PRÁCTICA 1

Material y Equipo Utilizado en el Laboratorio de Virología

INTRODUCCIÓN

La selección y uso adecuado del material del laboratorio es fundamental para el

éxito del experimento y trabajo de laboratorio. La eficiencia del trabajo exige disponer
del material adecuado en cantidad y calidad, tenerlo en buenas condiciones,
convenientemente preparado e identificado y bien ordenado para poder usarlo
inmediatamente en cualquier momento, aunque actualmente el uso de material
desechable se ha incrementado.

El lavado de material empleado en cultivo celular, es uno de los procesos en

los que se debe exigir el mayor esmero, ya que las superficies de cristal pueden estar
limpias, pero habitualmente son inadecuadas para los métodos de cultivo celulares. El
material debe ser de buena calidad, ya que la toxicidad del vidrio, impide el
crecimiento celular. A menudo las células se dividen abundantemente en ciertas áreas
de la superficie de cristal y mueren en áreas vecinas, a veces las áreas tóxicas no
afectan a las células hasta que se adhieren y comienzan a dividirse.

Gran parte de las técnicas requieren de material estéril por lo que deben
observarse precauciones de asepsia en el manejo del mismo para evitar
contaminaciones. Todo material debe esterilizarse inmediatamente después de su
empleo, para que pueda ser manipulado sin riesgo para su uso posterior.

LAVADO DE MATERIAL
Existen diferentes trenes de lavado para el material de virología y de igual manera
tratamientos particulares dependiendo del tipo de material a utilizar (ej. Si es nuevo,
sucio, contaminado etc.).

Detergentes más empleados

Extran, Stergene, 7X, Microsolve y Decon 25.

Álcalis: Jabón suave, Trifosfato de Sodio, Carbonato de Sodio, Metasilicato de Sodio.

ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL

La esterilización del material se puede llevar a cabo principalmente por dos métodos:

FÍSICOS.

Calor húmedo (autoclave): En general 15 libras de presión, 121º C. durante 15

minutos. Este tipo de esterilización se utiliza para material resistente a esta
temperatura.
Calor seco (horno Pasteur): General 170º C durante 2 horas. Este tipo de
esterilización se utiliza exclusivamente para material de vidrio.

También se emplea la incineración (animales muertos) y flama directa (área de

trabajo).

Radiaciones: Utilizando luz ultravioleta o rayos gamma por 24 horas.

Esencialmente utilizado para material de plástico.
Filtración: Principalmente para material y soluciones termolábiles.

QUÍMICOS.

Óxido de etileno.

OBJETIVOS

Familiarizar al estudiante con el material y equipo utilizado en el laboratorio de

virología veterinaria.
Adiestrar al estudiante en el manejo, cuidado y preparación del material que se
utiliza en el laboratorio de virología veterinaria.

Material por Equipo

Pipetas graduadas

Matraz Erlenmeyer

Cajas y tubos para cultivo

Jeringas
 Cajas de Petri

Vasos de precipitados

Papel estraza

Franela

Alcohol al 70%

Marcador indeleble

Material y Equipo por Grupo

Agua con Extrán

Agua destilada

Agua desmineralizada

Horno Pasteur

Autoclave

Masking Tape

Escobillones

Servitoallas

Jabón líquido para manos

 MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

LABORATORIO DE VIROLOGÍA

Práctica 1. Material y equipo utilizado en el

laboratorio de Virología.

Nombre del alumno__________________________

____________________________________________

Grupo____________ Equipo_____________

Semestre_____________ Fecha_____________

ACTIVIDAD PREVIA A LA PRÁCTICA

1. ¿Cuál es la diferencia entre material y equipo utilizado en el laboratorio?

2. Menciona 5 materiales de cristalería, 5 materiales de plástico que se utilizan en

el laboratorio y 5 equipos que se utilizan en el laboratorio de virología

3. ¿Cuáles son las constantes de esterilización del horno Pasteur y para que tipo
de material se recomienda usar?

4. ¿Cuáles son las constantes de esterilización en autoclave y que tipo de

material se puede esterilizar por este método?

5. ¿Cómo se esterilizan las substancias termolábiles en el laboratorio de

virología?
PROCEDIMIENTO

I. Previo tratamiento de inactivación del material que se utilizará, se iniciara el

tren de lavado.
II. Sumergir el material de vidrio (exclusivamente) que este manchado en solución
crómica (dicromato de potasio y ácido clorhídrico), dejar el material en estas
condiciones entre 24 a 48 horas.

III. Sacar el material y enjuagar exhaustivamente con agua corriente.

IV. Escurrir el exceso de agua.

V. Tallar con escobillón y sumergir en un recipiente que contenga detergente no

iónico (Extran), dejar el material en estas condiciones entre 5 a 10 minutos.

VI. Sacar el material y enjuagar exhaustivamente con agua corriente.

VII. Escurrir el exceso de agua.

VIII. Enjuagar abundantemente en un recipiente que contenga agua destilada.

IX. Escurrir el exceso de agua.

X. Enjuagar abundantemente en un recipiente que contenga agua

desmineralizada o desionizada.

XI. Escurrir el exceso de agua.

XII. Preparar el material para esterilización de acuerdo a las instrucciones del

profesor.

BIBLIOGRAFÍA

Ian F.R. Culture of animal cells, a manual of basic technique. 2da edition. Ed. A
John Wiley & Sons, INC., Publication. 1987.

