UNIVERSIDAD AUTÓNOMA CHAPINGO

Departamento de Fitotecnia
Ingeniería agronómica en Fitotecnia
Producción de leguminosas de grano
Catedrático: Samuel Sánchez Domínguez
Alumna: Paloma Alonso Hernández
Grado: Sexto
Grupo: 1
Chapingo edo. de México a 03 de Octubre de 2014

FIJACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO EN LEGUMINOSAS

Las rizobiaceas son un grupo muy heterogéneo de bacterias que se han dividido en cuatro familias:
Rhizobiaceae, Phyllobacteriaceae, Hyphomicrobiaceae y Bradyrhizobiaceae (Madigan M.T. y col.
2000). Dentro de estas familias sólo unos determinados géneros son capaces de efectuar el proceso
de fijación de
nitrógeno: Rhizobium, Sinorhizobium, Meshorizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium yAllorhizobium.
Con el fin de simplificar la lectura nos referiremos a todos estos géneros como Rhizobium.

A diferencia de las cianobacterias y las bacterias pertenecientes al género Frankia, las rizobiáceas
no pueden generar un ambiente anaerobio o microaerobio en donde poder realizar la fijación de
nitrógeno por si mismas. Para llevar a cabo el proceso estas bacterias han de encontrarse en las
inmediaciones de plantas de la familia de las fabáceas e interactuar con las mismas, originando una
serie de reacciones en la planta que desencadenarán la formación de un órgano mixto nuevo, el nódulo
simbiótico, en el cual se proporciona un entorno controlado, así como los nutrientes necesarios para
que la bacteria pueda efectuar el proceso de fijación.

Antes de llegar a la consecución del nódulo, tanto la planta como la bacteria han de seguir un
protocolo, de tal manera que, si cualquiera de ellos incumple alguna de las condiciones establecidas,
la formación del nódulo abortará. Dicho protocolo se puede resumir en:

1) Intercambio de señales de naturaleza química entre la planta y el microorganismo.

2) Activación del ciclo celular en células del córtex e iniciación del nuevo órgano en la planta.
3) Infección por parte de la bacteria, formación del canal de infección e invasión de los tejidos
recién formados.
4) Diferenciación de la bacteria a forma especializada.
INICIACIÓN DEL NÓDULO

Señalización entre la planta y Rhizobium

Se puede definir como rizosfera a la porción de suelo íntimamente asociada a las raíces de plantas
en crecimiento con propiedades físicas, químicas y biológicas diferentes a las del resto del suelo y con
una estructura extraordinariamente compleja en la que inciden gran número de variables y en la que
se establecen multitud de relaciones biológicas. De hecho, las características físico–químicas de dicha
región hacen de ella un lugar muy adecuado para el crecimiento de microorganismos (Bazin M.J. y
col., 1990), de los cuales los más abundantes son las bacterias, en gran parte propiciado por la
presencia de los exudados de la planta ricos, entre otros, en compuestos carbonados. Entre el 10% y
el 30% de los fotosintatos de la planta son secretados en los exudados radiculares (Bowen G.D. y
Rovira A.D., 1999) abarcando carbohidratos, ácidos orgánicos, vitaminas, aminoácidos y derivados
fenólicos. Entre dichos compuestos se encuentran los flavonoides (derivados del 2–fenil–1,4–
benzopirona) cuya composición va a variar dependiendo de la especie, y que además de ser
metabolizados, desencadenan una serie de respuestas específicas en los rizobios circundantes
apropiados. Así, algunos de estos flavonoides a concentraciones nanomolar, provocan la quimiotaxis
activa de los rizobios hacia la superficie radical (Sánchez F. y col., 1991). En cambio, estos mismos
flavonoides a concentración micromolar, activan en Rhizobium a los genes responsables de la
nodulación (genes nod).

Cada Rhizobium expresa constitutivamente un grupo de factores de transcripción hélice–lazo–

hélice de la familia LysR (Schell M.A., 1993) conocidos como NodD cuyo número y regulación va a
depender de la especie de Rhizobium,

Señalización entre Rhizobium y la planta

La mera presencia de los factores Nod en concentraciones del orden 10 –12 M es suficiente para que
en la planta se produzca la deformación de los pelos radiculares (Lerouge P. y col., 1990; Heidstra R.
y col., 1994) pero se necesitan niveles mayores, del orden de 10–7 a 10–9 M para provocar la formación
de los pre–canales de infección, la división de las células corticales y la inducción de genes implicados
en las fases previas a la nodulación, las nodulinas tempranas (Truchet G. y col., 1991). Esta elevada
sensibilidad a los factores Nod hace suponer que debe existir un mecanismo mediado por receptores
aunque aún no se han podido ni determinar el número ni identificarlos, no obstante se han propuesto
hipótesis:

