MACROMOLÉCULAS DE LA LEVADURA

Vanessa Calderón; Marcela Velásquez; Jeniffer collazos; Luis Alberto Quintero

a
[email protected]; [email protected]; c [email protected];
d
[email protected]
Facultad de Facultad de Ciencias Básicas, Programa de Química, Universidad Santiago
de Cali
2018/03/14

I. RESUMEN
En la práctica realizada, se separaron por centrifugación las principales macromoléculas de
la levadura (proteínas, ácidos nucleicos y glucógeno) y posteriormente se identificaron por
pruebas cualitativas. Se utilizaron los métodos de decantación y centrifugación para obtener
la separación y algunas pruebas cualitativas para la identificación de dichas
macromoléculas. Se realizaron tres pruebas: la prueba con el reactivo de Lugol, prueba de
Bial y prueba de Biuret, obteniendo resultados positivos para todas.
PALABRAS CLAVE: prueba de Lugol, levadura, prueba de biuret, decantación,
centrifugación, ARN.

II. ABSTRACT

In practice, the main yeast macromolecules (proteins, nucleic acids and glycogen) were
separate by centrifugation and were later identified by qualitative tests. Decantation and
Centrifugation methods were used to obtain separation and some qualitative tests for the
identification of these macromolecules. Three Tests were carried out: the test with Lugol's
reagent, Bial test and Biuret test, obtaining positive results for all.
KEYWORDS: Lugol's test, yeast, biuret test, decantation, centrifugation, RNA.
III. INTRODUCCIÓN
La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto que ha sido
ampliamente estudiado dada su importancia en la industria panadera y vitivinícola, así como
por su capacidad de producir etanol. Filogenéticamente de las cepas de Saccharomyces
cerevisiae se ha encontrado que la especie en su conjunto consta de dos poblaciones,
domésticos y salvaje. Algunas características de esta levadura que forman parte de su
adaptación son el hecho de que pueda metabolizar la glucosa y la fructosa tanto por vía
respiratoria como por vía fermentativa, y de crecer en condiciones aerobias o anaerobias 1.
Los estudios relacionados con S. cerevisae y su rol en la fermentación han sido, por
ejemplo, la caracterización por métodos moleculares, modificación genética para producir
otras enzimas, la detección de otras levaduras que actúan contra S. cerevisae, evaluación
de factores nutricionales que afectan su comportamiento o de fracciones celulares que
protegen el proceso, etc. Tiene gran importancia en crecer en el zumo de uva, que se
caracteriza por un alto contenido de azúcares y bajo contenido desustancias de nitrógeno.
La especie produce altas cantidades de etanol a la vez que consume el contenido de
azúcares y baja el pH, que inhiben el crecimiento de cepas no- Saccharomyce 1
Las proteínas son compuestos orgánicos constituidos por aminoácidos dispuestos en una
cadena lineal y unida por vínculos péptidos. Las proteínas son ensambladas a partir de los
aminoácidos usando la información codificada en los genes. Cada proteína tiene su
propia secuencia de aminoácidos que se especifica por la secuencia de nucleótidos del gen
que codifica esta proteína 2.
Al igual que otras macromoléculas biológicas tales como polisacáridos y ácidos nucleicos,
las proteínas son partes esenciales de los organismos y participan en todos los procesos
