GUÍA 7 de LABORATORIO - Enzimas Mitocondriales

Gua 7.
Extraccin y verificacin de la actividad de las enzimas: succnico deshidrogenasa y citocromo

oxidasa y estudio del efecto de algunos inhibidores
I. EL PROBLEMA
Realizar experimentalmente la extraccin de enzimas a partir de un tejido animal.
Verificar in vitro la actividad de las enzimas que se extrajeron mediante el uso de aceptores electrnicos
coloreados.
Reconocer el efecto de los inhibidores en la actividad de las enzimas y sobre la fosforilacin oxidativa y el
ciclo de Krebs.
II. FUNDAMENTO TERICO
La mitocondria es el organelo citoplasmtico en donde se lleva a cabo la respiracin celular representada en
vas metablicas como el ciclo de Krebs y la fosforilacin oxidativa. Posee dos membranas: la externa
altamente permeable por protenas de membrana llamadas porinas y la interna con pliegues o crestas y de
permeabilidad alatemnte selectiva (ver figura 1).
Figura 1. La mitocondria
El ciclo de Krebs
Es una ruta aerobia cuyos complejos multienzimticos se encuentran localizados en la matriz mitocondrial
con excepcin de la succnico deshidrogenasa protena integral de la membrana interna.
Este proceso metablico permite la descarboxilacin de los esqueletos carbonados que le llegan en forma
de Acetil CoA, provenientes de diferentes compuestos (carbohidratos, cidos grasos, aminocidos). Esta va
+
metablica oxidativa est asociada a la reduccin de las coenzimas FAD y NAD , que finalmente ingresan a la
cadena de transporte electrnico para su reoxidacin (ver figura 2).
Figura 2. Ciclo de Krebs

Figura 2. Ciclo de krebs
Accin de la succnico deshidrogenasa.
La succnico deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa o complejo II es una enzima que remueve dos
+
protones y dos electrones del succinato para dar origen al fumarato, oxidacin asociada a la coenzima FAD ,
que transfiere los electrones a la cadena de transporte electrnico. Este proceso lo inhibe en forma
competitiva la presencia de otros cidos dicarboxlicos como el malonato, oxalacetato y y oxalato, los cuales
se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, situacin que genera la acumulacin de succinato.
El proceso se puede observar in vitro mediante el uso de un aceptor electrnico artificial como el azul de
metileno que es coloreado en su estado oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida que se reoxida la
coenzima FAD. Cuando ste indicador de oxido reduccin se encuentra en contacto con el O 2 del aire se
reoxida tomando de nuevo la coloracin azul y formando perxido de hidrgeno. Cuando el azul de
metileno se encuentra en contacto con el oxgeno del aire, se reoxida tomando la coloracin azul y
formando perxido de hidrgeno, por esta razn el sistema se asla mediante una capa de aceite mineral.
La cadena de transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa

La cadena de transporte de electrones o cadena respiratoria como parte de la fosforilacin oxidativa es un
proceso que se lleva a cabo en la membrana interna mitocondrial y est constituido por una serie de
complejos enzima-coenzima de oxidorreductasas y ferroprotenas. (ver figura 3)
+
A travs de la cadena de transporte de electrones se realiza la reoxidacin de las coenzimas NADH H y

FADH2 producidas en las rutas catablicas, ya que permite el transporte de los electrones hasta el O2, que es
el aceptor final reducindose para formar agua.
Este flujo de electrones es exergnico por esto tres complejos enzimticos de la cadena respiratoria utilizan
la energa liberada para bombear protones al espacio intermembrana de las mitocondrias, generando un
potencial electroqumico que pormueve despus el regreso de los protones a la matriz mitocondrial y la
sntess de ATP atravs del complejo V o la ATP sintasa.
Accin de la citocromo oxidasa.
El complejo citocromo oxidasa o complejo IV es el componente final de la cadena respiratoria y est
++
constituido por el citocromo a y a3 y dos iones Cu . Aproximadamente el 90% del consumo celular del
oxgeno se debe a la accin de este complejo que cataliza la reduccin del oxgeno para formar agua.
Figura 3. Cadena de transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa

