Desarrollo de Metodos
Desarrollo de Metodos
Desarrollo de Metodos
Introduccin
08:00 10:30 Antecedentes
Fundamentos de cromatografa de lquidos de alta resolucin.
Tipos de cromatografa
Estndares
Informacin de
para API y Especificaciones del
agencias regulatorias Farmacopeas
Producto Innovador
(pblica) y literatura
Terminado
Dossier
Idea de
Registro
0 1 3 6 9 12 18 24
Meses
Soporte a la Frmula
(Tradicional o PAT)
TTA
Desarrollo de Validacin de
Mtodos Mtodos Estabilidad Estabilidad
Estabilidad
Analticos Analticos 6 meses 12 meses
3 meses
(Buenas Prcticas (Buenas Prcticas
Cientficas) de Fabricacin)
Atributos
Crticos de Espacio de Control de
Calidad Diseo Calidad
(CQA) (ED)
Parmetros
Crticos de
Proceso
CpD
(CPP)
2015 Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. Analytical Quality by Design Approach in RP-
HPLC Method Development for the Assay of Etofenamate in Dosage Forms.
ANTECEDENTES
Desarrollo de Mtodos Analticos
Es la aplicacin de conocimientos qumicos, fsicos, biolgicos y
matemticos en combinacin del uso de tcnicas instrumentales variadas
a fin de obtener un procedimiento/protocolo de anlisis para la sustancia
activa o el medicamento.
Desarrollo de Mtodos Analticos
1. Pruebas de Identificacin.
2. Mtodos de Valoracin/Potencia.
5. Mtodos Especficos.
CLINICO FARMACETICO MTODOS
En la fase Inicial del Desarrollo Farmacutico
Para determinar Para desarrollar Comprensin del perfil de
biodisponibilidad formulaciones estables impurezas / degradados y el
en voluntarios con los propsitos de: Estudio de Estabilidad.
sanos Bioequivalencia,
disolucin, estabilidad, Para medir el impacto del proceso
validacin escala piloto. de fabricacin y conocer las
variables crticas del proceso
que afectan la calidad del
producto.
En la fase Avanzadas del Desarrollo Farmacutico
Para demostrar Para optimizar, escalar y Debe ser robusto, facilmente
bioequivalencia. transferir un proceso transferible, exacto, preciso,
estable de fabricacin a indicativo de estabilidad y usado
la planta comercial. para control de calidad de lotes
pre-calificados / transferencia.
Toxicidad
(Impurezas y
Prod. Degs)
Pre-formulacin Farmacocintica
(Permeabilidad,
(Solubilidad, Tamao
Absorcin, Cmax,
de Partcula, Estabilidad)
Cmin, AUC)
Desarrollo
de Mtodos
Analticos
Desarrollo
Farmacutico Distribucin
(Liberacin API, (Empaque,
funcionalidad Estabilidad)
de excipientes) Fabricacin
(Uniformidad,
Estabilidad,
Reproducibilidad)
Guas /
PNO local de
Desarrollo
Analtico
Revistas
Procedimientos Cientficas y
Globales (HQ) o Disertasiones Conocimiento
Estndares
Corporativos Guas
de Expertos Pblico
Corporativas
Guas (Know-How)
Manual de
Calidad de la Bases de Datos
compaa ICH (SciFinder, PubMed)
FARMACOPEAS / Normas
FEUM / USP / WHO / TGA / Eur. Ph. /
Jap. Ph. / NOM / ISO
Lineamientos
Internacionales
Cambio en la
formulacin
Cambio en la
ruta de
sntesis
Carga de Adicin
la del
muestra solvente
Columna con
fase
estacionaria
Componentes
separados
Tiempo
HISTORIA
El HPLC / CLAR tiene alrededor de 35 aos de existir:
Silica
empacada
Fase Mvil
Tiempo Cero
Fase Mvil
Bandas de Analitos
Tiempo + X minutos
Fase Mvil
Caractersticas de las molculas basadas en su estructura y
distribucin de carga de electrones.
La desventaja de la slica es que
se disuelve a pH alto (por ello ha
sido necesario inventar partculas
hbridas que son ms estables a
pH alto.
