Agrupamiento Accesiones Quinua UNALM
Agrupamiento Accesiones Quinua UNALM
Agrupamiento Accesiones Quinua UNALM
FACULTAD DE CIENCIAS
PRESENTADO POR:
Lima – Perú
2015
Dedicatoria
A mi madre Norma, por cuidarme y apoyarme en todos los momentos que pase para la
elaboración de esta tesis, gracias por todo el esfuerzo, paciencia y buen humor, gracias por
tu labor de madre incondicional y como amiga también, mucho de lo que soy te lo debo a ti.
A mi hermana Gissel, que forma una parte importante de mi vida. A mis abuelos Jesús,
Lucrecia, Dante y Bertha, cuyos ejemplos de vida siempre han sido un ejemplo a seguir.
A mis asesores Dr. Jorge Jiménez Dávalos y Dr. César López Bonilla por la amistad brindad
y sabios consejos para le elaboración de este trabajo.
A la Blga. Eliana Iglesias por sus enseñanzas, consejos y ayuda desde el inicio hasta el final.
Gracias por la enorme amistad y fe depositada.
A todo el personal del Programa de Cereales y Granos Nativos, por haberme tratado como
un colega más y hacer mi estancia muy grata.
A mis amigos de la universidad, Analiz Rueda, Jessica Tolentino, Mitsuyo García, Karen
Rojas y Miguel Llapapasca, por los gratos momentos que pasamos en nuestra etapa de pre
grado y por la buena amistad que seguimos conservando.
Y por último pero no al final a Dios, solo nosotros sabemos por lo que hemos pasado y por
ello te lo agradezco.
ÍNDICE GENERAL
ABREVIATURAS ............................................................................................................................ ii
RESUMEN ....................................................................................................................................... iv
I. INTRODUCCIÓN.................................................................................................................1
II. OBJETIVOS ..........................................................................................................................2
III. REVISIÓN DE LITERATURA ...........................................................................................3
2.1. Origen e historia del cultivo de la quinua ...................................................................... 3
2.2. Distribución del cultivo .................................................................................................... 5
2.3. Producción y usos económicos del cultivo ...................................................................... 7
2.4. Descripción botánica ........................................................................................................ 9
2.4.1. Hojas ........................................................................................................................ 10
2.4.2. Tallo ......................................................................................................................... 10
2.4.3. Raíz .......................................................................................................................... 11
2.4.4. Flores ....................................................................................................................... 11
2.4.5. Inflorescencia .......................................................................................................... 11
2.4.6. Semilla ..................................................................................................................... 12
2.5. Tipo de reproducción ..................................................................................................... 13
2.6. Clasificación taxonómica ............................................................................................... 14
2.7. Genoma y Citotaxonomía .............................................................................................. 15
2.8. Diversidad genética silvestre y variedades comerciales de la quinua ........................ 17
2.9. Conservación de la diversidad genética de la quinua ................................................. 21
2.10. Genética de la quinua ................................................................................................. 23
2.11. Mejoramiento y herencia de caracteres de la quinua ............................................. 24
2.12. Definición de Marcadores moleculares en el estudio de la diversidad genética ... 26
2.13. Ventajas de los marcadores moleculares sobre los marcadores morfológicos ...... 28
2.14. Antecedentes de aplicaciones de marcadores moleculares en quinua ................... 29
2.15. Marcadores moleculares: SSR (simple sequence repeats) ...................................... 30
2.16. Origen de los SSRs ..................................................................................................... 31
2.17. Ventajas y desventajas de los SSRs........................................................................... 32
2.18. Usos y aplicaciones de los SSR .................................................................................. 34
2.19. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)............................................................ 37
IV. MATERIALES Y MÉTODOS ...........................................................................................39
3.1. Lugar de ejecución ......................................................................................................... 39
3.2. Material Vegetal ............................................................................................................. 39
3.3. Instrumentos de colecta de datos .................................................................................. 40
3.3.1. Enzimas ................................................................................................................... 40
3.3.2. Reactivos ................................................................................................................. 40
3.3.3. Equipos .................................................................................................................... 41
3.3.4. Materiales de Vidrio y otros .................................................................................. 42
3.4. Metodología .................................................................................................................... 42
3.4.1. Germinación de las semillas .................................................................................. 42
3.4.2. Colección de material vegetal ................................................................................ 42
3.4.3. Molienda de las muestras secas. ............................................................................ 42
3.4.4. Extracción del ADN ............................................................................................... 42
3.5. Evaluación de la calidad y cantidad de ADN ............................................................... 43
3.6. Dilución del ADN............................................................................................................ 44
3.7. Elaboración de los Bulks................................................................................................ 45
3.8. Amplificación por PCR .................................................................................................. 45
3.9. Iniciadores SSR utilizados ............................................................................................. 45
3.10. Preparación del mix de amplificación ...................................................................... 45
3.11. Programa de PCR ...................................................................................................... 46
3.12. Preparación de geles de poliacrilamida .................................................................... 46
3.13. Revelado de geles de poliacrilamida ......................................................................... 47
3.14. Evaluación de bandas................................................................................................. 48
3.15. Análisis de datos ......................................................................................................... 48
3.15.1. Índice de contenido polimórfico (PIC) ................................................................. 48
3.15.2. Construcción de una matriz básica de datos (MBD) ........................................... 49
3.15.3. Estimación de la similitud taxonómica ................................................................. 49
3.15.4. Coeficiente de asociación ....................................................................................... 49
3.15.5. Matriz de similitud ................................................................................................. 49
3.15.6. Análisis de grupos................................................................................................... 52
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES ....................................................................................53
4.1. Análisis del índice de contenido polimórfico (PIC) ..................................................... 53
4.2. Análisis de agrupamiento .............................................................................................. 55
VI. CONCLUSIONES ...............................................................................................................61
VII. RECOMENDACIONES .....................................................................................................63
VIII. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................64
IX. ANEXOS. .............................................................................................................................74
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Características de las semillas de quinua...................................................................... 12
Tabla 2. Principales variedades comerciales de Perú, Bolivia, Ecuador, Colombia y Chile...... 20
Tabla 3. Genes y herencia de algunos caracteres de la quinua..................................................... 25
Tabla 4. Ejemplos aplicativos de los SSR en algunas especies vegetales................................... 35
Tabla 5. Datos pasaporte de las 16 accesiones de quinua. ......................................................... 39
Tabla 6. Índice de contenido polimórfico (PIC), según Mason et al. 2005................................ 53
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Patrones de bandas obtenidos por los primers QAAT76 y QATG86............ 54
Figura 2. Dendrograma de las 16 accesiones de quinua analizadas, mostrando los
grupos formados............................................................................................................. 56
ÍNDICE DE ANEXOS
7.1. Reactivos para la extracción de ADN. .......................................................................... 74
7.2. Reactivos para la preparación de geles de Agarosa .................................................... 74
7.3. Reactivos para la preparación de geles de Poliacrilamida ......................................... 75
7.4. Datos pasaporte de las 16 accesiones de quinua. ......................................................... 76
7.5. Descripción de los microsatélites en quinua................................................................. 77
7.6. Número total de alelos presentes para los 9 locus analizados y número total de alelos
por zona de colecta. .................................................................................................................... 78
ABREVIATURAS
ADN Ácido desoxiribonucleico
AFLP Amplified fragment length polymorphism (polimorfismo en la longitud de los
fragmentos amplificados)
CIP Centro internacional de la Papa
c.s.p. Cantidad suficiente para
CTAB Bromuro de cetil-trimetil-amonio
dNTP Desoxirribonucleotido
DICE Dissimilarity coeffícients (Coeficiente de Disimilaridad- Nei-Li)
EDTA Etilen diamine tetra-acetíc acid (ácido etilén-diamino-tetra acético)
INIEA Instituto Nacional de Investigación y Extensión Agraria
mg microgramo
ml mililitro
μl microlitro
μM micromolar
mM milimolar
ng nanogramos
NTSYS Numerieal taxonomic system (Sistema de taxonomía numérica)
pb pares de bases
PCR Polymerase chain reaction (reacción en cadena de la polimerasa)
PVP Poli vinil pirrolidona
RAPD Random amplified polymorphism DNA (polimorfismo en el ADN
amplificado aleatoriamente)
RFLP Restriction fragment length polymorphism (polimorfismo en la longitud de
los fragmentos de restricción)
SSR Simple sequence repeats (secuencias simples repetidas)
TE Tris-EDTA
TBE Tris-Borato-EDTA
TEMED N. N. N'. NT-Tetra-metil etilen di-amina
ii
UPGMA Unweighted pair-group method using arithmetic averages (método de
agrupamiento por medias aritméticas no ponderadas)
iii
RESUMEN
El valor nutricional de la quinua en comparación con otros cereales hace de este antiguo
cultivo andino uno de los más importantes especímenes para la seguridad alimenticia.
Actualmente, mucho países como, Bolivia, Chile, Estados Unidos, Canadá, Inglaterra,
Francia, Rusia, Namibia, entre otros, han empezado a tomar mayor interés en este cultivo
usándolo tanto para consumo humano o como forraje animal.
La quinua posee una amplia diversidad, especialmente en la zona alto andina siendo Perú y
Bolivia quienes presentan mayor diversidad de variedades en los alrededores del Lago
Titicaca, llegándose a encontrar diferencias en hojas, altura de la planta, contenido de
saponinas, calidad de grano, colores y tipos de panoja. Así mismo, la quinua presenta una
amplia adaptación a diferentes zonas agroecológicas, reportándose la existencia de genotipos
tolerantes a las sequias, heladas y salinidad, sin disminuir en mucho su calidad nutricional o
rendimiento. Estas importantes características de la quinua han impulsado la investigación y
caracterización genética que contribuirá al desarrollo de variedades mejoradas.
Los SSR son marcadores moleculares altamente polimórficos útiles para la identificación de
variaciones intragenotípica e intergenotípica. Sin embargo, este tipo de marcadores son
específicos para una determinada especie y su elaboración es muy laboriosa y costosa,
debido a que deben identificarse y secuenciarse regiones genómicas concretas.
iv
Los datos moleculares agruparon las accesiones en seis grupos a un coeficiente de similitud
de 0.70, el grupo 1 estuvo conformado por 4 accesiones (Arequipa 2, Puno 1, Puno 2 y Puno
3); el grupo 2 conformado por 7 accesiones (Cajamarca 1, Cajamarca 2, Cuzco 2, Cuzco 3,
Puno 4, Puno 5, Puno 6); el grupo 3 formado por 2 accesiones (Ancash 1 y Ancash 2); el
grupo 4, 5 y 6 lo representan las accesiones Cuzco 4, Cajamarca 3 y Arequipa 1
respectivamente. El árbol dendrológico mostro accesiones con gran grado de similitud como
las accesiones Puno 1 y 2, mientras que las accesiones Cajamarca 3 y Arequipa 1 mostraron
un grado de similitud de 0.54 siendo el más bajo registrado.
v
I. INTRODUCCIÓN
Estudios previos muestran que el Perú posee, junto con Bolivia, la mayor diversidad genética
en variedades nativas de quinua (Gandarillas, 1974). A pesar de que su cultivo ha ido
menguando desde su apogeo en el imperio Incaico, actualmente se están haciendo trabajos
para prevenir la erosión genética de esta especie en ambos países. Esto gracias al surgimiento
de un nuevo y creciente mercado internacional y a un renovado interés por incrementar la
producción de ésta especie importante para la seguridad alimentaria de la Región Andina
(Kole, 2007).
