326
concluir que18512
en los17518
rangos 282
de 303

2AF 2,5 g/placa 233416* 219025* 228515*

concentraciones estudiados, tanto el EAB865104
2NF 2,5 g/placa
como* el cido clorognico, no resultaron
62425*
*
AZS 2,5 g/placa 2516364
ser mutagnicos empleando el Ensayo de Ames.
Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 106
Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Ello nos permiti continuar evaluando la posible capacidad antimutagnica del EAB

y del cido clorognico frente a la mutagenicidad inducida por agentes de accin

mutagnica reconocida.

Tabla 15. Evaluacin de la mutagenicidad inducida por el cido clorognico

utilizando el Ensayo de Ames con las cepas TA98 y TA100 en ensayos de

incorporacin en placa y pre-incubacin

Incorporacin en placa Pre-incubacin

cido clorognico Cepa TA98 CepaTA100 Cepa TA98 Cepa TA100
-S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9

0,0 mg/placaa 496 203 12715 11821 379 194 10411 10311
0,05 mg/placa 476 173 13726 10510 405 195 1063 10410
0,50 mg/placa 396 244 13414 1153 292 26,64 1086 1189

2AF 2,5 g/placa 278894* 21905* 204650* 2329440*

2NF 2,5 g/placa 865104* 6245*
AZS 2,5 g/placa 2516364* 21683*
a
+S9, con activacin metablica; -S9, sin activacin metablica; , revertantes

espontneas;*,revertantes inducidas (mutgenos) p<0,05. Incorporacin en placa

cido clorognico Cepa TA98 CepaTA100 Ce
-S9 +S9 -S9 +S9 -S9

0,0 mg/placa a 496 203 12715 11821 379

0,05 mg/placa 476 173 13726 10510 405
4.2. Evaluacin del efecto antimutagnico del EAB empleando
0,50 mg/placa 396
el Ensayo
244
de Ames
13414 1153 292

* *
2AF 2,5 del
La evaluacin de la capacidad antimutagenica g/placa 278894
EAB se realiz empleando el 21905
*
2NF 2,5 g/placa 865104 6245*
AZS 2,5 g/placa 2516364 *
Ensayo de Ames. Se utilizaron los mtodos de incorporacin en placa y pre-

incubacin con las cepas testigo S. typhimurium TA98 y TA100. Los mutgenos

diagnsticos seleccionados fueron el 2-NF y la AZS (mutgenos de accin directa, sin

empleo de activacin metablica) para las cepas TA98 y TA100, respectivamente, y

el 2-AF (pro-mutgeno, con requerimiento de activacin metablica) para ambas

cepas.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 107

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

4.2.1. Ensayo sin activacin metablica

Cepa TA98. Mutgeno 2-NF. Mtodo de incorporacin en placa

En la Fig. 12 se presentan los resultados obtenidos de las revertantes/placa de la

cepa testigo TA98 inducidas por el mutgeno de accin directa 2-NF (rango de

concentraciones 0,25-2,50 g/placa). En la figura se incluyen las curvas dosis-

respuesta correspondientes a los revertantes/placa de S. typhimurium cepa TA98,

inducidas por el mutgeno 2-NF en presencia de EAB (1,0 y 10,0 mg/placa)

empleando el mtodo directo de incorporacin en placa.

En la Tabla 16 se presenta el nmero de revertantes/placa (cepa TA98) inducidas

por el mutgeno 2-NF en el rango de concentraciones 0,25-2,50 g/placa y el

nmero de revertantes/placa obtenidas co-incubando el 2-NF con el extracto de

EAB (1,0 y 10,0 mg/placa), utilizando el mtodo de incorporacin en placa. En la

Tabla se incluyen los %I obtenidos por el EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) al co-incubar con

el mutgeno 2-NF. El valor del %I se calcul empleando la ecuacin 4 presentada en

la seccin Materiales y Mtodos (acpite 3.12).

En la curva dosis-respuesta correspondiente al 2-NF (control diagnstico) (Fig. 12)

el nmero de revertante/placa aumenta en forma significativa a medida que se

incrementa la concentracin del mutgeno (p<0,05). La co-incubacin del mutgeno

2-NF en niveles de concentracin de 0,25-2,50 g/placa con 1,0 y 10,0 mg/placa de

EAB produce un menor nmero de revertantes/placa que presentan diferencias

significativas en comparacin con el mutgeno diagnstico (p<0,05).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 108

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

1000

800
Revertantes / Placa

600

400

200

0
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50

Dosis (g/placa)

Fig. 11. Efecto antimutagnico del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el 2-NF

utilizando S. typhimurium cepa TA98 (mtodo de incorporacin en placa). ,

Revertantes/placa inducidas por 2-NF; , revertantes/placa inducidas por 2-NF en

presencia de 1,0 mg/placa de EAB; , revertantes /placa inducidas por 2-NF en presencia

de 10,0 mg/placa de EAB.

En la Tabla 16 puede observarse que con el empleo de 1,0 mg/placa de EAB los %I

variaron desde 20,00,8 al 46,04,4% a medida que aumenta las concentraciones

del mutgeno en el rango ensayado. Con la mayor concentracin del EAB estudiada

(10,0 mg/placa) los %I estuvieron en el rango de 28,00,7 a 56,54,0% para las de

concentraciones del mutgeno ensayado.

En esta condicin (mtodo de incorporacin en placa) se pudo observar el efecto

antimutagnico del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el mutgeno de

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 109

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

accin directa 2-NF en la cepa TA98, el cual se acentu cuando la concentracin de

EAB fue 10,0 mg/placa.

Tabla 16. Nmero de revertantes/placa de la cepa TA98 inducidas por 2-NF y

revertantes/placa inducidas por 2-NF co-incubado con el EAB. %I de la

mutagenicidad inducida por 2-NF en presencia de 1,0 y 10,0 mg/placa de EAB

(mtodo de incorporacin en placa).

g/placa Rev. / placa Rev. / placa %I EAB Rev./ placa %I EAB

2-NF 2-NF 2-NF + EAB 2-NF+ EAB
1,0mg/placa 1,0mg/placa 10,0mg/placa 10,0mg/placa
0,00 2420a 3120 282

0,25 20710* 17212* 20,00,8 15510* 28,00,7

0,50 28016* 22510* 23,02,6 20010* 24,02,4

1,25 50730* 32010* 41,00,4 30413* 43,00,4

2,50 88548* 49530* 46,04,4 40830* 56,54,0

%I, Porcentajes de inhibicin del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el 2- NF;
a
, revertantes espontneos. *, p<0,05

Cepa TA98. Mutgeno 2- NF. Mtodo de pre-incubacin

En la Fig. 13 se presentan los resultados obtenidos de las revertantes/placa de la

cepa testigo TA98 inducidas por el mutgeno de accin directa 2-NF (rango de

concentraciones 0,25-2,50 g/placa). En la figura se incluyen las curvas

correspondientes a los revertantes/placa de la cepa TA98 inducidas por el

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 110

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

mutgeno 2-NF incubadas con EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) empleando el mtodo de

pre-incubacin.

1000

800
Revertantes / Placa

600

400

200

0
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50

Dosis (g/placa)

Fig. 12. Efecto antimutagnico del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el 2-NF

utilizando S. typhimurium cepa TA98 (mtodo de pre-incubacin). , revertantes/placa

inducidas por 2-NF; , revertantes/placa inducidas por 2-NF en presencia de 1,0 mg/placa

del EAB; , revertantes/placa inducidas por 2-NF en presencia de 10,0 mg/placa del EAB.

En la Tabla 17 se presenta el nmero de revertantes/placa de la cepa TA98

inducidas por el mutgeno 2-NF en el rango de concentraciones testadas (0,25-2,50

g/placa) y el nmero de revertantes/placa obtenidas al co-incubar el 2NF con el

extracto de EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) utilizando el mtodo de preincubacin. En la

Tabla se incluyen los %I de la mutagnesis inducida por el mutgeno 2-NF cuando se

co-incuba con 1,0 y 10,0 mg/placa de EAB.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 111

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

De igual manera que en el ensayo de incorporacin en placa, la curva dosis-

respuesta del 2-NF presenta un nmero de revertante/placa que aumenta en forma

estadsticamente significativa a medida que se incrementa la concentracin de

mutgeno.

La co-incubacin del mutgeno 2-NF en las concentraciones mayores a 0,25

g/placa con 1,0 y 10,0 mg/placa del EAB inducen un menor nmero de

revertantes/placa que presentan diferencias estadsticamente significativas con el

mutgeno diagnstico (p<0,05).

En esta condicin (mtodo de pre-incubacin) se puede observar el efecto

antimutagnico del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el mutgeno de

accin directa 2-NF en la cepa TA98, el cual se acenta cuando la concentracin de

EAB es 10,0 mg/placa.

Asimismo, se obtuvieron diferencias estadsticamente significativas en los valores

de las revertantes/placa hallados, dependiendo del tratamiento con EAB (1,0 o 10,0

mg/placa) (p<0,05).

En la Tabla 17 se observa que con el empleo de 1,0 mg/placa de EAB de %I variaron

entre 60,01,4 y 71,00,3%, en el rango de concentraciones del mutgeno

ensayado.

Con la mayor concentracin de EAB estudiada (10,0 mg/placa), los %I variaron entre

59,01,1 y 91,00,4%, en el rango de concentraciones del mutgeno ensayado.

Tabla 17. Nmero de revertantes/placa de la cepa TA98 inducidas por 2-NF y

revertantes/placa inducidos por 2-NF co-incubados con el EAB. %I de la

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 112

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

mutagenicidad inducida por 2-NF en presencia de 1,0 y 10,0 mg/placa de EAB

(mtodo de pre-incubacin).

g/placa Rev. / placa Rev. / placa %I EAB Rev. / placa %I EAB

2-NF 2-NF 2-NF + EAB 2-NF+ EAB
1,0mg/placa 1,0mg/placa 10,0 mg/placa 10,0mg/placa
a
0,00 4320 1450 191

0,25 12713* 4250* 67,00,9 415* 74,00,8

0,50 18450* 10013* 60,01,4 773* 59,01,1

1,25 57010* 16726* 71,00,3 6719* 91,00,4

2,50 865104* 30912* 64,00,5 17526* 81,00,7

%I: Porcentajes de inhibicin del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el 2- NF

a
revertantes espontneos. *, p<0,05

Los valores de los %I muestran un efecto antimutgenico en ambas concentraciones

ensayadas del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el 2-NF pudindose

observar que el efecto inhibidor de la mutagnesis es mayor cuando la

concentracin de extracto EAB es de 10,0 mg/placa.

Comparando los resultados de los %I en ambos mtodos (ensayo de incorporacin

en placa y pre-incubacin) con la cepa testigo TA98 frente a la mutagenicidad

inducida por el mutgeno de accin directa 2-NF, la mayor inhibicin ejercida por el

EAB se obtiene empleando el mtodo de pre-incubacin (Figs. 12-13; Tablas 17-18).

Cepa TA100. Mutgeno AZS. Mtodo de incorporacin en placa

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 113

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

En la Fig. 14 se presentan los resultados obtenidos de las revertantes/placa de la

cepa TA100 inducidas por el mutgeno de accin directa AZS (rango de

concentraciones de 0,50-5,00 g/placa).

En la figura se incluyen las curvas de dosis-respuesta correspondientes a las

revertantes/placa de S. typhimurium cepa TA100 inducidas por el mutgeno AZS en

presencia de EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) empleando el mtodo directo de

incorporacin en placa.

En la Tabla 18 se presenta el nmero de colonias revertantes/placa de la cepa

TA100 inducidas por el mutgeno AZS en el rango de concentraciones ensayadas

0,50-5,00 g/placa y el nmero de revertantes inducidas por AZS co-incubado con el

EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) utilizando el mtodo de incorporacin en placa.

Puede observarse en la curva dosis-respuesta correspondiente a la AZS que el

nmero de revertantes/placa aumenta en forma significativa a medida que se

incrementa la concentracin del mutgeno.

La co-incubacin del mutgeno AZS en niveles de concentracin de 0,50 - 5,00

g/placa con 1,0 y 10,0 mg/placa inducen un menor nmero de revertantes/placa

que presentan diferencias estadsticamente significativas en comparacin con el

mutgeno diagnstico (p<0,05).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 114

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

4000

3000
Revertantes / Placa

2000

1000

0
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00

Dosis (g/placa)

Fig. 13. Efecto antimutagnico del EAB frente a la mutagenicidad inducida por AZS-

utilizando S. typhimurium cepa TA100 (mtodo de incorporacin en placa). ,

revertantes/placa inducidas por AZS; , revertantes/placa inducidas por AZS en presencia

de 1,0 mg/placa del EAB; , revertantes/placa inducidas por AZS en presencia de 10,0

mg/placa del EAB.

En la Tabla 18 se presentan los %I de la mutagnesis inducida por AZS cuando es co-

incubada con 1,0 y 10,0 mg/placa de EAB. Puede observarse que con el empleo de

1,0 mg/placa de EAB los %I estuvieron entre 5,01,9 y 7,43,1%, en el rango de

concentraciones del mutgeno ensayado.