Slica muy
polar
C18 (ODS)
Ligando C8 triclorosilano
FORMULAS Y CONCEPTOS
Tiempo de retencin y tiempo de retencin de la fase mvil.
FORMULAS Y CONCEPTOS
Factor de selectividad.
L
N=
H
FORMULAS Y CONCEPTOS
Resolucin
Representa pasos de equilibrio fase (2(t R )B (t R ) A )
estacionaria/fase mvil y en consecuencia RS =
una mejor separacin: WA + WB
Rs << picos ms estrechos = mejor
separacin.
Ecuacin fundamental de la Resolucin y su representacin grfica: A
valores muy pequeos el factor de retencin (k) tiene el impacto ms
grande en la resolucin, pero a valores modestos esto se vuelve
insignificante en comparacin con la eficiencia (N) y sucesivamente va
predominando la selectividad ().
FORMULAS Y CONCEPTOS
2
1
En columnas capilares
(CG) este trmino es
innecesario porque no
hay partculas como tal
que atravesar.
FORMULAS Y CONCEPTOS
Flujo
FORMULAS Y CONCEPTOS
Dependiendo de las
propiedades qumicas y fsicas
de las molculas algunas
tardarn ms o menos tiempo
en moverse de la fase mvil a
la fase estacionaria y
viceversa.
FORMULAS Y CONCEPTOS
Transferencia de masa, Cu
Difusin Axial , A
Velocidad Lineal, u
FORMULAS Y CONCEPTOS
Zona de U-HPLC
Dimetro Interno de la
Flujo (mL/min)
Columna (mm)
4.6 1.0
3.0 0.4
2.1 0.2
Combinacin de pendiente de dimensiones de la columna
y gradiente.
4.6 1.0 20
3.0 0.4 14
2.1 0.2 7
TIPOS DE
CROMATOGRAFA
CROMATOGRAFA DE LQUIDOS:
Cromatografa
en Papel
Extraccin en
Fase Slida
TIPOS DE CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
Quiral
TIPOS DE CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
Intercambio Inico
La elucin de las partculas cargadas (por ejemplo,
positivamente) se consiguen cambiando el pH del solvente
hasta igualarlo a su punto isoelctrico o hasta invertir su
carga neta.
TIPOS DE CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
Apareamiento Inico
TIPOS DE CROMATOGRAFA DE LQUIDOS
Fase Normal
Exclusin Molecular
Carta de polaridad por composicin de la fase mvil.
Carta de Selectividad para columnas de fase inversa
FAST LC.
Detector de Conductividad.
Detector de Fluorescencia.
FD
Rejilla de difraccin /
Lmpara Lentes Foto Diodo
Seleccin de longitud de La variacin diferencial de la luz
onda
crea una seal elctrica que se
representa como un pico.
Flujo proveniente
de la columna
Medicin de la absorbancia
En los anlisis espectrofotomtricos siempre intentamos trabajar a
longitudes de onda donde se encuentra la mxima absorbancia (max)
Este es el punto de mxima respuesta en donde se mejora la sensibilidad y
se tiene el lmite de deteccin ms bajo, y tambin donde se reduce el error
en la medicin.
Piridoxina 100% at 1.74 min
400
mAU
287.6
Error pequeo
300
200
Variaciones de idnticas
222.8
100
Error
grande
nm
-50
230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400
Desviaciones de la ley de Lambert-Beer
( N o s e r e q u i e r e q u e u n a
molcula contenga un cromforo
o que sea capaz de ionizarse.
( Principio es la conversin de un
efluente de la columna en un
aerosol seco al cual se le aplica
una carga elctrica, las
partculas se cargan en la
medida de la masa de cada
compuesto.
UV/Vis 0.1 1 ng SI
Conductividad 0.5 1 ng NO
Espectrometra de
0.1 1 ng SI
masas
DEFINICIN DEL
OBJETIVO
Tomada de Development and Validation of HPLC Methods for Analytical
and preparative Purposes de Johan Linholm, 2004.
VALORACIN
(API y DISOLUCIN).
Scouting /
Caracterizacin
Documentacin
(Reporte y Libreta de Proyecto)
Informacin de
Desarrollo Farmacutico
(que quieren hacer
nuestros colegas?).