Sin embargo, para llevar a cabo programas de seguridad alimenticia con esta especie es
necesario realizar más estudios, para incrementar el conocimiento de su enorme potencial
productivo y nutritivo; pero no solo centrado en las propiedades de su composición química,
nutricional y funcional. La biotecnología, permite acrecentar la eficiencia en el conocimiento
de las especies. El uso de los marcadores moleculares da la posibilidad de conocer
genéticamente las poblaciones que permitan mejorar la eficiencia en los programas de
mejoramiento. Los microsatélites son marcadores moleculares eficientes por las ventajas que
ofrece para la identificación y determinación de los genotipos.
1
II. OBJETIVOS
General
. Determinar si las accesiones en estudio se agrupan de acuerdo a su origen geográfico.
Específicos
. Analizar la variabilidad alélica entre 16 accesiones de quinua en estudio.
. Identificar las accesiones similares.
2
III. REVISIÓN DE LITERATURA
La zona andina comprende uno de los ocho mayores centros de domesticación de plantas
cultivadas del mundo, dando origen a uno de los sistemas agrícolas más sostenibles y con
mayor diversidad genética en el mundo. La quinua, una planta andina, muestra la mayor
distribución de formas, diversidad de genotipos y de progenitores silvestres, en los
alrededores del lago Titicaca de Perú y Bolivia, encontrándose la mayor diversidad entre
Potosí - Bolivia y Sicuani (Cusco) – Perú. Existen pocas evidencias arqueológicas,
lingüísticas, etnográficas e históricas sobre la quinua. Sin embargo, existen evidencias claras
de la distribución de los parientes silvestres, botánicas y citogenéticas, lo que posiblemente
demuestra que su domesticación tomó mucho tiempo, hasta conseguir la planta domesticada
y cultivada a partir de la silvestre, proceso que probablemente se inició como planta usada
principalmente por sus hojas en la alimentación y luego por las semillas. Actualmente, las
especies y parientes silvestres se utilizan localmente como jataco o llipcha (verdura de hoja)
en muchas comunidades del área andina. Posteriormente, la especie fue adaptada a diferentes
condiciones agroclimáticas, edáficas y culturales, haciendo que la planta presente una amplia
adaptación desde el nivel del mar hasta los 4000 msnm y usos diversos en las diferentes
comunidades étnicas de acuerdo a sus necesidades alimentarias.
La quinua fue cultivada y utilizada por las civilizaciones prehispánicas, y reemplazada por
los cereales a la llegada de los españoles, a pesar de constituir un alimento básico de la
población de ese entonces.
En el pasado ha tenido una amplia distribución geográfica, que abarcó en Sudamérica, desde
Nariño en Colombia hasta Tucumán en la Argentina y las Islas de Chiloé en Chile, también
fue cultivada por las culturas precolombinas, Aztecas y Mayas en los valles de México,
denominándola Huauzontle, pero usándola únicamente como verdura de inflorescencia. Este
caso puede explicarse como una migración antigua de quinua, por tener caracteres similares
3
de grano, ser conespecíficos, además por haberse obtenido descendencia al realizarse
cruzamiento entre ellos (Heiser y Nelson; 1974). La quinua en la actualidad tiene
distribución mundial: en América, desde Norteamérica y Canadá, hasta Chiloé en Chile; en
Europa, Asia y el Africa, obteniendo resultados aceptables en cuanto a producción y
adaptación.
Wilson (1976), considera que la quinua se habría originado en el hemisferio norte (México
y Estados Unidos), en base a estudios de los Chenopodium cultivados, concluyendo que Ch.
nuttalliae y Ch.quinoa, son conespecíficos distintos, pero conespecíficos con sus formas
silvestres acompañantes, sugiriendo cambios en la nomenclatura existente, como son incluir
dentro de Ch. quinoa ssp. milleanum las diferentes subespecies de Ch. hircinum y a la especie
mexicana cultivada reducirla como una subespecie de Ch. berlandierii, del mismo modo
sugiere que la quinua se habría derivado directamente de algún tipo silvestre en los Andes.
También, Wilson y Heiser (1979), manifiestan que Ch. quinoa habría evolucionado
independientemente en sudamérica sin influencia de las especie del Norte, siendo los
posibles progenitores Ch. hircinum de tierras bajas o una especie silvestre extinguida de los
Andes, que pudo haber sido desplazada o asimilada por el acompañante silvestre.
El origen de Ch. quinoa aún es complejo, especialmente por que están involucradas muchas
posibilidades. Se sugiere la participación de dos especies diploides en el origen de Ch.
quinoa, por lo que la quinua sería un anfidiploide con herencia disómica, siendo el pariente
silvestre más cercano de Ch. quinoa, Ch. hircinum y de Ch. nuttalliae el silvestre Ch.
berlandieri respectivamente.
Desde el punto de vista de su variabilidad genética puede considerarse como una especie
oligocéntrica, con centro de origen de amplia distribución y diversificación múltiple, siendo
la región andina y dentro de ella, las orillas del Lago Titicaca, las que muestran mayor
diversidad y variación genética.
4
domesticación de la quinua ocurrió hace 5000 años antes de Cristo (Uhle, 1919). Existen
también hallazgos arqueológicos de quinua en tumbas de Tarapacá, Calama, Arica y
diferentes regiones del Perú, consistentes en semillas e inflorescencias, encontrándose
abundante cantidad de semillas en sepulturas indígenas de los Tiltil y Quillagua (Chile).
Posteriormente, Cieza de León (1560), indica que la quinua se cultivaba en las tierras altas
de Pasto y Quito, mencionando que en esas tierras frías se siembra poco maíz y abundante
quinua. También Patiño (1964), menciona que en sus revisiones sobre La Paz, se habla de la
quinua como una planta que servía de alimento a los indígenas (Jimenes de la Espada, 1885,
II, 68) y finalmente Humboldt, al visitar Colombia indica que la quinua siempre ha
acompañado y seguido a los habitantes de Cundinamarca.
La distribución del cultivo, se inicia con las culturas preincas y su expansión se consolida
con el imperio incaico, extendiéndose desde Pasto-Colombia hasta el río Maule en Chile y
Catamarca en Argentina, aunque su uso como verdura, estuvo extendido en toda la zona
andina muy anteriormente; en Colombia, es cultivada, usada y difundida por los Chibchas,
5
denominandola Suba o Pasca y extendiendo su cultivo a toda la sabana Bogotense; en el
Ecuador, su cultivo es generalizado en toda la sierra ecuatoriana, principalmente en los
departamentos y provincias de Carchi, Imbabura (Pablo del Lago, Otavalo), Pichincha,
Cotopaxi (Saquisili), Tungurahua, Chinborazo (Calpi), Guamote (Laguna de Colta) y el
Cañar; en el Perú se ha generalizado su cultivo, en las diferentes zonas agroclimáticas,
pudiendo distinguirse seis tipos de quinuas de acuerdo a su forma de cultivo, ubicación
geográfica y destino de la producción: altiplano, valles interandinos abrigados, zonas altas y
frías por encima de los 4000 msnm, zonas de las salinas, costa y en la ceja de selva, estas
últimas áreas no tradicionales para este cultivo. En el pasado no se podía observar cultivos
en costa ni en ceja de selva, su cultivo ahora está distribuido desde Piura (Huancabamba)
hasta Tacna (Torata).
En Bolivia, está distribuido tanto en el altiplano (norte, central y sur), valles interandinos y
en los salares existentes al sur, con características propias y peculiares de cultivo, uso y
transformación. En Chile su cultivo se ubica mayormente en la zona colindante con el
altiplano boliviano, zonas de Tarapacá, Antofagasta, Calama, San Pedro de Atacama y al sur
en Concepción y Valdivia, siendo en el pasado cultivado por las comunidades indígenas de
Araucanos y Mapuches, que distribuyeron su cultivo hasta las islas de Chiloé (Latitud sur
47’). En la Argentina su cultivo en el pasado llegó hasta Catamarca pero luego por razones
de mayor competitividad de los cereales se ha replegado a Córdoba y San Juan de Jujuy, sin
embargo aun su cultivo se mantiene en la zona de Tucumán, en forma aislada en pequeños
campos y asociada al maíz.
El cultivo de la quinua del área andina, se ha difundido a los demás países de sudamérica a
través de los programas de investigación y transferencia de tecnología cooperativa como
PROCISUR, PROCIANDINO, JUNAC, y la FAO y de ahí a Centro América, México,
Guatemala (inicialmente con fines de investigación y luego para la producción).
Posteriormente ha sido difundida a los Estados Unidos y Canadá, principalmente bajo forma
de cultivares del sur de Bolivia y Chile. Más recientemente, material genético del área andina
ha sido intercambiado y difundido entre investigadores del área andina, y luego fuera de ella
a través de los programas cooperativos entre países e instituciones de investigación.
Desde principios de los noventa la quinua es conocida y cultivada en Europa, Asia y África,
inicialmente por los programas de investigación en diversificación de cultivos de diferentes
6
universidades donde numerosos estudiantes sudamericanos han efectuado estudios de
posgrado, cuyos resultados han sido acogidos por investigadores europeos, empresas
interesadas en la distribución de productos vegetarianos y naturales (Jacobsen, 2000). Las
pruebas de los Estados Unidos y Europa en la producción de quinua han tenido buenos
resultados y han demostrado que la quinua tiene un buen potencial como grano y cultivo
alimenticio (Mujica et al., 2001; Casini, 2002; Jacobsen, 2003). Actualmente está difundida
en Inglaterra, Alemania, Dinamarca, España, Italia, Francia, Rusia, Portugal, Los Himalayas,
Sur Este de Asia, y Namibia (Bhargava et al, 2005).
En un esfuerzo para introducir la quinua al mercado global por su alto valor proteico, balance
adecuado de aminoácidos esenciales, alto contenido de lisina, minerales, vitaminas, facilidad
de producción sin uso de fertilizantes y de pesticidas, así como por la gran adaptación a
diferentes condiciones agroclimáticas, el Centro Internacional de la Papa (CIP) y la
Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO de sus
siglas en inglés Food and Agriculture Organization of the United Nations) unieron fuerzas
para la elaboración de un banco de germoplasma y caracterizar la diversidad genética de esta
especie (Shawn, 2005).
Los principales productores de este grano a nivel internacional son: Bolivia, Perú, Ecuador,
y Colombia. Bolivia con más de 47.534 ha cultivadas y alrededor de 30.412 ton cosechadas,
de las cuales un 49% es consumida por las familias productoras, 35% se venden en los
mercados locales y el resto para mercados externos, constituyéndose así como el primer
productor y exportador de quinua en el mundo, siendo productores exclusivos tanto el
altiplano central como el sur de Bolivia (Viñas, 2000).
7
La producción fuera de los principales productores de quinua sudamericanos tuvo partida en
los primeros años de la década del 80, donde se iniciaron algunas investigaciones en quinua,
en varios condados del estado de Colorado, EE.UU. con la finalidad de evaluar el
comportamiento orgánico, seleccionando variedades de alto rendimiento, grano grande, bajo
contenido de saponina e identificar algunos problemas relativos a plagas con colecciones
procedentes del Perú, Bolivia, y Chile.
En cuanto a los usos económicos de la quinua, ésta al ser altamente nutritiva, es utilizada
para hacer harina, sopa, hojuelas para el desayuno y alcohol. Se comercializa, ya sea como
grano entero que se cocina como el arroz o en platos combinados. Puede ser fermentada para
hacer cerveza, o utilizase para alimentar al ganado (Galwey, 1989). Toda la planta también
se utiliza como forraje verde para alimentar ganado vacuno, porcino y aves de corral. En
Perú y Bolivia, hojuelas de quinua, tortillas, crepes y granos inflados se producen
comercialmente (Popenoe et al., 1989). El uso de la quinua con fines medicinales se ha
reportado raramente (Mujica. 1994). Sin embargo esta especie se emplearía contra
inflamaciones, como analgésico y como un desinfectante de las vías urinarias. También
puede ser utilizada en las fracturas y hemorragias internas y como repelente de insectos
(Mujica, 1994). Estos informes se pueden abrir nuevas vías para su uso como un cultivo
8
medicinal.