Con 10,0 mg/placa de EAB los %I fueron de 10,71,71 a 26,02,1% en el rango de

concentraciones del mutgeno ensayado.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 115

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Tabla 18. Nmero de revertantes/placa de la cepa TA100 inducidas por AZS o por

AZS co-incubados con el EAB. %I de la mutagenicidad inducida por la AZS en

presencia de 1,0 y 10,0 mg/placa de EAB (mtodo de incorporacin en placa).

g/placa Rev. /placa Rev. /placa %I EAB Rev. /placa %I EAB

AZS AZS AZS+ EAB AZS+ EAB
1,0mg/placa 1,0mg/placa 10,0mg/placa 10mg/placa
0,00 1831a 1852 1852

0,50 164648* 154012* 7,43,1 149617* 10,05,1

2,50 251636* 240524* 5,01,9 224022* 10,71,7

5,00 303222* 290024* 5,02,4 228233* 26,02,1

%I: Porcentajes de inhibicin del EAB frente a la mutagenicidad inducida por la AZS
a
revertantes espontneos. *, p<0,05

Cepa TA100. Mutgeno azida sdica. Mtodo de pre-incubacin

En la Fig. 15 se presentan los resultados obtenidos de las revertantes/placa de la

cepa TA100 inducidas por el mutgeno de accin directa AZS (rango de

concentraciones de 0,50-5,00 g/placa). En la figura se incluyen las curvas de dosis-

respuesta correspondientes a las revertantes/placa de la cepa S. typhimurium

TA100, inducidas por el mutgeno AZS en presencia del EAB (1,0 y 10,0 mg/placa)

empleando el mtodo de pre-incubacin.

En la Tabla 19 se presenta el nmero de colonias revertantes/placa de la cepa

TA100 inducidas por el mutgeno AZS en el rango de concentraciones testadas 0,50

5,00 g/placa y las revertantes inducidas por AZS co-incubado con el EAB

(concentraciones ensayadas 1,0 y 10,0 mg/placa) utilizando el mtodo de pre-

incubacin.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 116

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

En la Tabla se incluyen los %I de la mutagnesis inducida por el mutgeno AZS

cuando se co-incub con 1,0 y 10,0 mg/placa de EAB.

Pudo observarse en la curva dosis-respuesta correspondiente a la AZS que el

nmero de revertantes/placa aumenta en forma significativa a medida que se

incrementa la concentracin del mutgeno. La co-incubacin del mutgeno AZS en

niveles de concentracin de 2,50 y 5,00 g/placa co-incubado con 1,0 y 10,0

mg/placa de EAB inducen un menor nmero de revertantes/placa que presentan

diferencias estadsticamente significativas a las obtenidas con el mutgeno

diagnstico (p<0,05).

Asimismo, puede observarse que los revertantes/placa obtenidos no presentan

diferencias estadsticamente significativas entre los tratamientos con EAB (1,0 y

10,0 mg/placa) (p>0,05).

En la Tabla 19 se presentan los %I de la mutagnesis inducida por el AZS co-

incubado con 1,0 y 10,0 mg/placa de EAB. Pudo observarse que para 0,50 g/placa

de AZS los valores de %I fueron de 5,0 y 11,0% (1,0 y 10,0 mg/placa

respectivamente). Para las concentraciones de mutgeno 2,50 y 5,00 g/placa, la

actividad antimutagnica del EAB vari entre 26,02,1 y 41,02,0% para las dos

concentraciones de EAB ensayadas (1,0 y 10,0 mg/placa).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 117

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

4000

3000
Revertantes / Placa

2000

1000

0
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00

Dosis (g/placa)

Fig. 14. Efecto antimutagnico del EAB frente a la mutagenicidad inducida por AZS

utilizando S. typhimurium cepa TA100 (mtodo de pre-incubacin). , revertantes/placa

inducidas por AZS; , revertantes/placa inducidas por AZS en presencia de 1,0 mg/placa

del EAB; , revertantes/placa inducidas por AZS en presencia de 10,0 mg/placa del EAB.

Comparando los resultados de los %I en ambos mtodos (ensayo de incorporacin

en placa y pre-incubacin) con la cepa testigo TA100 frente a la mutagenicidad

ejercida por el mutgeno de accin directa AZS, se logr una mayor inhibicin

empleando el mtodo de pre-incubacin (Tabla 18 y Tabla 19).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 118

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Tabla 19. Nmero de revertantes/placa de la cepa TA100 inducidas por AZS y

revertantes/placa inducidas por AZS co-incubadas con el.EAB %I de la

mutagenicidad inducida por la AZS en presencia de 1,0 y 10,0 mg/placa de EAB

(mtodo de pre-incubacin).

g/placa Rev. / placa Rev. / placa %I EAB Rev. / placa %I EAB

AZS AZS AZS+ EAB AZS+ EAB
1,0mg/placa 1,0mg/placa 10,0mg/placa 10,0mg/placa
a
0,00 21921 23212 22811

0,50 143155 * 136013* 5,04,2 1303130* 11,04,1

2,50 214038* 164328* 282,1 167697* 26,02,1

5,00 286749* 18328* 402,0 178040* 41,02,0

%I: Porcentajes de inhibicin del EAB frente a la mutagenicidad inducida por AZS
a
revertantes espontneas. *, p<0,05.

4.2.2. Ensayo con activacin metablica

Cepa TA98. Mutgeno 2- AF. Mtodo de incorporacin en placa

En la Fig. 16 se presentan los resultados obtenidos de las revertantes/placa de la

cepa TA98 inducidas por el pro-mutgeno 2-AF (rango de concentraciones 0,25-2,50

g/placa) con el agregado de activacin metablica (mezcla S9). En la misma se

incluyen las curvas correspondientes a las revertantes/placa de S. typhimurium cepa

TA98 inducidas por 2-AF en presencia del EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) y mezcla S9.

En la Tabla 20 se presenta el nmero de revertantes/placa de la cepa TA98

inducidas por el pro-mutgeno 2-AF en el rango de concentraciones ensayadas 0,25

2,50 g/placa y co-incubado con el extracto de EAB (concentraciones ensayadas

1,0 y 10,0 mg/placa), en presencia de la fraccin microsomal S9 y utilizando el

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 119

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

mtodo de incorporacin en placa. En la Tabla se incluyen los porcentajes de

inhibicin %I de la mutagnesis inducida por 2-AF en presencia de activacin

metablica cuando se co-incuba con 1,0 y 10,0 mg/placa de EAB.

Puede observarse en la curva dosis-respuesta correspondiente al pro mutgeno 2-

AF en presencia de activacin metablica que el nmero de revertantes/placa

aumenta en forma estadsticamente significativa a medida que se incrementa la

concentracin del mutgeno (p<0,05).

Fig. 15. Efecto antimutagnico del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el 2-AF con

activacin metablica utilizando S. typhimurium cepa TA98 (mtodo de incorporacin en

placa). , revertantes/placa inducidas por 2-AF; , revertantes/placa inducidas por 2-AF

en presencia de 1,0 mg/placa de EAB; , revertantes/placa inducidas por 2-AF en presencia

de 10,0 mg/placa de EAB.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 120

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

La co-incubacin del pro-mutgeno 2-AF en niveles de concentracin de 0,25-2,50

g/placa con 1,0 y 10,0 mg/placa inducen un menor nmero de revertantes/placa,

que presentan diferencias estadsticamente significativas (p<0,05) y altamente

significativas p<0,01, en comparacin con el mutgeno control (100% de

mutagenicidad) .

Tabla 20. Nmero de revertantes/placa de la cepa TA98 inducidas por 2-AF y

revertantes/placa inducidos por 2-AF y co-incubados con el EAB con el agregado de

activacin metablica. %I de la mutagenicidad inducida por 2AF en presencia de 1,0

y 10,0 mg/placa de EAB (mtodo de incorporacin en placa).

g/placa Rev. / placa Rev. / placa %I EAB Rev. / placa %I EAB

2-AF 2AF+S9 2AF+ EAB 2AF + EAB
1,0mg/placa 1,0mg/placa 10,0mg/placa 10,0mg/placa
0,00 372 a 383 326

0,25 95940* 6955* 28,12,9 32620** 68,01,9

0,50 158313* 116552* 28,00,7 3118** 82,00,4

1,25 176925* 116940* 40,01,2 3322** 73,00,6

2,50 2334126* 160057* 32,05,6 4893** 80,03,0

%I: Porcentajes de inhibicin del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el 2- AF

a
revertantes espontneos. *, p<0,05; **, p0,01.

Se pudo observar que con el empleo de 1,0 mg/placa de EAB, los valores de %I

varan desde 28,12,9 a 40,01,2% en el rango de concentraciones del mutgeno

ensayado.

Con la mayor concentracin del EAB estudiada (10,0 mg/placa) los %I fueron de

68,01,9 a 82,00,4% en el rango de concentraciones del mutgeno ensayadas.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 121

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Se pudo observar que el efecto antimutagnico del EAB frente a la mutagenicidad

inducida por el mutgeno de accin directa 2-AF, se acenta cuando la

concentracin del EAB es de 10,0 mg/placa.

Cepa TA98. Mutgeno 2- AF. Mtodo de pre-incubacin:

En la Fig. 17 se presentan los resultados obtenidos de las revertantes/placa de la

cepa TA98 inducidas por el pro-mutgeno 2-AF (rango de concentraciones 0,25-2,50

g/placa) con el agregado de activacin metablica (mezcla S9). En la figura se

incluyen las curvas correspondientes a las revertantes/placa de S. typhimurium cepa

TA98 inducidas por 2-AF en presencia de EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) y mezcla S9

empleando el mtodo de pre-incubacin.

En la Tabla 21 se presenta el nmero de revertantes/placa correspondientes a la

cepa TA98 inducidas por el pro-mutgeno 2-AF en el rango de concentraciones

ensayadas 0,25 2,50 g/placa y co-incubado con el extracto de EAB (1,0 y 10,0

mg/placa) en presencia de activacin metablica utilizando el mtodo de pre-

incubacin. En la Tabla se incluyen los %I de la mutagnesis inducida por 2-AF en

presencia de activacin metablica cuando se co-incuba con 1,0 y 10,0 mg/placa de

EAB. Pudo observarse en la curva dosis-respuesta correspondiente al pro mutgeno

2-AF en presencia de activacin metablica que el nmero de revertantes/placa

aumenta en forma estadsticamente significativa a medida que se incrementa la

concentracin del mutgeno.

La co-incubacin del pro-mutgeno 2AF en niveles de concentracin de 0,25 - 2,50

g/placa con 1,0 y 10,0 mg/placa inducen un menor nmero de revertantes/placa

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 122

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

que presentan diferencias estadsticamente significativas (p<0,05) y altamente

significativas (p<0,01), en comparacin con el mutgeno diagnstico (100% de

mutagenicidad).

Fig. 16. Efecto antimutagnico del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el 2-AF con

activacin metablica utilizando S. typhimurium cepa TA98 (mtodo de pre-incubacin). ,

revertantes/placa inducidas por 2-AF; , revertantes/placa inducidas por 2-AF en presencia

de 1,0 mg/placa de EAB; , revertantes/placa inducidas por 2-AF en presencia de 10,0

mg/placa de EAB.

En la Tabla 21 pudo observarse que la co-incubacin del mutgeno con 1,0

mg/placa de EAB arroj un %I de 28,00,5 a 41,05,8% en el rango de

concentraciones de mutgeno ensayado. Con la mayor concentracin del EAB

estudiada (10,0 mg/placa), los ndices de inhibicin fueron de 84,00,2 a 92,02,1%

en el rango de concentraciones del mutgeno ensayado.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 123

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Tabla 21. Nmero de revertantes/placa de la cepa TA98 inducidas por el 2-AF y

revertantes/placa inducidos por 2-AF co-incubados con el EAB y con el agregado de

activacin metablica y %I de la mutagenicidad inducida por 2-AF en presencia de

1,0 y 10,0 mg/placa de EAB (mtodo de pre-incubacin).

g/placa Rev. / placa Rev. / placa %I EAB Rev. / placa %I EAB

2-AF 2AF+S9 2AF+ EAB 2AF+ EAB
1,0mg/placa 1,0mg/placa 10,0mg/placa 10,0mg/placa
a
0,00 463 303 303

0,25 80882* 47813* 41,05,8 8813** 92,02,1

0,50 183620* 126792* 31,01,0 23520** 89,00,4

1,25 189010* 134570* 28,00,5 31013** 84,00,2

2,50 228545* 14148* 38,01,9 39628** 84,00,9

%I: Porcentajes de inhibicin del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el 2- AF

a
revertantes espontneas. *, p<0,05; **, p<0,01

En esta condicin (mtodo de pre-incubacin y con activacin metablica) se pudo

observar que el efecto antimutagnico ejercido por el EAB frente a la

mutagenicidad inducida por el mutgeno de accin indirecta 2-AF sobre la cepa

TA98 se acentu cuando la concentracin de EAB fue de 10,0 mg/placa.

Comparando los resultados de los %I en ambos mtodos (ensayo de incorporacin

en placa y pre-incubacin) con la cepa testigo TA98 frente a la mutagenicidad

ejercida por el pro- mutgeno 2-AF en presencia de activacin metablica, la mayor

inhibicin se logra empleando el mtodo de pre-incubacin, que es superior a el

mtodo de incorporacin en placa. (Tabla 20 y 21).

Cepa TA100. Mutgeno 2- AF. Mtodo de incorporacin en placa

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 124
Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

En la Fig. 18 se presentan los resultados obtenidos de las revertantes/placa de la

cepa TA100 inducidas por el pro-mutgeno 2-AF (rango de concentraciones 0,25-

2,50 g/placa) con el agregado de activacin metablica (mezcla S9).