En donde se pretende
vender el producto?
Qu tiempo tengo para
el Desarrollo del Mtodo
Analtico.
Estrategia General del Desarrollo de Mtodos
Requerimientos del
Cliente / Usuario
Previous Bibliographic
Research
Journals
International Guidelines 1. Identification Test
Pharmacopeia 2. Potency assays A n a l y t i c a l
Instruments, Non-
Supplier Technical 3. Impurity test: A n a l y t i c a l
Information Quantitative Instruments and/or
Apparatus Selection.
4. I m p u r i t y Te s t :
SPRI Information limit
Seminaries, Courses, 5. Specific Tests.
Trainings, Congresses.
Previous methodologies.
Documentacin
(Reporte y Libreta de Proyecto)
Pharmaceutical
Formula
Batch Record Data Base Search over the company
Analytical Methodologies previously
General Information generated and external.
Regulatory and Compendial
Information
Other
-Material Safety External Local
Data Bases Data Sheets -Journals -FEUM
Elsevier, PubMed, -Scientists -Data Bases - N O M
Magazines and International (COFEPRIS)
ScienceDirect, -Library
UNAM Library, articles. -USP -SEMARNAT
University
Nature Pharmaceuticals -EP -CFR
-IPA
Chemical Abstracts. Company -JP
-CIPAM
-Research Lab -ICH
-Intranet -International
Books -QC H e a l t h
-Handbook of excipients, -RMS Authorities
-Index Merck (FDA,EMEA,
-PLM, PDR TGA)
-Analytical Profiles and Drug
Substances. Florey Connors
-Martindale
Raw Material Analysis Method Developments
Finished Product Methodology
First Analysis. Transferences
Validation and
In process
Stability Area
Analysis
Pre-analytical Studies Support
Stability Study
Pilot Batches
Method (Most Important Variables)
analysis
Development
Stability Plan
(25C/60%RH., 0C-5C, cycles, 40C, light, 75C, etc.).
Proposes Optimization
(Secondary variables
analysis). Sample Extraction
Robustness (Preliminary) Proccess and/or
Sample Preparation
(Operational Range Evaluation of the
critical variables of the method).
Method Linearity
Specificity (Preliminary)
QL, DL
Precision and (if apply)
Reproducibility
METHOD DEVELOPMENT
FINAL REPORT AND
ANALYTICAL
METHODOLOGY.
Method Development Protocol.
1. Objective
2. Introduction
3. Background
3.1 API s Physical Chemical properties
3.2 Related/Degradation Products and
Impurities Physical Chemical
properties.
3.3 Excipients Physical Chemical
properties.
3.4 Formulation Prototype.
3.5 Previous Analytical Methodologies.
5. Scope
6. Justification
7. Analytical Method Proposes
7.1 Reactives and solutions
7.2 Standards and Sample Preparation
7.3 Special sample preparations
7.3 Test Process and/or Experimental Design.
8. Results and Analysis of Results (for each propose)
9. Conclusion (for each propose)
10. Perspectives and/or Next Step Re-definition of Final
chosen Method.
11. Optimization of Final chosen Method.
12. Method Validation Preliminary Tests.
'Esta etapa es fundamental y debe dedicarse el tiempo necesario
para investigar sobre informacin de muy diversas fuentes y tpicos.
'El resultado de esta etapa debe ser un acervo bibliogrfico que nos
haya permitido plantear la estrategia general para el Desarrollo del
Mtodo (plan).
Draft. Mometasone
Furoate Cream 3.2.P.
ACN:MeOH:Agu Gradiente 5.2.1 Analytical
C18, 150 x 4.6 a (10:9:90, v/v/v) 0.08 mg/
254! 40 C! 20 l! (Consultar 1.5! Procedures Assay,
mm, 3m! ACN:MeOH:Agu mL!
referencia)! Degradates and
a (90:9:10, v/v/v)!
Identity. Ver. 1.2 15-
ago-2012!
Silica Octadecil
ACN:Agua edQm. PhEur 7th
250mm x 4.6 254! N/E! 20 l! Isocratico! 1.0! 1 mg/mL!