La quinua está siendo considerada como un cultivo potencial por la NASA como control del
sistema ecológico de soporte de vida (CELSS de sus siglas en ingles Controlled Ecological
Life Support System), cuyo objetivo es utilizar las plantas para eliminar el dióxido de
carbono de la atmósfera y generar alimentos, oxígeno y agua para la tripulación de las
misiones espaciales de larga duración (Schlick y Bubenlieim, 1996).
La quinua, es una planta herbácea anual, dicotiledónea que usualmente alcanza una altura de
1 a 3 m. Tiene una amplia dispersión geográfica, presenta características peculiares en su
morfología, coloración y comportamiento en diferentes zonas agroecológicas donde se la
cultiva, fue utilizada como alimento desde tiempos inmemoriales, se calcula que su
domesticación ocurrió hace más de 7000 años antes de Cristo, presenta enorme variación y
plasticidad para adaptarse a diferentes condiciones ambientales, se cultiva desde el nivel del
mar hasta los 4000 msnm, aunque su mayor productividad se da entre los 2500 y 3800 msnm.
(Mujica y Jacobsen, 2006). Puede encontrarse desde zonas áridas, hasta zonas húmedas y
9
tropicales, desde zonas frías hasta templadas y cálidas; muy tolerante a los factores abióticos
adversos como son sequía, helada, salinidad de suelos y otros que afectan a las plantas
cultivadas (Kole, 2007).
Su período vegetativo varía desde los 90 hasta los 240 días, crece con precipitaciones desde
200 a 2600 mm anuales y temperatura media entre 5 y 14°C (Mujica y Jacobsen, 2006). Se
adapta a suelos ácidos de pH 4.5 hasta alcalinos con pH de 9.0, sus semillas germinan hasta
con 56 mmhos/cm de concentración salina, se adapta a diferentes tipos de suelos desde los
arenosos hasta los arcillosos, la coloración de la planta es también variable con los genotipos
y etapas fenológicas, desde el verde hasta el rojo, pasando por el púrpura oscuro, amarillento,
anaranjado, granate y demás gamas que se pueden diferenciar (Mujica, 1988).
2.4.1. Hojas
Son simples, enteras, esparcidas, glabras, pecioladas, sin estipulas, pinnatinervadas,
presentan oxalatos de calcio o vesículas granulosas en el envés a veces en el haz; las cuales
evitan la transpiración excesiva en caso de que se presentaran sequías. En la quinua, podemos
notar que la hoja esta formada por una lamina y un pecíolo, los pecíolos son largos
acanalados y finos, las hojas son polimorfas, las hojas inferiores son de forma romboidal o
de forma triangular y las hojas superiores son lanceoladas que se ubican cerca de las panojas.
Pueden tomar diferentes coloraciones, va del verde al rojo o púrpura (dependiendo de la
variedad). Según Gallardo, et al. 1996, el color de las hojas es variable dependiendo de los
genotipos, se han observado pigmentos rojos, púrpuras, amarillos, que están constituidos por
betalainas, tanto del tipo, betacianinas (rojo- violeta) y betaxantinas (amarillas).
2.4.2. Tallo
Es cilíndrico y herbáceo anual a la altura del cuello cerca a la raíz y de una forma angulosa
a la altura donde se insertan las ramas y hojas, estando dispuestas en las cuatro caras del
tallo, la altura es variable de acuerdo a las variedades y siempre terminan en una
inflorescencia; cuando la planta es joven tiene una médula blanca y cuando va madurando
10
se vuelve esponjosa, hueca sin fibra, sin embargo la corteza se lignifica, el color del tallo es
variable, puede ser púrpura como la Pasankalla, blanco cremoso (Blanca de Juli) y con las
axilas coloreadas como la blanca de Juli, en toda su longitud; colorada como la kancolla y
otros colores según el ecotipo de cada zona (el color varía de acuerdo a las fases fenológicas,
se pueden diferenciar bien los colores en la floración).
Cuando se tiene plantas monopodicas (de un solo tallo), se puede inducir cortando la yema
apical para tener plantas simpodicas (de varios tallos); esta técnica se debe realizar antes del
inicio de panojamiento.
2.4.3. Raíz
El tipo de raíz varía de acuerdo a las fases fenológicas. Empieza con raíz pivotante
terminando en raíz ramificado con una longitud de 25 a 30 cm., según el ecotipo, profundidad
del suelo y altura de la planta; la raíz se caracteriza por tener numerosas raíces secundarias
y terciarias.
2.4.4. Flores
En una misma inflorescencia pueden presentar flores hermafroditas (perfectas), femeninas y
androésteriles (imperfectas).
Las flores son pequeñas de 1 a 2 mm de diámetro como en todas las Quenopodiáceas, son
flores incompletas porque carecen de pétalos (Tapia et al, 1979). Hay un grupo intermedio
como la blanca de Juli, originaria de Puno, en el cual el grado de cruzamiento depende del
porcentaje de flores pístiladas.
2.4.5. Inflorescencia
Es de tipo racimosa con frutos tipo Aquino que pueden ser de color rojo, purpura o verde
(Tapia et al, 1979). Por la disposición de las flores en el racimo se le denomina como una
panoja, por el habito de crecimiento algunas inflorescencias se difieren por que pueden ser
axilares y terminales.
11
En algunas variedades no se tiene una diferencia clara y pueden ser ramificadas teniendo una
forma cónica, el eje principal de la inflorescencia es de forma angulosa o piramidal y tiene
dos surcos, donde se ubican las flores. De acuerdo a la forma de panoja; se le considera
amarantiforme, cuando sus glomérulos están insertados en el eje secundario y glomérulada,
cuando los glomérulos están insertos en el eje primario o principal y toda la panoja tiene la
forma, de un solo glomérulo. De acuerdo a la densidad de panoja que se presentan estas son
considerados: compactas, semicompactas o semilaxas y laxas.
2.4.6. Semilla
Constituye el fruto maduro sin el perigonio, es de forma lenticular, elipsoidal, cónica o
esferoidal, presenta tres partes bien definidas que son: Episperma, embrión y perisperma. La
episperma, está constituida por cuatro capas: una externa de superficie rugosa, quebradiza,
la cual se desprende fácilmente al frotarla, en ella se ubica la saponina y cuya adherencia a
la semilla es variable con los genotipos. La segunda capa es muy delgada y lisa, se observa
sólo cuando la capa externa es translúcida; la tercera capa es de coloración amarillenta,
delgada y opaca y la cuarta capa, translúcida, está constituida por un solo estrato de células.
El embrión, está formado por dos cotiledones y la radícula, y constituye el 30% del volumen
total de la semilla el cual envuelve al perisperma como un anillo. En ella se encuentra la
mayor cantidad de proteína que alcanza del 35-40%, mientras que en el perisperma solo del
6.3 al 8.3 % de la proteína total del grano.
12
Tabla 1. Características de las semillas de quinua. (Continuación)
La quinua se reproduce por la vía sexual, es decir, mediante semilla botánica, aunque en
condiciones experimentales la propagación asexual no está descartada. En la reproducción
sexual los procesos de meiosis y la fecundación implicados conducen a la generación de la
variabilidad genética. Esta variabilidad es mayor en especies alógamas y menor en
autógamas, de todos modos la reproducción sexual constituye una fuente importante de
variación, la misma que es aprovechada en el mejoramiento genético de los cultivos.
13
autógama con fecundación cruzada frecuente (Gandarillas, 1979); por tanto, en el
mejoramiento genético de la quinua se han aplicado preferentemente los métodos
recomendados para autógamas y especialmente aquellas aplicados en el sorgo y arroz.
El grado de alogamia de las plantas depende de varios factores inherentes a la planta y al
medio ambiente. En el caso de la quinua, el grado de alogamia depende de las características
en la morfología floral, aspectos genéticos y la influencia del medio ambiente. Risi y Galwey
(1984), sostienen que el cruzamiento puede estar influenciado por la velocidad del viento, la
proporción de flores femeninas y flores androestériles y la autoincompatibilidad. A esto se
debe agregar la presencia de flores pistiladas y flores protóginas en una misma planta o en
distintas plantas de la misma variedad. A mayor frecuencia de estos tipos de flores o mayor
frecuencia de plantas con estos caracteres, mayor será el grado de polinización y fecundación
cruzadas. Otros factores que influyen son la temperatura y la presencia insectos. Las
temperaturas mayores a 30°C afectan negativamente sobre la factibilidad de la antesis
retardando o impidiendo este proceso como también reduciendo la viabilidad del polen; por
otra parte, temperaturas frías inducen a la androesterilidad temporal en algunos ecotipos y
variedades. En cambio, la intensidad y frecuencia de vientos actúan como agentes de
transporte del polen. Finalmente, la presencia de insectos del grupo de los trips que son muy
frecuentes en la fase de floración probablemente actúa como vectores de transporte de polen.
Lescano (1994), admite la posibilidad de que los pulgones verde (Aphis sp.) sean agentes
polinizadores. La influencia del viento y los insectos sobre la polinización cruzada depende
de la distancia de separación de las plantas o variedades.
La quinua es una planta de la familia Amarantaceae, de la que forma parte junto con la
cañihua (Chenopodium pallidicaule), la espinaca (Spinacea oleracea) y la remolacha (Beta
vulgaris) (Mujica y Jacobsen, 2006). El género Chenopodium es el principal dentro de la
14
familia Amarantaceae y tiene amplia distribución mundial, con cerca de 250 especies
(Giusti, 1970).
Dentro del género Chenopodium existen cuatro especies cultivadas como plantas
alimenticias: como productoras de grano, Ch. quinoa Willd. y Ch. pallidicaule Aellen, en
Sudamérica; como verdura Ch, nuttalliae Safford y Ch. ambrosioides L. en México; Ch.
carnoslolum y Ch. ambrosioides en Sudamérica; el número cromosómico básico del género
es nueve, siendo una planta alotetraploide con 36 cromosomas somáticos.
Este género también incluye especies silvestres de amplia distribución mundial: Ch. album,
Ch. hircinum, Ch. murale, Ch. graveolens, Ch. petiolare entre otros.
Reino : Plantae
División : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Orden : Caryophyllales
Familia : Amaranthaceae
Sub familia : Chenopodioideae
Género : Chenopodium
Sección : Chenopodia
Subsección : Cellulata
Especie : Chenopodium quinoa Willdenow.
La quinua al parecer es una especie alotetraploide con número cromosómico 2n=36, por lo
que la herencia de la mayoría de sus características cualitativas es disómica. Está constituido
por 4 genomios, con un número básico de 9 cromosomas (4n = 4 x 9 = 36). Su genoma
15
haploide consta de aproximadamente 967 millones de pares de bases siendo relativamente
pequeño en comparación con otras especies vegetales (Kole, 2007).
16
que también es tetraploide y éste a partir de especies diploides que podrían ser Ch.
carnosolum, Ch. pallidicaule o Ch. petiolare, ampliamente distribuidos en la zona andina,
en base a las características morfológicas, de adaptación y tolerancia a factores abióticos
adversos, podríamos indicar que en el proceso de formación de Ch. quinoa hayan participado
activamente grupos de genes de Ch. carnosolum por ello la quinua tiene una alta tolerancia
al exceso de sales, puesto que Ch. carnosolum crece en zonas de amplia concentración salina
y humedad, la resistencia al frío lo habría obtenido de Ch. pallidicaule que crece en las
grandes altitudes del altiplano peruano-boliviano, soportando bajas temperaturas durante su
ciclo de vida y que la morfología de la quinua vendría de Ch. petiolare por su gran parecido
y porque cruzamientos efectuados entre Ch. petiolare y Ch. hircinum producen descendencia
fértil, obteniendo de este modo un alotetraploide, incluso con producción de semillas de
tamaños grandes y de color blanco (Gandarillas, 1984) .