En la figura se incluyen las curvas correspondientes a las revertantes/placa de S.

typhimurium cepa TA100 inducidas por 2-AF en presencia de EAB (1,0 y 10,0

mg/placa) y mezcla S9.

En la Tabla 22 se presenta el nmero de revertantes/placa de la cepa TA100

inducidas por el pro-mutgeno 2-AF en el rango de concentraciones ensayadas 0,25

2,5,0 g/placa y co-incubado con el extracto de EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) en

presencia de fraccin microsomal S9 utilizando el mtodo de incorporacin en

placa.

En la Tabla se incluyen los porcentajes de inhibicin %I de la mutagnesis inducida

por 2-AF en presencia de activacin metablica cuando se co-incuba con 1,0 y 10,0

mg/placa de EAB.

Pudo observarse en la curva dosis-respuesta correspondiente al pro mutgeno 2-AF,

en presencia de activacin metablica, que el nmero de revertantes/placa

aument en forma estadsticamente significativa a medida que se increment la

concentracin del mutgeno (p<0,05).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 125

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

2500

2000
Revertantes / Placa

1500

1000

500

0
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50

Dosis (g/placa)

Fig. 17. Efecto antimutagnico del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el 2-AF con

activacin metablica utilizando S. typhimurium cepa TA100 (mtodo de incorporacin en

placa). , revertantes/placa inducidas por 2-AF; , nmero de revertantes/placa inducidas

por 2-AF en presencia de 1,0 mg/ placa de EAB; , revertantes/placa inducidas por 2-AF en

presencia de 10,0 mg/placa de EAB.

La co-incubacin del pro-mutgeno 2-AF en niveles de concentracin de 0,25-2,50

con 1,0 y 10,0 mg/placa indujeron un menor nmero de revertantes/placa con

diferencias estadsticamente significativas en comparacin con el mutgeno slo

(p<0,05). Pudo observarse en la Tabla 22 que el tratamiento con 1,0 mg/placa de

EAB arroj %I que fueron desde 31,02,6 y 52,02,7% en el rango de

concentraciones del mutgeno ensayado.

Con la mayor concentracin del EAB estudiada (10,0 mg/placa), %I variaron entre

34,04,9 y 56,02,5%.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 126

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Tabla 22. Nmero de revertantes/placa de la cepa TA100 inducidas por 2-AF y

revertantes/placa inducidos por 2-AF co-incubados con el EAB y con el agregado de

actividad metablica. %I de la mutagenicidad inducida por el 2-AF en presencia de

1,0 y 10,0 mg/placa de EAB (mtodo de incorporacin en placa).

g/placa Rev. / placa Rev. / placa %I EAB Rev. / placa %I EAB

2-AF 2AF+S9 2AF+ EAB 2AF + EAB
1,0mg/placa 1,0mg/placa 10,0mg/placa) 10,0mg/placa
a
0.00 23658 1443 1753

0,25 66030* 4705* 37,05,8 5206* 34,04,9

0,50 13909* 7441* 52,02,7 7932* 50,02,7

1,25 158020* 8803* 41,02,7 8103* 56,02,5

2,50 21805* 176726* 31,02,6 12793* 46,02,3

%I: Porcentajes de inhibicin del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el 2-AF
a
revertantes espontneos. *, p<0,05

En esta condicin, (mtodo de incorporacin en placa con activacin metablica) se

pudo observar el efecto antimutagnico del EAB frente a la mutagenicidad inducida

por el mutgeno de accin directa 2-AF sobre la cepa TA100. Asimismo, no se

observan diferencias significativas en los %I de la mutagenicidad por 2-AF co

incubado con 1,0 o 10,0 mg/placa de EAB.

Cepa TA100. Mutgeno 2-AF. Mtodo de pre incubacin.

En la Fig. 19 se presentan los resultados obtenidos de las revertantes/placa de la

cepa TA100 inducidas por el pro-mutgeno 2-AF (rango de concentraciones 0,25-

2,50 g/placa) con el agregado de activacin metablica (mezcla S9). En la figura se

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 127

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

incluyen las curvas correspondientes a las revertantes/placa de S. typhimurium cepa

TA100 inducidas por 2-AF en presencia de EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) y mezcla S9.

En la Tabla 23 se presenta el nmero de revertantes/placa cepa TA100 inducidas

por el pro-mutgeno 2-AF en el rango de concentraciones ensayadas 0,25-2,50

g/placa y co-incubado con el extracto de EAB (1,0 y 10,0 mg/placa) en presencia

de activacin metablica utilizando el mtodo de pre-incubacin. En la Tabla se

incluyen los porcentajes de inhibicin %I de la mutagnesis inducida por 2-AF en

presencia de activacin metablica cuando se co-incuba con EAB.

Pudo observarse en la curva dosis-respuesta correspondiente al pro- mutgeno 2-

AF en presencia de activacin metablica que el nmero de revertantes/placa

aument en forma estadsticamente significativa a medida que se increment la

concentracin del mutgeno.

La co-incubacin del pro-mutgeno 2-AF en niveles de concentracin de 0,25 - 2,50

con 1,0 y 10,0 mg/placa indujeron un menor nmero de revertantes/placa con

diferencias estadsticamente muy significativas con el mutgeno diagnstico

(p<0,01)

Pudo observarse que con el empleo de 1,0 mg/placa de EAB los de %I variaron entre

91,00,7 y 100,60,0% en el rango de concentraciones del mutgeno ensayadas.

Con la mayor concentracin del EAB (10,0 mg/placa), los %I variaron entre de

95,00,7 y 100,00,1% en el rango de concentraciones del mutgeno ensayadas.

Bajo estas condiciones (mtodo de pre-incubacin con activacin metablica) se

pudo observar un fuerte efecto antimutagnico del EAB frente a la mutagenicidad

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 128

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

inducida por el mutgeno 2-AF sobre la cepa TA100 el cual result ser

independiente de la concentracin de EAB agregada (1,0 y 10,0 mg/placa).

Comparando los resultados de los %I en ambos mtodos (ensayo de incorporacin

en placa y pre-incubacin) con la cepa testigo TA100 frente a la mutagenicidad

ejercida por el pro mutgeno 2-AF con activacin metablica, se logra una mayor

inhibicin empleando el mtodo de pre-incubacin (Tabla 22 y 23).

2500

2000
Revertantes / Placa

1500

1000

500

0
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50

Dosis (g/placa)

Fig. 18. Efecto antimutagnico del EAB frente a la mutagenicidad inducida por el 2-AF con

activacin metablica utilizando S. typhimurium cepa TA100 (mtodo de pre-incubacin).

, revertantes/placa inducidas por 2-AF; , revertantes/placa inducidas por 2-AF en

presencia de 1,0 mg/ placa de EAB; , revertantes/placa inducidas por 2-AF en presencia

de 10,0 mg/placa de EAB

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 129

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Tabla 23. Nmero de revertantes/placa de la cepa TA100 inducidas por el 2-AF y

revertantes/placa inducidos por 2-AF co-incubados con el EAB con el agregado de

activacin metablica. %I de la mutagenicidad inducida por el 2-AF en presencia de

1,0 y 10,0 mg/placa de EAB (mtodo de pre-incubacin).

g/placa Rev. / placa Rev. / placa %I EAB Rev. / placa %I EAB

2-AF 2AF+S9 2AF+(EAB 2AF+ EAB
1,0mg/placa) 1,0mg/placa 10,0mg/placa 10,0mg/placa
0,00 13012 1369 1461

0,25 4588* 1549** 93,00,7 16213** 95,00,7

0,50 5927* 17026** 91,00,7 14617** 100,00,1

1,25 6505* 16318** 99,00,4 15817** 98,00,3

2,50 18087* 14820** 100,60,0 15416** 99,0 0,1

%I: Porcentajes de inhibicin del EAB frente a la mutagenicidad inducida por 2- AF

a
revertantes espontneos. *, p<0,05; **,p<0,01

4.2.3. Comparacin de los mtodos de incorporacin en placa y de pre-incubacin

A efectos de evaluar en forma conjunta los resultados encontrados en la actividad

antimutagnica del EAB empleando el ensayo de Ames en sus dos formas

metodolgicas, se presentan los %I en forma conjunta en la Tabla 24.

Puede observarse en la tabla que en la mayora de los ensayos el mtodo de pre-

incubacin produce los mayores %I. Resulta importante recalcar que el mayor %I de

antimutagenicidad del EAB se logra con frente a la cepa TA100, sobre el mutgeno

2-AF empleando activacin metablica. Adems se observ que esta inhibicin fue

independiente de la concentracin de EAB ensayada (1,0 y 10,0 mg/placa). En la

Tabla 24, se puede observar que los porcentajes de inhibicin obtenidos con el EAB,
Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 130
Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

en esta condicin, son similares frente a cada concentracin de mutgeno (0,25-

2,50 g/ml) y para cada concentracion de EAB ensayadas 1,0 y 10,0 mg/placa.

Tabla 24. Porcentaje de inhibicin de la mutagenicidad inducida por los mutgenos

2AF, 2NF y AZS en las cepas S. typhimurium TA98 y TA100 mediante los mtodos de

incorporacin en placa (IP) y pre-incubacin (PI); utilizando EAB (1,0 Y 10,0

mg/placa).

Cepa TA98 Cepa TA100

Ensayo mezcla S9 Mutgenob EAB1a EAB10 a
mezcla S9 Mutgenob EAB1a EAB10a
c c c c
%I %I %I %I
IP + 2AF + 2AF
0,25 28,12,9 68,01,9 0,25 37,05,8 34,04,9
0,50 28,00,7 82,00,4 0,50 52,02,7 50,02,7
1,25 40,01,2 73,00,6 1,25 41,02,7 56,02,5
2,50 32,05,6 80,03,0 2,50 31,02,6 46,02,3
PI + 2AF + 2AF
0,25 41,05,8 92,02,1 0,25 93,0 0,7 95,00,7
0,50 31,01,0 89,00,4 0,50 91,00,7 110,00,1
1,25 28,00,5 84,00,2 1,25 99,00,4 98,00,3
2,50 38,01,9 84,00,9 2,50 100,00,0 99,00,1

IP - 2NF - AZS
0,25 20,00,8 28,00,7 0,50 7,43,1 10,05,1
0,50 23,02,6 24,02,4 2,50 5,01,9 10,71,7
1,25 41,00,4 43,00,4 5,00 5,02,4 26,02,1
2,50 46,04,4 56,54,0
PI - 2NF - AZS
0,25 67,00,9 74,00,8 0,50 5,04,2 11,04,1
0,50 40,01,4 59,01,1 2,50 28,02,1 26,02,2
1,25 71,00,3 91,00,4 5,00 40,02,0 41,02,0
2,50 64,00,5 81,00,7
a
mg/placa, bg/placa, cporcentaje de inhibicin, EAB1 (1,0mg/placa),EAB 10 (10,0

mg/placa).

El EAB produce un %I de la mutagenicidad inducida por el 2-AF entre 68,01,9 y

92,02,1% en la cepa TA98 en presencia de activacin metablica siendo mayor la

inhibicin aplicando el mtodo de pre-incubacin. En este caso, la inhibicin es

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 131

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

dependiente de la concentracin de EAB utilizada (1,0 y 10,0 mg/placa), siendo esta

inhibicin mayor cuando se ensay la concentracin mayor 10,0 mg/placa. El EAB

produce los menores valores de %I con el empleo de AZS sobre la cepa TA100,

observndose una inhibicin mayor empleando el mtodo de pre-incubacin.

Esta cepa resulta ser menos sensible frente al efecto antimutgenico del EAB sobre

la mutagenicidad inducida por AZS.

4.3. Evaluacin de la actividad antimutagnica del cido clorognico

Los resultados de antimutagenicidad encontrados con el EAB nos condujeron a

preguntarnos si el principal componente de los polifenoles detectados en el EAB, el

cido clorognico, podra ser uno de los constituyentes presentes en el extracto

responsable y/o contribuyente de la antimutagenicidad observada en los

experimentos anteriores. Para ello, se evalu la actividad antimutagnica de

diferentes concentraciones de cido clorognico utilizando las cepas TA98 y TA100

frente a la mutagenicidad inducida por los mutgenos diagnstico 2-AF, 2-NF y AZS

con y sin activacin metablica. Las concentraciones de cido clorognico

estudiadas se seleccionaron considerando el valor hallado en el EAB mediante la

tcnica de HPLC (2,05 mg de cido clorognico/ml del EAB) y un valor 5 veces mayor

a ste. Por lo tanto, se emple una concentracin de cido clorognico de 0,10

mg/placa (concentracin contenida en 10mg de EAB) y una concentracin 5 veces

mayor correspondiente a 0,50 mg/placa.

Se utiliz el mtodo de pre-incubacin dado que result ser el que present mayor

sensibilidad en detectar la actividad antimutagnica del EAB.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 132

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

En la Tabla 25 se presenta el nmero de revertantes/placa en las cepas TA98 y

TA100 inducidas por los mutgenos 2-AF, 2-NF y AZS en una nica concentracin de

2,50 g/placa y co-incubado con el cido clorognico (0,10 y 0,50 mg/placa) con y

sin activacin metablica utilizando el mtodo de pre-incubacin.

En la Tabla se incluyen los porcentajes de inhibicin %I de la mutagnesis inducida

por los mutgenos 2-AF, 2-NF y AZS con y sin activacin metablica cuando se co-

incub con cido clorognico.