(50:50 % v/v)! Edicin 2013 (7.6)!
mm, 5m!
0-44 min (70:30
% v/v)
Carga de la muestra
Elucin eliminacin de la
interaccin entre el analito y
solvente
EXTRACCIN LQUIDO-LQUIDO
Ej: agua-cloroformo,
ter-agua,
n-heptano-agua
DERIVATIZACIN
La derivatizacin es un proceso mediante el cual se transforma el analito
por una reaccin qumica en un derivado ms fcil de analizar.
Se obtienen
compuestos
fluorescentes
derivados de
proteinas, aminas y
compuestos
fenlicos, la
excitacin ocurre a
335 365 nm y la
Cloruro de
dansilo emisin a 520 nm.
Ejemplos:
( No se sugiere diluirla.
Mayor retencin
C18
C2
C4 C8
NH2
Mayor retencin
Agua/Buffer
Agua
Fuerza de Elucin
Metanol
Acetonitrilo
Etanol
Isopropanol
Tetrahidrofurano
Propiedades importantes de los solventes
' El Acetonitrilo tiene menor viscosidad reduce la contrapresin y
frecuentemente permite una mejor forma de pico.
100% ACN
80% ACN
50% ACN
30% ACN
Fase mvil
Efecto del tipo de modificador orgnico de la fase mvil en la
resolucin de compuestos hidrofbicos
X Y Z
DETECCIN
MIGRACIN
TIEMPO TIEMPO
CONSEJO PARA DETERMINAR SI UN
MTODO PUEDE SER RESUELTO
ISOCRTICAMENTE.
tg = (tf ti)
Tg = tiempo del gradiente.
tf = 21.2 min
ti = 12.8 min
tg = 20 min
Rangos de pH de 1 a 12
) Utilizando mayores rangos de pH para resolver
problemas en desarrollo de mtodos de fase reversa
) Seleccin de buffers
$Formas de picos
$Deteccin de anlitos problemas de sensibilidad.
$Selectividad.
Por que es importante el pH para obtener
resolucin ?
)pKa
)Cambios de selectividad
)Reglas tradicionales de fase mvil
)Tecnologa de partculas nuevas
)Influencia de concentracin organica
Como encontrar el pKa de tu compuesto?
)Tablas
)Textos
)Experimentales
2 4 6 8 10 12 14
pH
Agentes de Apareamiento Inico
Efecto de la temperatura
Como regla para fase reversa en separaciones
isocraticas, un incremento de 1C
La temperatura afecta a:
& La selectividad
& Resolucin (Rs 2). Si la fase entrando a la
columna puede resultar en picos deformes.
& Para eliminar distorcin, la temperatura de la
fase movil entrando a la columna debe estar
dentro 6C de la temperatura de la columna.
Perdida de Resolucin
Balance de T en la columna
Horno
60C
60C
Pre acondicionador
Gradiente de T
Horno
Centro de la columna:
*Viscosidad alta, menor velocidad linear, mayor retencin.
Ensanchamiento de la banda extracolumnar
Tiene lugar cuando se transporta el soluto a travs de
tuberas como los utilizados en inyectores detector.
Lo ms relevante de esta
etapa es comprender los
principios qumicos y
fsicos que rigen el
comportamiento del
mtodo en desarrollo y
medir su efecto sobre el
analito de inters.
Consiste en la evaluacin de las diferentes propuestas / alternativas para
fundamentar la metodologa analtica. Esta seleccin debe realizarse en
funcin de:
% Objetivo del mtodo analtico
% Disponibilidad de Tecnologa Instrumental.
% Facilidad de adquisicin de suministros para el anlisis.
% Factibilidad de implementacin / transferencia en los Laboratorios de Control
de Calidad para Anlisis Rutinario (cliente final).
% Tiempo asignado para el Desarrollo del Mtodo Analtico en cuestin.
% Respuesta inicial del mtodo y potencial de adaptacin para cumplir con el
objetivo.