Por ello el pariente más cercano de la quinua cultivada seria Ch. hircinum (tetraploide), el
escape del cultivo sería Ch. quinoa var. melanospermun (tertraploide), llamado comunmente
aspha quinua y que los progenitores ancestrales serian Ch. carnosolum, Ch. pallidicaule y
Ch. petiolare todos ellos diploides.
En los últimos años detallados estudios cariotípicos se han realizado en muchos taxones
silvestres y cultivadas de Chenopodium spp. (Bhargava et al., 2003). El índice de simetría
(TF%) de la quinua varía desde 43,9 hasta 47,4%. y sólo un simple par satélite se ha
observado en todas las accesiones de quinua estudiadas, lo cual ha sido corroborado por
estudios de hibridación fluorescentes in situ (Kolano et al., 2001). Según los estudios
realizados por Bhargava et al. en el 2006, se muestran una gran similitud cariotípica entre
Ch. quinoa y Ch. berlandieri subsp. Nuttaltiae; que es evidente a partir de las fórmulas
cariotípica, índice de simetría y un par de satélite de morfología similar (Bhargava et al.,
2003).
17
genética in situ, manejo altitudinal y uso racional de la diversidad (Ichuta y Artiaga, 1986).
También podemos encontrar a los parientes silvestres en forma aislada, ya sea en los bordes
de las chacras o lugares considerados sagrados, como los Gentil Wasi o Phiru. Sin embargo,
debido al avance tecnológico e introducción de nuevas variedades, las aynokas están en
proceso de erosión y pérdida, porque el desarrollo actual es avasallador y drástico,
provocando su desintegración y resquebrajamiento en la organización, aunada a la pérdida
de la cultura e identidad andina.
Chenopodium carnosulum Moq. Es una especie diploide con diez genotipos diferentes
en las características estudiadas. Se ha encontrado en algunos casos creciendo dentro de
los totorales, sumergida en el agua, con gran tolerancia al exceso de humedad y a la
salinidad (Mujica et al. 2000). Las hojas son utilizadas en la alimentación humana como
verdura, denominándose en el idioma nativo choq’a chiwa (verdura de los patos del
lago). Se nota una alta concentración salina en las hojas, incluso al ser probado en forma
cruda, debido a que acumula sales.
Chenopodium petiolare Kunth, con siete genotipos diferentes y es también una especie
diploide. Fue observada desde 3.830 hasta 3.900 m, mostrando gran variación fenotípica
y confundiéndose con la quinua cultivada, no solo por su apariencia y coloración de
planta, sino también por su forma muy erecta y con pocas ramificaciones. La planta
tierna se emplea para la alimentación del ganado y sus hojas tiernas como verdura para
alimentación humana. Los granos se usan en la alimentación para elaborar el quispiño
(panecillo de color oscuro elaborado de dicha harina) y también tiene uso medicinal,
principalmente para fracturas de huesos.
19
En cuanto a las variedades comerciales la tabla 2 presenta las variedades más representativas
de diferentes países andinos.
20
Tabla 2. Principales variedades comerciales de Perú, Bolivia, Ecuador, Colombia y Chile.
(Continuación)
País Nombre Tipo Color de grano Sabor
Tunkahuan
En Ecuador
Ingapirca
Baer Nivel del mar Castaño Semiamargo
Faro Nivel del mar Castaño/marrón Semiamargo
En Chile
Litu Nivel del mar Castaño Semiamargo
Pichaman Nivel del mar Castaño Semiamargo
Dulce de Quitopampa Valle Blanco Dulce
En Colombia
Nariño Valle Blanco Dulce
En Argentina Selección Jujuy Valle Cristalino Semidulce
Las colecciones más completas de germoplasma ex situ para Chenopodium son mantenidas
por el Royal Botanic Garden en Kew (Inglaterra), el USDA-ARS (Estados Unidos), el
National Bureau of Plant Genetic Resources (India), la Fundación para la Promoción e
Investigación de Productos Andinos (PROINPA, colección nacional de Bolivia), la
Universidad Nacional del Altiplano (UNAP, Perú), y el IPK-Gatersleben en Alemania. De
21
estos bancos, sólo el de USDA-ARS y el Royal Botanic Garden en Kew mantiene una gran
colección de Chenopodium silvestres del continente americano.
22
monitorear el progreso en la mantención de la biodiversidad. Proyectos similares han sido
desarrollados en la zona centro de México desde el año 2004, para la promoción activa de la
conservación in situ de razas nativas de C. berlandieri subsp. nuttaliae, muchas de las cuales
están al borde de la extinción (Perez-Agis et al. 2005).
23
2.11. Mejoramiento y herencia de caracteres de la quinua
El objetico principal del mejoramiento de la quinua es, desarrollar variedades con un alto
nivel de rendimiento y producción, alto contenido de proteína y bajo contenido de saponina.
Más no se centra en el mejoramiento de sus capacidades de resistencia a factores abióticos.
Esta falta de interés puede deberse a que estas características inherentes de la quinua son
muy amplias y fuertemente marcadas en casi todas las variedades existentes como las
describe el CIP (Jacobsen, 2000), en donde ésta puede crecer en agua de mar, en diferentes
zonas de vida y alturas o incluso bajo condiciones extremas de sequía y heladas.
Actualmente los esfuerzos de mejoramiento genéticos de esta especie se han realizado bajo
técnicas convencionales, es decir, mediante cruzamientos. Sin embargo, esta técnica es muy
complicada debido al alto porcentaje de auto-polinización y a que el tamaño de las flores de
quinua son muy pequeñas, lo que hace que la emasculación e hibridación sea un trabajo muy
tedioso (Bhargava et al., 2006). Pero, aun así con las existentes dificultades la selección de
masa e hibridación han sido practicados en la quinua durante años (Risi y Galwey, 1984).
24
que a mixtura como autógama (97.6 % de autopolinización), en ambos genotipos se observó
homostilia, siendo homógamas. Valdivia (1978), encontró una marcada variación sexual en
dos líneas según el color de la panoja, observando flores pistiladas, hermafroditas y
androestériles, la línea blanca presentó 99.13 % de autopolinización y la morada 98.66%,
considerando a ambas como autógamas.
Por otra parte, es de vital importancia considerar el uso de la biotecnología como una
herramienta capaz de acelerar el alcance de objetivos en los programas de mejoramiento
mediante el estudio de ADN y otras técnicas. Estudios que pueden ir desde la determinación
del nivel de diversidad en un proceso de selección, hasta el estudio de genes específicos que
controlan importantes características, tales como la resistencia a enfermedades, control
genético de la producción de saponinas en el grano, o la comprensión de características más
complejas como la tolerancia a la sequía o la salinidad (Fuentes et al., 2009).
Tipo G Glomerulado G
1 G 2 Dominante sobre g Simple
panoja g Amarantiforme gg
25
Tabla 3. Genes y herencia de algunos caracteres de la quinua. (Continuación)
No Cifra Número Tipo
Carácter de de de de Dominancia Heredabilidad Fenotipo planta Genotipo
genes genes alelos alelos
Contenido D Dulce D
1 D 2 Dominante sobre d Simple
saponina
d Amargo dd
Esterilidad M Fértil M
1 M 2 Dominante sobre m Simple
masculina
m Estéril mm
Carácter S Normal S
1 S 2 Dominante sobre s simple
chullpi
s chullpi ss
Axilas
Ax Ax
Color pigmentadas
1 Ax 2 Dominante sobre ax simple
axilar Axilas sin
ax ax ax
pigmentación
A Dominante sobre ac
Negro A-C
c
a acaccccc
Café
ac–cc
acc Dominante sobre acc Café claro acc acc cc
A 5 Amarillo
ar Dominante sobre ar A
Color Interactivo + C
2
grano complementario
a Recesivo ac
cc
C Dominante sobre cc Rojo Ar ar
cc Dominante sobre ccc Blanco aacc
C 4 ccc
c Recesivo
Los marcadores moleculares son una herramienta que tiene muchos campos en la biología
como genética evolutiva, ecología, biomedicina, ciencias forenses y estudios de diversidad.
Actualmente su importancia radica en localizar y aislar genes de interés.
Para Valadez y Kahl (2000) un marcador se refiere a cualquier molécula de proteína, ARN
o ADN de tamaño o peso molecular conocido que sirve para monitorear o calibrar la
separación de las mismas utilizando electroforesis o cromatografía, y un marcador genético
como cualquier gen cuya expresión permite un efecto fenotípico que puede ser detectado
fácilmente (por ejemplo, un gen que ocasiona resistencia para algún antibiótico).
26
Los marcadores del ADN se basan fundamentalmente en el análisis de las diferencias en
pequeñas secuencias del ADN entre individuos. Las técnicas empleadas para ello son muy
diversas y dan el nombre a los distintos tipos de marcadores, los cuales pueden ser de carácter
dominante o codominante (Karp y Edwards, 1998).
Existen dos clases de marcadores genéticos: los morfológicos y los moleculares (Tanksley,
1983). El uso de marcadores morfológicos en las plantas tiene muchas limitantes, estos
marcadores solo es posible evaluarlos a nivel de toda la planta y cuando esta llega a su estado
adulto, esto significa una espera, no deseable, de varios años. Además, pueden ocurrir
cambios epigenéticos que limitan el número de marcadores que pueden ser evaluados sin
equivocación en la población segregante (Powell, 1992; Phillips et al., 1995).
Además, los marcadores moleculares son herramientas importantes para la gestión de los
recursos genéticos en programas de mejoramiento. La evaluación de la diversidad genética
entre los genotipos se puede utilizar para: (i) identificar las identidades genéticas dentro de
las colecciones, (ii) desarrollar genéticamente diversas colecciones núcleo (un sub grupo
genéticamente representativa de la colección de reserva), (iii) monitorear los cambios
naturales y artificiales en las colecciones genéticas (por ejemplo, los contaminantes, las
hibridaciones o mezclas), y (iv) identificar las relaciones filogenéticas dentro de la colección
del germoplasma y las relaciona con especies de malezas (McGregor et al, 2002).
Según Ferreira y Grattapaglia (1998), las características que debe cumplir para ser un buen
marcador molecular deben ser: (i) altamente polimórfico y discriminante, permitiendo
diferenciar individuos aún muy cercanos genéticamente; (ii) multialélico para un solo locus;
27
(iii) codominate, permitiendo distinguir homocigotos de heterocigotos; (iv) no epistáticos,
sin interacciones de diferentes genes para una característica; (v) no epigenéticos, sin
interacción entre sus genes y el ambiente; (vi) distribución uniforme en todo el genoma, para
facilitar la evaluación del polimorfismo en muchos lugares del genoma; (vii) reproducible;
(viii) económico y manejable a gran escala.
En general los marcadores moleculares son neutros con relación a los efectos fenotípicos,
con efectos epistáticos o pleiotrópicos mínimos o nulos. Sin embargo, los morfológicos están
sujetos a estos efectos por lo que puede generar errores en la generación de mapas genéticos.
Otra ventaja de los marcadores moleculares sobre los morfológicos es que estos pueden
usarse en cualquier fase del desarrollo de la planta. Mientras que los morfológicos solamente
pueden usarse cuando la plata ha alcanzado el nivel de planta entera o adulta. Lo que implica
un tiempo de espera no deseado. Por lo que la identificación de genotipos en fases iniciales
de desarrollo de la planta, abre la posibilidad de acelerar el proceso de selección y
cruzamiento de los individuos para la generación de nuevas variedades. Casos de
mejoramiento genético en trigo han tomado un promedio de 20 años de espera para la
generación de nuevas variedades mejoradas. Es por estos que gracias a la eficiencia de los
marcadores moleculares se ha reducido este tiempo a un promedio de siete a diez años de
espera para le obtención de variedades mejoradas (Ferreira y Grattapaglia, 1998).