Para la cepa TA98 el acido clorognico mostr un efecto inhibidor de la mutagnesis

inducida por el 2-AF de 29,00,3% y de 84,00,1% para 0,10 y 0,50 mg/placa,

respectivamente.

El cido clorognico en valores de 0,10 y 0,50 mg/placa present similar

comportamiento en los ensayos sin activacin metablica frente a la mutagnesis

inducida por el 2-NF, donde los %I fueron de 44,00,7 y 75,50,4%,

respectivamente.

La capacidad antimutagnica del cido clorognico sobre la cepa TA100 frente a la

mutagenicidad inducida por 2-AF (con activacin metablica) result ser efectiva

para ambas concentraciones ensayadas presentando mayor efecto antimutagnico

cuando se ensay la concentracin mayor de 0,50 mg/placa (98,90,1%).

Al analizar la capacidad antimutagnica del cido clorognico frente al mutgeno de

accin directa AZS (cepa TA100) no se observ un efecto marcado en los valores del

%I segn las concentraciones utilizadas 0,10 y 0,50 mg/placa siendo de 36,00,3% y

41,00,72%, respectivamente.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 133

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Tabla 25. Nmero de revertantes/placa de la cepa TA98 y TA100 inducidas por el 2-

AF, 2-NF y AZS co-incubados con el cido clorognico (ACL) con y sin activacin

metablica empleando el mtodo de pre-incubacin. %I de la mutagenicidad

inducida por los mutgenos en presencia de 0,10 y 0,50 mg/placa de ACL.

Mutgeno Rev/placa Rev/placa %I ACL Rev/placa %I ACL

Cepa 2,50 mutgeno mutgeno+ACL 0,10 mutgeno+ACL 0,50
g/placa 0,10 mg/placa) mg/placa 0,50 mg/placa mg/placa)
TA98 2-AF+S9 2379431a 1696125 * 29,00,3 39837 ** 84,00,1

TA98 2-NF 69162a 33046 * 44,00,7 19230 ** 75,50,4

TA100 2-AF+S9 2329140 a 65658 ** 76,00,2 1594** 98,90,1

TA100 AZS 2300280 a 152088* 36,00,3 144351* 41,00,72

%I: Porcentajes de inhibicin del cido clorognico frente a la mutagenicidad inducida por

2-NF, 2-NF y AZS. acontrol positivo. Valores en la misma fila con *, p<0,05,**p<0,01

respecto al control positivo

4.4. Anlisis comparativo del efecto antimutagnico ejercido por EAB y el acido

clorognico

A efectos de comparar la actividad antimutagnica del EAB y la correspondiente al

cido clorognico, se evaluaron en forma conjunta los %I sobre la mutagenicidad

inducida por los mutgenos diagnstico.

4.4.1. Ensayo sin activacin metablica

En la Fig. 20 A y B se representa los efectos antimutagnicos ejercidos por el cido

clorognico (0,10 y 0,50 mg/placa) y el EAB (10,0 mg/placa) en presencia de las

cepas TA98 y TA100 , frente a la mutagenicidad inducida por los mutgenos 2-NF y

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 134

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

AZS (2,50 g/placa). Para el anlisis comparativo se utiliz 0,10 mg/placa de cido

clorognico, que corresponde a la concentracin de este compuesto en la muestra

de EAB (10,0 mg/placa) y una segunda concentracin de cido clorognico 5 veces

mayor 0,50 mg/placa, que la contenida en el EAB (10mg/placa), con la finalidad de

evaluar la posible diferencia en la respuesta, segn las condiciones ensayadas. Para

la cepa TA98 (Fig. 20 A) el % I de la mutagenicidad inducida por el 2-NF empleando

0,10 mg/placa de ACL fue de 44,00,7% mientras que empleando 10,0 mg/placa de

EAB se observ un %I del 81,00,7%. Al incrementar la concentracin del cido

clorognico a 0,50 mg/placa, el %I result ser de 75,50,4%.

Para la cepa TA100 (Fig. 20 B) los % I frente a la mutagenicidad inducida por AZS co-

incubado con 0,10 y 0,50 mg/placa de cido clorognico fueron de 36,00,3 y

41,00,72% respectivamente, mientras que el EAB con 10,0 mg/placa present un

%I del 26,02,2%. Estos valores indican que en esta condicin, el cido clorognico a

concentraciones de 0,10 y 0,50 mg/placa, mostr una actividad antimutagnica

superior a la ejercida por el EAB 10,0 mg/placa.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 135

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

A Cepa TA98 + 2-NF B 100

100 Cepa TA100 + AZS
Porcentaje de inhibicin

Porcentaje de inhibicin
81%
75%

50 50

44% 41%
36%
26%

0 0
0,10 ACL 0,50 ACL 10,0 EAB 0,10 ACL 0,50 ACL 10,0 EAB
Dosis mg/placa Dosis mg/placa

Fig. 19. Efecto antimutagnico del cido clorognico (ACL) 0,10 y 0,50 mg/placa (Barras

turquesa) y del EAB 10 mg/placa (Barra verde) frente a la mutagenicidad inducida por: A) 2-

NF (2,50 g/placa) utilizando S. typhimurium TA98 sin activacin metablica B) AZS (2,50

g/placa) S. typhimurium cepa TA 100 sin activacin metablica

4.4.2. Ensayo con activacin metablica

En las Figura 21 A y B se representa los efectos antimutagnicos ejercidos por el

cido clorognico (0,10 y 0,50 mg/placa) y el EAB (10,0 mg/placa) en presencia de

las cepas TA98 y TA100 , frente a la mutagenicidad inducida por el pro -mutgeno.

2-AF, con activacin metablica.

Para la cepa TA98 (Fig. 21 A) los % I de la mutagenicidad inducidas por el 2-AF co-

incubado con 0,10 y 0,50 mg/placa de cido clorognico fueron de 29,00,3 y

84,00,1% respectivamente, mientras que con 10,0 mg/placa de EAB se observ un

%I del 840,9%. Pudo observarse que la capacidad antimutagnica del EAB, result

semejante a la ejercida por la mayor concentracin ensayada de cido clorognico

0,50 mg/placa.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 136

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

A 100 Cepa TA98 + 2-AF B 100 Cepa TA100 + 2-AF

98,9% 99%

Porcentaje de inhibicin
84% 84%
Porcentaje de inhibicin

76%

50 50

29%

0 0
0,10 ACL 0,50 ACL 10,0 EAB 0,10 ACL 0,50 ACL 10,0 EAB
Dosis mg/placa Dosis mg/placa

Fig. 20. Efecto antimutagnico del cido clorognico (ACL) 0,10 y 0,50 mg/placa (Barras

turquesa) y del EAB 10,0 mg/placa (Barra verde) frente a la mutagenicidad inducida por el

2-AF (2,50 g/placa) utilizando la cepa S. typhimurium con activacin metablica. A) cepa

TA98, B) cepa TA100

Para la cepa TA100 (Fig.21 B), los % I de la mutagenicidad inducidos por el 2-AF con

0,10 y 0,50 mg/placa de cido clorognico fueron de 76,00,2 y 98,90,1%

respectivamente, mientras que con 10,0 mg/placa del EAB %I fue del 99,00,1%.

Estos valores indicaron que 0,10 mg/placa de cido clorognico tuvo una capacidad

antimutagnica menor que la ejercida por el EAB 10,0 mg/placa. Sin embargo

cuando se increment 5 veces la concentracin de cido clorognico, la capacidad

antimutagnica del cido clorognico result semejante a la ejercida por el EAB.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 137

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

5. DISCUSIN

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 138

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Esta Tesis Doctoral tuvo como objetivo general evaluar la accin antimutagnica de

un extracto acuoso de la especie vegetal B. articulata (EAB) mediante el Ensayo de

Ames utilizando las cepas de S. typymurium y empleando dos mtodos de

evaluacin: el mtodo de incorporacin en placa y pre-incubacin. Para ello, result

relevante caracterizar previamente la composicin qumica del EAB y evaluar la

actividad antioxidante as como su actividad mutagnica y txica.

Los resultados encontrados en el presente estudio referidos a la caracterizacin

qumica del EAB indicaron que el principal polifenol identificado fue el cido

clorognico con una concentracin de 2,050,11 mg/ml lo cual representara 1mg

de cido clorognico por cada 100 mg de EAB (1%).

El estudio de la actividad antioxidante producida por el EAB y el cido clorognico

mostr un valor de CE50 de 101,86 g/ml y de 0,269 g/ml respectivamente. La

actividad antioxidante del cido clorognico result ser mayor que la obtenida para

el EAB, indicando que se requiere una concentracin menor de cido clorognico

para lograr el 50% de la eficiencia inhibitoria.

Respecto a los resultados encontrados al evaluar la toxicidad tanto del EAB como

del cido clorognico, estos indicaron que ambas fracciones no fueron txicas para

las cepas de S. typhymurium TA98 y TA100, dentro del rango de las concentraciones

ensayadas.

Asimismo, se evalu la actividad mutagnica y se determin que, tanto el EAB como

el cido clorognico, no resultaron ser mutagnicos empleando el Ensayo de Ames

como modelo experimental. Ello nos permiti continuar evaluando la posible

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 139

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

capacidad antimutagnica del EAB y del cido clorognico frente a la mutagenicidad

inducida por agentes mutgenos de accin reconocida tales como 2-AF, 2-NF y AZS.

Respecto a los estudios de antimutagenicidad, los resultados encontrados

empleando la cepa TA98 mostraron que el EAB present un efecto protector frente

a la mutagenicidad inducida por el mutgeno 2-NF (ensayos sin activacin

metablica) que vari con la concentracin de EAB utilizada. Los valores de los %I

indicaron un efecto antimutgenico que result ser mayor cuando la concentracin

del EAB fue de 10,0 mg/placa. Comparando los resultados de los %I en ambos

mtodos (ensayo de incorporacin en placa y pre-incubacin), la mayor inhibicin

ejercida por el EAB se obtuvo empleando el mtodo de pre-incubacin con valores

que variaron entre 59,01,1 y 91,00,4%.

De manera similar a lo mencionado anteriormente, para la cepa TA98 en los

ensayos con activacin metablica, el EAB present efecto antimutagnico frente a

la mutagenicidad inducida por el 2-AF utilizando 10 mg/placa, con %I que variaron

entre 89,00,4 y 92,02,1%I para los ensayos realizados con el mtodo de pre-

incubacin y activacin metablica.

Al emplear la cepa TA100 se observ que el EAB present un efecto protector

frente a la mutagenicidad inducida por el mutgeno 2-AF (ensayos con activacin

metablica) que vari con la concentracin de EAB utilizada. En forma similar, la

mayor inhibicin ejercida por el EAB se obtuvo empleando el mtodo de pre-

incubacin con %I que variaron entre 95,00,7 y 100,00,0% utilizando 10 mg/placa

de EAB.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 140

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Para la cepa TA100 en los ensayos sin activacin metablica, empleando la AZS

como mutgeno diagnstico, en una concentracin de 10 mg/placa de EAB, el %I

vari entre 11,04,1- 40,02,0% con el mtodo de pre-incubacin. Valores menores

de %I se obtuvieron empleando el mtodo de incorporacin en placa.

De acuerdo a los resultados obtenidos, la discusin de esta Tesis Doctoral est

planteada teniendo en cuenta la caracterizacin qumica, actividad antioxidante,

mutagnica y la capacidad antimutagnica del EAB.

5.1. Composicin qumica del EAB y evaluacin de la actividad antioxidante

Los estudios realizados en la presente Tesis Doctoral sobre los compuestos qumicos

presentes en el EAB analizados por HPLC permitieron determinar al cido

clorognico como el polifenol mayoritario de la muestra. En la bibliografa

internacional se confirma la presencia de este polifenol en diversas plantas como

Ilex paraguayensis, B. genistelloides, Pimpinela anisum, entre otras (Yoshimoto y

col., 2002; Marques y Farah, 2009). El cido clorognico es un ster del cido

cafeico y el cido qunico. Otros estudios han demostrado que el cido clorognico

(Fig. 22) es el compuesto mayoritario aislado del caf, de hojas y frutos de las

plantas dicotiledneas siendo el ms importante del grupo de fenoles bioactivos

(Olthof y col., 2001). En concordancia con nuestros resultados, estudios

fitoqumicos realizados sobre especies de Baccharis han identificado compuestos

tales como flavonoides, cidos fenlicos y diterpenos como constituyentes

principales en esta planta (Verdi y col., 2005).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 141

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Respecto a la composicin qumica, Grecco y col. (2012) aislaron ocho flavonoides

(sakuranetina, naringenina, eriodictyol, apigenina, taxifolina, aromadendrina,

quercetina, kaempferol) y tres cidos clorognicos (3,4-O-dicaffeoylquinic acid, 3,5-

O-dicaffeoylquinic acid, 4,5-O-dicaffeoylquinic acid) de las partes areas de B.

retusa. Estos autores concluyeron que la fitoqumica de esta especie es similar a la

de otros miembros del gnero Baccharis: B. dracunculifolia (Marques y Farah,

2009), B. trimera y B. usterii (Verdi y col., 2005; Simes-Pires y col., 2005).