Coll M.J. Técnicas de diagnóstico en Virología. Ed. Díaz de Santos S.A. 1993.
 PRÁCTICA 2

MÉTODOS DE PURIFICACIÓN VIRAL (ELECTROFORESIS EN GEL DE

POLIACRILAMIDA)

INTRODUCCIÓN

Esta técnica se basa en la separación de los principales constituyentes

proteicos de una mezcla en zonas distintas, según su peso molecular y bajo la
influencia de un campo eléctrico, pH y temperatura entre otras.

Se conoce como electroforesis al movimiento de partículas cargadas bajo la

influencia de un campo eléctrico. Esta técnica permite identificar los componentes
simples en las mezclas complejas. Cuando el antígeno proteico se quiere caracterizar
y se encuentra mezclado con otros antígenos, puede hacerse primero una separación
por electroforesis en gel de poliacrilamida con duodecil-sulfato de sodio (SDS-PAGE
[por sus siglas en inglés "polyacrylamide gel electrophoresis"]), de manera que la
posición de las diferentes proteínas en el gel esté en función de su tamaño molecular.

Los geles de poliacrilamida constituyen un excelente medio de soporte para

separaciones electroforéticas, dado que reúnen propiedades idóneas: transparencia,
elasticidad, porosidad controlable y compatibilidad con una gran variedad de
compuestos químicos.

Los aminoácidos y proteínas poseen cargas positivas y negativas debido a la

presencia de grupos ionizables con el grupo carboxilo o el grupo amino, por lo que en
una solución pueden estar cargados positiva o negativamente o como moléculas
neutras o sin carga (punto isoeléctrico).

En la técnica de SDS-PAGE, se mezclan las proteínas con un detergente

aniónico SDS para formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. Los
complejos proteína/SDS poseen una estructura elipsoide o de bastón, donde la
cadena proteica es distendida y solubilizada por el detergente, estas van a ser
separadas en el gel poroso fundamentalmente con base en sus diferencias de peso
molecular (PM): a menor tamaño, mayor movilidad de la proteína y viceversa.

1.- Controles

Se establecen como controles marcadores de peso molecular (PM) de diversas

proteínas ya conocidas para así comparar las bandas y determinar su PM.
2.- Antígenos: vacunas comerciales, sobrenadante de cultivos celulares entre otros.

3.- Colorantes: estos son importantes ya que se unirán a la proteína separada

previamente permitiendo identificar el respectivo peso molecular.

La elaboración de los geles consta de dos partes (gel separador y concentrador

o compactador); para la observación correcta de las proteínas. En el gel separador, la
movilidad es restringida por el tamaño del poro, el cual depende de la concentración
de reactivos del gel. Así, si se requiere resolver componentes de muy alto PM, se
utilizan geles al 5% o al 7,5%, mientras que los geles de poro menor, ej. 15-20% son
útiles en la separación de péptidos y proteínas pequeñas. Los geles de poro
intermedio (10-12%) proveen una separación adecuada para proteínas de ~10.000-
90.000 daltons.

Partes de un gel de SDS-PAGE. Está compuesto de dos geles de distinta porosidad y

pH, que cumplen con funciones diferentes, para aumentar el poder de resolución.
APLICACIONES:

Monitoreo de los esquemas de purificación.

Análisis de la pureza del producto aislado.

Combinación con técnicas de Inmunoelectrotransferencia o Western blot.

OBJETIVO

El alumno conocerá el principio de la técnica así como las ventajas,

desventajas y distintas aplicaciones en el laboratorio de Virología.

MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

LABORATORIO DE VIROLOGÍA

Práctica 2. PRUEBA QUE DETECTA ANTÍGENOS

(PROTÉINAS): ELECTROFORESIS

Nombre del alumno__________________________

____________________________________________

Grupo____________ Equipo_____________

Semestre_____________ Fecha_____________

ACTIVIDAD PREVIA A LA PRÁCTICA

1. ¿Qué se detecta con esta técnica?

2. ¿Cuál es el fundamento de la técnica de electroforesis?

3. ¿Cuáles son las concentraciones del gel de poliacrilamida que se utiliza en la

prueba de electroforesis?
 4. ¿Qué es un marcador de pesos moleculares y para qué sirve?

5. ¿Cuál es el colorante que se utiliza para teñir las proteínas en el gel de

poliacrilamida?

Material por grupo

Matraces de 50ml.
Soluciones para la electroforesis.
Pipetas de 10 ml.
Agua desionizada.
Micropipetas con puntas.
Cámara de electroforesis.
Fuente de poder.
Vacunas.
Marcador de peso.
Algodón.
Alcohol al 70%.
Franela.
Marcador indeleble.
Servitoallas.

Bolsas de residuos biológico infecciosos roja y amarilla.

Solución con desinfectante (cloro).

Material que deben traer de manera individual

Guantes de exploración.

PROCEDIMIENTO

+ Armar la cámara de electroforesis.

+ Preparar las soluciones para el gel separador con los reactivos a temperatura
ambiente.

Gel separador (12%).

Agua Destilada 3.35 ml

Tris HCl 1.5 M pH 8.8 2.5 ml

SDS stock 10% 100 l

Acrilamida-Bis (stock 30%) 4 ml

Persulfato de amonio 10% (100 mg/ml.) 50 l

Temed _5 l___

Total 10ml

+ Dejar polimerizar 30 minutos.

+ Colocar el gel concentrador.

Gel concentrador (4%)

Agua Destilada 1.5 ml

Tris HCl 0.5 M pH 6.8 0.625 ml

SDS stock 10% 25 l

Acrilamida-Bis (stock 30%) 0.325 ml

Persulfato de amonio 10% (100 mg/ml.) 12.5 l

Temed _2.5 l___

Total 2.5 ml

+ Dejar polimerizar 45 minutos.