28
2.14. Antecedentes de aplicaciones de marcadores moleculares en quinua
Hasta la fecha, sólo algunos investigadores han reportado el desarrollo y uso de marcadores
moleculares en la quinua. Wilson (1988) empleó datos de aloenzimas para confirmar la
diferencia genética entre ecotipos de quinua altiplánicas y costeras. Fairbanks et al. (1990)
utilizaron la variación electroforética de las proteínas de semillas para la caracterización de
germoplasma de quinua. Ruas et al. (1999) utilizaron marcadores de polimorfismo de DNA
amplificado arbitrariamente (RAPD), para detectar polimorfismos entre varios cultivares de
C. quínoa y especies de malas hierbas relacionadas a Chenopodium en los altiplanos
bolivianos. En el estudio se caracterizó 19 accesiones de seis especies de quinua observando
altos niveles de polimorfismo en la especies estudiadas y bajos niveles en de variación
intraespecífica dentro de las accesiones. Además se mencionó que cuarto accesiones de la
especie C. ambrosioides tuvieron un grado de similitud de 0.75 el cual supone que son
nuevas colecciones que podrían ser introducidas al banco de germoplasma de Patacamaya
(Bolivia).
Maughan et al. (2004) desarrollaron el primer mapa de ligamiento genético para quinua
empleando 230 AFLP, 19 SSR y seis RFLP. Donde se obtuvo una extensión del mapa de
1,020 cM y se obtuvieron 35 grupos de ligamiento. El desarrollo de este mapa de ligamiento
genético es un importante paso para la caracterización genética y la iniciación de selección
asistida por marcadores (MAS) para las características agronómicas más importantes de la
quinua.
29
0.35, con el cual se pudo determinar los polimorfismos para la diferenciación de las
variedades en estudio. Por lo que se concluyó que esta combinación puede ser utilizada para
la creación de mapas de ligamiento debido a que es altamente informativo.
Los microsatélites, también llamados SSR (simple sequence repeats), son secuencias
repetidas en tándem de ADN que pueden ir desde un mínimo de 8 nucleótidos (nt) hasta por
encima de los 100 nt de longuitud (Litt y Luty, 1989). Los arreglos de las secuencias
repetidas contenidas en él pueden tener un tamaño de 2 a 6 nt; sin embargo, existe cierta
controversia ya que algunos los clasifican como SSR de 2-8 nt versus SSR de 1-5 nt repetidos
(Chambers y MacAvoy, 2000). Los tipos de repeticiones que ocurren en los SSR varían entre
las especies. Las repeticiones más frecuentes en las plantas son (AA)n y (AT)n (Lagercrantz
et al. 1993). Los SSR son altamente polimórficos, tanto intra como inter específicamente,
esto se debe a que poseen tasas de mutación entre 10-3 y 10-6 que se generan por
deslizamiento erróneo de la hebra de ADN durante la replicación (Malik et al., 2009;
Wiessenbach y Dib, 1992; Weber y Wong, 1993). Se encuentran dispersas a través de los
genomas de hongos, plantas y animales, los cuales pueden o no estar asociadas con genes,
son loci altamente mutables que pueden estar presentes en muchos sitios del genoma.
La elaboración de marcadores SSR es muy laboriosa y en este aspecto costoso, debido a que
deben identificarse y secuenciarse regiones genómicas concretas (bordes del microsatélite),
aunque una vez conseguido presenta un sistema muy informativo. Al respecto, Cervera et
al. (2002) mencionan que aunque los microsatélites permiten analizar sólo un locus por
experimento son bastante informativos ya que dejan diferenciar las variantes alélicas de los
loci analizados y por lo tanto identificar grupos de ligamiento entre diferentes mapas
genéticos. Sin embargo, para su desarrollo se precisa conocer la secuencia y, por lo tanto,
son menos numerosos que otros marcadores dominantes.
30
variaciones detectadas por los SSR son el resultado de cambios en el número de unidades
repetidas (Lowe et al. 2004).
Una técnica derivada de la anterior se conoce como “PCR iniciada con microsatélites
anclados (AMP-PCR)” la cual emplea iniciadores con “anclas” en sus extremos 3´ o 5´. Esta
clase de iniciadores consiste de una, dos o tres bases adicionales al microsatélite, por
ejemplo; C(CT)8, CA(CT)8, CAC(CT)8 o (CT)8C, (CT)8CA y (CT)8CAC, y sirven para
seleccionar aquellas islas de microsatélites en el genoma que están flanqueandos con el
complemento de bases específicas, por lo que se incrementa su especificidad (Valadez y
Kahl 2000). Generalmente esta técnica es más eficiente que las técnicas SSR o RAPDs, ya
que ha demostrado detectar más variabilidad genética (Salimath et al. 1996).
El uso de SSR ofrece una serie de ventajas sobre otro tipo de marcadores moleculares. Su
tamaño (<500pb) es adecuado para su amplificación mediante PCR y tanto su naturaleza
codominante como su herencia mendeliana permiten el análisis genético de poblaciones y
relaciones de parentesco. Además el uso de iniciadores (20-30pb) complementarios a
secuencias específicas que flanquean al microsatélite permiten que se amplifique un solo
locus y que su uso sea reproducible en diferentes laboratorios (Karp et al., 1998). Finalmente
una de las ventajas más atractivas es que una vez conocidas estas secuencias, se pueden
utilizar en especies cercanas, para esto es necesario modificar el programa de amplificación
para que esta sea menos restringida (Karp et al., 1998).
Las secuencias o matrices de SSR se cree que tienen un "ciclo de vida" que muestra un
equilibrio entre el crecimiento y la degradación que se extiende por cientos de millones de
años. La génesis de los SSR bien puede comenzar en las regiones inclasificables en el ADN
que no tienen tales repeticiones o tener pequeñas repeticiones simples representativas
(requisito mínimo de ocho nucleótidos repetitivos puede ser esencial), seguidos por
mutaciones (Morgante y Olivieri, 1993). Estos cortos "proto-SSR", entonces podrá ser
extendidos por acontecimientos de deslizamiento.
31
ADN en la transcripción o durante la reparación de roturas en la cadena doble. Esto puede
suceder, porque en la ausencia de otras secuencias de información, secuencias repetitivas
podrían ser adecuadas para rellenar los huecos. El relleno de espacios con secuencias
repetidas es potencial inherente para formar conformaciones alternativas de ADN o las
mutaciones pueden ser también importantes en la generación de SSRs (Trivedi, 2003).
Los microsatélites han tomado ventaja sobre otros marcadores genéticos como los AFLPs,
RAPDs, RFLPs, debido a que: i) tienen el más alto grado de polimorfismo, pudiendo revelar
entre 2 a 25 alelos; ii) se segregan de manera mendeliana y son codominantes, lo que permite
discriminar fácilmente los estados homocigotes de los heterocigotes, lo que permite
identificar heterocigotes en la F1 facilitando los análisis de flujo génico, hibridación y
paternidad. Además, incrementan la agudeza y eficiencia de las medidas genético-
poblacionales a comparación de los AFLP y RAPD que son marcadores dominantes; iii) la
presencia de un solo locus genético por microsatélite hace que la lectura de las bandas sea
clara y fácil de interpretar y iv) son selectivamente neutros (Golstein y Pollock, 1994;
Vendramin et al., 1996).
Una ventaja muy atractiva para análisis de diversidad es que los microsatélites son
específicos para ciertos grupos de especies y/o especies medianamente relacionadas
(Vendramin et al., 1996), lo que permite hacer estudios comparativos entre especies o
32
géneros de un mismo grupo. Por otra parte, se han realizado estimaciones de las tasas de
mutación de estas regiones y se ha llegado a la conclusión de que los microsatélite del ADN
nuclear tienen tasas de mutación de 1x 10-3 a 1x 10-6 (Wiessenbach et al., 1992; Weber y
Wong, 1993), más altas que las que se presentan en el ADN de cloroplasto las cuales según
Provan et al. (1999) son de 3.2-7.9 x 10-5. Conocer las tasas de mutación nos brinda una base
importante para realizar análisis robustos de la genealogía de las poblaciones que nos hablen
acerca de la historia evolutiva de las especies, ventaja muy importante sobre otros
marcadores genéticos.
Otra ventaja que presenta el uso de microsatélites con relación al uso de secuencias, es que
la mutación es homogénea, lo que posibilita identificar no solo las tasa de mutación sino
también, el tipo de mutación. En la mayoría de los SSR las mutaciones son de un paso (una
unidad repetitiva) siguiendo el modelo mutacional SSM de Ohta y Kimura (1973). Sin
embargo, Golstein et al. (1995) mencionan que las mutaciones de repeticiones formadas por
dinucleótidos o trinucleótidos son de dos pasos o incluso de múltiples pasos, lo que ha sido
confirmado por estudios en trinucleótidos. Por ejemplo, en el humano el microsatélite
formado por las repeticiones CAG −asociado con un desorden neurológico−, puede mutar
de pocos a cientos de alelos (Ashley y Warren 1995). Sin embargo este comportamiento
asimétrico del tamaño de las mutaciones de SSR ha sido raramente reportado.
Una de las desventajas de la variación de los SSRs en el ADN nuclear es que debe analizarse
con precaución, ya que estas variaciones pueden haberse generado por duplicaciones o por
la presencia de familias multigénicas (Rieseberg, 1991), que generan un alto grado de
homogeneidad dentro y entre especies, proceso conocido como evolución concertada. Estos
fenómenos pueden distorsionar la historia evolutiva de los organismos en estudio y
confundir las relaciones filogenéticas (Rieseberg, 1991). Es decir, se pueden presentar
aparentes reticulaciones o escenarios de hibridización introgresiva.
Otro problema inherente de los SSR es la redundancia esto se debe al origen informativo de
para la creación del iniciador. Generalmente las librerías genómicas pueden proporcionar
grandes niveles de redundancia mientras que las librerías génicas son mas acertadas y evitan
o reducen drásticamente las redundancias (Varshney et al., 2005). En cuanto al tipo de origen
informativo del SSR los genómicos son marcadores menos robustos y de baja calidad a
comparación de los génicos (Varshney et al., 2005). El diseño de los iniciadores SSR no es
33
una ciencia exacta generalmente se reporta un porcentaje de amplificación de entre 60 a
90%, esto se puede deber a: i) desplazamientos en el sitio de anclaje, ii) la presencia de
intrones en la secuencia genómica, iii) el uso de información cuestionable para el desarrollo
de los iniciadores y iv) que los iniciadores fueron derivados de quimeras de cADN clones.
Y finalmente otra desventaja es la presencia de alelos nulos que pueden ocurrir básicamente
por dos acciones i) por deleción del microsatélite en un locus específico y ii) por mutaciones
en el sitio de anclaje; complicando la interpretación de análisis de segregación por que se
hace imposible detectar la heterocigosis (Varshney et al., 2005).
Gracias a estos avances, los SSR son cada vez más utilizados como marcadores genéticos de
segmentos cromosómicos (Dib et al, 1996), para la identificación de individuos (Anon,
1996), estudios de evolución y relación ortóloga y paraloga (Rubinsztein et al, 1995; Azfer
et al, 1999; Ali et al, 1999), conservación de la vida silvestre (Roca et al, 2001), seguimiento
de la historia biológica de poblaciones (Bergstrom et al, 1999), para diferenciar
categóricamente los organismos de importancia comercial como el gusano de seda (Reddy
et al, 1999), incluso para desentrañar la dinámica del plegado y desplegado genómico
durante los ciclos celulares y en la regulación génica (Dokholyan et al, 2000). Los
polimorfismos que se pueden encontrar gracias a los SSR son de utilidad para los estudios
de patrones y tasas de mutación en poblaciones al azar y en la reconstrucción de la historia
evolutiva (Stallings, 1995).