De acuerdo a Marques y Farah (2009) el principal grupo de compuestos fenlicos

encontrado en las plantas es el de los cidos hidroxicinmicos; stos estn

compuestos por el cido cafeico, ferlico y p-cumrico que son cidos trans-

cinmicos, naturalmente en estas tres formas o como mono teres o di-esteres de

stos compuestos con el cido qunico, conocidos genricamente como la familia de

los cidos clorognicos (Farah y Donangelo, 2006). Dentro de este grupo, los ms

frecuentemente hallados en la naturaleza son los cidos cafeilqunicos, cidos

dicafeilqunicos y los menos comunes los cidos feruloqunicos. Asimismo, cabe

sealar que cada uno de estos grupos posee al menos tres ismeros qumicos

(Palacios y col., 1999).

Los principales componentes qumicos y principios activos responsables de la

actividad estimulante digestiva colertica y colagoga informados para la especie de

Baccharis son los flavonoides, cidos cafeilqunicos y terpenoides (Simes-Pires y

col., 2005).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 142

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Fig. 21. Estructura qumica del cido clorognico (5- cafeilqunico (CQA))

En estudios cromatogrficos empleando HPLC realizados con extractos

hidroalcohlicos de B. articulata y otras carquejas del mismo gnero, tales como B.

crispa y B. trmera, Palacios y col. (1999) demostraron la presencia de cidos

fenlicos (cido cafeco, cido clorognico y cidos isoclorognicos). Estos autores

encontraron que B. crispa present un mayor contenido de cido clorognico y de

isoclorognico que B. articulata. Los niveles detectados de acido clorognico para B.

crispa fueron de 0,35% y para B. articulata de 0,17% expresados como g/100 g de

material seco. Los niveles de isoclorognico encontrados en B. crispa y para B.

articulata fueron de 1,51% y 1,14% expresados como g/100 g de materia seca

respectivamente. Slo trazas de cido cafeico fue encontrado en B. crispa y B.

articulata.

En el presente trabajo de Tesis Doctoral se detect cido clorognico en niveles de

2,05 mg/ml de EAB y considerando que la concentracin inicial es de 1mg por cada
Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 143
Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

100 mg de material seco, este valor indica que el contenido de cido clorognico es

del 1% expresada como g/100 g de material seco.

Este valor result ser mayor a los informados por Palacios y col. (1999) pudiendo

deberse a las diferencias en la metodologa de extraccin (extraccin metanlica)

de los cidos cafeilquinicos realizado por estos autores. Por otra parte, en nuestro

trabajo no se detectaron niveles de cido cafeco de manera similar a lo informado

en el trabajo de Palacios y col. (1999).

Castaeda y col. (2008) realizaron un estudio de la capacidad antioxidante de

diferentes plantas medicinales del Per. Ellos informaron que el extracto acuoso de

las hojas de lagarto caspi Calophyllum brasiliense (rbol medicinal americano) en

una concentracin de 100 g/ml present un porcentaje de inhibicin de DPPH* de

110,56%. Asimismo, el extracto metanlico de hipoctilo de Lepidium peruvianum

(200 g/ml) mostr un porcentaje de inhibicin de DPPH* de 95,55%. Los extractos

acuosos de L. meyenii (200 g/ml) y de Minthostachys mollis (50 g/ml)

presentaron un porcentaje de inhibicin de 88,21% y 92,41%, respectivamente. En

todos los casos, se utiliz como patrn la actividad antioxidante promedio el cido

ascrbico (Vitamina C) que result del 92,82%.

En el presente trabajo de Tesis Doctoral empleando una concentracin de 150

g/ml del EAB se obtuvo un porcentaje de inhibicin de DPPH* de 76,1% indicando

que el EAB present una actividad antioxidante similar a la obtenida en los

extractos de las plantas anteriormente mencionados.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 144

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Otros autores tales como Vieira y col. (2011) realizaron un anlisis de la actividad

antioxidante de diferentes especies de Baccharis e informaron que la concentracin

eficiente (CE50) para el extracto acuoso de B. articulata fue de CE50 = 262 g/ml;

para el extracto acuoso de B. trimera fue de CE50 = 301 g/ml; para el extracto

acuoso de B. spicata fue de CE50 = 362 g/ml y para el extracto acuoso de B. usterii

de CE50= 183 g/ml. El control positivo para estas determinaciones fue quercetina

con un CE50= 0,02 g/ml, valor superior de actividad antioxidante al mostrado por

los extractos. Rodrigues y col. (2009) en un estudio realizado con la especie B.

trimera, que posee propiedades similares a B. articulata, informaron un valor de

CE50= 92,39 g/ml, siendo los patrones utilizados por estos autores cido ascrbico

y rutina CE50= 4,03 y 18,93 g/ml, respectivamente.

En el presente trabajo de Tesis Doctoral, el EAB mostr actividad antioxidante con

un valor de CE50= 101,86 g/ml utilizando como control positivo el cido

clorognico. El valor de CE50 para el cido clorognico fue de 0,269 g/ml, indicando

que la eficiencia inhibitoria del cido clorognico frente al DPPH* result ser mayor

que la obtenida para el EAB.

Madsen (1997) en base a estudios fitoqumicos realizados en especies del gnero

Baccharis identific compuestos fenlicos, fenilpropanoides y flavonoides que

poseen varias propiedades biolgicas in vitro e in vivo. Estos efectos biolgicos

fueron atribuidos mayoritariamente a la actividad antioxidante de estas hierbas

capaces de neutralizar radicales libres producidos por la peroxidacin lipdica o

iones metlicos responsables de la generacin de especies reactivas y del dao a

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 145

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

biomolculas esenciales.

De Oliveira y col. (2003) estudiaron la actividad antioxidante mediante el ensayo

DPPH* de los extractos acuoso y etanlico de B. articulata as como las fracciones

de diclorometano, acetato de etilo y n-butanol obtenidos a partir de extractos

acuosos. Estos autores encontraron que la fraccin de n-butanol fue la ms activa

en su actividad antioxidante siendo el principal compuesto aislado e identificado el

4'-O--D glucopiranosil-3',5'-dimetoxibenzil-cafeato el cual represent el 2,5% del

total de los constituyentes y fue el responsable del efecto protector frente al estrs

oxidativo generado por el perxido de hidrgeno.

De Oliveira y col. (2004) determinaron la actividad antioxidante de B. spicata, B.

trmera y B. uterii a travs del ensayo TRAP (parmetro de radical-atrapador de

antioxidantes) y TBARS (formacin de especies reactivas por el cido tiobarbiturico).

Los autores determinaron que la fraccin n-butanol fue la ms activa en B. spicata y

B. trmera, sin embargo en B. uterii tanto la fraccin acuosa como la n-butanol la

actividad antioxidante result ser similar. En un trabajo previo (De Oliveira y col.,

2003) la fraccin n-butanol en B. articulata present la mayor actividad

antioxidante de la cual se aisl un compuesto denominado Ball (4'-O--D

glucopiranosil-3',5'-dimetoxibenzil-cafeato). Este compuesto no fue identificado en

B. spicata, B. trmera y B. uterii. Los autores sugieren lo anterior podra indicar la

presencia de diferentes compuestos qumicos (derivados fenlicos y terpenoides)

en las especies de Baccharis estudiadas.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 146

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

En la presente Tesis Doctoral, la actividad antioxidante obtenida para el EAB result

ser comparable a la presentada en la bibliografa de otros gneros de Baccharis

(Rodrguez y col., 2009).

A efectos de completar la caracterizacin del EAB se evalu el efecto txico y

mutagnico frente cepas de S. typhimurium mediante el Ensayo de Ames .

5.2. Evaluacin del efecto txico y mutagnico del EAB y del cido clorognico

Existe abundante evidencia de los efectos benficos de B. articulata sobre la salud

humana y animal. En la extensa bibliografa referida a la toxicidad de las diferentes

especies de Baccharis como ser B. trmera, B. crispa y B. articulata. (Debenedetti y

col., 2006). En otros trabajos, no se encontraron evidencias que indiquen toxicidad

ni efectos adversos en ensayos en va oral en ratones. La dosis administrada fue 100

veces superior al consumo humano habitual (extracto acuoso equivalente a 14,0 -

14,4 g de planta seca/kg de peso corporal) (Gorzalczany y col., 1999).

Respecto a su accin bactericida, resulta importante tener en cuenta que algunos

compuestos qumicos presentes en los extractos de plantas ejercen accin

bactericida sobre las cepas bacterianas utilizadas en el Ensayo de Ames (Purchase y

col., 1976).

Los resultados de toxicidad encontrados en la presente Tesis Doctoral empleando

EAB en el rango de concentraciones (1,0 y 10,0 mg/placa) no present efectos

txicos sobre las cepas de S. typhymurium TA98 y TA100 con y sin activacin

metablica. Tampoco se observaron diferencias estadsticamente significativas en la

toxicidad con los mtodos ensayados (incorporacin en placa y pre-incubacin).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 147

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Respecto al cido clorognico, en el rango de concentraciones estudiadas (0,05 y

0,50 mg/placa), no result ser txico frente a las cepas TA98 y TA100 con el mtodo

de pre-incubacin.

Respecto a la actividad mutagnica del EAB y del cido clorognico, aplicando el

Ensayo de Ames, las cepas TA98 y TA100, nuestros resultados no indicaron efecto

mutagnico en el rango de concentraciones estudiadas.

Sin embargo, los estudios de mutagenicidad realizados por Borgo y col. (2004) con

un extracto acuoso de B. articulata en concentraciones de 62, 50, 125, 250 y 500

mg/placa empleando el Ensayo de Ames observaron una actividad mutagnica leve

a partir de 250 y 500 mg/placa con la cepa TA98 empleando el mtodo de pre-

incubacin y sin activacin metablica. La diferencia encontrada con nuestros

resultados podra deberse a las altas concentraciones de extracto acuoso utilizada

por los autores (entre 25 y 50 veces mayores a los ensayados en esta Tesis Doctoral)

que podran producir una interferencia con el ensayo, permitiendo la duplicacin

bacteriana durante el estado de pre-incubacin (Chu y col., 1981).

Rodrigues y col. (2009) llevaron a cabo un anlisis in vivo de genotoxicidad y anti-

genotoxicidad del extracto acuoso del gnero B. trmera, empleando el ensayo de

microncleos y electroforesis de clulas nicas (ensayo cometa) en ratones

expuestos al extracto. Estos autores concluyeron que independientemente de la

dosis ensayada, no se observaron efectos genotxicos, tanto en sangre perifrica

como en hgado de los animales tratados cuando la metodologa del ensayo cometa

fue empleada como biomarcador. Sin embargo, el extracto acuoso en

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 148

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

concentraciones de 500, 1000 o 2000 mg/Kg de B. trimera aument la frecuencia de

microncleos en medula sea de ratn, despus de ser tratados tres das

consecutivos, indicando capacidad clastognica y/o aneugnica del mismo. Estos

autores encontraron adems un efecto antigenotxico, protegiendo el dao

oxidativo sobre el ADN cuando la sangre de los ratones fue tratada in vivo con

perxido de hidrgeno (Datos no mostrados). Los mismos autores sugieren que el

efecto antigenotxico encontrado podra estar relacionado con la actividad

antioxidante del extracto acuoso de B. trimera.

Por otra parte, la actividad citotxica del extracto acuoso fro de B. articulata fue

estudiada in vitro en linfocitos de sangre perifrica de individuos humanos sanos en

concentraciones de 40, 78, 156, 313, 625 y 1250 g/ml mediante tratamiento

continuo de 18-24 h (Cariddi y col., 2010). Asimismo, estos autores analizaron la

genotoxicidad inducida mediante el ensayo de microncleos empleando ratones

Balb/c inyectados con 1800, 900 y 450 mg/kg de extracto acuoso de B. articulata.

Los estudios pusieron en evidencia que el extracto acuoso de B. articulata no

ejerci actividad citotxica sobre linfocitos humanos, ni mutagnicos en eritrocitos

de mdula sea de ratn luego de 6 h de aplicacin (Cariddi y col., 2010). Sin

embargo, en un estudio posterior Cariddi y col. (2012) revelaron que el extracto

acuoso fro de B. articulata, mostr tener un efecto mutagnico cuando se

increment el tiempo de exposicin a 24 y 48 h en las dosis ensayadas (900 y 1800

mg/Kg) incrementndose estadsticamente el nmero de microncleos (p0,05)

evaluados mediante un ensayo ANOVA empleando la comparacin mltiple de

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 149

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Tukey. Los autores argumentaron que el tiempo de exposicin estara influenciando

esta respuesta diferencial.

Los resultados encontrados en la presente Tesis Doctoral y otros que surgen de la

bibliografa consultada referidos a la evaluacin de la mutagenicidad por el Ensayo

de Ames, nos permite afirmar que el EAB y el cido clorognico son no txicos sobre

las cepas de S. typhymurium utilizadas (TA98 y TA100) ni mutagnicos en las

concentraciones ensayadas en los dos mtodos estudiados (incorporacin en placa

y pre-incubacin), con y sin activacin metablica. Esto nos habilita a avanzar en la

discusin inherente a los ensayos de antimutagenicidad del EAB realizados con el

Ensayo de Ames.

5.3. Evaluacin de la actividad antimutagnica del EAB y del cido clorognico

frente a mutgenos de accin conocida empleando las cepas TA100 y TA98 con y

sin activacin metablica

Existe en la bibliografa gran nmero de estudios en los cuales las plantas

medicinales muestran su capacidad inhibitoria sobre mutgenos de reconocida

actividad mutagnica y carcinognica. Entre la gran lista de posibles ejemplos, se

encuentran fundamentalmente las frutas, como: la arjuna o arjun rbol (Terminalia

arjuna) (Kaur y col., 2001), la guayava o guava (Psidium guajava) (Grover y Bala,

1993).