-
Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores ms fuertes como es el caso de in cianuro (CN ), azida
(N3 ), monxido de carbono (CO) y otros inhibidores que bloquean irreversiblemente este complejo
enzimtico. Con ello se ve interrumpido el transporte electrnico y se deja de utilizar el O 2 generando una
condicin de cianosis celular.
La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidacin de aceptores
electrnicos artificiales como la p-fenilendiamina (pFDH2) en presencia del sistema de citocromos de los
complejos de la cadena respiratoria. Esta sustancia es muy reactiva as que se condensa y polimeriza
fcilmente originando mezclas de pigmentos oscuros.
La siguiente ecuacin qumica representa la accin de esta sustancia indicadora de las reacciones de oxido
reduccin en los sistemas in vitro.
III. REACTIVOS.
Buffer de fosfatos 0,1M pH = 7,4
p fenilendiamina, 1% en agua
Azul de metileno 0,01% en agua
Oxalato de sodio, 1,5% en buffer
Arena lavada
Aceite mineral
Succinato de sodio, 1% en buffer

*Cianuro de potasio, 0,05M en agua
*Azida de sodio, 0,5% en agua
Malonato de sodio, 1% en buffer
Agua destilada
Hielo
IV. MATERIALES.
12
3
1
2
1
1
1
1
Tubos de ensayo - gradilla

Pipetas (1, 2 y 5 mL)
Vaso de precipitados (250 mL)
Tubos de centrfuga
Erlenmeyer
Mortero pistilo
Termmetro
Esptula
Balanza
Bao termostatado
Centrfuga
Trpode mechero
Placa de calentamiento
Bistur cuchilla
Pipeta Pasteur.
MATERIAL DE PRUEBA.
Tejido muscular, heptico, cardaco de vaca, conejo o ave, bien fresco (trado del matadero ese mismo da).
V. PROCEDIMIENTO.
Extraccin y preparacin de las enzimas y coenzimas.
Procedimiento para el monitor: Pesar una muestra de aproximadamente 6 g de tejido libre de sangre y
colocarla en un mortero con arena lavada, enfriada previamente en un bao de hielo. Proceder a macerar
cuidadosamente hasta formar una pasta suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5ml) de
buffer fosfato pH 7,4, hasta completar un volumen de aproximadamente 18 mL. Transferir la mezcla a un
erlenmeyer de 150mL y mantenerlo en un bao con hielo durante 15 minutos, mezclando ocasionalmente.
Pasar la muestra a tubos de centrfuga y centrifugar a 1500 rpm por 7 minutos. Transferir el sobrenadante a
otro erlenmeyer de 150mL y marcarlo como extracto enzimtico; mantenerlo en bao de hielo hasta su
posterior uso.
Seguimiento de la reaccin catalizada por la citocromo oxidasa.
Preparar una serie de tubos debidamente marcados segn las indicaciones de la Tabla 1, hasta adicionar el
agua. Dejar los tubos incubando a 37C durante 10 minutos y sin retirarlos del bao agregar el extracto
enzimtico y la p-fenilendiamina, agitar bien, este momento corresponde al tiempo cero, observar y
registrar el tiempo en que aparece el complejo coloreado, el color final y la intensidad del color.
Tabla 1. Seguimiento de la reaccin catalizada por la citocromo oxidasa

Tubos
Blanco
Reactivos (mL)
Buffer fosfatos pH 7,4
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Malonato de sodio
0,0
0,0
0,0
1,0
0,0
Cianuro de potasio
0,0
0,0
1,0
0,0
0,0
Azida de sodio
0,0
0,0
0,0
0,0
1,0
Agua destilada
2,0
1,0
0,0
0,0
0,0
Extracto enzimtico
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
p-fenililendiamina
0,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Seguimiento de la reaccin catalizada por la succnico deshidrogenasa

Prepare una serie de tubos debidamente marcados segn las indicaciones de la tabla 2. Antes de agregar el
extracto enzimtico, deje los tubos incubando a 37C durante 10 minutos, y sin retirarlos del bao agregue
el extracto enzimtico, inmediatamente agite bien y coloque el aceite mineral. Tome como tiempo cero el
momento en que coloc el extracto enzimtico y anote el tiempo en que cambia el color, color e intensidad
de color final.
Tabla 2. Seguimiento de la reaccin catalizada por la succnico deshidrogenasa
Tubos
Reactivos
mL
Buffer fosfato pH 7.4
Succinato de sodio 1%
Azul de metileno
Malonato de sodio 1%.
Oxalato de sodio
Extracto enzimtico
Aceite mineral
Blanco
3,0
0,0
0.5
0,0
0,0
1,0
1.0
2,5
1,0
0.5
0,0
0,0
0,5
1.0
2,0
1,0
0.5
0,0
0,0
1,0
1.0
1,5
1,0
0.5
0,0
0,0
1,5
1.0
1,0
1,0
0.5
1,0
0,0
1,0
1.0
1,0
1,0
0,5
0,0
1,0
1,0
1,0
VI. BIBLIOGRAFA.
- MATHEWS C., VAN HOLDE K., AHERN K G. (2002). Bioqumica. 3 ed. Madrid: Addison Wesley.
- PLUMMER, D. (1981). Bioqumica prctica. Mxico: Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana.
- NELSON, David. L. y COX, Michael. Lehninger. Principles of Biochemistry. 3 ed. New York: Worth Publischer,
1993.
PREINFORME E INFORME
Extraccin y verificacin de la actividad de las enzimas: succnico deshidrogenasa y citocromo oxidasa y
estudio del efecto de algunos inhibidores
Nombre __________________________Fecha __________________Grupo___
CUESTIONARIO PARA EL PREINFORME.

