Cromatografía Líquida de Alta Resolución
Cromatografía Líquida de Alta Resolución
Cromatografía Líquida de Alta Resolución
Concepto de HPLC
La cromatografía líquida de alta resolución se caracteriza por el empleo de una fase estacionaria constituida
por partículas de tamaño muy pequeño, del orden de los m. Esto hace que la eficacia del sistema sea muy
elevada proporcionando columnas con un número muy grande de platos teóricos.
Para vencer la enorme resistencia que ofrece la fase estacionaria al paso de la fase móvil es necesario
emplear un sistema de bombeo a alta presión.
Otra característica importante de la HPLC es la detección continua de los análitos conforme son eluidos
Modalidades de HPLC
o Cromatografía de líquido - Sólido (ADSORCIÓN): Fenómeno de superficie que
ocurre por la interacción física o química de un adsorbente.
o Cromatografía de líquido – líquido (PARTICIÓN): Es el fenómeno de reparto de un
soluto en 2 fases distintas.
o Cromatografía de INTERCAMBIO IÓNICO: Es un fenómeno generado por la
interacción electroestática entre moléculas encargas eléctricamente.
o Cromatografía de EXCLUSIÓN: Es un fenómeno físico que consiste más que nada en
separar moléculas en base a su tamaño molecular.
o AFINIDAD: Se combina la alta especificidad de ciertas moléculas por un sustrato,
tales como: Enzimas, Receptores, etc.
La modalidad más empleada es la cromatografía con fases ligadas, donde podemos distinguir:
La cromatografía en fase normal (fase estacionaria más polar que la fase móvil).
La cromatografía en fase reversa (fase estacionaria menos polar que la fase móvil).
La mayoría de los análisis cromatográficos actuales se llevan a cabo por cromatografía en fase reversa. Esta
modalidad emplea una fase estacionaria apolar, generalmente una cadena hidrocarbonada, C8 o C18, junto
a una fase móvil polar, constituida por una mezcla de agua o tampón con un disolvente orgánico miscible
como MeOH o Acetonitrilo. El poder eluyente de la fase móvil se regula variando la proporción
Agua/Disolvente orgánico. Cuanto mayor sea la proporción de agua menor será el poder eluyente de la fase
móvil, y por tanto, mayores los tiempos de retención.
DETERMINANCIÓN DE VITAMINA A
Método utilizado por Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento – HPLC.
Extracción de la vitamina
CONCLUSIONES
o Se demostró que el método utilizado fue sencillo, selectivo, preciso y exacto.
o Se demostró que el contenido de vitamina A de las tres marcas de leches estudiadas
está por debajo del valor establecido por la norma Venezolana.
o Las condiciones del sistema Cromatógrafo que producen señales más intensas y
que proporcionan mejores resultados para la cuantificación de la vitamina A son:
flujo 1,2 mL/mim, donde la longitud de onda de 300nm y fase móvil 100% de
metanol.
DETERMINANCIÓN DE VITAMINA A, D y E
Método utilizado por Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento - HPLC
Muestras: harina de quinua, lupino, levadura de cerveza y albumina de huevo
Preparación de la Muestra
En un tubo falcón (50 mL), Se adicionan 4 mL de etanol Se añade lentamente 1 mL Se agitando nuevamente
Se agita a 1.700 rpm/1 h
se pesan 2,0 g de muestra más 1 mL de solución de de hidróxido de potasio al a 1.700 rpm/1min.
en rotatubos
previamente homogenizada. ácido ascórbico al 10% p/v. 50% p/v.
Se extrae el hexano y se
Se adicionan 2 mL de trasvasija a un tubo falcón. Se lavan con volúmenes Se verifica utilizando el
La fase superior se junta con solución de cloruro de sodio pequeños de agua indicador fenolftaleína al 1%
Se realizan dos extracciones
la recolectada anteriormente saturado y 4 mL de hexano, más con 4 mL de hexano desionizada entre 5 a 15 p/v. Se centrifuga a 4.000
en el tubo falcón esto se agita vigorosamente cada una, juntando cada mL, hasta alcanzar pH rpm/1min.
a 1.700 rpm/1 min. extracción con la anterior. neutro
RESULTADOS
Se presenta el contenido de vitaminas liposolubles presente en las materias primas.
CONCLUSIÓN
El método desarrollado, permitió determinar de forma simultánea las vitaminas
liposolubles A, D y E demostrando ser rápido y eficiente.
La validación del método cromatográfico indicó límites de decisión (Ccα) que se
encuentran entre 0,4 μg/g (vitamina A y D2) y 0,8 μg/g (vitamina E), mientras que la
capacidad de detección (Ccβ) fue de 1,8 para vitamina A, 0,6 μg/g para vitamina D2 y
7,0 μg/g para vitamina E. El método obtuvo una precisión de 3,17% para vitamina A,
2,31% para vitamina D2 y 2,76% para vitamina E. En tanto que la exactitud presentó
valores correspondientes a 111,57% para vitamina A, 124,97% para vitamina D2 y
106,34% para vitamina E.
Bibliografía