Diversos estudios realizados en ensayos bacterianos demuestran la clara capacidad

antimutagnica de algunos extractos de plantas, como son los provenientes del

rbol de la orqudea roja o bauhinia roja (Bauhinia galpinii), de la mariposa azul

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 150

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

(Rotheca myricoides), igual que tes chinos (Gunpowder Chinese y Japanese Sencha)

(Bunkova y col.,2005, Verschaeve y Van Staden, 2008).

En la bibliografa se encuentran gran cantidad de investigaciones previas que

examinan las propiedades antimutagnicas de hierbas e infusiones de plantas de

uso popular (Marnewick y col., 2000; Santana-Rios y col., 2001; ; Horn y Ferra

Vargas, 2008). Muchos de estos trabajos fueron realizados utilizando el Ensayo

Ames como modelo experimental (Yen y col., 2001; ; Horn y Ferra Vargas Vargas,

2003; Cario-Cortz y col., 2007). Como consecuencia se ha sugerido que tal efecto

protector podra estar relacionado con los flavonoides y/o taninos presentes en los

extractos acuosos, inactivadores potenciales de las enzimas involucradas en el

metabolismo de la mutagnesis (Horn y Ferra Vargas, 2008).

En concordancia con los estudios anteriores, los resultados encontrados en la

presente Tesis Doctoral indican que el EAB result ser antimutagnico sobre la

mutagenicidad inducida por tres mutgenos diagnstico (2-AF, 2-NF y AZS), en el

Ensayo de Ames en sus dos variantes, en las concentraciones estudiadas ,con las

cepas testigo seleccionadas y con y sin activacin metablica. Asimismo, el principal

compuesto detectado en el EAB correspondi al cido clorognico, el cual tambin

mostr ser antimutagnico en el rango de concentraciones ensayadas. En la Tabla

25 (acpite 4.3.) se observan los ndices de inhibicin del cido clorognico sobre la

mutagenicidad inducida por los mutgenos 2-AF, 2-NF y AZS .en la cual se observa

una efectividad mayor al ensayar la concentracin ms alta del mismo (0,50

mg/placa).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 151

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

En la bibliografa algunos autores hacen mencin a la capacidad antimutagnica de

los polifenoles, los cafeilqunicos y sus derivados en ciertas plantas (Yoshimoto y

col., 2002). Otros autores mencionan los efectos inhibitorios del cido clorognico y

el cido cafeco frente a los mutgenos Trp-P-1 y Glu-P-2 utilizando el Ensayo de

Ames (Yamada y Tomita, 1996).

Los resultados encontrados en la presente Tesis Doctoral son coincidentes con los

encontrados en la bibliografa respecto a la capacidad antimutagnica del cido

clorognico. Por ello, estaramos en condiciones de afirmar que el EAB y el cido

clorognico en los rangos ensayados es antimutagnico, utilizando el Ensayo de

Ames.

5.3.1. Evaluacin del efecto antimutagnico del EAB utilizando dos variantes del

ensayo (incorporacin en placa y pre-incubacin)

Diferentes autores han empleado el mtodo de incorporacin en placa del Ensayo

de Ames para determinar la actividad antimutagnica de un xenobitico (Nakasugi y

Komai, 1998; Abdullaev y col., 2003; Moreno y col., 2005; Guachalla 2006; Bunkova

y col., 2005).

Otros autores, sin embargo, utilizan el mtodo modificado con pre-incubacin (Yen

y col., 2001; Santana-Rios y col., 2001; Pedreschi y col., 2006; Saito y col., 2006;

Cario-Cortez y col., 2007). Finalmente, otros autores implementan ambos mtodos

para la evaluacin de la antimutagnesis de diversas sustancias, drogas e hierbas

(Ferrer y col, 2002; Anjana y col., 2007). Segn datos bibliogrficos en todos los

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 152

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

casos el ensayo con pre-incubacin resulta ser igual o ms sensible que el de

incorporacin en placa (Matsushima y col., 1980). Kaur y col., (2002) en su estudio

sobre la antimutagnesis ejercida por los extractos (fraccin metanlica, acetnica,

benzoica y clorofrmica) de la planta medicinal Terminalia arjuna sobre la

mutagenicidad inducida por diferentes mutgenos (colorante cido negro, 4-nitro-

o-fenilenediamina y 2-AF) con la cepa testigo TA98 y utilizando ambos mtodos

(incorporacin en placa y pre-incubacin) concluyen que el efecto inhibitorio de la

mutacin por las fracciones estudiadas fue similar en ambos mtodos. Anjana y col.

(2007) de manera similar encuentran que para la cepa TA100 utilizando el ensayo

de incorporacin en placa y pre-incubacin y mutgenos de accin directa, los

valores de inhibicin fueron similares.

Nuestros resultados indicaron que el mtodo de pre-incubacin mostr mayor

sensibilidad que el mtodo de incorporacin en placa en todas las condiciones

ensayadas.

Similares resultados fueron obtenidos por Cario-Corts y col. (2007) quienes

observaron una mayor inhibicin de la mutagnesis empleando el mtodo de pre-

incubacin al evaluar extractos de Stevia pilosa y Stevia eupatoria empleando el

Ensayo de Ames. Estos autores vinculan los hallazgos a la formacin de metabolitos

antimutagnicos de corta duracin que podran tener una mejor oportunidad de

reaccionar con la cepa de ensayo en el pequeo volumen de la mezcla de

preincubacin.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 153

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Considerando que tanto el EAB como el cido clorognico resultaron ser

antimutagnicos frente a las cepas testigo y los mutgenos diagnstico, resulta de

inters evaluar en forma comparativa estos efectos.

5.3.2. Comparacin de los efectos antimutagnicos del EAB y del cido clorognico

El anlisis comparativo del efecto antimutagnico del EAB y del cido clorognico

revelan que cuando se ensay el cido clorognico en la concentracin contenida

en los 10,0 mg/placa del EAB (correspondiente a 0,10 mg/placa de cido

clorognico) el EAB mostr mayor eficiencia protectora.

La comparacin de la actividad antimutagnica entre el EAB y el cido clorognico

indic que se necesit una concentracin 5 veces mayor de cido clorognico para

alcanzar una actividad antimutagnica similar a la observada en el EAB. Esto nos

estara indicando que la capacidad antioxidante, tanto del EAB como del cido

clorognico contenido en la muestra, tendra vinculacin con el efecto

antimutagenico. Es probable que el EAB contenga otros compuestos antioxidantes

(flavonoides, y otros cafeilqunicos) que podran contribuir a la capacidad

antimutagnica observada la cual es mayor a la observada con el acido clorognico

puro.

Por otra parte, el efecto antimutagnico observado en el EAB con tres diferentes

mutgenos ensayados sugerira que ste extracto podra tener diferentes

mecanismos de accin por parte de cada uno de los mismos, los que seran

responsables de las variaciones observadas. Ello es objeto de anlisis en los

siguientes puntos.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 154

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

5.4. Posibles mecanismos de antimutagnisis del EAB frente a diferentes

mutgenos y cepas selecionadas

A efectos de evaluar el mecanismo de la actividad antimutagnica se han propuesto

dos categoras de antimutgenos denominados desmutgenos y bioantimutgenos

de acuerdo a su modo de accin. Segn se defini en el acpite 1.14, los

desmutgenos son compuestos que inactivan al mutgeno antes que este sea

incorporado en la clula bacteriana e incluyen los que actan directamente sobre el

mutgeno o sobre la actividad del mutgeno. Otros desmutgenos, en cambio

inhiben la accin de las enzimas del sistema P450 durante la activacin metablica

del mutgeno.

Por otra parte, los bioantimutgenos son compuestos que actan sobre la

reparacin del DNA despus de que el mutgeno ha infligido su dao en el mismo. A

efectos de proponer un posible mecanismo de la antimutagenicidad encontrada en

el EAB se presenta a continuacin un anlisis de la capacidad inhibitoria del EAB

ejercida frente a cada mutgeno diagnostico y la cepa testigo seleccionada.

5.4.1. 2-AF

El mecanismo exacto por el cual EAB inhibe la mutagenicidad de 2-AF no se conoce

hasta el presente. Sin embargo, algunas sugerencias se pueden hacer sobre la base

de los resultados encontrados en la presente Tesis Doctoral y aquellos informados

previamente por otros grupos de investigacin (Cario- Corts y col., 2007; Horn y

Ferra Vargas, 2008). Para ello resulta importante considerar las rutas metablicas

del mutgeno 2-AF y las cepas testigo empleadas (TA98 y TA100).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 155

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Las aminas aromticas, como lo es el 2-AF, son mutagnicas a travs de un proceso

de reduccin que genera un radical anin nitro. La principal ruta de activacin

metablica en la N-oxidacin a hidroxilamina es mediante la enzima citocromo

P4501A2 y la subsecuente activacin por la enzima N-acetiltransferasa (NAT) (Dong

y Guengerich, 1995). El 2-AF es un mutgeno que precisa de activacin metablica

en la forma electroflica para ser mutagnico y carcinognico (Hereflich y Neft,

1994). En la Fig. 23 se presenta la estructura molecular del 2-AF.

Ames y col. (1972) demuestran que ciertos metabolitos del carcingeno 2-AF

(especialmente 2-NF y N- hidroxi-2-aminofluoreno) y los derivados de cinco aminas

aromticas son carcinognicas e inductores de mutaciones de corrimiento de marco

de lectura.

El 2-AF, al igual que otras aminas aromticas (N-2- acetilaminofluoreno (AAF), y su

derivado N-2-(acetilamino) 7- iodofluoreno (AAIF), introducen aductos en el ADN y

son considerados como mutgenos que otorgan importante informacin en

relacin a la actividad metablica en procesos de mutagnesis y carcinognesis

(Hereflich y Neft, 1994). Adems de ser los ms estudiados por generar aductos en

la posicin C8 de la guanina del ADN, su estudio aporta informacin acerca de las

consecuencias biolgicas del dao sobre el mismo.

Fig. 22. Estructura qumica del 2-AF

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 156

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

En la Fig. 24 se resume el proceso metablico de las aminas aromticas y

compuestos relacionados.

Respecto a las cepas utilizadas en el Ensayo de Ames, la cepa testigo TA100

presenta una mutacin en el gen histG46 que codifica para la primera enzima de la

biosntesis de histidina. Esta mutacin sustituye prolina por leucina en la secuencia

del ADN (Ames, 1971). La cepa TA100 detecta mutgenos que causan sustitucin de

pares de bases que podra depender de las especies reactivas generadas por la N-

oxidacin del compuesto (Levine y col., 1994).

La cepa testigo TA98 presenta una mutacin HisD3052 (-1) de corrimiento de marco

de lectura (delecin del par de bases G-C). Esta mutacin posee, adems del

complejo del corrimiento del marco de lectura, una sustitucin de base (Levin y col.,

1982). La mutacin que causa corrimiento del marco de lectura es revertida por

mutgenos dependientes de la estructura molecular plana del compuesto activo y

permite su interaccin con el ADN (Levine y col., 1994). Esta mutacin compleja

tambin requiere la presencia de sitios moleculares capaces de formar aductos en

el ADN (mayoritariamente C-8-G). Este efecto es inducido por las aminas aromticas

en presencia de activacin metablica (Levine y col., 1994).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 157

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

N-Sulfonoxy-AF
Sulfotransferasa

P450
AF N-OH-AF -AF aductos
NF
(NR) O-acetilasa
De -acetilacin
(carboxiesterasa) NAT

N-Ac0-AF

AAF N-OH-AAF
(NOAT)

Detoxificacin por Sulfotransferasa -AAF aductos

Hidroxilacin en el
C-1,3,5,7 O 9

OH-AAF N-Sulfonoxy-AAF

N-Aco-AF
Fig. 23. Descripcin del metabolismo del AAF y AF y compuestos relacionados AAF: N-2-

acetilaminofluoreno; NF: 2-nitrofluoreno; N-Aco-AAFF: N-acetoxi-N-2-acetilaminofluoreno;

N-Aco-AF: N-acetoxi-N-2-aminofluoreno; N-OH-AAF: N-hidroxi-N-2- acetilaminofluoreno;

OH-AAF: varios C-hidroxilados derivados del AAF; N-OH-AF: N-hidroxi-N-2-aminofluoreno.

Enzimas activas: P450: citocromo monoxigenasas; NR: nitroreductasas; NAT: N-

acetiltransferasa; NOAT: N,O-acetiltransferasa (modificado de Hereflich y Neft, 1994)

Existen diversos estudios de antimutagnesis realizados con extractos de plantas

empleando el Ensayo de Ames (cepas TA98 y TA100) y el mutgeno diagnostico 2-

AF.

Horn y Ferra Vargas (2008) evaluaron la antimutagenicidad de extractos acuosos

de tres especies pertenecientes a la familia Asteraceae y Lamiaceae (plantas de uso

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 158

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

medicinal popular en Brasil) utilizando el Ensayo de Ames. Demostraron que los

mismos presentaron un efecto antimutagnico muy significativo frente a la

mutagenicidad inducida por el pro-mutgeno 2-AF (5 g/placa) utilizando el mtodo

de pre-incubacin encontrando un porcentaje de inhibicin de la mutagenicidad del

67% y 100% para la cepa TA98 y TA100, respectivamente. Los autores sugieren que

este efecto protector posiblemente est relacionado con las propiedades descriptas

para los flavonoides y/o taninos actuando como inactivadores potenciales de las

enzimas comprometidas con el metabolismo del mutgeno. En concordancia con lo

anterior, nuestros resultados indicaron que al co-incubar el EAB con el pro-

mutgeno 2-AF (2,50 g/placa) se obtuvo un %I en un rango de 95,00,7-100,00,1

% (para la mayor concentracin de EAB 10,0 mg/placa) y de 84,00,2-922,1%I con

las cepas TA100 y TA98, respectivamente, utilizando el mtodo de pre-incubacin

(Tabla 24).