En esta etapa para facilitar el escudriamiento de propuestas se puede recurrir a
software de Desarrollo de Mtodos Analticos
Variable
Diseo de
Experimentos Proporcin de
[mM] Acetato de
23 pH Fase Orgnica
Amonio
(ACN:MeOH)
Con las variables crticas 1 5.6 17 7:3
identificadas, el cientfico puede 2 5.6 23 7:3
recurrir a Diseo de Experimentos 3 6.0 17 7:3
(factoriales completos 2n o 4 6.0 23 7:3
f r a c c i o n a d o s ( 2n-p) , P l a c k e t -
5 5.6 17 9:1
Burman, Simplex, Cuadrados
6 5.6 23 9:1
Latinos, etc.).
7 6.0 17 9:1
8 6.0 23 9:1
COOH
COOH
CH3
CH3
Optimizando la separacin
Factor de retencin (factor de capacidad)
k es una medida de la fuerza de interaccin que tiene un
compuesto sobre el sistema cromatogrfico. Se expresa como el
tiempo de residencia de un compuesto en la fase estacionaria en
comparacin con la fase mvil.
El valor k, al igual que , es independiente de las condiciones
instrumentales (dimensiones de la columna, flujo, etc.) por lo que
se puede modificar solo con la qumica de la columna.
Optimizando la separacin
Resolucin
La resolucin solo depende de tres factores:
La fuerza de interaccin entre los compuestos de inters y la
fase estacionaria (k)
La capacidad del sistema cromatogrfico para separar los
componentes de inters ()
El ancho de los picos de inters (N)
Optimizando la separacin
Resolucin
En consecuencia para mejorar la resolucin hay 3
posibilidades:
Aumentando la interaccin (k)
Un cambio en la qumica de la columna()
Un aumento en la eficiencia de la separacin (N)
Optimizando la separacin
Sistema Preliminar
240
mAU
200
150
100
50
min
-20
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
Optimizando la separacin
Posibilidad 1. Disminuir el flujo
240
mAU
200
150
100
50
min
-20
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
Optimizando la separacin
Posibilidad 2. Mejorar la forma del pico
240
mAU
200
150
100
50
min
-20
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
Optimizando la separacin
Posibilidad 2. Mejorar la forma del pico
200
150
100
50
min
-20
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
Optimizando la separacin
Posibilidad 3. Aumentar la interaccin
200
150
100
50
min
-20
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0
Optimizando la separacin
Posibilidad 4. Aumentar la interaccin con aditivos
Cambio de pH
Uso de reactivos de apareamiento inico
Utilizar aminas para evitar el ensanchamiento de los picos
Optimizando la separacin
En que secuencia se deben optimizar los parmetros
para la separacin?
Informacin de la muestra
Optimizacin de k (2-8)
Baja resolucin
Cambiar
Baja resolucin
Optimizacin de N
Buena separacin
Reporte de
Desarrollo
Analtico
DE HPLC a U-HPLC
Los fundamentos
de U-HPLC
residen en la
curva de Van
Deemter.
Al existir picos ms finos y delgados en UHPLC, se
pueden de conducir ms separacin y tener mezclas
de analitos con 10 a 30 picos.
UHPLC
Ajusta el volumen de inyeccin:
Paso 4. Ajusta el flujo:
http://www.sigmaaldrich.com/analytical-
chromatography/hplc/method-transfer-
calculator.html#gradient
Calculadora de Transferencias de Mtodos
HPLC.
http://www.hplctransfer.com/GradientMethod.aspx
Calculadora de Transferencias de Mtodos
HPLC.
http://www.hplctransfer.com/
GradientMethod.aspx
Calculadora de Transferencias de Mtodos
HPLC.
http://www.hplctransfer.com/
IsocraticMethod.aspx
ADECUABILIDAD DEL
SISTEMA Y PRE-
VALIDACIN
Conforme el mtodo analtico ha madurado, se deben evaluar ciertas caractersticas del
mismo a manera de Validacin temprana.
Especificidad/
Selectividad preliminar,
para asegurar que no hay
interferencias con los
analitos de inters.
1.Diluente
2.Solucin estndar
3.S olucin muestra de producto
terminado recin fabricado.
4.S olucin muestra de producto
terminado estresada.
5.Solucin de sustancias relacionadas
disponibles.