34
En la aplicación de los SSR en el mapeo genético, los SSR desarrollados a partir de
bibliotecas genómicas pueden pertenecer tanto a regiones codificantes como a no
codificantes, y rara vez existe información disponible con respecto a sus funciones. Sin
embargo, los SSR génicos a menudo pueden representan genes potencialmente funcionales
o genes putativos. Una de las aplicaciones con mayor uso es la caracterización de la variación
genética en las poblaciones naturales y entre las líneas de cultivo, esto es crucial para la
conservación y la explotación de los recursos genéticos para los programas de mejoramiento
de cultivos. Los marcadores moleculares han demostrado ser útiles para la evaluación de la
variación genética en las colecciones de germoplasma. Sin embargo, tal vez la característica
más importante para la aplicación práctica es que los marcadores SSR génicos son
transferibles entre especies medianamente alejadas, mientras que los SSR genómicos no son
adecuados para este propósito. La transferibilidad de los marcadores de este tipo a las
especies o géneros afines se ha demostrado en varios estudios (Rajeev K. et al., 2005).
35
Tabla 4. Ejemplos aplicativos de los SSR en algunas especies vegetales. (Continuación)
Autor Especie Objetivo Técnicas Comentario/Resultado
El análisis con marcadores RAPDs y SSRs, así
Definir origen y como el uso de caracteres morfológicos y
Decker-
afinidad de los fisiológicos permitió entender mejor las
Walters Cucumis RAPD,
materiales relaciones en y entre las accesiones. Los datos
et al. melo SSR
silvestres en Norte sugieren que las poblaciones de Norte América
(2002)
América. son distintas, y pueden ser clasificadas como
una especie diferente.
Análisis de la
Ge et al. Determinaron las relaciones genéticas entre los
Musa spp. estructura SSR, RFLP
(2005) materiales.
poblacional.
Construcción de mapa con una longitud de
1.021cM. Distribuido en 12 grupos de
Gonzalo
Cucumis Construcción de ligamiento y una densidad de 3,11
et al. SSR, RFLP
melo L. mapa. cM/marcador. Los marcadores SSR cubren
(2005)
aproximadamente el 80% de la longitud total
del mapa.
Aislaron seis microsatélites marcadores de loci
con sus respectivos juegos de iniciadores. Los
Honsho Aislamiento y marcadores fueron capaces de discriminar la
Mangifera
et al. caracterización de SSR composición genética de la mayoría de los
indica
(2005) microsatélites genotipos en estudio. Los resultados sugieren el
potencial de la técnica para la identificación de
los cultivares de mango.
Valorar el uso de
la tecnología del
Polimorfismo de
Kaemmer Marcadores de
Idoneidad de los SSR para estudios de genética
et al. Musa spp. Secuencias SSR, PCR
en Musáceas.
(1997) Específicas
Vecinas a
Microsatélites
(STMS).
Análisis de la Se logró identificar las relaciones filogenéticos
Mhameed Persea
diversidad SSR, ADN entre los materiales en estudio. Se observó una
et al. americana
genética. fingerpring alta variación entre los cultivares de la especie
(1997) Mill.
Minisatélites, y entre diferentes especies del género Persea.
RFLP, Desarrollo parcial del mapa. De un total de 411
Construcción AFLP, loci, 391 se colocan en 12 grupos de ligamiento
Oliver et Cucumis
mapa de RAPD, y 21 segregaron independientemente. Un 66%
al. (2001) melo L.
ligamiento. SSR, de los marcadores fueron codominantes (RFLP,
Isoenzimas SSR e isoenzimas).
Parasnis
Carica Identificación del La prueba (GATA)4 mostró ser indicativa
et al. SSR
papaya sexo en plántulas. según el sexo.
(1999)
Desarrollo de mapa de ligamiento, más
Desarrollo e
detallado, basado en marcadores codominantes.
integración de
SSR, El nuevo mapa consta de 465 marcadores; 268
Pugh et Theobroma nuevos marcadores
RFLP, SSRs, 176 RFLPs, cinco isoenzimas y 16
al. (2004) cacao L. microsatélites a
Isoenzimas Rgenes-RFLP dispuestos en 10 grupos de
mapa de
ligamiento que corresponden al número
ligamiento.
haploide de cromosomas de la especie.
Risterucci Primer reporte y caracterización de 23 SSR
Psidium Caracterización de
et al. SSR genómicos en la especie. Se indican que son
guajava L. microsatélites
(2005) altamente polimórficas.
36
Tabla 4. Ejemplos aplicativos de los SSR en algunas especies vegetales. (Continuación)
Autor Especie Objetivo Técnicas Comentario/Resultado
Desarrollar
metodología
En la mayoría de los casos los SSR son más
alterna a las
eficientes que las isoenzimas en la
isoenzimas, para
identificación del origen sexual o no de los
discriminar entre
Ruiz et materiales. Además, los SSR detectaron un
Citrus spp. materiales SSR
al. (2000) mayor nivel de polimorfismo respecto del
desarrollados a
escaso número de enzimas polimórficas
partir de
detectadas mediante la técnica de isoenzimas
embriones
para algunas de las poblaciones estudiadas.
cigóticos de los
nucelares.
Determinar Identificación de materiales. No determinaron
Persea variación genética marcadores útiles, asociados a alelos únicos,
Schnell et
americana en y entre razas SSR para separar entre razas. La agrupación
al. (2003)
Mill. hortícolas de hortícola de las razas es congruente con la
aguacate. agrupación generada por los marcadores.
Detección de SSR,
Persea Encontraron que seis características se asocian
Sharon et probables loci de RAPD y
americana con al menos uno de los 90 marcadores
al. (1998) características ADN
Mill. evaluados.
cuantitativas. fingerprint
Análisis de la
Staub et Cucumis Desarrollo de dendrograma y análisis de las
diversidad SSR
al. (2000) melo L. relaciones filogenéticas entre los materiales.
genética.
Se determinaron 12 secuencias marcadoras
Viruel y Litchi Identificación de enriquecidas en repeticiones CT. Los
Hormaza chinensis secuencias SSR microsatélites desarrollados permitieron
(2004) Sonn. marcadoras. discriminar adecuadamente los materiales en
estudio.
Los resultados demuestran la utilidad de los
Identificación de
Viruel et Mangifera SSR en estudios de identificación, variabilidad,
genotipos de SSR
al. (2005) indica L. conservación y manejo de germoplasma y
mango.
domesticación.
Desarrollaron 397 iniciadores SSR en quinua,
de los cuales 208 fueron polimórficos,
Chenopodium Aislamiento y
Mason et presentando entre 2 y 13 alelos por locus. Los
quinoa caracterización de SSR
al. (2005) mismos fueron utilizados en especies
Willdenow. microsatélites
relacionadas donde 67% de estos amplificaron
satisfactoriamente.
Desarrollado el primer mapa de ligamiento
Maughan Chenopodium Desarrollo de AFLP, genético para quinua empleando 230 AFLP, 19
et al. quinoa mapa de RAPD, SSR y 6 RFLP. Donde se obtuvo una extensión
(2004) Willdenow. ligamiento. SSR del mapa de 1,020 cM y contiene 35 grupos de
ligamiento
37
10 a 30 pares de bases de longitud y complementarios a la secuencia nucleotídica de los
extremos del ADN blanco. Además de los iniciadores, otro elemento clave es la ADN
polimerasa, enzima que en condiciones determinadas y en presencia de los iniciadores, es
capaz de producir millones de copias de determinados fragmentos del ADN. Estos
fragmentos se separan posteriormente por peso molecular y conformación mediante técnicas
electroforéticas, obteniéndose un patrón de bandas específico que nos permite diferenciar
individuos (Rallo et al. 2002).
El método implica la ejecución de una serie repetitiva de ciclos (conocidos como ciclos
térmicos), cada uno de los cuales involucra la desnaturalización del ADN, la unión del
iniciador a la cadena desnaturalizada y la síntesis, a partir del iniciador, de una doble cadena
mediante la acción de la polimerasa.
El análisis PCR, desde su invención, por Saiki et al. (1985), ha sufrido modificaciones y en
algunos casos ha generado incluso nuevas técnicas (Phillips et al. 1995). Rallo et al. (2002)
mencionan que la gran mayoría de los marcadores moleculares del ADN, de uso actual, se
basan en la técnica del PCR.
El PCR ha suministrado un conjunto de marcadores como por ejemplo; los RAPDs, SSR,
AFLPs, regiones amplificadas de secuencias caracterizadas (SCARs), amplificación
selectiva de loci polimórficos (SAMPLs), amplificación azarosa de las huellas del ADN
“ADN Fingerprinting” (RAF) y amplificación directa con ADN microsatélites (DAMD).
38
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
39
Tabla 5. Datos pasaporte de las 16 accesiones de quinua. (Continuación)
No. Altitud Color del
Accesión Departam. Provincia Distrito Localidad
Pasaport msnm grano
Cajamarca PEQPC-
Cajamarca Cajamarca Cajamarca Huacariz 2750 Marrón
1 0705
Cajamarca PEQPC-
Cajamarca Cajamarca Cajabanba Tangalbamba 2950 Morado
2 0704
Cajamarca PEQPC-
Cajamarca Cajamarca Cajabanba Chimibamba 2800 Blanco
3 0703
PEQPC-
Ancash 1 Ancash Carhuaz Shilla Catay 3336 Crema
0425
PEQPC-
Ancash 2 Ancash Recuay Ticapampa Ticapampa 3451 Rojizo
0489
PEQPC- Cabanacon
Arequipa 1 Arequipa Caylloma Cabanaconde 2956 Amarillo
1900 de
PEQPC- Amarillo
Arequipa 2 Arequipa La Unión Cotahuasi Cotahuasi 2800
1905 anaranjado
3.3.1. Enzimas
x Taq Polimerasa (Fermentas)
x RNAasa (Merck)
x dNTP’s (Fermentas)
3.3.2. Reactivos
x Ácido Acético (Merck)
x Ácido Bórico (Applichem)
x Alcohol Isoamílico (Merck)
x Acrilamida/bisacrilamida (19:1) (Applichem)
x Agarosa (D1-LE)
x Azul de Bromofenol (sigma)
x Bromuro de Etidio (Merck)
x Bromuro de Hexadeciltrimetil amonio - CTAB (Calbiochem)
x Cloroformo (Merck)
x Cloruro de Sodio (NaCl) (Sigma)
x Repelente (RainX)
x J - methacryloxypropyltrimethoxysilane (Sigma)
40
x Ácido Etilen Diamino Tetra Acético - EDTA (Applichem)
x Etanol Absoluto (Merck)
x Formaldehido (Merck)
x Formamida (Merck)
x Hidróxido de Sodio (Merck)
x Isopropanol (Merck)
x Mercaptoetanol (Merck)
x Nitrato de Plata (Merck)
x Persulfato de Amonio – APS (Sigma)
x TEMED (N.N.N’.N’. – Tetra-metil etilen di amida) (Sigma)
x Tris[hidroximetil] amino etano – Tris (Applichem)
x Urea (Applichem)
x Xilene cianol (Sigma)
x Marcador Molecular de 20pb (Fermentas)
3.3.3. Equipos
x Baño María
x Cámara de electroforesis horizontal (Bio-Rad)
x Cámara de electroforesis Vertical (Handmade)
x Captador de Imagen (Bio-Rad)
x Fuente de Poder de 300V y 500V (Consort)
x Juego de Pipetas 0.5-10Pl; 2-20Pl; 20-200Pl (Bio-Rad)
x Juego de Pipetas 10-100Pl; 20-200Pl; 100-1000Pl (Eppendorf)
x Centrífuga (Eppendorf)
x Sistema de Agua Ultra pura (Barnstead)
x Termociclador (Eppendorf)
x Molino de muestras secas (Retsch – Mill 200)
x Balanza analítica (Sartorius)
x Biofótometro (Eppendorf)
x Hornilla con agitador magnético (Hridolph)
x Microondas (Panasonic)
41
3.3.4. Materiales de Vidrio y otros
x Espátulas, tijeras, pinzas
x Gradilla de tubos para centrífuga
x Guantes (Cranberry)
x Matraces y vasos de precipitado
x Placas de policarbonato para PCR de 96 muestras (Corning Incorporated)
x Placas de vidrio para electroforesis vertical
x Probetas de 100, 500 y 1000ml
x Puntas para pipetas (Axygen)
3.4. Metodología
3.4.1. Germinación de las semillas
Las semillas se sembraron en las macetas correspondientemente identificadas, con
sustrato desinfectado (50% de compost y 50% de arena). El lugar de incubación se
realizó en un tinglado con mallas antiáfidos.