+ Enjuagar el gel con solución tampón de corrida 1x.

+ Colocar las muestras (antígenos vacunales), previamente preparadas con buffer de
lisis y de muestra, además de colocar el marcador de peso preteñido (10 l).

+ Correr a 120 volts constantes y parar diez minutos después de que salga el
colorante de las muestras.

+ Desmontar el gel y teñir con Comassie.

+ Interpretación y análisis.

DISPOSICIÓN FINAL DE DESECHOS BIOLÓGICOS

Inspeccionar e identificar el material biológico para clasificarlo de acuerdo a su

origen y tipo según la tabla anexa.

Tipo de residuos Estado físico Envasado Color

Sangre Sólidos Bolsa de Rojo

plástico
Cultivos celulares y virus

Residuos no anatómicos Líquidos Recipientes Rojo

derivados de la práctica herméticos

Sólidos Bolsa de Amarillo

plástico
Patológicos (cadáveres,

fluidos, órganos y Líquidos Recipientes Amarillo

embriones de pollo) herméticos

Objetos punzo cortantes: Sólidos Recipientes Rojo

agujas hipodérmicas, rígidos
porta y cubre objetos, y
cristalería

El material de cristalería utilizado durante la práctica como son tubos,

matraces, frascos etc. que hubieran estado en contacto con los RPBI serán
inactivados utilizando un desinfectante (cloro) y posteriormente lavados y
esterilizados.
 MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

LABORATORIO DE VIROLOGÍA

Práctica 2. Métodos de purificación viral

(Electroforesis en gel de poliacrilamida)

Nombre del alumno__________________________

____________________________________________

Grupo____________ Equipo_____________

Semestre_____________ Fecha_____________

REPORTE DE RESULTADOS

1. Menciona las características físicas y químicas del virus identificado por esta
técnica.

2. ¿Qué resultado obtuviste en el gel? Dibújalo.

3. ¿Para qué sirve realizar esta técnica en el laboratorio y por qué es importante
dicha técnica?
BIBLIOGRAFÍA

Abbas, A.K., Lichtman, A.H. y Pober, J.S. Inmunología Celular y Molecular. Tercera
Edición. Ed. McGraw-Hill-Interamericana. 1998.

Coll M.J. Técnicas de diagnóstico en virología. Ed. Díaz de Santos S.A. 1993.

Dinter, Z. Diagnostic procedures at the NVI. Diagnostic virology: special part, p. 63. In
J. Moreno-Lopez (ed.), Diagnostic virology: a review of methods at the National
Veterinary Institute. Swedish University of Agricultural Sciences/National Veterinary
Institute/Swedish International Developing Authority, Uppsala, Sweden. 1989.

Westermeier R. Electrophoresis in practics. 4ta edition. Wiley-VCH. 2005.

 PRÁCTICA 3

Microscopia Electrónica

INTRODUCCIÓN
Tanto el electrón como el fotón tienen propiedades muy semejantes, al ser
partículas asociadas a una onda electromagnética y puesto que un objeto se ve
gracias a los fotones que envía, también se puede observar bombardeándolo de
electrones.

La luz visible tiene una gran longitud de onda lo que causa el fenómeno de
difracción, esto impide distinguir 2 puntos separados por menos de 4 diezmilésimas de
milímetro. Los rayos ultravioleta permiten obtener aumentos del orden de 1500 veces,
por tener menor longitud de onda, y el haz de electrones, al tener una longitud de onda
mas corta proporciona ampliaciones superiores. La longitud de onda asociada al
movimiento rápido de los electrones es 100,000 veces menor que de las radiaciones
luminosas, lo que se traduce en aumentos del orden de 100,000X o más.

Las diferencias entre el microscopio óptico y el microscopio electrónico se

basan en las características propias del electrón. Estos son partículas negativas cuyos
ases no pueden atravesar el aire y el cristal como lo hace la luz, por lo que no pueden
impresionar la retina. Estos inconvenientes se solucionan aplicando vació en el interior
del aparato, con el fin de que las moléculas del aire no constituyan un obstáculo para
los electrones; las lentes ópticas de cristal son reemplazadas por lentes
electromagnéticas y el haz de electrones forma una imagen en una pantalla
fluorescente o también sobre una emulsión sensible para la obtención de fotografías
de la imagen.

TIPOS DE MICROSCOPIOS ELECTRÓNICOS

Existen dos tipos principales de microscopios electrónicos:

Microscopio electrónico de transmisión (MET): se lanza un rayo de

electrones a través de la muestra del cual se obtienen imágenes
bidimensionales similares ha radiografías, en las cuales se puede identificar
algunas características estructurales y de tamaño.
 Microscopio electrónico de barrido (MEB): se bombardea la superficie de la
muestra generándose electrones secundarios de los cual se obtienen
imágenes tridimensionales, en las cuales se puede identificar características
estructurales, además, de información sobre la composición de las muestras
estudiadas.
Usos:

Investigación: ayuda a conocer la estructura viral, además de su composición.

Diagnostico: identifica partículas virales directamente en las muestras.

TOMA Y ENVÍO DE MUESTRAS

Se deben seguir los mismos procedimientos de toma y envío de muestras que

generalmente se utilizan para el laboratorio de virología. Pero los métodos de
conservación son diferentes, ya que en este caso se puede utilizar la congelación (-200
C) o se utiliza glutaraldehido, tetracloruro de osmio o acroleína como conservadores
químicos que no altera las estructuras proteicas (Precaución, son altamente tóxicos).

Las muestras que se pueden enviar son:

Lesiones vesiculares y costras.
Heces.
Secreciones respiratorias.
Sangre y suero.
Exudados y trasudados.
Líquido cefalorraquídeo.
Tejidos.
Cultivos celulares.