Numerosos autores sugieren que el efecto inhibitorio ejercido por diferentes

extractos de plantas y hierbas frente al pro-mutageno 2-AF podra deberse a un

proceso de desactivacin del pro-mutgeno mediado por el bloqueo de las enzimas

comprometidas con el metabolismo del mutgeno (Teel, 1986; Calomme y col.,

1996; Shih y col., 2000; Kweon y col., 2001; Chan y col., 2011; Yun y col., 2012).

Asimismo, Kaur y col. (2001) analizaron la capacidad inhibitoria de los extractos del

t negro y Oolong frente a la mutagenicidad inducida por el 2-AF utilizando el

Ensayo de Ames con la cepa TA98 y TA100. Estos autores sugieren que algn

compuesto antimutgeno presente en las fracciones de los extractos de t

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 159

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

interactuaran especficamente con el sistema microsomal citocromo P450 del

homogeneizado de hgado, necesario para la activacin del mutgeno. De manera

semejante, Cario- Corts y col. (2007) analizaron la antimutagnesis ejercida por

los extractos de las plantas medicinales tales como Stevia pilosa y Stevia eupatoria

mediante el Ensayo de Ames frente al mutgeno indirecto 2-aminoantraceno

utilizando las cepas TA98 y TA100 y el mtodo de pre-incubacin. Estos autores

demostraron que para ambas cepas y en ambas especies de plantas, la inhibicin de

la mutagenicidad mostr un porcentaje de inhibicin del 94-99%. Los mismos

sugieren que la reduccin de la mutagenicidad del 2-aminoantraceno podra

deberse a la capacidad de los extractos de estas plantas de interferir con la

activacin metablica del pro-mutgeno, funcionando as como un agente

bloqueador.

Segn De Flora (1997), los inhibidores de la mutagnesis y de la carcinognesis

actan por impedimento o modulacin de la cascada de eventos involucrados en los

pasos consecutivos de las mutaciones y el cncer. Por otro lado, otros estudios

realizados sobre la capacidad inhibitoria de fenoles naturales presentes en las

plantas (e.g., ferlico, cafeico, clorognico y elgico) sobre la mutagnesis del

benzo()pireno, utilizando el Ensayo de Ames como modelo experimental, pondran

en evidencia que una concentracin relativamente alta de cido clorogenico,

ferlico y cafeico (dosis de 150, 75 y 50 nmol respectivamente) es requerida para

bloquear la mutagenicidad del benzo()pireno en un 50% (Wood y col., 1982) .

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 160

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Asimismo, estos autores demostraron que el efecto antimutagenico de los fenoles

resulta de la interaccin directa con el benzo()pireno 7,8-diol-9, 10-epoxido-2.

Varios autores sugieren que la respuesta antimutagnica podra vincularse a la

inhibicin competitiva de las isoenzimas del citocromo P450 presentes en el hgado

(Edenharder y col., 1993; Edenharder y Tang 1997; Edenharder y col., 2003).

Buening y col. (1981) tambin postularon que algunos flavonoides son potentes

inhibidores de citocromo P450 reductasa. Este tipo de actividad protectora, despus

de la activacin metablica, ha sido relacionada con la funcin de las isoformas del

citocromo P450 en el sistema de desintoxicacin con reductasa y/o oxigenasa, cuya

funcin en el sistema antioxidante es neutralizar compuestos que generan radicales

de oxgeno, radicales libres y especies reactivas del oxgeno (Kappus, 1986). Por lo

tanto, el mayor potencial antimutagnico observado en ensayos se observa siempre

en presencia de la fraccin microsomal metablica. Esto puede estar relacionado

con la activacin de un citocromo P450 que media la oxidacin de promutgenos

(Mitscher y col., 1986). En este sentido, se ha informado que el compuesto qumico

luteolina (una flavona encontrada en B. trimera) es un potente inhibidor del CY1A2

(Edenharder y col., 1993). Este compuesto es conocido como fuerte desmutgeno y

muestra una importante actividad antimutagnica llegando a valores cercanos al

94%I (Samejima y col., 1995).

Del anlisis de la bibliografa, se desprende que la mayora de los extractos de

plantas frente al pro-mutgeno 2-AF ejerceran su accin antimutagnica mediante

el mecanismo de tipo desmutgenos.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 161

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Los resultados encontrados en la presente Tesis Doctoral indicaron que el EAB

mostr capacidad antimutagnica frente al mutgeno indirecto 2-AF. Estos

resultados permitiran sugerir que compuestos presentes en el EAB podran

interactuar con algunas enzimas especficas presentes en la activacin metablica

que resultan necesarias para la metabolizacin del pro-mutgeno.

Teniendo en cuenta que el Ensayo de Ames es una prueba basada en la reversin de

la mutacin, la diferente respuesta de las cepas bacterianas resulta dependiente de

la mutacin puntual que genera su condicin auxtrofa his-.

Cuando la cepa TA100 fue utilizada como indicadora, el efecto inhibitorio result

independiente de las concentraciones ensayadas y se obtuvo una inhibicin

completa de la mutagenicidad inducida por 2-AF en presencia del EAB con el

mtodo de pre-incubacin (Fig 19). Por el contrario, cuando se utiliz la cepa TA98

como cepa indicadora, el efecto protector del EAB se comport dependiente de las

concentraciones utilizadas (Fig. 16 y 17) y se observ un efecto antimutagnico

parcial. Ello nos indic que la actividad inhibitoria del EAB frente al pro-mutgeno 2-

AF se comporta en forma diferente y muy probablemente debido a la diferencias

genotpicas de la cepa testigo utilizada TA100 o TA98.

Por otra parte, entre los constituyentes del EAB encontramos al cido clorognico

que ha mostrado una actividad antioxidante y antimutagnica efectiva frente a la

mutagenicidad inducida por el 2-AF en las cepas TA98 y TA100 (Acpite 4.4.2).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 162

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Nakasugi y Komai (1998) analizaron la actividad antimutagenica de cuatro flavonas

aisladas de B. trimera (cirsimaritina, hispidulina, apigenina y luteolina) las cuales

mostraron fuerte actividad antimutagnica (72-90%I) en el Ensayo de Ames.

Se ha informado que el acido clorognico suprime la actividad mutagnica de la N-

metil-N-nitro-nitrosoguanidina en S. typhimurium cepa TA1535 por captura de

productos electroflicos generados por los compuestos carcinognicos (Chen y col.,

1996).

Nuestros resultados sugieren que tanto el EAB como el cido clorognico podran

estar involucrados en la captura de productos electroflicos debido a que ambos

mostraron propiedades antioxidantes inhibiendo al radical libre DPPH* como se

present en este trabajo de Tesis Doctoral (Acpite 4.1.2). Por ello, la actividad

antimutagnica del EAB observada podra estar vinculada con la inhibicin de la

ruta de reduccin de las aminas aromticas. Una interpretacin similar se encuentra

en los trabajos de Beudot y col. (1998); estos autores informan sobre la actividad

antimutagnica de flavonas sintticas evaluadas mediante el Ensayo de Ames

empleando 2-AF como mutgeno de referencia.

De esta forma, podramos inferir que los compuestos presentes en el EAB podran

ejercer su accin antimutagnica mediante un mecanismo denominado

desmutgeno.

5.4.2. 2-NF

Los fluorenos, pirenos y fluorantenos son los hidrocarburos policclicos aromticos

que se encuentran en gran cantidad en la atmsfera, siendo el 2-NF (Fig. 25) y el

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 163

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

nitroareno dominantes en la misma, seguido por los nitrofluorenos, 3-

nitrofluorantreno y nitropirenos (Edenharder y Tang, 1997).

El 2-NF es un mutgeno de accin directa, reconocido como iniciador y promotor

del proceso de carcinognesis y formacin de aductos en el ADN de clulas de

animales de laboratorio (Mller, 1994). Es conocido que en mamferos expuestos en

condiciones de laboratorio, este agente despus de ser inhalado, produce potentes

metabolitos mutagnicos. Entre los mismos se pueden mencionar nitrofluorenos

hidroxilados que migran al torrente sistmico. A su vez despus de ser inhalado es

reducido por la microflora intestinal a su correspondiente amina, el AAF, el cual es

un potente carcingeno (Fig. 24) (Hereflich y Neft, 1994). La induccin del sistema

P450 afecta a este metabolito y se forma mayor cantidad de N-OH-AAF, un potente

agente mutagnico (Mller, 1994; Bichara y Fuchs, 1985).

Fig. 24. Estructura qumica del mutgeno 2-NF

Mosovsk y col. (2010) analizaron el efecto antimutagnico de diferentes extractos

de pseudocereales (Amarantus sp., Sorghum bicolor y Echinochloa frumentacea)

frente al mutgeno de accin directa 2-NF y confirmaron que la inhibicin

producida por estos extractos es dependiente de la concentracin de los mismos.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 164

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

En el presente trabajo de Tesis Doctoral, el EAB present, bajo nuestras condiciones

ensayadas, un efecto antimutagnico frente a la mutagenicidad inducida por el

mutgeno de accin directa 2-NF, con la cepa testigo TA98.

El 2-NF acta como mutgeno de accin directa e induce mutaciones de

corrimiento de marco de lectura debido a la formacin de aductos (Rosenkranz y

Mermelstein, 1983). La mutacin depende de la forma planar de la molcula del

compuesto activo, lo cual permite su intercalacin en el ADN.

Horn y Ferra Vargas (2003) proponen que los extractos de plantas probablemente

puedan ejercer su efecto protector por un mecanismo de intercepcin del

mutgeno. Asimismo, estos autores proponen que tambin podran actuar

desactivando el 2-NF y as, por consiguiente, bloquear la induccin de dao del

mutgeno en el ADN.

Rossi y col. (2003) estudiaron la capacidad antimutagnica de la planta

sudamericana Sangre de Drago (Croton lechleri, Euphorbiaceae), utilizada en

medicina folclrica, y encontraron que la capacidad protectora frente a la

mutagenicidad inducida por el 2-NF en la cepa TA98 result ser moderada, con un

%I de 45% al utilizar 500 g/placa.

Horn y Ferra Vargas (2003) informaron resultados interesantes en relacin a la

capacidad antimutagnica demostrada en dos plantas medicinales, Maytenus

ilicifolia y Peltastes peltatus, ricas en flavonoides y taninos. La mayor inhibicin

frente a la mutagenicidad inducida por el 2-NF utilizando la cepa TA98 la obtuvieron

con M. ilicifolia en las dosis de 125 375 mg/placa con un %I de 50,56 52,90%

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 165

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

respectivamente. Estos autores concluyen que esta proteccin frente a la

mutagenicidad del agente sera mediada a travs de un mecanismo de intercepcin

del mutgeno, ms que por alteracin de la actividad enzimtica. La desactivacin

se producira bloqueando directamente el 2-NF, no permitiendo de esta manera

ejercer dao sobre el ADN bacteriano.

Evandri y col. (2005) en estudios similares y utilizando tambin la cepa TA98, para

analizar la capacidad antimutagnica del aceite de lavanda (Lavandula angustifolia)

frente al mutgeno 2-NF, obtienen un %I mximo frente al 2-NF del 66,4% con una

concentracin de 0,28 mg/placa. En coincidencia con los autores antes

mencionados, sugieren que el aceite de lavanda probablemente protege el ADN de

la mutacin mediante la interceptacin del agente mutagnico. Estos autores

agregan que este efecto inhibidor del aceite de lavanda sera directamente ejercido

por un mecanismo de desactivacin del 2-NF bloqueando as el mutgeno que daa

el ADN.

Cabe mencionar que otros autores, luego de analizar los nitro derivados

(nitroarenos), como el 2-NF, frente a la capacidad inhibitoria de varios compuestos

de la clase de los polifenoles, plantean en forma especulativa otro mecanismo

factible y concebible, tal como la interferencia con el mecanismo que conduce a la

mutagenicidad o los efectos de los flavonoides sobre el sistema de reparacin,

fijacin y expresin del dao causado por el 2-NF, 2-3-nitrofluorantreno y

nitropirenos (Edenharder y Tang, 1997).

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 166

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Otro posible mecanismo propuesto para la accin protectora ejercida por los

extractos de plantas es la adsorcin de los mutgenos, los que han sido asociados a

pigmentos pirrolicos tales como la clorofila (Arimoto y col., 1995; Ferguson y col.,

2004; Nogueira y col., 2006).

Nuestros resultados muestran que el EAB ejerce un efecto antimutagnico frente al

mutgeno de accin directa 2-NF (sin activacin metablica), lo cual excluira alguna

interaccin entre los componentes del EAB y el sistema de enzimtico presente en

la activacin metablica.

Asimismo, el principal compuesto hallado en el EAB (cido clorognico), tambin

mostr una actividad antimutagnica efectiva frente a la mutagenicidad del 2-NF en

la cepa TA98 (Acpite 4.2.1). La mayor inhibicin de la mutagnesis se logr con la

mayor concentracin de clorognico ensayada (0,50 mg/placa). En esta

concentracin, el cido clorognico mostr un efecto antimutagnico frente al 2-NF

presentando un %I del 75,50,4%.