42
Se agregó 800 μl de buffer CTAB y se mezcló suavemente por inversión, hasta
homogenizar la muestra.
Luego se colocó en un Termomixer a 60 °C durante 30 minutos, mezclando
suavemente cada 10 minutos.
Se adicionó 800 μl de cloroformo-alcohol isoamílico en la proporción de 24:1,
mezclando por inversión y luego centrifugando a 14,000 rpm por 10 minutos.
El sobrenadante obtenido se transfirió a un nuevo tubo, se la añadió 50 μl de
CTAB al 10% (en 0.7 M de NaCl), se mezcló suavemente hasta obtener una
muestra uniforme y luego se agregó 800 μl de cloroformo-alcohol isoamílico
24:1 mezclando nuevamente y luego centrifugando a 14,000 rpm por 10 minutos.
Se transfirió el sobrenadante con mucho cuidado y se precipitó el ADN
agregando 800 μl de etanol al 96%, mezclando por inversión hasta observar un
precipitado blanquecino.
Cuando el precipitado fue visible solo se eliminó el sobrenadante y quedó listo
para el siguiente paso, en algunos casos no fue posible observar el precipitado de
ADN, por lo que se centrifugó la muestra por cinco minutos y luego se eliminó
el sobrenadante.
Se agregó etanol al 70% y se dejo a temperatura ambiente por 5 minutos, se
centrifugo a 10,000 rpm por cinco minutos, se eliminó el sobrenadante y luego
se repitió el lavado y centrifugado.
Se eliminó el sobrenadante y se dejo secar toda la noche dejando los tubitos
abiertos e invertidos.
Se re-suspendió el precipitado de ADN en 50 μl de TE y luego se le agregó 2 μl
de ARNasa (10mg/ml) agitando suavemente e incubando en baño maría a 37° C
por una hora.
Posteriormente se crearon bulks para cada una de las 16 accesiones con una
concentración final de 10 ng/ml. Cada bulk estuvo conformado por 2 ul de cada muestra
(5 muestras por accesión)
43
estimado de pureza. Dicha relación en una muestra pura de ADN registraría un valor de
entre 1.7 a 1.9. Un valor inferior a 1.7 indica que pueden existir proteínas y/u otros
elementos absorbentes de luz ultravioleta en la muestra. En cambio un valor superior a
1.9 indica que las muestras de ADN purificadas pueden estar contaminadas con fenol o
cloroformo. (Clark, 1996)
44
3.7. Elaboración de los Bulks
Una vez diluidas cada una de las muestras y llevaron a una concentración de 10ng/Pl. en
un volumen de 100Pl. se procedió a formar los bulks de la siguiente manera: de una
accesión se tomaron 2Pl. de cada una de las 5 muestras que conforma dicha accesión y se
mezclaran en tubos eppendorf. Este mismo procedimiento se realizara para cada una de
las 16 accesiones presentes en la investigación.
45
0.5uM, y Taq polimerasa 0.5 U y 2.4 μl de agua esterilizada para un volumen final de 10
μl para cada reacción.
46
costados donde se pusieron los separadores y luego se terminaron de sellar con un
1% de agarosa líquida.
Para la preparación del gel de poliacrilamida se emplearon 35 ml de acrilamida al
6% y se agregó 300 μl de APS al 10% y 30 μl de Temed, se mezcló y vertió esta
solución entre los dos vidrios procurando no formar burbujas; finalmente se
colocó el peine y se dejó polimerizar por una hora.
Luego se limpiaron los vidrios para colocarlos en el aparato de electroforesis
sacando el peine con mucho cuidado de no romper los pocillos y el separador de
la parte inferior de los vidrios, una vez instalado se procedió a llenar los pocillos
de la parte superior con buffer TBE al 1% y la parte inferior con TBE al 0.5%.
Haciendo uso de una jeringa con aguja delgada, se limpió cada uno de los pocillos
formados por el peine, esto se hace para eliminar la urea o pequeños trozos de gel
que pueden quedar atrapados en los pocillos.
Se pre corrió el gel a 500V por media hora.
Las muestras amplificadas por PCR fueron desnaturalizadas agregando 6 μl de
tampón de carga y llevadas a 94° C por 4 minutos.
Antes de colocar las muestras se volvió a limpiar cada uno de los pocillos para
remover residuos de urea.
Finalmente se corrió el gel de poliacrilamida a 500V por seis horas.
47
Finalmente, una vez reveladas las bandas, se volvió a poner el gel en la solución
de fijación por unos cinco minutos seguido de un enjuague con agua corriente por
tres minutos y se deja secar a temperatura ambiente.
ൌ ͳ െ ܲ݅ ଶ
ୀଵ
Donde:
H: Heterocigosis, como medida de la diversidad alélica.
k: Numero de alelos
Pi: Frecuencia del i-esimo alelo.
48
3.15.2. Construcción de una matriz básica de datos (MBD)
Los datos obtenidos se presentaron en forma de una matriz básica de datos, esta fue una
matriz donde las columnas representaron el carácter binario (presencia o ausencia de
bandas) y las filas representan las unidades taxonómicas operativas (OTU).
49
Cada elemento representante de un cluster que solamente contiene dicho
elementos.
Calcular las similitudes entre todos los clusters existentes dos a dos.
Elegir los cluster cuya similitud sea mayor.
Mezcla los clusters elegidos en el paso anterior según la medida de similitud.
Según como se calcule la similitud de enlace entre clusters se pueden distinguir los
siguientes métodos: ligamientos simple, completo y promedio. Para nuestro caso en
estudio se usó el método de ligamiento promedio no ponderado (UPGMA) que utiliza las
medias según el número de elementos que hay en cada conglomerado siendo el más
utilizado en las taxonomía numérica debido a que no produce efectos de distorsión en el
espacio y es combinatorio, el UPGMA calcula el promedio entre coeficientes de
semejanza de dos grupos que tienen la posibilidad de unirse.
OTU 1 2 3 4
1 1
2 0.50 1
3 0.69 0.43 1
4 0.25 0.62 0.19 1
Puede observarse que las OTU más relacionadas son la 1 y 3 con 69% de similitud. Esto
también puede representarse gráficamente de la siguiente manera:
Coeficiente de similitud
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
50
El próximo paso consiste en construir una nueva matriz en la que las OTUs 1 y 3 forman
una sola OTU o cluster (1-3). A continuación pueden aplicarse tres métodos para la
construcción de la nueva matriz:
a. Ligamiento máximo.
b. Ligamiento mínimo.
c. Ligamiento promedio.
OTU 1-3 2 4
1-3 1
2 0.465 1
4 0.22 0.62 1
51
Ahora puede construirse el dendrograma completo:
4
3.15.6. Análisis de grupos
La representación gráfica de la técnica de clustering jerárquico fue el dendrograma, la
cual muestra la formación de grupos jerárquicos, así como la similitud entre los clusters.
El dendrograma permitió conocer la composición de los clusters.
52
V. RESULTADOS Y DISCUSIONES
A pesar de que el valor del PIC es una herramienta importante para distinguir que marcador
es más informativo, se puede realizar un comparativo sobre hechos experimentales previos
con los resultados obtenidos en la presente tesis. Se tomó en cuenta la investigación de
Mason et al. (2005) en el desarrollo y uso de microsatélites SSR en Quinua, en este sentido
los valores de PIC obtenidos en la evaluación de bandas es más acertada no solo porque
evalúa la presencia o ausencia de alelos de cada individuo en la población, sino también por
la cantidad de accesiones evaluadas.
53
Tabla 6. Índice de contenido polimórfico (PIC), según Mason et al. 2005. (Continuación)
Nombre Alelos
Alelos
del observados
Forward primer (5' - 3') Reverse primer (5' - 3') PIC observados
Marcador por Mason
en tesis
SSR et al. 2005
QATG018 ccaaacaaagacaataaggaaacc cgaggttgaaggagattcca 0.78 6 5
QATG086 aatcgcagcctaaactgagc agttccatttcgaccatatgataa 0.58 4 3
QCA006 gctctattaaggaaatgaggttaca gccattcaattcagcaaagg 0.58 3 2
QCA038 catttcccaaactgcatgaat atgtgtgttgcgtgtgagtg 0.69 4 3
QCA048 acaatacatacataacccaatattcaa tggaaatgtcactatgattgga 0.40 3 4
NA: el marcador no amplifico.
54
Como se muestra en la tabla 6 los alelos observados por Mason et al. (2005) y los obtenidos
experimentalmente son muy similares siendo los iniciadores QaaT74 y QaaT76, los que
obtuvieron mayor cantidad de alelos observados y un PIC más elevado. Empíricamente el
valor de PIC es de gran utilidad, dependiendo de los propósitos y recursos que se tenga para
la investigación, esta herramienta nos permite seleccionar los iniciadores más adecuados.
Para dar valor a la comparación entre los alelos obtenidos por Mason et al. (2005) y los
observados experimentalmente se realizó una prueba estadística chi-cuadrada, la cual
consiste en identificar si hay una congruencia exacta o muy estrecha entre las frecuencias
observadas y las que se esperan. Esta prueba nos dio un valor calculado de 3.1528, el cual
es comparado con el valor tabular de X2 que para un nivel de significancia de 0.001 con 8
grados de libertad representa un valor de 27.8767.
Dado que el valor calculado (X2 = 3.1528) es menor que el valor tabular (X2 = 27.8767) se
acepta la hipótesis de que las frecuencias observadas y esperadas guardan una gran similitud
entre ellas.
Adicionalmente Koskinen (2004), menciona que, cuando las posibilidades de hacer este tipo
de estudios se ve limitada por los recursos, es muy importante saber poder seleccionar cuales
primers pueden ser más eficientes que otros en la determinación de variabilidad genética de
una población.
55
56
Figura 2. Dendrograma de las 16 accesiones de quinua analizadas, mostrando los grupos formados.
En la figura 1 se puede apreciar que a un coeficiente de 0.70 se forman seis grupos. El primer
grupo lo conforman 4 accesiones (3 provenientes de Puno y 1 de Arequipa). En este grupo
se puede apreciar que las accesiones Puno 1 y Puno 2 poseen un coeficiente de similitud de
1, lo que haría suponer que podrían pertenecer al mismo cultivar. Además al observar la
matriz de similitud se puede apreciar que para los 9 locus evaluados con los respectivos
SSRs, los alelos encontrados son exactamente los mismos para ambas accesiones. Aunque,
podría afirmarse que se tratan de accesiones duplicadas, ya que pertenecen a la misma región,
no podemos confirmar con total seguridad que ambas accesiones sean idénticas, porque para
esto sería necesario emplear una gran cantidad de SSR que puedan explorar en su totalidad
el genoma de estas accesiones y un secuenciamiento genético. Sin embargo, ambas
accesiones al ser pertenecientes a la misma región, es posible creer que se haya efectuado
algún mecanismo de intercambio de semillas, mecanismo muy común entre los agricultores
de la zona, y generalmente se dan estos intercambios mediante trueques, ferias regionales y
nacionales o por las administraciones de las aynokas.