PROCESAMIENTO GENERAL DE LA MUESTRA

Muestras de tejidos: se selecciona el área lesionada mediante técnicas

histopatológicas, posteriormente se deshidrata el tejido y se embebe en resina epoxy,
para formar un pellet, mediante un ultramicrotomo se realizan cortes finos de 500nm
de grosor, se colocan en una rejilla de cobre o platino y se sigue el procedimiento de
tinción. Una técnica alterna es mediante la congelación del cubo de tejido y la
realización de cortes ultrafinos, para posteriormente seguir un procedimiento de
tinción.

Muestras liquidas: se centrifugan a 60,000 - 100,000 rpm., mediante una

ultracentrífuga para concentrar las partículas virales, formándose un pellet en el fondo
del tubo, se retira el sobrenadante, y se agrega agua destilada, volviendo a suspender
el pellet, posteriormente se vuelve a centrifugar. Se toma una gota del pellet y se
coloca en una rejilla de cobre o platino recubierta de colodión. Se tiñe y se observa al
microscopio.

Muestras de heces: a una pequeña cantidad de heces se le agrega agua destilada y

se homogeniza, posteriormente, se sigue el mismo procedimiento para muestras
liquidas.

TÉCNICA DE INCLUSIÓN DE MUESTRAS EN RESINA

Fijación con glutaraldehido.

Lavado con solución buffer.
Postfijación con tetroxido de osmio al 1%, 90 minutos.
Lavado con solución buffer.
Deshidratación mediante alcoholes progresivos.

Alcohol al 50%, 3 minutos; alcohol al 60%, 3 minutos; alcohol al 70%, 3 minutos;

alcohol al 80%, 3 minutos; alcohol al 100%, 15 minutos (repitiendo este paso 3 veces
con cambios de alcohol).

Infiltración de la muestra
Se sumerge la muestra en oxido de propileno por 10 minutos, repitiendo este paso 3
veces con cambios de la solución.

Posteriormente se sumerge la muestra en una solución de oxido de propileno y resina

en relación 2:1, durante 60 minutos; se realiza un segundo paso sumergiendo la
muestra en una solución de oxido de propileno y resina en una relación 1:1.

Para la preinclusión, se coloca la muestra destapada un día antes en la

campana de deshidratación para que evapore el oxido de propileno; a la
muestra se le retira el exceso de resina.
 Las muestras se colocan en papel aluminio y se meten al horno a 60° C una
hora, adicionándoles resina pura; posteriormente, este paso se vuelve a repetir
recambiando la resina.
Para la inclusión se colocan las muestras en cápsulas de gelatina y se llenan
con resina colocándolas en el horno a 60° C por 24 horas.
Posteriormente se realizan cortes semifinos y se tiñen con azul de toluidina
para elegir la zona de interés y enseguida se realizan cortes finos montándolos
en rejillas de cobre para observarse al microscopio electrónico.

Técnicas de tinción

Tinción negativa: las partículas virales no dispersan los electrones lo

suficiente como para ser visible al microscopio electrónico, por lo que se
utilizan metales pesados como el acetato de uranilo, ácido fosfotungstico o
molibdato de amonio entre otros, para dar un fondo electrón-opaco mediante el
cual se pueden visualizar las partículas. Obteniéndose imágenes
bidimensionales, que evidencian la estructura del virus.

Imbibición con oro: la muestra es sometida mediante cargas eléctricas a un

aerosol formado de oro coloidal. El cual se sedimenta en la superficie de la
muestra y se cristaliza. Posteriormente se observa en el MEB.

Críofractura: la muestra se congela y luego el bloque congelado se fractura

con una cuchilla quedando expuestas varias superficies externas e internas de
la muestra. Estas superficies se pueden teñir mediante tinción negativa o con
oro coloidal.

Inmunoelectroquímica: se utilizan anticuerpos marcados con oro o con

peroxidasa, que también es electrón-opaca, estos se ponen a reaccionar con la
muestra donde se unirán específicamente con los antígenos deseados y al
observarlos en el MET se observaran áreas sombreadas.

OBJETIVO
El alumno reconocerá los tipos de microscopios electrónicos que se utilizan y
su diferencia con el microscopio óptico, así como algunas técnicas de
procesamiento de muestras para el diagnóstico ultramicroscópico viral.
 MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

LABORATORIO DE VIROLOGÍA

Práctica 3. Microscopía Electrónica.

Nombre del alumno__________________________

____________________________________________

Grupo____________ Equipo_____________

Semestre_____________ Fecha_____________

ACTIVIDAD PREVIA A LA PRÁCTICA

1. ¿Cuántos tipos de microscopios electrónicos se conocen?

2. ¿Cuál es la diferencia entre ellos?

3. ¿Cuál es el virus más grande que se ha identificado, hasta el día de hoy?

4. ¿Cuáles son las técnicas de tinción que se utilizan en microscopía electrónica?

 BIBLIOGRAFÍA

1. Ingraham J.L., Ingraham C.A., Prentiss H. Introducción a la microbiología.

Editorial Reverte S.A. España 1998.