del interior de las células 2. Muchas proteínas son enzimas que catalizan reacciones
bioquímicas y son vitales para el metabolismo. Las proteínas a demas tienen funciones
estructurales o mecánicas en los músculos y las proteínas del cito esqueleto, que forman
un sistema de andamiaje que mantiene la forma celular 2.
Otras proteínas son importantes en la señalización celular, la respuesta inmune, la adhesión
celular y el ciclo celular. Las proteínas son también necesarias en la dieta en los animales
ya que los animales no pueden sintetizar todos los aminoácidos que necesitan y debe
obtener los aminoácidos esenciales de los alimentos. A través del proceso de la digestión,
los animales se descomponen las proteínas en aminoácidos libres que se utilizan en el
metabolismo 2.
 Las proteínas son solubles: Disminuye con los aumentos de temperatura y pH.
Las proteínas son solubles si los enlaces débiles y fuertes están presentes.
 Las proteínas tienen capacidad electrolítica: La capacidad electrolítica de las
proteínas se determina mediante la técnica conocida como electroforesis.
 Especificidad de las proteínas: Las proteínas tienen funciones específicas. La
función específica de cada proteína, la determina su estructura primaria.
 Efecto tampón de las proteínas: Las proteínas actúan como amortiguador del pH
ya que pueden comportarse como ácidos o bases. Por este efecto las proteínas se
denominan de carácter anfótero 3.
Los ácidos nucleicos son las biomoléculas portadoras de la información genética. Tienen
una estructura polimérica, lineal, cuyos monómeros son los nucleótidos. El grado de
polimerización puede llegar a ser altísimo, con moléculas constituidas por centenares de
millones de nucleótidos en una sola estructura covalente. De la misma manera que
las proteínas son polímeros lineales aperiódicos de aminoácidos, los ácidos nucleicos lo
son de nucleótidos. La aperiodicidad de la secuencia de nucleótidos implica la existencia
de información. Existe una correlación entre ambas secuencias, lo que se expresa diciendo
que ácidos nucleicos y proteínas son colineales; la descripción de esta correlación es lo
que llamamos Código Genético, establecido de forma que a una secuencia de tres
nucleótidos en un ácido nucleico corresponde un aminoácido en una proteína 3.
El cuerpo descompone la mayoría de los carbohidratos de los alimentos que comemos y
los convierte en un tipo de azúcar llamado “glucosa”. La glucosa es la fuente principal de
combustible para nuestras células. Cuando el cuerpo no necesita usar la glucosa para
generar energía, la almacena en el hígado y los músculos. Esta forma almacenada de
glucosa se compone de varias moléculas conectadas entre sí y se llama “glucógeno”.
Cuando el cuerpo necesita una inyección rápida de energía o cuando no puede obtener
 suficiente glucosa de los alimentos, se descompone el glucógeno para liberar glucosa al
torrente sanguíneo y servir de combustible para las células 4.
El objetivo de la práctica fue identificar los diferentes tipos de macromoléculas presentes
en una muestra de levadura comercial haciendo uso de diferentes pruebas cualitativas para
el correcto procedimiento de identificación.
IV. PARTE EXPERIMENTAL
a. Prueba con el Lugol