6.Solucin de placebo (si se cuenta)
CRITERIOS DE
ACEPTACIN
RESULTADOS
ESPECIFICIDAD
(PUREZA DE UN PICO).
Tipo de Mtodo
Cuantificacin de Lmite de Valoracin / Otros
Caracterstica Identificacin
Impureza Impurezas Potencia Especficos
Exactitud - + - + +
Repetibilidad - + - + +
Precisin - + (1) - + (1) +(1)
Intermedia
Linealidad - + - + +
Rango - + - + +
- Significa que la caracterstica normalmente NO se evala.
- Significa que la caracterstica es normalmente evaluada.
(1) Tambin puede ser considerada como la reproducibilidad.
(2) La falta de especificidad puede ser compensado al aplicar otro mtodo de soporte.
(3) Puede ser necesario en algunos casos.
(4) Puede no ser necesario dependiendo del objetivo del mtodo.
RAZONES POR LAS QUE SE HACE LA ESPECIFICIDAD.
% Identidad.
& Para asegurar la identidad del analito.
% Pureza y Valoracin.
& Para asegurar la declaracin de la cantidad exacta de un
analito (sustancias relacionadas, produ, metales pesados,
disolventes residuales), etc.
% Anlisis cualitativos.
& Debe tener la capacidad de distinguir compuestos
estructuralmente relacionados (productos de degradacin).
La especificidad: Sobrelapar el cromatograma de la
solucin de impurezas con la solucin muestra.
Analito
Impurezas
Muestra
Solucin de referencia
de impurezas
Las muestra para especificidad incluyen:
) Diluente (blanco)
!
CRITERIOS DE ACEPTACIN:
0.100
0.090
0.080
D
0.070
0.060 C
0.050
0.040
0.030
B
0.020
0.010 A
0.000
-0.010
0.00 1.10 2.20 3.30 4.40 5.50 6.60 7.70 8.80 9.90 11.00 12.10 13.20 14.30 15.40 16.50 17.60 18.70 19.80 20.90 22.00 23.10 24.20 25.30
Minutes
A = Placebo Total
B = Placebo cargado Fenil
C = Placebo cargado Fenil + Dextro
D = Placebo cargado Fenil + CTM
Fenilefrina - 19.052
0.0240
Producto de Producto de Fenilefrina
0.0228
Degradacin Degradacin
0.0216
FEN (1) Producto de FEN (8)
0.0204 Producto de Degradacin
0.0192 Degradacin
0.0180
FEN (6) Producto de
FEN (4) Degradacin
0.0168
Producto de Producto de FEN (9)
0.0156
Producto de Degradacin
0.0144 Degradacin Degradacin
0.0132 FEN (3) FEN (7)
0.0120 FEN (5) D
0.0108
C
AU
0.0096
0.0084
0.0072
0.0060
B
0.0048
0.0036 A
0.0024
0.0012
0.0000
-0.0012
-0.0024
-0.0036
0.97 1.94 2.91 3.88 4.85 5.82 6.79 7.76 8.73 9.70 10.67 11.64 12.61 13.58 14.55 15.52 16.49 17.46 18.43 19.40 20.37 21.34 22.31 23.28 24.25
Minutes
A = Hidrlisis cida
B = Hidrlisis bsica
C = Oxidacin
D = Degradacin Trmica
Los Estudios de Estabilidad de Prueba, tambin conocidos como
Estudios de Estrs Acelerado, NO son reconocidos como Estudios de
Estabilidad Formal para el integrar el Registro del Medicamento.
Su principal funcin es:
Si el FRR esta
fuera del 0.8 a
1.2, se deber
incluir un
factor de
correccin en
los clculos
finales.
Factor de Respuesta Relativo.
50000"
40000"
y"="105773x"'"2263.8"
R"="0.99384"
30000"
20000"
AS"
10000" AAS"
Lineal"(AS)"
0" Lineal"(AAS)"
0" 0.1" 0.2" 0.3" 0.4" 0.5" 0.6"
EL DESARROLLO DE MTODOS
ANALTICOS CONTRIBUYE A LOGRAR
ESTE OBJETIVO.
GRACIAS
PREGUNTAS?