1) Modelo de un único receptor (Hirsch A.M., 1992): se propone la existencia de un único

receptor cuya actividad va a venir dada por la estructura del factor Nod, el cual se integraría en
la membrana celular de la planta a través del grupo acilo.
 2) Modelo de dos receptores (Ardourel M. y col., 1994): con esta hipótesis se plantea la posible
presencia de dos receptores, ambos necesarios para iniciar el proceso de nodulación. Uno de
los receptores no posee una especificidad muy elevada en el reconocimiento de los factores
Nod pero puede inducir la deformación del pelo radicular, la formación del primordio del canal
de infección y la división de las células corticales aún en ausencia de la bacteria. El segundo
receptor es más específico e induce la formación del canal de infección y del nódulo aunque
siempre es necesaria la presencia de la bacteria. Este modelo actualmente es el que va
cobrando más fuerza. Así se ha descubierto un posible receptor de factores Nod, que presenta
una elevada homología a receptores tirosina quinasa (Endre G. y col., 2002), y que además
presenta dominios de unión a otras proteínas. Una de estas proteínas podía ser una proteína G
de membrana la cual también es necesaria para la percepción de los factores Nod (Pingret J.L.
y col., 1998).

Uno de los primeros efectos que se observa tras la percepción del factor Nod en el pelo radicular
es la entrada de Ca2+ al citoplasma (Felle H.H. y col., 1998; Cárdenas L. y col., 1999). Ello conduce a
la activación de ciertos canales aniónicos que originan la expulsión de Cl– y por tanto la despolarización
de la membrana del pelo. No se conocen los mecanismos que inducen la entrada de Ca 2+, aunque se
ha propuesto que podría estar mediado por proteínas G (Pingret J.L. y col., 1998) y mantenido por
canales de Ca2+ sensibles a voltaje. Esta entrada de Ca2+, además de servir como mensajero para la
inducción de genes y activación de proteínas implicadas en la nodulación, induce una reorganización
del citoesqueleto, que contribuye a la deformación del pelo radicular hasta llegar a una forma
característica del fenómeno de la nodulación, el “cayado del pastor” (Shepherd’s crook en inglés). Esta
estructura generará una pequeña cavidad en donde la bacteria puede crecer y prosperar.

Invasión y formación del canal de infección

La unión de las bacterias a la superficie de la raíz es un paso preliminar muy importante que precede
a la invasión. Fibrillas de celulosa producida por la bacteria pueden ayudar a enredar al rizobio en la
superficie mucilaginosa de la raíz, proceso reforzado por la presencia de proteínas dependientes de
Ca2+, ricadhesinas, producidas por la bacteria (Smit G. y col., 1989). Es por ello que los polisacáridos
y proteínas producidos por Rhizobium pueden jugar un papel importante en la interacción física entre
la planta y la bacteria. Así, mutantes que carecen de EPS ni invaden ni forman canales de infección.
Aunque aún no se conoce el papel específico del EPS en los prolegómenos de la relación entre la
planta y la bacteria, sí se ha hipotetizado sobre dichas funciones (Gray J.X. y Rolfe B.G., 1990). Entre
otras, el EPSpodría enmascarar la superficie bacteriana para evitar el desencadenamiento de una
respuesta de defensa por parte de la planta, encapsular a la bacteria contra el estrés fisiológico que
existe en el canal de infección, identificar a la bacteria ante el receptor de la planta adecuado... Otro
factor a considerar es el hecho de que esta matriz extracelular puede formar una estructura gelatinosa
en presencia de iones de calcio (Morris V. y col., 1989). Dicha capacidad podría servir para retirar los
iones de Ca2+ presentes en el entorno de la pared vegetal, que normalmente son utilizados para
estabilizar y organizar a las pectinas recién sintetizadas y, por tanto, debilita esa zona de la pared
habilitando así un lugar propicio para la infección. Además, la presencia de un gel de naturaleza tan
rígida puede servir a la bacteria como punto de apoyo para entrar en el pelo aprovechando la presión
que ejercen las sucesivas divisiones de la bacteria. De este modo se origina una invaginación de la
membrana del pelo por la cual las bacterias infectan a la planta.