En una hoja responda las siguientes preguntas
1- La ecuacin de las reaciones que catalizan las enzimas a utilizar en la prctica.
2-Para los rganos a utilizar mencione brevemente si su metabolismo es ms fermentativo (anaerobio) o
aerobio, tenga en cuenta el color caracterstico de los citocromos que hacen parte de la fosforilacin
oxidativa.
3- tabla con los valores de potencial redox para todos los componentes de la cadena respiratoria, as como
del azul de metileno y la p-fenilendiamina, compuesto que se usarn para evidenciar la actividad de las
enzimas citocromo oxidasa y succnico deshidrogenasa.
4- De acuerdo con el fundamento terico de la gua y la bibliografa describa brevemente los cambios de
color en el azul de metileno y la p-fenilendiamina cuando:
a- La citocromo oxidasa y la succnico deshidrogenasa se encuentran sin inhibidores.
b- La citocromo oxidasa y la succnico deshidrogenasa se encuentran con los inhibidores (cianuro, azida,
malonato u oxalato).
1. Seguimiento de la reaccin catalizada por la citocromo oxidasa
Escriba las hiptesis con base en la consulta realizada en el preinforme
________________________________________________________________________________________
____________________________________________
Diagrama de flujo
Diagrama de flujo
2. Seguimiento de la reaccin catalizada por la succnico deshidrogenasa
Escriba las hiptesis con base en la consulta realizada en el preinforme

________________________________________________________________________________________
____________________________________________
Diagrama de flujo
Fichas tcnicas. Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio.
Nombre
Frmula
Aspecto
Peligrosi
Primeros auxilios y
Forma de
dad*
medidas de higiene
eliminacin
Indique la peligrosidad con el smbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable (F),
extremadamente inflamable (F+), txico (T), muy txico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o
peligroso para el medio ambiente (N). Pictogramas SGA
PAUTAS PARA LA ELABORACIN DEL INFORME
Escribir los datos, observaciones y fotos debidamente tabulados.
Haga un anlisis de las observaciones de la prctica con citas
Usando toda la informacin de su gua y preinforme:
- Explique el propsito de agregar cada reactivo y la tempertaura de incubacin en cada caso.
-Explique el tipo de inhibidores presentes en algunos tubos de ensayo y sus efectos.
- Explique el efecto de la concentracin de extracto enzimtico en el ensayo que corresponda.
-Para cada tubo de ensayo realice una figura diferente ilustrativa de la cadena respiratoria, con las
siglas de cada componente y su secuencia, indique hasta dnde se llevo a cabo la fosforilacin
oxidativa, la ubicacin del aceptor de electrones artificial (azul de metileno o p-fenilendiamina), de
acuerdo con su potencial de reduccin estndar(E) y aclare si qued oxidado o reducido de
cauerdo con sus observaciones.
-Compare y discuta qu tan aerobio o anaerbio es su tejido muestra y por lo tanto que rutas usa
principalmente para la generacin de energa.
- Explique si se cumplieron o no las hiptesis planteadas.
Bibliografa con normas APA

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Extraccin y verificacin de la actividad de las enzimas: succnico deshidrogenasa y citocromo

Figura 2. Ciclo de Krebs

La cadena de transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa

A travs de la cadena de transporte de electrones se realiza la reoxidacin de las coenzimas NADH H y

Figura 3. Cadena de transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa

Succinato de sodio, 1% en buffer

Tubos de ensayo - gradilla

Tabla 1. Seguimiento de la reaccin catalizada por la citocromo oxidasa

Seguimiento de la reaccin catalizada por la succnico deshidrogenasa

Tabla 2. Seguimiento de la reaccin catalizada por la succnico deshidrogenasa

Nombre __________Fecha Grupo_

CUESTIONARIO PARA EL PREINFORME.

2. Seguimiento de la reaccin catalizada por la succnico deshidrogenasa

Escriba las hiptesis con base en la consulta realizada en el preinforme

Fichas tcnicas. Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio.

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