2. Mahy B.W.J., Kangro H.O. Virology methods manual. Ed. Academic Press
Inc. E.U.A. 1996.

3. Specter S., Lanez G.J. Clinical virology manual. Ed. Elsevier Science
Publishing Company Inc. E.U.A. 1990.

4. Stainer R.Y., Ingraham J.L., Wheelis M.L., Painter P.R. Microbiología. 2da.
Edición. Editorial Reverte S.A. España, 1996.
 PRÁCTICA 4

Inoculación de Animales de Laboratorio

INTRODUCCIÓN

En nuestros días la experimentación científica en sus aspectos básicos y

aplicados ha aumentado la necesidad de utilizar animales para su realización. Esta
experimentación muchas veces no sería posible realizarla en ausencia de los animales
de laboratorio. Tanto la prueba de nuevas drogas antivirales, como las terapias
alternativas para diferentes enfermedades son ensayadas en modelos biológicos, así
como también la elaboración de vacunas, comienzan con ensayos en cultivo de
células y finalizan en el empleo de modelos animales de la especie adecuada para el
problema que se quiere resolver.

Los modelos animales, permiten estudiar y comprender el origen de ciertas

enfermedades, así como analizar el mecanismo de innumerables procesos biológicos.
La inoculación de animales susceptibles fue el primer procedimiento empleado para el
cultivo de virus. Este método ha sido sustituido en parte por el cultivo del embrión de
pollo o por cultivos celulares, pero aún este, tiene la ventaja de que permite estudios
clínicos de la enfermedad.

IMPORTANCIA

La utilización de animales de laboratorio permitió que se desarrollaran, por

ejemplo, las vacunas para la rabia, ántrax, viruela, tétanos, difteria y poliomielitis,
además de la obtención de la insulina y diversos antibióticos y la dilucidación de la
estructura del ADN. Los avances de la investigación en cáncer, cardiología,
trasplantes de órganos, SIDA y la enfermedad de Alzheimer, pueden ser también
atribuidos en gran parte a los estudios realizados en animales de laboratorio.

La experimentación con animales es fundamental en las ciencias biomédicas,

no solo para comprender los mecanismos celulares que son la base de la vida, sino
también para favorecer el desarrollo de mejores métodos de prevención, diagnóstico y
tratamiento de las enfermedades que afectan al ser humano y a los animales. El uso
en el laboratorio de animales de experimentación es también indispensable para las
pruebas de potencia, alcance y seguridad de sustancias biológicas utilizadas en
medicina y para la determinación de la toxicidad de un gran número de compuestos
que se preparan por síntesis química y cuyo uso puede representar un riesgo para la
salud. Los animales constituyen un excelente sistema para el aislamiento de algunos
virus que no se replican ni en cultivos de células ni en embriones de pollo, así como
también para el estudio de la patogenia de las infecciones vírales. También
proporciona órganos y tejidos para la preparación de cultivos celulares.

FACTORES QUE SE DEBEN TOMAR EN CUENTA AL UTILIZAR ANIMALES DE

LABORATORIO:

1. Que sea apropiado y que permita la transferencia de la información.

2. Costo, disponibilidad y alojamiento.
3. Generalización de los resultados.
4. Facilidad y adaptabilidad a la manipulación experimental.
5. Número de animales necesarios para realizar el experimento.
6. Tiempo de vida.
7. Sexo, edad y progenie necesarias.
8. Especie, genética, susceptibilidad y raza.
9. Considerar la posibilidad de una protección con anticuerpos maternos o de una
incompetencia inmunológica.
10. Consecuencias ecológicas e implicaciones éticas del uso de los mismos.

ALGUNOS DE LOS INCONVENIENTES DEL EMPLEO DE ANIMALES SON:

1. Su elevado costo.

2. La limitación del espacio para jaulas y materiales.

3. La infección cruzada entre los animales.

4. Riesgo de infección en el laboratorio de otros animales y del hombre que los cuida.

5. Infección latente.

6. Falta de respuesta inmune.

7. El huésped natural es sin duda, el ideal para propagar y estudiar a los virus pero
esto no es práctico ni posible, cuando éste es el hombre o los animales de gran talla.
CLASIFICACIÓN
AXENICOS: son aquellos que se obtienen a partir de cesárea, la lactación y
alimentación se realiza de manera estéril, no presentan ningún tipo de flora en
su organismo.
GNOTOBIÓTICO O GENOTOBIÓTICO: son aquellos que previamente fueron
axénicos sólo que se le inocula a su flora 1 o 2 microorganismos conocidos, se
mantienen de manera controlada.
LIBRES DE PATÓGENOS ESPECÍFICOS (SPF): nacen de forma natural,
presentan flora normal, pero son mantenidos de manera controlada y no
presentan ningún tipo de microorganismos causantes de enfermedad.

ANIMALES DE LABORATORIO

Ratones

Los ratones son entre los animales de laboratorio, los más empleados para la
experimentación biomédica. El ratón lactante (menos de 48 horas de edad) y adulto
se utiliza para el aislamiento viral, principalmente para virus miembros del grupo
Coxsackie, Herpesvirus, Arbovirus y Reovirus.

Conejos
Se utilizan para la preparación de sueros hiperinmunes fundamentalmente, así
como para el diagnóstico de: Pseudorrabia, Rabia y Viruela de Mamíferos.

Cobayos
Son muy importantes en el campo de la nutrición. También son utilizados para el
aislamiento viral, obtención de suero, tejidos para cultivo de células, como fuente de
complemento. Además para la propagación de enfermedades neumotrópicas como
influenza, enfermedades vesiculares de los animales domésticos y rickettsias.

Hámster
Se utilizan para diagnóstico de enfermedades neurotrópicas y como fuente de
tejidos para cultivos celulares.
 Aves

Los pollos se utilizan para inoculaciones peculiares de la especie y para suministrar

glóbulos rojos para la reacción de hemoaglutinación, preparación de sueros
hiperinmunes y como fuente de tejido para cultivo celular.