Paralelamente y coincidiendo con la entrada de la bacteria en el pelo radicular, en el interior del mismo
se produce un trasiego de vesículas que volcarán su contenido en el entorno de la bacteria (Brewin
N.J., 1991) formando así los primordios del canal de infección, estructura a través de la cual las
bacterias van a discurrir por la planta hasta llegar al nódulo. Las estructuras preinfectivas se inducen
por acción de LCOs en leguminosas con nódulos indeterminados (van Brussel A.A.N. y col., 1992), y
en algunas con nódulos determinados como Lotus, aunque no en Phaseolus (van Spronsen P.C. y
col., 2001; Niwa S. y col., 2001). Más tarde se detallan estos dos tipos de desarrollo del nódulo. La
formación del dicho “camino” de infección está dirigida por la planta merced a la deformación del
citoesqueleto que induce una invaginación en la vacuola generando los llamados puentes
citoplasmáticos (van Brussel A.A.N. y col., 1992) cuya orientación comunica unas células con otras y
por los cuales irá creciendo la bacteria. A lo largo de toda la luz del canal existe una matriz
glucoproteica cuyos componentes proceden tanto de la planta como de la bacteria (Broughton W.J. y
col., 2000). Así, por parte de Rhizobium nos encontramos, entre otros, glúcidos cíclicos,
lipopolisacárido (LPS), fundamental para una correcta infección, succinoglucano y EPS, siendo éste
último crucial para la iniciación y posterior elongación del canal de infección (Cheng H.P. y Walker
G.C., 1998). La planta por su parte, entre los distintos compuestos que liberan las vesículas al canal
de infección, aporta arabinogalactanos (o PsENOD5 en guisante) y proteínas ricas en prolina como
ENOD12, pero el componente principal es material glucoproteico denominado glucoproteína de matriz
(MGP) (VandenBosch K.A. y col., 1989), recientemente identificado como un tipo de extensina
(Wisniewski J.P. y col., 2000), que es secretada por las células del pelo radicular y del córtex y que se
acumula tanto en el canal de infección como en los espacios intercelulares de células no infectadas
(Rae A.L. y col., 1991). Es una glucoproteína constitutiva cuya expresión en el proceso de infección
se ve incrementada y cuya presencia es necesaria para el desarrollo del canal de infección (Rae A.L.
y col., 1992). Se la ha relacionado con un mecanismo de defensa de la planta, al observar cómo plantas
infectadas con bacterias mutantes en la síntesis de lipopolisacárido (LPS), aumentan su secreción
(Perotto S. y col., 1994).