En un mortero se adiciono una cucharada de levadura con trazas de arena que fueron
lavadas previamente, se trituro la mezcla adicionando 15 ml de ácido tricloroacético al 5%;
posteriormente se decantó la mezcla en tubo de centrifuga, el cual se centrifugo por 5
minutos a 3000 rpm. Después de centrifugar, el sobrenadante se trasvaso a un tubo de
ensayo y el precipitado se dejó enfriar un baño maría por 5 minutos.
El tubo de ensayo que contuvo el sobrenadante se le adiciono dos volúmenes de alcohol
etílico y se agito lentamente, se dejó enfriar hasta que hubo la aparición de un precipitado.
La solución que se formó se centrifugo a 3000 rpm por 3 minutos, cuando finalizo se
descartó el sobrenadante. A esta prueba se le realizo un test de control, para lo cual fue
necesario utilizar otro tubo de ensayo que no contenía nada de la solución, a ambos tubos
se le agrego un ml de agua destilada y un ml del reactivo de yodo.
b. Prueba de Biuret
El precipitado frio se transvaso a un tubo de ensayo y se agregó 15 ml de cloruro de sodio
al 10% agitando cuidadosamente, seguidamente, se colocó en un baño de agua caliente
por 10 minutos. Al enfriarse se centrifugo por 3 minutos a 3000 rpm. El sobrenadante se
pasó a un tubo ensayo y el precipitado se colocó en un baño de agua hielo por cinco
minutos, a continuación, se realizó una prueba de control con el precipitado, utilizando otro
tubo de ensayo que no contuvo nada, a ambos tubos se le agrego 2 ml de la solución salina
0.15M, un ml de sulfato de cobre y 2 ml de hidróxido de sodio 10 M.
c. Prueba de Bial
El tubo de ensayo que contuvo el sobrenadante se le adiciono dos volúmenes de alcohol
etílico y se agito lentamente, se dejó enfriar hasta que hubo la aparición de un precipitado.
Se trasvaso a un tubo de centrifuga, La solución que se formó se centrifugo a 3000 rpm por
3 minutos, cuando finalizo se descartó el sobrenadante. A esta prueba se le realizo otro test
de control, adicionando 2 ml de amortiguador salino y 3 ml del reactivo de orcinol, finalmente
se calentó por 8 minutos hasta la aparición de un color verde.
V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos en la práctica se demuestran en la siguiente tabla.
Tabla 1. Resultados cualitativos de las pruebas realizadas
NOMBRE DE LA PRUEBA COLOR NEGATIVA/ POSITIVA
Reactivo de lugol Naranja rojizo Positiva
Prueba biuret Violeta intenso Positiva
Prueba de bial Verde claro Positiva
En un mortero se añadió una cucharada de levadura y unas trazas de arena, con el fin de
romper la pared celular (que es una capa que protegió el contenido de la célula y dio rigidez
de esta, además represento el 80% de carbohidratos constituidos por el b- glucano, manano
y quitina) (imagen 1). después se adiciono 15 ml de ácido tricloroacético al 5% para ayudar
al macerado y la separación del glucógeno del ácido nucleico. La estructura del glucógeno
es muy ramificada, puesto que, está formada por varias cadenas que tienen de 12 a 18
unidades de α- glucosas (imagen 2), uno de los extremos de esta cadena se une a la
siguiente mediante un enlace α- 1,6 glucosidico, por este motivo, su solubilidad va aumentar
en disolventes apolares. Sin embargo, el ácido tricloro acético es un disolvente polar, que
en presencia de ácidos con agentes desactivantes, como son los halógenos en su cadena
carbonada, hicieron que la polaridad del mismo disminuyera, lo que hizo que el glucógeno
se solubilizara por completo en el solvente. De esta manera se formaron dos fases, una con
el glucógeno solubilizado y la con proteínas y ácidos nucleicos precipitados, la
centrifugación permito optimizar el proceso de decantación.