En cuanto a las accesiones Arequipa 2 y Puno 3 del primer grupo, ambas presentaron menor
similitud, probablemente por la existencia de un intercambio de semillas en el tiempo,
migración o dispersión de semillas desde su centro de origen hacia otra región mediada por
los agricultores.
57
genética en el centro del Perú. Además Christensen et al. (2007), realizó un análisis genético
en 121 accesiones de quinua mediante marcadores SSRs, indicando una disminución en la
variación genética en las regiones del norte y costa del Perú, estas reducción en la diversidad
genética podrían ser debido al resultado de efectos asociativos con la dispersión del cultivo
del centro de origen, pérdida de identidad cultural asociada al cultivo como desintegración
de las aynokas o alternativamente como una respuesta a la adaptación selectiva de un
cultivar.
El cuarto, quinto y sexto grupo los conforman las accesiones Cusco 4, Cajamarca 3 y
Arequipa 1 respectivamente. Estos grupos son lo que presentan mayor disimilitud con los
anteriores tres grupos mencionados. Estas accesiones pueden pertenecer a variedades
silvestres en lugar de las variedades cultivadas. Según Mujica (2006), algunas especies
silvestres como, Chenopodium petiolare Kunth., Chenopodium quinoa ssp. Melanospermum
Hunz. o Chenopodium hircinum Schrad., se pueden confundir o cultivar a la par con las
variedades comerciales. Estas variedades muestran una gran variedad fenotípica mostrando
semillas que van desde el color oscuro hasta el blanco y/o diferentes niveles de saponina,
que por lo general son elevados a comparación de las variedades cultivadas, lo que hace que
la identificación morfológica sea difícil de conseguir; siendo los marcadores SSR ideales
para realizar comparaciones entre estos tipos de variedades.
Según nuestro árbol dendrológico la accesión Cusco 4 se separa de todos los demás grupos
relacionados con otras accesiones de la región Cusco, sin embargo, guardan una relación con
un coeficiente de similitud de 0.56, lo que hace suponer que ésta se trate probablemente de
una variedad silvestre como Chenopodium petiolare Kunth, la cual es observada
comúnmente en los altiplanos andinos, entre los 3.830 hasta los 3.900 m.s.n.m. (Mujica,
2006).
58
En cuanto a la comparación entre grupos formados en el árbol dendrológico los primeros
tres grupos agrupan todas las accesiones de Puno, siendo las accesiones Puno 4 y 3 las que
se separan más fuertemente de estos tres grupos, lo que indica que existe una fuerte relación
entre estas accesiones por su ubicación geográfica, aunque guarden cierta variabilidad
genética. Debemos mencionar que también que la región sur del Perú, como Puno, presenta
la mayor diversidad y se representa centro de origen de este cultivo. Por su parte Gandarillas
(1979) y Wilson (1988) sugirieron también que la sierra sur cercana al lago Titicaca
representa el centro de diversidad basándose en los altos niveles de morfología y a la
diversidad obtenida a través de estudios de isoenzimas; del mismo modo Castillo (2006)
estudio la estructura genética de las diferentes poblaciones de quinua en tres regiones
distintas del altiplano peruano-boliviano, en la cual dio a conocer que las poblaciones de
quinua exhibieron polimorfismos generados a través de marcadores RAPDs, evidenciándose
un amplia divergencia en los diferentes cultivares de quinua sembrados en los Andes.
Adicionalmente, Ruas et al. (1999) caracterizó 19 accesiones de seis especies de quinua
altiplánica con marcadores RAPDs concluyendo al igual que otros investigadores que
existen altos niveles de polimorfismo entre todas las especies estudiadas y bajos niveles de
variación intraespecífica dentro de las accesiones de quinua dependiendo del origen de cada
accesión. Finalmente los resultados obtenidos en este estudio sugieren que las accesiones de
quinua provenientes de Cajamarca, Arequipa y Cusco presentaron la mayor disimilitud
genética, amplia variabilidad y probablemente heterogeneidad, resultados muy similares a
los obtenidos por Tamayo (2010), quien realizó una caracterización molecular inter e intra
genotípica de 16 accesiones de quinua mediante la técnica de ISSRs.
Según Motilal et al. (2009), la utilización de un número reducido de marcadores SSR y uso
de bulks es una gran alternativa para solucionar el mal etiquetado o duplicación de especies
vegetales en colecciones de germoplasma, esto representa un grave inconveniente debido a
59
que genera grandes costos innecesarios para su mantenimiento. Generalmente estas
equivocaciones ocurren principalmente por la multiplicidad de introducciones y
transferencias de las plantas desde el punto de recolección hasta el establecimiento en los
primeros sitios de alberge, por subsiguientes recolecciones de injertos y material de
propagación o por errores humanos durante la demarcación de la parcela y/o plantación
también pueden haber llevado a la confusión de identidad entre y dentro de las accesiones.
60
VI. CONCLUSIONES
1. Los marcadores SSR probaron ser una técnica eficiente para la asociación inter-
genotípica de las 16 accesiones de quinua. Pudiéndose asociar geográficamente
muchas de estas accesiones.
4. La utilización de bulks resultó ser una metodología realmente útil en cuanto a los
costos y tiempo empleado para la realización de la investigación. Así mismo el uso
de esta metodología obtuvo resultados muy acordes a investigaciones descritas por
otros autores.
5. El alto grado de autogamia en la quinua hace que su variabilidad genética sea menor
con respecto de especies alogamas, básicamente la variabilidad genética que pueda
manifestarse en esta especie se debe a varios factores inherentes a la morfología de
la quinua misma, procesos meióticos, errores en la replicación del ADN y a factores
ambientales.
6. Puede existir una alta probabilidad de encontrar especies silvestres dentro de los
cultivos comerciales, esto puede deberse a que estas especies con respecto a las
61
cultivadas son morfológicamente similares o en algunos casos como la Chenopodium
quinoa ssp. Melanospermum Hunz, los mismos agricultores la siembran
conjuntamente. Para este tipo de investigación donde se desea establecer una relación
de agrupamiento en relación al origen, las especies silvestres pueden generar bajos
coeficientes de similitud. Sin embargo, para estudios de calidad dentro de un cultivar
puede ser muy útil el uso de los marcadores SSR para establecer la homogeneidad
de cultivo.
62
VII. RECOMENDACIONES
2. Siendo los marcadores SSR muy versátiles para diferentes tipos de investigación es
necesario elaborar un plan de las metodologías más útiles que nos permitan administrar
adecuadamente los recursos que se dispongan.
3. Para análisis de asociaciones se debe hacer una selección previa de los marcadores SSR
más informativos.
63
VIII. BIBLIOGRAFÍA
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73
IX. ANEXOS.
Tampón T10E1
Stock Final 1000 ml
10 mM 10 ml 10 g
Tris HCl 1M, pH 8 1 mM 2 ml
H2O destilada c.s.p. 1000 ml
ARNasa 10 mg/ml
Stock Final 5 ml
ARNasa 10 mg/ml 50 mg
NaCl 5M 0.7 M 4.09 g
EDTA 0.5M, pH 8 15 mM 15 μl
Tris HCl 1M, pH 8 10 mM 50 μl
H2O destilada c.s.p. 5 ml
74
7.3. Reactivos para la preparación de geles de Poliacrilamida
Tampón TBE 10X
Stock Final 100 ml
Tris-Base 90 mM 108 g
Ácido Borico 5.5% 55 g
EDTA 0.5M, pH 8 20 mM 40 ml
H2O destilada MilliQ c.s.p. 100 ml
75
7.4. Datos pasaporte de las 16 accesiones de quinua.
Puno 3 PEQPC-0762 Puno Collao Ilave Santa María 3890 Blanco 16° 05' 42,96" S 69° 39' 28,75" O
Puno 4 PEQPC-0835 Puno Puno Capachica Barrio 3 3860 Blanco 15° 38' 23,20" S 69° 50' 02,24" O
Puno 5 PEQPC-0283 Puno Puno - - 3827 Blanco 16° 03' 18,08" S 69° 32' 30,32" O
Puno 6 PEQPC-0298 Puno Puno - - 3827 Amarillo 16° 03' 18,08" S 69° 32' 30,32" O
Cuzco 2 PEQPC-0444 Cuzco Canchas Maranganí Quisine 3937 Negro 14° 22' 39,89" S 71° 11' 16,20" O
Rio
Cuzco 3 PEQPC-0326 Cuzco Calca Calca 2928 Amarillo 13° 19' 45,35" S 71° 56' 57,12" O
Vilcanota
Cuzco 4 PEQPC-0321 Cuzco Canchas Maranganí Mamuera 3725 Rojo 14° 21' 36,84" S 71° 09' 54,06" O
Cajamarca 1 PEQPC-0705 Cajamarca Cajamarca Cajamarca Huacariz 2750 Marrón 7° 11' 27,08" S 78° 29' 46,15" O
Cajamarca 2 PEQPC-0704 Cajamarca Cajamarca Cajabanba Tangalbamba 2950 Morado 7° 37' 27,86" S 78° 01' 42,91" O
Cajamarca 3 PEQPC-0703 Cajamarca Cajamarca Cajabanba Chimibamba 2800 Blanco 7° 38' 17,39" S 78° 08' 53,06" O
Ancash 1 PEQPC-0425 Ancash Carhuaz Shilla Catay 3336 Crema 9° 13' 22,94" S 77° 36' 41,21" O
Ancash 2 PEQPC-0489 Ancash Recuay Ticapampa Ticapampa 3451 Rojizo 9° 45' 40,14" S 77° 26' 34,36" O
Arequipa 1 PEQPC-1900 Arequipa Caylloma Cabanaconde Cabanaconde 2956 Amarillo 15° 36' 25,33" S 72° 00' 58,32" O
Amarillo
Arequipa 2 PEQPC-1905 Arequipa La Unión Cotahuasi Cotahuasi 2800 15° 12' 58,28" S 72° 52' 49,58" O
anaranjado
76
7.5. Descripción de los microsatélites en quinua
Tamaño
Nombre
esperado Numero de
del Comple
Motif primario Tipo Forward primer (5' - 3') Reverse primer (5' - 3') del alelos PIC
Marcador jidad
producto observados
SSR
del PCR
77
7.6. Número total de alelos presentes para los 9 locus analizados y número total de alelos por zona de colecta.
Numero de alelos
Total de
Primer
alelos
Puno 1
Puno 2
Puno 3
Puno 4
Puno 5
Puno 6
Cuzco 2
Cuzco 3
Cuzco 4
Ancash 1
Ancash 2
Arequipa 1
Arequipa 2
Cajamarca 1
Cajamarca 2
Cajamarca 3
QaaT74 7 3 3 4 3 3 3 3 3 3 4 3 3 3 2 3 3
QaaT76 5 2 2 2 2 1 2 0 0 2 2 1 1 1 1 0 0
QaaT52 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1
Qatg19 5 2 2 3 2 2 2 2 2 3 3 2 4 4 2 2 0
Qatg86 3 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1
Qca38 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Qca06 2 1 1 1 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 2 2 1
QaaT48 3 1 1 1 1 0 0 1 1 0 0 0 1 1 0 1 0
Qca48 4 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Total 35 14 14 15 14 12 14 13 12 14 15 12 17 15 12 13 9
Promedio 3.889 1.556 1.556 1.667 1.556 1.333 1.556 1.444 1.333 1.556 1.667 1.333 1.889 1.667 1.333 1.444 1
78