Primates

El uso de estos animales fue decisivo para lograr la vacuna de la poliomielitis

(cultivos primarios de riñón y pruebas de neurovirulencia) y también para
comprender los fenómenos de compatibilidad sanguínea; otras enfermedades que
involucran estudios con primates son la malaria, sarampión, hepatitis y
enfermedades cardíacas. Por su parentesco con el hombre, los primates son
utilizados habitualmente en las últimas etapas del ensayo de nuevas terapias.

Perros y gatos

Estos animales representan menos de 1% de los animales utilizados en

investigación; los primeros se usaron para el desarrollo de la vacuna de parvovirus
canino y en ellos se realizó el primer trasplante exitoso de riñón. En los gatos se
realizaron estudios del mecanismo de la visión y de las inmunodeficiencias
(patología presente en el SIDA) y se desarrollo la vacuna contra leucemia felina.
Para el estudio del SIDA se ha demostrado que la inoculación del virus de
inmunodeficiencia felina en gatos es un mejor modelo para el estudio de la
enfermedad que el desarrollado en primates.

VÍAS DE INOCULACIÓN

La vía de inoculación depende del virus estudiado y su posible tropismo. Las

vías de inoculación más comúnmente utilizadas son:

Intracerebral. Intramuscular.
Intravenosa. Subcutánea.
Oral. Escarificación.
Intranasal. Ocular.
Intraperitoneal.
OBSERVACIONES DESPUÉS DE LA INOCULACIÓN

Después de la inoculación; diariamente deben examinarse los animales para

estudiar todo signo de infección y comprobar la duración del período de incubación.
Para las enfermedades neurotrópicas es recomendable un período de 3 - 4 semanas y
de 1 semana para las enfermedades neumotrópicas. Los animales que mueran en el
transcurso del período de observación se les deben realizar la necropsia y tomar las
muestras correspondientes.

TITULACIÓN DE LA INFECTIVIDAD DE LOS VIRUS

Toda investigación debe contar con métodos confiables para la medición de las
propiedades de los virus, la infectividad es la propiedad que más nos interesa. La
concentración de viriones infectantes de una suspensión puede titularse utilizando
diluciones decrecientes del material infeccioso a un determinado número de
hospedadores susceptibles (cultivos celulares, embriones de pollos, animales de
laboratorio u hospedador natural), observándolos para ver si hay evidencia de
replicación viral. La titulación de los virus se mide determinando la capacidad de
producir un efecto dado, por ejemplo: muerte del animal, efecto citopático, parálisis,
etc.

Para calcular el número de partículas infecciosas de la suspensión viral, se aplica

rus que mata, infecta, causa
parálisis etc. al 50% de la población huésped. De esta manera se pretende ser más
exacto, ya que con una dilución determinada de virus encontramos que muere el 50%
de los animales inoculados.

El título de infectividad de la suspensión original de virus es el número de Dosis

Letales 50% o Dosis Infectantes 50% por volumen inoculado.

Las dosis difieren en los distintos hospedadores por lo que es preciso hacer
referencia al sistema hospedador empleado, por ejemplo:

DI 50%: Dosis Infectante al 50%, aplicable a sistemas de unidad básica.

DICC 50%: Dosis Infectante en Cultivo Celular al 50%, aplicable en cultivo celular.

DIEP 50%: Dosis Infectante en Embrión de Pollo, aplicable en huevos embrionados.

 DLEP 50%: Dosis Letal en Embriones de Pollo al 50%, aplicable en huevos
embrionados.

DL 50%: Dosis Letal al 50%, aplicada en animales cuando la infección es seguida de

muerte.

DP 50%: Dosis Paralítica al 50%, aplicada en animales cuando la infección seguida de

parálisis.

Dilución
100 10 -1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9
del virus

* 10/10 9/10 8/10 7/10 6/10 5/10 4/10 2/10 1/10 0/10

DL 50% ó 100, 000 10, 000 ó 1000 100 ó 10 ó

5 4 3 2
1
DI 50% ó 10 10 ó 10 10 101

* Número de respuestas positivas sobre número de respuestas probables.

El PF 50% en este ejemplo es 10-5

TITULO = 105 DL 50%/Volumen inoculado.

El método bioestadístico de Reed & Müench es el más comúnmente utilizado para

la INTERPOLACIÓN (valor intermedio) del PF 50% en datos derivados de una
respuesta en la que no se observa el 50% de respuestas positivas y el 50% de
respuestas negativas.

Método de Reed & Müench

1) Disponer los datos en forma tabular.
2) Abarcar diluciones tanto las más bajas donde se obtienen todas las respuestas
positivas, como las diluciones más altas donde se obtiene todas las respuestas
negativas. En la práctica puede utilizarse el método con 2 diluciones próximas
al PF 50%.
3) Separar el número de respuestas positivas y negativas y hacer la acumulación
de respuestas positivas y negativas. El PF del siguiente ejemplo, está entre las
diluciones10-5 y 10-6 por lo tanto hay que calcular la dilución exacta donde está
el 50% de respuestas positivas por interpolación a partir de las frecuencias
acumuladas de las respuestas positivas y negativas.
 4) Las respuestas positivas acumuladas se suman desde la dilución más alta a la
más baja considerando que si en la dilución 10-7 se murieron 2 es de esperarse
que se mueran también en la dilución 10-6 además de los 4 que murieron en
esta dilución. Igual sucede con la acumulación de respuestas negativas, si en
la dilución 10-3 hubo un negativo es de esperarse que en la dilución 10-4
también será negativo, además de los 3 negativos de esta dilución.
5) Obtener la proporción de respuestas positivas sobre respuestas negativas y el
porcentaje de respuestas positivas a partir de los totales acumulados.
6) Aplicar la siguiente fórmula para determinar la distancia proporcional (DP) en la
que se estima está el PF 50% entre las diluciones 10-5 y 10-6.
DP = %>50 50
%>50 - %<50
7) Determinar el PF con la siguiente fórmula:
PF 50% = Log de la dilución del % >50% + (DP X log del factor de dilución)

8) Determina el título con la siguiente fórmula

Título: Inverso del PF 50%.