Imagen 1. Estructura de la levadura Imagen 2. Estructura ramificada del glucógeno

En la primera parte del procedimiento se utilizó la prueba del Lugol con el objetivo de
comprobar la presencia del glucógeno en la muestra problema, dando una coloración
naranja rojizo. El Lugol es preparado en una mezcla de yodo que es un compuesto
covalente insoluble en agua, con yoduro de potasio, un compuesto iónico que contribuye a
la disolución del yodo para formar el reactivo de Lugol soluble en agua, esto se explica
mediante la siguiente reacción química5:
𝐼2(𝑠) + 𝐾𝐼(𝑎𝑐) → 𝐾𝐼3(𝑎𝑐) . [5]

Este reactivo reacciona generalmente con el almidón, donde se esperaría una coloración
azul intensa, sin embargo, al reaccionar con el glucógeno este dio una coloración rojiza
menos intensa indicando un resultado positivo en la prueba como se muestra en la imagen
3. El proceso de identificación consiste en la reacción del yodo con la amilopectina del
polisacárido que contribuye a la formación de hélices cortas en las cuales las moléculas de
yodo son incapaces de juntarse, produciendo así la coloración rojiza que indica que la
prueba resultó positiva6.
 Imagen 3. Reacción del Lugol

En la segunda parte se identificó la proteína de la levadura con lo cual fue necesario utilizar
el reactivo de Biuret, el resultado que se obtuvo fue cambio de color de azul a violeta intenso
como se muestra en la imagen 5. La reacción coloreada que es específica de las proteínas
también puede producirse para péptidos y no puede ocurrir con ácidos nucleicos debido a
que en la reacción se produce un rompimiento de enlace peptídico CO-NH al momento de
liberarse los aminoácidos7. El color que evidencio la prueba fue positivo, debido a la
formación de un complejo de coordinación en donde los pares no apareados de los átomos
de nitrógeno del péptido o proteína actúan como ligandos, que se coordinarán con los iones
cobre del sulfato presente en el reactivo de Biuret8. Como se puede percibir en la siguiente
reacción:

Imagen 5. Reacción del reactivo de Biuret. [8]

Imagen 6. Prueba del reactivo de biuret

finalmente en la última parte, se utilizó el reactivo de Bial, para la identificación de ARN en
la levadura, el cual se compone con una mezcla de ácido clorhídrico, cloruro férrico, etanol
y orcinol disuelto en este. durante la reacción la ribosa presente en el ARN se deshidrata y
produce la formación de furfural. Al calentarse una pentosa en presencia de ácido
clorhídrico concentrado genera una reacción de pentosas, además el orcinol reacciona en
presencia de cloruro férrico como catalizador y esto es lo que produce la coloración verde
 lo cual indico un resultado positivo en la prueba 9. La prueba de Bial se explica mediante la
siguiente reacción:

Imagen 7. Reacción del reactivo de Orcinol. [9]

En esta prueba, el color obtenido fue verde como se muestra en la imagen 8. Demostrando
que la prueba fue positiva.

Imagen 8. Prueba de bial.

VI. CONCLUSIONES
Se obtuvieron resultados positivos para la realización de las tres pruebas, lugol , Biuret y
bial; logrando las tonalidades reportadas por la literatura, demostrando así la presencia de
glucógeno, enlaces peptídicos y ARN en la levadura. Las pruebas realizadas son muy útiles
en el área de la bioquímica, ya que además de la identificación de las macromoléculas
estudiadas, también pueden identificar otras biomoléculas dependiendo de la fuente de la
que procedan, a excepción de la prueba de Bial, ya que es exclusiva para la identificación
de ARN.
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. levadura Saccharomyces, Accedido el 11 de Marzo, 2018, obtenido de
http://www.biblioweb.tic.unam.mx/libros/microbios/Cap16/
2. Que son las proteínas, definición de proteínas, Accedido el 11 de Marzo, 2018,
obtenido de .http://alimentosproteinas.com/proteinas
3. Ecured.co. Ácido nucleico, Accedido el 11 de Marzo, 2018, obtenido de.
https://www.ecured.cu/%C3%81cido_nucleico
4. Kidshealth.org.Glucogeno, Accedido el 11 de Marzo, 2018, obtenido de.
http://kidshealth.org/es/parents/glycogen-esp.html
5. Bolaños, N, Lutz, G, Herrera, C. (2003). Química de los alimentos: Manual de
laboratorio. San José, Costa Rica: Editorial de la Universidad de Costa Rica. P: 10
6. Martín, Sánchez, M, Martín Sánchez, M, T, Pinto, G. (2013). Reactivo de Lugol:
Historia de su descubrimiento y sus aplicaciones didácticas. Revista Scielo, 24.
7. Escuela europea de Luxemburgo (Sección española). Proteínas. Recuperado de:
http://www.euroschool.lu/prof.montilla/ficheroactivi/actividadesbio4_6/PPROTEINAS
8. Guarnizo, A, Martínez, P. (2010). Experimentos de química orgánica con enfoque en
ciencias de la vida diaria. Armenia, Colombia: Editorial de la Universidad del Quindío.
P: 183
9. Arzápalo, Marín, R. (2012). Prácticas de laboratorio: Bioquímica. Instituto tecnológico
de Conkal, Carrera de ingeniería en agronomía.