DESARROLLO DEL NÓDULO

Dependiendo del sistema simbiótico podemos encontrar dos tipos de nódulos: determinados o
indeterminados. Ello va a venir dado por el lugar en donde se induzcan las divisiones mitóticas en la
raíz. Así, si se originan en el córtex interno se originan nódulos indeterminados y si lo hacen en el
córtex externo nódulos determinados. Ambos tipos de nódulos, además de presentar una estructura
anatómica distinta, también difieren en la forma en que se comporta la bacteria dentro del nódulo en
formación. A pesar de ello, la inducción del ciclo celular en ambos sistemas sigue la misma regulación.
Desarrollo del nódulo indeterminado
Los nódulos indeterminados se dan en plantas como las del
género Medicago, Pisum, Trifolium y Vicia. En este tipo de nódulos son las células del córtex interior
las que se reintroducen en el ciclo celular, además, tienen la característica de poseer un meristemo
permanente, lo que les otorga una forma cilíndrica con simetría radial en la organización de los tejidos.
Así en la zona más exterior se hallan las células vacuoladas del córtex, y hacia el interior se encuentran
la endodermis y el parénquima, en donde también aparecen los haces vasculares. Todo ello cubre una
zona central en donde Rhizobium se alberga y realiza la fijación de nitrógeno.
Desarrollo del nódulo determinado
Este tipo de nódulos es inducido en plantas como las del
género Phaseolus, Glycine, Vigna y Lotus, entre otras. A diferencia que en los indeterminados, en esta
clase de nódulos no hay un meristemo permanente. Así, su crecimiento se basa en la expansión en
vez de en la división celular, razón por la que presentan una morfología esférica en vez de cilíndrica
(Hirsch A.M., 1992). La causa de la ausencia de un meristemo permanente la podemos encontrar en
el proceso de formación. Se ha comprobado que las primeras divisiones celulares en respuesta a la
presencia de Rhizobium son anticlinales y se producen en la hipodermis (Newcomb W. y col., 1979;
Rolfe B.G. y Gresshoff P.M., 1988). A continuación, se genera otro foco de división celular en el
periciclo. Posteriormente, estos dos meristemos convergen generando el primordio nodular, en el cual
podemos encontrarnos células no vacuoladas procedente de las divisiones de la hipodermis
conformando el tejido central del nódulo, y células con un elevado grado de vacuolización procedentes
de las divisiones en el periciclo, componiendo el parénquima nodular que rodea al tejido
central. gran parte de la actividad mitótica en la región central del nódulo se pierde transcurridos 12 a
18 días tras la inoculación (Newcomb W. y col., 1979). Algunas células de este tejido central son
invadidas a través de los canales de infección y pueden ser identificadas por su gran tamaño y
densidad, debidos a la elevada presencia de simbiosomas en su interior. Estos simbiosomas, a
diferencia de los existentes en nódulos indeterminados, pueden presentar más de un bacteroide en su
interior. El resto de células, no infectadas, presentan un tamaño inferior y con una elevada
vacuolización; además, en soja se ha comprobado que expresan la enzima uricasa encargada de la
producción de ureidos que es la forma en la que se distribuyen los compuestos nitrogenados en estas
plantas. Por otro lado, en el parénquima se encuentran varias capas de células separadas por exiguos
espacios intercelulares y con un elevado contenido de proteínas ricas en prolina en su pared, que
pueden contribuir a limitar la difusión del oxígeno al tejido central (Tjepkema J.D. y Yocum C.S., 1974).
Sin embargo, el parénquima no tiene únicamente esta función protectora, ya que posiblemente puede
participar en la producción de ureidos, al haberse detectado en la zona de contacto con el tejido central
células que presentan un elevado número de peroxisomas, así como un gran retículo endoplasmático
y la enzima uricasa (Newcomb E.H. y col., 1989).
DIFERENCIACIÓN DEL SIMBIOSOMA
De forma paralela al desarrollo del nódulo, Rhizobium se distribuye por el mismo a través de los
canales de infección, o a través de la división de células previamente infectadas, según se trate de un
nódulo indeterminado o determinado, a la par que va sufriendo una serie de modificaciones que
culminan en la formación del simbiosoma, el cual presenta una serie de características que son
indispensables para realizar la actividad fijadora de nitrógeno.

En un simbiosoma se pueden distinguir los siguientes componentes:

1) Membrana peribacteroidea (mpb)
2) Fluido peribacteroideo (fpb)
3) Bacteroide
Membrana peribacteroidea
Está envuelta es absolutamente necesaria para la actividad del simbiosoma (Regensburger B. y
col., 1986), al servir de intermediario de señales y nutrientes entre la bacteria y la planta. Aunque tiene
su origen en la porción de la membrana plasmática vegetal que rodea a Rhizobium durante la invasión,
la naturaleza de la mpb madura se asemeja más a la de la membrana del tonoplasto.
Se ha podido determinar que en el simbiosoma se acumula Ca 2+ (Vincent J.M. y Humphrey B.A.,
1963) y que además participa en la regulación de protein–quinasas de membrana que controlan el
transporte de malato y amonio a través de la mpb.

Fluido peribacteroideo
El fluido peribacteroideo (fpb), definido como el material soluble existente entre la mpb y el
bacteroide, mantiene en contacto la superficie de ambos, estableciendo una zona que permite la
interacción, es donde se va a acumular una alta concentración de H+ debido a la actividad ATPasa de
la mpb .

Bacteroide

La diferenciación de los bacteroides fue observada por primera vez por Beijerinck en 1888
(Beijerinck M.W., 1888). Dependiendo del sistema simbiótico, los rizobios al invadir las células del
córtex sufren un destino distinto. En nódulos indeterminados las bacterias que se liberan al citoplasma
dejan de dividirse poco después de diferenciarse. En el proceso de diferenciación pueden o bien
aumentar su tamaño original de cuatro a siete veces, como es el caso de Sinorhizobium meliloti, o bien
adquirir un forma de “Y”, como el caso de Rhizobium leguminosarum. En nódulos determinados sin
embargo, las células infectadas mantienen momentáneamente la actividad mitótica por lo que las
bacterias en el interior de la gota endofítica siguen dividiéndose con el fin de poder mantener su
presencia en las células vegetales recién formadas. Al igual que en nódulos indeterminados las
bacterias incrementan su tamaño aunque no cambian de forma.