Ejemplo:
Se tituló un virus de Newcastle en embrión de pollo inoculando 0.1ml., por embrión,
evaluando la letalidad del virus, los resultados obtenidos fueron los siguientes:

Dilución del virus 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8
No. de respuestas positivas/ No.
10/10 9/10 7/10 6/10 4/10 2/10 0/10
de respuestas probables
Respuestas positivas 10 9 7 6 4 2 0
Respuestas negativas 0 1 3 4 6 8 10
Positivos 38 28 19 12 6 2 0
Negativos 0 1 4 8 14 22 32
Totales Positivos sobre
acumulados 38/38 28/29 19/23 12/20 6/20 2/24 0/32
totales
% de respuestas
100 96.50 82.60 60.0 30.0 8.3 0
positivas

DP = %>50 50 Sustituyendo: 60 - 50 = 10 = 0.333

%>50 - %<50 60 30 30
PF 50% = Log de la dilución del % >50% + (DP X log del factor de dilución)
Sustituyendo:
-5 + (0.33) (-1) = -5.33
PF 50% = 10-5.33
Titulo: Inverso del PF 50%.
Sustituyendo: 10-5.33 5.33
DLEP 50%/0.1ml.

REGLAMENTACIÓN PARA EL USO DE LOS ANIMALES EN INVESTIGACIÓN

Desde hace muchos años la mayoría de los países poseen leyes generales o
regulaciones que sancionan el maltrato de los animales, pero las pautas para el uso
científico de los mismos son relativamente recientes. La primera ley de protección de
animales fue sancionada en Inglaterra en 1876; en ella se incluía una referencia a los
animales de experimentación.

En los países desarrollados se han intentado crear normas éticas para el uso
de animales para la investigación, docencia y experimentación. Algunos poseen
legislaciones muy severas como Gran Bretaña, otros países europeos tienen
regulaciones o requisitos bien especificados y controles severos para el uso de
animales de investigación. En Canadá existe un programa de control que aparte del
cuidado de los animales, implica la acreditación y entrenamiento de las personas que
trabajan con ellos. En estados unidos además de las disposiciones legales que cada
institución debe establecer, estos deben ser controlados por un comité de ética y de
cuidado de uso de animales. En México se aplica la NOM-062-1999, especificaciones
técnicas para la producción, cuidado y uso de animales de laboratorio y la NOM-033-
ZOO-1995, Sacrificio humanitario de los animales domésticos y silvestres.

En la mayoría de los países de Occidente se condena el maltrato a los

animales; en muchos de ellos se eliminaron las peleas de gallos, perros y corridas de
toros. No hay duda que los animales pueden sufrir y que debe evitarse al máximo su
sufrimiento, pero no puede ponerse al mismo nivel el uso de gallos o perros para
peleas, que la utilización y mantenimiento de animales para el desarrollo de nuevas
vacunas y terapias
 PRINCIPIOS INTERNACIONALES PARA LA GUÍA EN INVESTIGACIÓN
BIOMÉDICA QUE INVOLUCRA EL USO DE ANIMALES.

1. El avance del conocimiento en el área de la biología y el desarrollo de

mejores medios para la protección de la salud y bienestar tanto para el
hombre como en los animales, requiere como recurso, la experimentación
con animales vivos e intactos de una gran variedad de especies.

2. Métodos tales como modelos matemáticos, simulación por computadora o

ensayos biológicos in vitro deberían ser usados en forma prioritaria,
siempre que se consideren apropiados.

3. Los experimentos con animales deben ser establecidos solamente después

de estudiar su importancia y relevancia para la salud y el avance del
conocimiento.

4. Los animales seleccionados para un experimento deben ser de la especie y

calidad apropiada para el mismo; debe usarse el mínimo número necesario
para la obtención de resultados científicos válidos.

5. Los investigadores y todo el personal involucrado nunca deben de dejar de

tratar a los animales como seres sensibles; deben tener en cuenta su
cuidado y uso adecuado tratando de minimizar su dolor, mortificación y
estrés como imperativos éticos.

6. Los investigadores deben inferir que aquellos procedimientos que causan

dolor en los seres humanos también causan dolor en otras especies de
vertebrados, a pesar de que se necesita profundizar más en el
conocimiento de la percepción de dolor en animales.

7. Los procedimientos con animales que causan más que un dolor

momentáneo o mínimo deben realizarse con una sedación apropiada,
analgesia o anestesia de acuerdo con las prácticas veterinarias aceptadas.
Cirugías y otros procedimientos dolorosos no deben realizarse con
animales sin anestesiar o paralizados por agentes químicos.

8. En el caso de requerirse dispensas con relación a las provisiones del

artículo 7, las decisiones deberían tomarlas no solo los investigadores
involucrados, sino un comité integrado adecuadamente, teniendo en cuenta
las provisiones de los artículos 4, 5 y 7. Estas excepciones no deben
tomarse con fines de docencia o demostración.
 9. Al final o en el momento adecuado durante un experimento, aquellos
animales que sufran dolor crónico o incapacidad irreversible deben ser
sacrificados sin dolor.