De esta forma, podramos sugerir que los compuestos presentes en el EAB podran

ejercer su accin antimutagnica frente al 2-NF mediante un mecanismo de

desmutgenos, a travs de un mecanismo de intercepcin, bloqueando

parcialmente el agente de accin directa 2-NF.

5.4.3. AZS

La AZS es un potente mutgeno (Fig. 26) y un agente muy comn en los laboratorios

qumicos, adems de ser extensamente utilizado en los laboratorios industriales

(gas nitrgeno de los airbags de los autos, entre otros ejemplos), la agricultura,

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 167

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

prcticas mdicas y en estudios de sntesis orgnica. Qumicamente es la base

conjugada del cido hidrazoico, es un anin linear que tiene propiedades

isoelctricas con CO2 y N2O. Segn la teora del enlace de valencia, la AZS puede ser

descripta con diferentes estructuras resonantes, siendo una de la ms importante la

que se presenta a continuacin.

Fig. 25. Estructura qumica de la AZS

Anjana y col. (2007) en estudios realizados con extractos metablicos de la planta

espino amarillo (Hippophae Rhamnoides Linn.) planta medicinal india, demostraron

un efecto antimutagnico moderado frente a la AZS empleando el Ensayo de Ames

y las cepas TA98 y TA100, con un %I en el rango de 41-46% respectivamente para

una concentracin de 2,50 x 107 mg/ml. Estos autores sugieren que la capacidad

inhibitoria de estos extractos probablemente sea a travs de un mecanismo

antioxidante.

Rossi y col. (2003) realizaron estudios de la capacidad antimutagnica de la planta

medicinal Croton lechleri frente a la mutagenicidad de la AZS y concluyeron que una

concentracin de 1mg/placa de la planta posee una leve actividad antimutagnica

con %I de 34%.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 168

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Similares valores de %I se obtuvieron en el presente trabajo de Tesis Doctoral con el

EAB en concentraciones de 1,0 y 10,0 mg/placa frente a la mutagenicidad de la AZS

que mostr una baja efectividad llegando a valores mximos de inhibicin de

40,02,0 y 41,02,0% respectivamente con el mtodo de pre-incubacin utilizando

la cepa TA100 (Tabla 23).

Asimismo, el principal compuesto fenlico (acido clorognico) hallado en el EAB ha

mostrado una actividad antimutagnica frente a la mutagnesis de la AZS en la cepa

TA100 (Acpite 4.2.1) con un %I que vari entre 36,00,3 y 41,00,72% en el rango

de concentraciones ensayadas 0,10 0,50 mg/placa (Tabla 25).

Estos resultados sugieren que la actividad antimutagnica hallada en el EAB frente a

la AZS sera probablemente a travs de un mecanismo antioxidante, propiedad que

ha sido demostrada tanto en el EAB como en el cido clorognico.

Por otra parte otro posible efecto antimutagnico informado en diversas plantas

sobre la mutagenicidad de la AZS sugieren que el mecanismo protector frente a este

mutgeno podra depender de la activacin metablica bacteriana del mutgeno

(AZS). De acuerdo con esta hiptesis se ha informado que la mutagnesis de la AZS

inorgnica (N3-) estara mediada por un metabolito orgnico, la L-azidoalanina, en

el medio ambiente bacteriano (Owais y Kleinhofs, 1988). Por ello podramos sugerir

que en el EAB podran coexistir diversos compuestos adems del cido clorognico

los cuales interferiran con la activacin bacteriana del mutgeno. Este mecanismo

tambin forma parte del denominado desmutgeno.

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Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

6. CONCLUSIONES

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 170

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

A partir de los resultados encontrados y de la discusin planteada en la presente

Tesis Doctoral se presentan las siguientes conclusiones:

La caracterizacin del EAB mediante HPLC permiti detectar al cido clorognico

como el principal y mayoritario polifenol de la muestra.

El contenido de cido clorognico presente en el EAB fue de 2,05 mg/ml de EAB que

corresponde a 1 g/100 g de material seco (1%).

No se detect cido cafeico en el EAB similarmente a lo informado por otros

autores.

El EAB en una concentracin de 150 g/ml mostr capacidad antioxidante

inhibiendo en un 76,1% al radical DPPH* siendo este valor similar al obsevado para

otros extractos de plantas que presentan propiedades antioxidantes.

El estudio de la actividad antioxidante del EAB mostr un valor de CE 50 de 101,86

g/ml siendo comparable a la informada para otras especies del gnero Baccharis.

El valor de CE50 para el cido clorognico fue de CE50= 0,269 g/ml, indicando una

mayor eficiencia inhibitoria del cido clorognico frente al DPPH* que el EAB.

El EAB en el rango de las concentraciones ensayadas (1,0 y 10,0 mg/placa) no

result ser txico frente a las cepas de S. typhymurium TA98 y TA100 en el Ensayo

de Ames empleando tanto el mtodo de pre-incubacin como el de incorporacin

en placa.

El cido clorognico en el rango de las concentraciones ensayadas (0,05 y 0,50

mg/placa) no result ser txico frente a las cepas de S. typhymurium TA98 y TA100

en el Ensayo de Ames empleando el mtodo de pre-incubacin.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 171

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

El EAB en el rango de las concentraciones ensayadas (1,0 y 10,0 mg/placa) no

result ser mutagnico frente a las cepas de S. typhymurium TA98 y TA100 en el

Ensayo de Ames en sus dos variantes: incorporacin en placa y pre-incubacin.

El cido clorognico en el rango de las concentraciones ensayadas (0,05 y 0,50

mg/placa) no result ser mutagnico frente a las cepas de S. typhymurium TA98 y

TA100 en el Ensayo de Ames en sus dos varianteslos incorporacin en placa y pre-

incubacin.

El EAB en el rango de concentraciones estudiadas (1,0 y 10,0 mg/placa), utilizando

el Ensayo de Ames, result ser antimutagnico sobre la mutagenicidad inducida por

los mutgenos de accin directa 2-NF y AZS, sobre las cepas TA98 y TA100

respectivamente y la mutagenicidad inducida por el pro-mutgeno 2-AF (con

activacin metablica) sobre las cepas TA98 y TA100.

Comparando ambos mtodos del Ensayo de Ames (incorporacin en placa y pre-

incubacin), la mayor inhibicin de la mutagnesis ejercida por el EAB se obtuvo

empleando el mtodo de pre-incubacin con %I que variaron entre 28,00,5% y

92,02,1,% para la cepa TA98 y de 5,04,2 a 100,00,1% para la cepa TA100.

Empleando el Ensayo de Ames (mtodo de preincubacin), el EAB mostr actividad

antimutagenica frente a la cepa TA98 inducida por diferentes concentraciones del

mutgeno 2-AF con activacin metablica que vari con la concentracin de EAB

utilizada. Con 1,0 mg/placa de EAB los valores de los %I de la mutagenicidad

variaron entre 28,00,5 y 41,05,8%. Con 10,0 mg/placa de EAB los %I de la

mutagenicidad variaron entre 84,00,9 y 92,02,1%.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 172

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Empleando el Ensayo de Ames (mtodo de pre-incubacin), el EAB mostr actividad

antimutagnica frente a la cepa TA98 inducida por diferentes concentraciones del

mutgeno 2-NF (sin activacin metablica) que vari con la concentracin de EAB

utilizada. Con 1,0 mg/placa de EAB los %I de la mutagenicidad variaron entre

60,01,4 y 71,00,3%. Con 10,0 mg/placa de EAB los %I de la mutagenicidad

variaron entre 59,01,1 y 91,00,4%.

Empleando el Ensayo de Ames (mtodo de pre-incubacin), el EAB mostr actividad

antimutagnica frente a la cepa TA100 inducida por diferentes concentraciones del

mutgeno 2-AF (con activacin metablica) que vari con la concentracin de EAB

utilizada. Con 10,0 mg/placa de EAB los %I de la mutagenicidad variaron entre 95 y

100%.

Empleando el Ensayo de Ames (mtodo de pre-incubacin), el EAB mostr actividad

antimutagenica frente a la cepa TA100 inducida por el mutgeno AZS (sin activacin

metablica) que vari con la concentracin de EAB utilizada. Con 1,0 mg/placa de

EAB los %I de la mutagenicidad variaron entre 5,04,2% y 40,02,0%. Con 10,0

mg/placa de EAB los %I de la mutagenicidad variaron entre 11,04,1 y 41,02,0%.

Con el Ensayo de Ames (mtodo de pre-incubacin), el cido clorognico present

actividad antimutagnica frente a la cepa TA98 inducida por el mutgeno 2-AF (con

activacin metablica) que vari con la concertacin utilizada. Empleando 0,10 y

0,50 mg/placa de cido clorognico el %I de la mutagenicidad fue de 29,00,3 y

84,00,1% respectivamente.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 173

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Empleando el Ensayo de Ames (mtodo de preincubacin), el cido clorognico

present actividad antimutagnica frente a la cepa TA98 inducida por el mutgeno

2-NF (sin activacin metablica) que vari con la concentracin utilizada. Con 0,10 y

0,50 mg/placa de cido clorognico el %I de la mutagenicidad fue 44,00,7% y

75,50,4% respectivamente.

Empleando el Ensayo de Ames (mtodo de pre-incubacin), el cido clorognico

present actividad antimutagnica frente a la cepa TA100 inducida por el mutgeno

2-AF (con activacin metablica) que vari con la concentracin utilizada. Con 0,10

y 0,50 mg/placa de cido clorognico el %I de la mutagenicidad fue de 76,00,2% y

98,90,1% respectivamente.

Empleando el Ensayo de Ames (mtodo de pre-incubacin), el cido clorognico

present actividad antimutagnica frente a la cepa TA100 inducida por el mutgeno

AZS (sin activacin metablica) que vari con la concentracin utilizada. Con 0,10 y

0,50 mg/placa de cido clorognico el %I de la mutagenicidad fue de 36,00,3% y

41,00,72% respectivamente.

La comparacin de la actividad antimutagnica entre el EAB y el cido clorognico

indic que se necesit una concentracin 5 veces mayor de cido clorognico para

alcanzar una actividad antimutagnica similar a la observada en el EAB, lo cual

indica que otros compuestos presentes en EAB podran generar la capacidad

antimutagnica observada.

El efecto antimutagnico aplicando el Ensayo de Ames, del EAB y el cido

clorognico frente a tres diferentes mutgenos ensayados permitira sugerir que

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 174

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

podran operar diferentes mecanismos antimutagnicos puesto en evidencia en

este Trabajo de Tesis.

La actividad antimutagnica obsevada con el Ensayo de Ames del EAB frente al pro-

mutgeno 2-AF podra producirse mediante un mecanismo de desmutgeno, dado

por la interferencia o bloqueo de las enzimas microsomales involucradas en la

activacin metablica de este mutgeno.

Existen diferencias en la actividad antimutagnica en el EAB cuando se la caracteriza

con el Ensayo de Ames, segn las cepas estudiadas, las que resultan ser

dependientes de las caractersticas genticas de cada cepa.

La antimutagnesis result ser mayor para la cepa TA100 que para la cepa TA98

empleando el mtodo de pre-incubacin con el Ensayo de Ames, pudiendo ser

atribuido a que en esta ltima la mutacin resultante constituye un complejo del

corrimiento del marco de lectura ms una sustitucin de bases.

La antimutagnesis del EAB sobre el mutgeno de accin directa 2-NF podra ser

ejercida mediante un mecanismo de intercepcin del mutgeno. La desactivacin se

producira bloqueando directamente al agente, no permitiendo de esta manera

ejercer dao sobre el ADN bacteriano, de acuerdo al diseo empleado en el Ensayo

de Ames en el marco de esta Tesis Doctoral.

La antimutagenicidad observada del EAB sobre el mutgeno AZS podra ser segn el

Ensayo de Ames y el diseo experimental implementado, debida a un mecanismo

de intercepcin en la actividad metablica bacteriana tambin denominado

desmutgeno.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 175

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

Un mecanismo relacionado con la va antioxidante del EAB, acentuado por la

presencia del cido clorognico y otros compuestos derivados como los

cafeilqunicos, podran ser responsables o al menos contribuir a los efectos

observados.

Conclusiones finales de la Tesis Doctoral

El EAB, mostr capacidad antimutagnica en el Ensayo de Ames, con las cepas S.

thyphimurium TA 98 y TA100 utilizando dos variantes del ensayo (incorporacin en

placa y pre-incubacin). Dicha actividad estara vinculada a la capacidad

antioxidante del EAB, la presencia del cido clorognico y otros compuestos

bioactivos presentes en la infusin.

Prespectivas futuras

Posibles temas de investigacin a ser desarrollados:

1) Profundizar en los posibles mecanismos de quimioproteccin implicados en

el efecto antimutgnico ejercido por el EAB, frente a los diferentes

mutgenos.

2) Evaluacion de la actividad antioxidante y antimutagenica de otros

compuestos bioactivos presentes en B. articulata (Lam.) Persoon.

3) Futuros ensayos de genotoxicidad, carcinognesis y teratognesis mediante

biomarcadores biolgicos.

Lic. Mara de las Nieves Rodriguez Pgina 176

Estudio de la capacidad antimutagnica del extracto acuoso de Baccharis articulata (Lam.) Persoon

7. BIBLIOGRAFIA

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