10. Deben procurarse las mejores condiciones de habitabilidad para los

animales, el cuidado de los mismos debe estar bajo supervisión de
veterinarios con experiencia en animales de laboratorio.

11. Es responsabilidad del director de un instituto o departamento que utiliza

animales asegurar que los investigadores y personal tengan las
calificaciones o experiencia adecuadas para conducir experimentos con
animales. Deben ofrecer oportunidades de entrenamiento en estos servicios
en lo que concierne al cuidado y prácticas de los animales que van a
utilizarse tanto para el bienestar de estos como para la seguridad del
investigador.

La utilización de animales para propósitos científicos plantea problemas

morales y filosóficos por solucionar, para los cuales no existen criterios éticos
objetivos. Sí existe por el contrario, un consenso general de que la crueldad
deliberada es inaceptable. Los investigadores que utilizan animales deberían
ser conscientes de que están ejerciendo un privilegio y no un derecho, aunque

animales difiere de una cultura a otra.

OBJETIVOS

El alumno se familiarizara con el manejo adecuado de los animales más

comúnmente utilizados en el laboratorio de virología.
El alumno utilizará la técnica de inoculación de virus más adecuada, para su
propagación en un modelo animal utilizado en el laboratorio de virología.
 MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

LABORATORIO DE VIROLOGÍA

Práctica 4. Inoculación de Animales de

Laboratorio.

Nombre del alumno__________________________

____________________________________________

Grupo____________ Equipo_____________

Semestre_____________ Fecha_____________

ACTIVIDAD PREVIA A LA PRÁCTICA

1. Menciona 5 animales de laboratorio que se puedan utilizar en Virología.

2. Menciona las vías de inoculación en animales de experimentación.

3. ¿Cuáles son las ventajas de utilizar animales de laboratorio?

4. ¿Cuál es la función del CICUAE?

5. ¿Qué NOM regula el uso de animales de laboratorio?

Prá

Material por equipo

Pollo o pato (Aproximadamente de una semana a dos de edad).

Jeringa 1ml.

Alcohol al 70%

Torunda con alcohol

Virus

Franela

Marcador indeleble

Guantes de exploración (por alumno)

Material y equipo por grupo

Jaulas para pollo (con fuente de calor)

Bebederos

Comederos

Alimento

Viruta

Bolsas de residuos biológico infecciosos roja y amarilla

Recipiente para punzocortantes

PROCEDIMIENTO

Para la ejecución de algunas técnicas se recomienda previa tranquilización o

anestesia de los animales para facilitar el manejo.

Nota: la vía de inoculación a utilizar dependerá de la especie animal y el tipo de

virus a inocular.

OCULAR

1. Sujetar la cabeza del animal y mantener el ojo abierto del mismo.

2. Depositar la gota del inóculo sobre el ojo.

3. Dejar absorber.

INTRAPERITONEAL

1. Antisepsia de la zona.

2. Sujetar al animal en posición dorsal sobre la palma de la mano con los dedos,
meñique, anular, índice y pulgar.

3. Colocar al animal con la cabeza hacia abajo e inocular en la parte ventral, hacia un
lado de la línea media.

4. Antisepsia de la zona y retirar la aguja.

NASAL

1. Sujetar al animal de manera que pueda facilitarse la ejecución de esta técnica.

2. Dejar caer las gotas del inóculo en el orificio nasal, ayudándose de una jeringa
pequeña o de un gotero.

3. Dejar absorber.

Nota: esta inoculación puede ser peligrosa por la formación de aerosoles

DISPOSICIÓN FINAL DE DESECHOS BIOLÓGICOS

Inspeccionar e identificar el material biológico para clasificarlo de acuerdo a

su origen y tipo según la tabla anexa.

Tipo de residuos Estado físico Envasado Color

Sangre Sólidos Bolsa de Rojo

plástico
Cultivos celulares y virus

Residuos no anatómicos Líquidos Recipientes Rojo

derivados de la práctica herméticos

Patológicos (cadáveres, Sólidos Bolsa de Amarillo

fluidos, órganos y plástico
embriones de pollo)
Líquidos Recipientes Amarillo
herméticos

Objetos punzo cortantes: Sólidos Recipientes Rojo

agujas hipodérmicas , rígidos
porta y cubre objetos, y
cristalería

El material de cristalería utilizado durante la práctica como son tubos,

matraces, frascos etc. que hubieran estado en contacto con los RPBI serán
inactivados utilizando un desinfectante (cloro) y posteriormente lavados y
esterilizados.

MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

LABORATORIO DE VIROLOGÍA

Práctica 4 Inoculación de Animales de Laboratorio

Nombre del alumno__________________________

____________________________________________

Grupo____________ Equipo_____________

Semestre_____________ Fecha_____________

REPORTE DE RESULTADOS

1. ¿Qué vía de inoculación utilizaste en el animal de laboratorio empleado?

2. Menciona que vacuna utilizaste y qué características tiene.

3. ¿Cuál es la justificación para utilizar animales de laboratorio?

BIBLIOGRAFÍA

Han J and Van Hoosier G.L. Handbook of Laboratory Animal Science. Vol II.
Animal models. Second edition. CRC PRESS. 2003.

Han J and Van Hoosier G.L. Handbook of Laboratory Animal Science. Vol III.
Animal models. Second edition. CRC PRESS. 2005.

Mohanty S y Dutta S. Virología Veterinaria. Ed. Interamericana, México. 1983.

Reinhardt C.A. Alternatives to animal testing. VCH Edition. 1994.

Van Hoosier G.L and Han J. Handbook of Laboratory Animal Science. Vol I.
Essential principles and practices. Second edition. CRC PRESS. 2003.